INTRODUCCION

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.

Sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado.

Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente.

Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo.

Las temperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayoría de los seres vivos. como: Thermus aquaticus (polimerasa Taq).

Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Necesaria para cada etapa de la reacción.

Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción.

La PCR es una técnica de gran sensibilidad, necesita una mínima cantidad de ADN para obtener un gran número de copias. Además, puede ser muy propensa a errores si se lleva a cabo en condiciones inadecuadas de esterilidad, que conduzcan a la amplificación de ADN no correspondiente a la muestra a analizar (y por tanto a conclusiones inciertas).

Se han de tomar una serie de precauciones para evitar la contaminación con ADN extraño. Ejemplos en los que es especialmente importante la amplificación son la detección

de enfermedades o el diagnóstico de identidad y parentesco. Posibles precauciones son:

Tener especial cuidado durante los pasos previos a la amplificación: recogida, envío, custodia y procesado de muestras.

Limpieza exhaustiva y esterilización (lejía, etanol, luz UV) de la superficie de trabajo entre la realización de una PCR y la siguiente.

En laboratorios de diagnóstico genético, se suelen tener áreas separadas de trabajo: un laboratorio para la preparación de la mezcla madre para la PCR, otro para la adición del ADN a amplificar, otro donde se encuentra la maquinaria para realizar la PCR y otro donde se abre y analiza la muestra ya amplificada.

Cabinas de seguridad biológica para reducir vapores cargados de ampliaciones de enfermedades.

Protección adecuada de los operarios que manipulen las muestras y los instrumentos del laboratorio: guantes, bata, botas, gafas de seguridad, pelo recogido... En el diagnóstico molecular es conveniente que se cambien estos elementos al pasar de una zona de trabajo a otra.

OBJETIVOS

Aplicar el método de extracción del DNA mediante la utilización del kit promega.

Conocer los diferentes materiales y reactivos a utilizar en el laboratorio para la extracción de DNA.

MATERIALES4. PROCEDIMIENTOa. Se tomaron 300 µl de la muestra, se depositó en un tubo eppendorf y se le agregaron 400 µl de lisis celular.

b. Mezclar por inmersión. Cuando se homogenizo se llevó a 37°C por 10 minutos.

c. Se centrifugo por 20 segundos a 13000 rpm. Descartamos el sobrenadante y nos quedamos con el pellet y aplicamos bortex para separar el tejido del tubo.

d. Se agregó 300 µl de la solución lisis nuclear.

e. Se llevó por 10 minutos a 37°C y durante este tiempo se fue agitando.

f. Agregamos 100 µl de proteinaza Pk, se agitó, se agregó bortex y se centrifugo por 1 minuto, nos quedamos con el sobrenadante.

f. Agregamos isopropanol 1:1 por 20 minutos. (Para precipitar el DNA)

g. Se centrifugo por un minuto.

h. Retiramos el sobrenadante y nos quedamos con el pellet, lavamos con etanol al 70%, agregamos 200 µl y centrifugamos por un minuto.

i. Dejamos a 4°C por 15 días en edta de T.

Seguidamente realizamos la prueba de electroforesis.

j. Nos familiarizamos con los materiales que íbamos a utilizar en el laboratorio. (Cámara de electroforesis, fuente de poder, micropipetas, peinilla y soporte del gel)

k. se preparó la garosa al 1% donde se calentó 100 ml del tampón tbe y 1 g de agarosa.

l. Después servimos la preparación del gel de agarosa, colocando la peinilla después de servir la agarosa y esperamos 20 minutos hasta q se solidifique el gel.

m. Agregamos 5 mm de tbe sobre el gel en los sitios donde estaba insertada la peinilla.

n. Retiramos la peinilla con cuidado.

o. Se agregó tbe hasta cubrir completamente el gel. Se agregó a las muestras de dna un marcador de 1 kiloasa

p. Se agregó sobre cada hueco 20 µl de DNA con sus respectivos marcadores.

q. se tapó la cámara, conectando la cámara a la fuente, dejándola en un voltaje constante. (10 voltios x centímetro) inmediatamente se inició con el recorrido observando un burjeo constante a un lado de la caja. Y se dejó correr la electroforesis hasta llegar a mitad de la caja.

r. se sacó el gel y se colocó en una caja de Petri, se sumergió en una solución de bromuro de etilio. Se observó el gel con luz ultravioleta.

RESULTADOS

ANALISIS SE LOS RESULTADOSCUESTIONARIOBIBLIOGRAFIA

ANEXOS