Estrategias de Ingeniería Genética y Metabólica para Mejorar la producción de etanol 

de primera y segunda generación

Estrategias de Ingeniería Genética y Metabólica para Mejorar la producción de etanol 

de primera y segunda generación

Jorge Alberto Vásquez Castillo. MSc cPhD.Docente Facultad de Ciencias BásicasUniversidad Santiago de Cali.

Aspecto relevantes de cepas para producción de etanol a escala Industrial

Aspecto relevantes de cepas para producción de etanol a escala Industrial

1. Tolerancia a etanol2. Osmotolerancia.3. Tolerancia cambios de pH.4. Tolerancia a estrés Mecánico.5. Caracterización Molecular6. Productividad de etanol (Qp)7. Rendimiento (Yp/s).8. Velocidad de hidrólisis9. Velocidad de consumo de sustrato10.Velocidad de conversión de azúcar a etanol

1. Tolerancia a etanol2. Osmotolerancia.3. Tolerancia cambios de pH.4. Tolerancia a estrés Mecánico.5. Caracterización Molecular6. Productividad de etanol (Qp)7. Rendimiento (Yp/s).8. Velocidad de hidrólisis9. Velocidad de consumo de sustrato10.Velocidad de conversión de azúcar a etanol

3

Miel Bo Jugo de caña de azúcar

12- 13% sacarosa~ 2 - 3% hexosas

Dilución del sustrato

Agua nutrientes

Producción del Inóculo

Fermentación

Separación de Biomasa

Destilación

Vinaza diluida

Evaporación

Etanol 95%

Deshidratación

Levadura Flujo de Aire

InoculoSustratoDiluido

Etanol anhidro

Acido lactico 8000 ppm.Acido acetico. 3000 ppm.Potasio 8000 ppm.

Vinaza Diluida

Operaciones unitarias para la producción de etanol

H+

Hexosas-6P

EMP

H+

ATP

ADP + Pi

Piruvato

EtanolCO2

Glicerol

Invertasa-I

Inversión de la sacarosaInversión de la sacarosa

HXT

AGT1

Invertasa-E

H+

Regulación de la expresión de la invertasa

Figura 6. Mecanismos moleculares de la represión catabólica por glucosa. Durante el crecimiento en medio con glucosa, la proteína represora Mig1 está en su forma no fosforilada, debido a la actividad de la proteína fosfatasa del complejo Glc7-REG1, el cual activa la unión de HXK2 y cyc8, que permiten que mig1 se una a la región reguladora del gen SUC2 por medio de la proteína Tup1, evitando así la expresión de la enzima invertasa (Gancedo Juana M, 2008).

Acetato

Acetaldehido2 Piruvato

Glicólisis

Acetil-coA

Biosíntesis de Lípidos

Acetil-coA

Mitocondria en O2

Piruvato

Mitocondria sin O2

TCAVariante delTCA

Oxalacetato

2CO2

2ATP

2NAD+

2NADH + 2H+

NAD(P)+

NAD(P)H + H+

ATP + CoASH

AMP + PPi

ATP+CO2 NAD+ +CoASH

NADH + H++ CO2

1

2

356

4

Salto de la Piruvato deshidrogenasa

PDC

ADH

H2OH2O Rutas Metabólicas para

Px de etanol

Producción de etanol con la cepa recombinante de Saccaromyces cerevisiae que porta los genes PDC y ADH de Z. mobilis (GG570-CIBII9.1 ), que la cepa que porta ▲solo el gen PDC (GG570-CIBI4.1 ) y que la cepa control (CBS8066 ). Vásquez y col. ♦■Ingeniería genética rutas metabólicas. Tesis 2007.

Producción de etanol y glicerol de las cepas GG570-CIBI 4.1; GG570-CIBII 9.1 y el control CBS8066

1. Aislar y caracterizar levaduras nativas con tolerancia natural a 65% v/v de vinaza. 2. Seleccionar la levadura nativa con mayor tolerancia a vinaza y sobreexpresar los genes suc2 de S. cerevisiae y adh2 de Zymomonas mobilis. 3. Determinar los niveles de expresión de los genes suc2 y adh2 por PCR en tiempo real en la levadura recombinante y compararlos con la levadura nativa 4. Comparar los parámetros de fermentación de las levaduras recombinantes y su control nativo con una levadura comercial, realizando fermentaciones con un medio que contenga miel B y de 65% de vinazas a escala Erlenmeyer y bioreactor operando en modo discontinuo.

OBJETIVOS ESPECÍFICOSOBJETIVOS ESPECÍFICOS

Aislamiento de levaduras nativas

Caracterización Bioquímica y molecular

Evaluación del nivel de expresión relativa de los genes 

Suc2 y Adh2

método de selección 2DG

qPCR (PCR cuantitativa)

Caracterización intraespecífica

Parámetros de fermentación

Fermentaciones a escala Erlenmeyer  200ml.                            12.53% de Sacarosa, 3.55% de glucosa y 4.08 de 

fructosa

Objetivo No. 1Objetivo No. 1

Objetivo No. 2Objetivo No. 2

Objetivo No. 3Objetivo No. 3

Objetivo No. 4Objetivo No. 4

Selección  y adaptación

Medio de cultivo MVYS

Diseño, selección y desarrollo

Interdelta

AFLPs

Criterios de selección

Osmotolerancia

Tolerancia a etanol

Tolerancia a vinaza 65%

Ingeniería Genética de la levadura Construcción del cassette

Escala Bioreactor

Densitometría

HPLC. Sugar Pack I y edetato de calcio (Fase Mov)

Conteo celular Neubauer

Genes Adh2 y Suc2

Ensayos de susceptibilidad

Transformación

Curvas de eficiencia

Genes normalizadores

Electroporación

METODOLOGIA GENERALMETODOLOGIA GENERAL

T103, Hoja y cogollo

Aislamiento selectivo de levaduras  nativas tolerantes a vinaza a partir de tanques de almacenamiento de mieles usando un medio selectivo

Tanque de Propagración

Tanque de alimentación

T124

Mezclador

Pasteurizador

Intercambiador de calor

H124

ETANOL

VINAZA 10

Destilador

R311 Tanques de

Fermentación

Tanque de almacenamiento

de mieles

T103

Refinería de azúcar

Miel B

Puntos de aislamientos en las destilerías

Composición del medio MVYS- Miel B ajustar hasta 7% p/v de ART, Amonio bifosfato 300ppm, Vinaza 70% v/v, Cloranfenicol 100μg/ml, Agar bacteriológico 3.5% p/v, pH: 4,5.

Extracción de DNA genómico levaduras

Dilución DNA = 10ng/µl

Digestión de 2.5ng/ul con 

Ligación de adaptadores

EcoRI/MseI

0.04U de T4 DNA ligasa

Condiciones: 4min 95⁰C; 35 ciclos de 30s a 95⁰C, 30s a 46⁰C, 90s a 72⁰C

Cuantificación DNA y pureza Nanodrop

PCR inespecífica

PCR especifica

EcoRI-0: 5’GACTGCGTACCAATTC’3

Bioquímica Kit Api C-20Interespecífica

Intraespecífica

Huella Interdelta 12-21

AFLPs

PCR

Forward: Delta 125-TCAACAATGGAATCCCAAC-3

Reverse: Delta 215P-CATCTTAACACCGTATATGA-3P

MseI-0: 5’GATGAGTCCTGAGTAA’3

TA:58⁰C

EcoRI-AG /MseI-C

EcoRI-AC /MseI-C

EcoRI-AG/AC: 5’GACTGCGTACCAATTC/AG/AC’3

MseI/C: 5’GATGAGTCCTGAGTAAAC’3

CARACTERIZACION DE CEPASCARACTERIZACION DE CEPAS

p S P -G M 1 -S U C 28971 bp

URA3

am pR

SUC 2

P PGK1 P TEF1

2µ ori

pUC ori

f1 ori

T CYC1

T ADH1

Age I

Asc I

Avr I I

Bcl I

Bsg I

Bsm I

Bsp EI

Bsr GI

Bss H I I

Bst BI

Cla I

Eco R V

Fse I

Hpa I

M fe I

M lu I

Nde I

Nhe I

Not I

Pac I

Pml I

Pst I

Sa c I

Sac I I

Sal I

Sbf I

Sgr AI

Sma I

Sna BI

Sp e I

Srf I

Stu I

Xho I

Xma I

pSP-GM 1-SUC2-ADH210072 bp

U R A3

am p R

SU C 2

Z m AD H 2

P PG K 1

P TE F 1

2µ o r i

p U C o r i

f1 o r i

T C YC 1

T AD H 1

A a rI

A c c6 5 I

A g eI

A l oI

A s cI

A v rI I

B g lI I

B m gB I

B m tI

B p lI

B p u1 0 I

B s aB I

B s aH I

B s gI

B s mI

B s pE I

B s rG I

B s sH II

B s tB I

C l aI

E c oIC R I

E c oR V

F s eI

K p nI

M l uI

M s cI

N d eI

N h eI N o tI

P a cI

P m lI

P s tI

R l eA I

S a cI

S a cI I

S b fI

S g rA I

S m aI

S n aB I

S p eI

S p hI

S s e2 3 2 I

S s e8 6 4 7 I

S tuI

U th S I X m aI

Iniciadores para generar el constructo URA7-pTEF1-SUC2- pPGK-ADH2-URA7

Vector pSP-GM1-Suc2Vector pSP-GM1-Suc2-Adh2

Procesos in silicoVector NtiPrimer premiere

Iniciador Sequencia pb Tm TA optProducto

bp

SU-F 5' AAATAATTACTAGTATGCTTTTGCAAGCTTTCCTT 3‘ 35 64.19 59.19 1599SU-R 5' AAAAGAGCTCTACTATTTTACTTCCCTTACTTGGAACTTG 3‘ 40 63.26 58.26 1599AD-F 5' AAATTATTGTCGACATGGCTTCTTCTACTTTTTACATTCCA 3' 41 64.88 59.88 1155AD-R 5' AAAATAAAGCTAGCTCATCAGAAGGCGGACAAG 3' 33 64.52 59.52 1155U7p-F 5' ACAAGTGGACTGTTAATTGGTAATAATT 3' 28 61.98 56,98 392U7p-R 5' CGCCTTATTTTCTGTCTATAAGTTTCTTTTGTTCTATT 3' 38 61.35 56.35 392U7t-F 5' CCAACGCATCAAAATTTTAGAATTAAAAGTCTACTGC 3' 36 60.50 55.50 297U7t-R 5' AAGACTCTTATTTCTCATTTTGAAAGC 3' 27 62.30 57.30 297Cons-F 5' CAAAAGAAACTTATAGACAGAAAATAAGGCGCGCCAAAC 3' 39 62.89 57.89 4815Cons-R 5' TTTTAATTCTAAAATTTTGATGCGTTGGCCGATTCA 3' 36 63.89 57.89 4815

NConst-F 5' AGCCTAGGGTTCTGTTCTTTGAC 3' 23 63.93 58.93 5315

NConst-R 5' AACAACTGTTGGCCAGTCGAAAA 3' 23 64.29 59.29 5315

Diseño de constructos

TransformaciónPor electroporación1.5KV, 25 μF y 200Ω

TransformaciónPor electroporación1.5KV, 25 μF y 200Ω

Extracción de ADN

Extracción de ADN

PCR para verificar

presencia de los genes

PCR para verificar

presencia de los genes

Repique en medio YPSSacarosa

15%72h

Cultivo en caldo YPSSucrosa 150g/L

+ A. acético y láctico 12h

Parámetros de fermentación

Po HPLC

Parámetros de fermentación

Po HPLC

Repique a tubos de criopreservación YPS

10%, Glicerol 30%. 24h a 30°C

Fermentaciones a escala 250ml Miel (15% ART) Vinaza

60%. 24h

Repique en medio YPSSucrosa 150g/L

72h

Cultivo en medio YPSSucrosa 150g/L

24h

Parámetros de fermentación

por HPLC

Parámetros de fermentación

por HPLCParámetros de fermentación por HPLC. Se usó la columna de

separación Sugar Pack I y edetato de calcio como fase

móvil

Parámetros de fermentación por HPLC. Se usó la columna de

separación Sugar Pack I y edetato de calcio como fase

móvil

Expresión genica, qPCR

Expresión genica, qPCR

Colonias transformantes.120h en medio

YPS + 2DG a 30°CRepique en medio YPS

Sacarosa 100g/L.72h a 30°C

Repique en medio MVYS

10% ART72h a 30°C

Fermentaciones a escala Bioreactor de 10Lts , medio con

Miel (20% ART) Vinaza 65%, 24h, 30°C

Repique a tubos sland YPS 10%.

24h a 30°C

Cultivo en caldo YPS

Sucrosa 100g/L16h a 30°C

Cultivo en caldo YPS

Sucrosa 100g/L16h a 30°C

PROCESOS POSTERIORES A LA TRANSFORMACIONPROCESOS POSTERIORES A LA TRANSFORMACION

Fermentaciones a escala Bioreactor - Fermentación Tipo batch: 24 h - Materia prima: Miel B - ART ~ 19 % (w/w). 15.0% de sacarosa, 2.0% de glucosa y 2.0% de fructosa-DAP: 300ppm-Volumen de Trabajo: 10 litros Con adición de vinaza (65%)- Acidez volátil: 4000ppm con ácido acético-pH: 4.5.-Temperatura: 30 °C-Agitación: 150 r.p.m.

Etapas para la evaluación de las cepas recombinantes a escala Erlenmeyer y bioreactor

CONDICIONES DE OPERACIÓN

Fermentaciones escala Erlenmeyer 250mls. Miel B 15% (p/v) ART, Vinaza 65% v/v, DAP 300ppm y el pH se ajusto a 4.5. 4000ppm de acido láctico. Agitación 150RPM y 30˚C de temperatura. (24h)

100% Saccharomyces cerevisiae100% Interdelta profile ≈ comercial

Aislamiento a partir de destilería y caracterización de cepas

Tanque de Propagración

Tanque de alimentación

T124

Mezclador

Pasteurizador

Intercambiador de calor

H124

ETANOL

VINAZA 10

Destilador

R311 Tanques de

Fermentación

Tanque de almacenamiento

de mieles

T103

Refinería de azúcar

Miel B

58% Saccharomyces cerevisiae42% otros géneros100% Interdelta profile ≈ comercial

25% Saccharomyces cerevisiae75% Candida sp.100% Interdelta Profile ≈ comercial

75% Criptococcus sp.25% Candida sp

72% Saccharomyces cerevisiae28% Candida sp72% Saccharomyces cerevisiae28% Candida sp

From 100% of S. cerevisiae61,54 % Interdelta profile ≈ comercial30,8 % Interdelta profile ≠ comercial7,6% Non interdelta profile

From 100% of S. cerevisiae61,54 % Interdelta profile ≈ comercial30,8 % Interdelta profile ≠ comercial7,6% Non interdelta profile

Las distancias fenéticas de Nei’s entre una forma nativa y su progenitor entá entre el rango 0.02 and 0.09 (S. Coulibaly Theor Appl Genet (2002) 104:358–366),

AFLPs de Levaduras nativas y comerciales de S. cerevisiae

Distancias Fenéticas entre cepas Distancias Fenéticas entre cepas

El propósito del uso de los AFLPs en este trabajo, fue corroborar los resultados de los marcadores moleculares interdelta. En este sentido las combinaciones de iniciadores usados, EcoRI-AG/MseI-C y EcoRI-AC/MseI-C mostraron un alto polimorfismo permitiendo visualizar hasta 53 bandas por par de iniciadores (106 en total), con pesos moleculares que oscilaron entre 50 y 550pb de las que 85 (81,13%) resultaron polimórficas, (Figura 4). La heterocigocidad promedio fue de: 0.2562.

Fermentaciones cepas nativas vs Comercial

Azucares fermentable consumidos, población celular y conteo celular a las 24 horas de fermentación con levaduras nativas aisladas a partir de ambiente de destilería y hoja y cogollo de caña de azúcar, usando miel B con (15% de ARTs) y vinaza (50%).

Miel B 19% (p/v) ART, Vinaza 65% v/v, DAP 300ppm y el pH se ajustó a 4.5. 3000ppm de ácido acético y 4000ppm de acido láctico. Agitación 150RPM y 30˚C de temperatura.

Producción de etanol levaduras recombinantes usando medio industrial Escala Erlenmeyer 250mls

Resultados Comparación de la eficiencia, rendimiento y productividad volumétrica de las cepas nativas vs

recombinantes

Miel B 19% (p/v) ART, Vinaza 65% v/v, DAP 300ppm y el pH se ajustó a 4.5. 3000ppm de ácido acético y 4000ppm de acido láctico. Agitación 150RPM y 30˚C de temperatura.El incremento en Qp de la cepa 2-26E11-7 fue de 0,7g etanol/L * h

expresión relativa del gen Adh2 de las cepas recombinantes 2-26E11-8 y 2-26E11-4

Cepa LCC2-26E11-4 (4.4 %p/v de etanol a las 12h) comparando con la cepa LCC2-26E11-8 la cual presenta el nivel más bajo de producción de etanol (3.7 %p/v a las 12h),

Expresión relativa del gen Suc2 de las cepas recombinante 2-26E11-4 y nativa LCC2-26 wt.

Expresión Relativa de los genes Adh2 y Suc2 

Cepa LCC2-26E11-4 (4.4 %p/v de etanol a las 12h) comparando con la cepa LCC2-26WT con una producción de etanol de (3.1 %p/v a las 12h)

Cinética de consumo de azucares fermentables y producción de etanol y biomasa por las cepas LCC2-26E11-4 y LCC-2-26 nativa

Cinética de consumo de azucares fermentables y producción de etanol y biomasa por las cepas LCC2-26E11-4 y LCC-2-26 nativa

Cinética a escala bioreactor de 10Lts usando un medio industrial con alta gravedad específica

El incremento en la producción de etanol de la cepa recombinante LC2-26E11-4 usando el medio miel B con 20% de azúcares fermentables, también mantuvo la tendencia observada en las fermentaciones realizadas usando el medio YPS (sacarosa 15% datos no reportados). Iniciando con una población celular de 50 x 106 se observa un incremento paulatino de la concentración de etanol en las fermentaciones realizadas con la cepa recombinante entre 0.5%, 1.0%, 1.82%, 2.25%p/v, a las 4, 8, 12 y 24 horas respectivamente con respecto del control LCC2-26WT

Velocidad de consumo de glucosa y fructosa en las fermentaciones realizadas con las cepas recombinante y nativa

Velocidad de consumo de glucosa=  ((Sacarosa hidrolizada/2) 0.95 + Glucosa Residual T(h-1))* (1-µ) -                                                                                            Concentración de Glucosa T (h) / Δ Tiempo

Por otra parte el incremento del 168% (0.326 g/L*h) en la velocidad de consumo de glucosa y del 221% (0.43 g/L*h) en la velocidad de consumo de fructosa en la cepa recombinante LCC2-26E11-4 comparada con la nativa LCC2-26WT a las 4 horas (Figura 47), coincide con el aumento en la tasa de hidrólisis (figura 45) y con el incremento en la concentración de glucosa y fructosa (Figura 46).

Productividad volumétrica en las fermentaciones realizadas con las cepas recombinante y nativa

)t - )/(tP - (P tofof

/PQp

En el presente trabajo, se observó una relación entre el aumento en la tasa de hidrólisis (1.82 gL-1h-1), la velocidad de consumo de sustrato (0.326 g glucosa L-1h-1; 0.43 g fructosa L-1h-1) y la productividad volumétrica de etanol (0,359g de etanol/L*h), la cual fue evidente a las 4 horas de fermentación.

Xylose

o

Xylose

Xylulose

Xylulose 5PPentose 

PO pathway

Embden-Meyerhof  Pathway

Ethanol

ATPADP

Requerimientos de la levadura para el crecimiento en residuos de lignocelulosa 

Xylose and glucose metabolic pathways in engineered xylose-utilizing S. cerevisiaeXylose and glucose metabolic pathways in engineered xylose-utilizing S. cerevisiae

Xylose

o

Xylose

Xylulose

Xylulose 5PPentose PO pathway

Embden-Meyerhof  Pathway

Ethanol

ATPADP

USER VECTOR

Xylose Isomerase and Xylulokinase overexpression in Saccharomyces cerevisiae

Xylose Isomerase and Xylulokinase overexpression in Saccharomyces cerevisiae

Vasquez Jorge A.; Siewers Verena; Roldao Antonio, Nielsen Jens

XII-5b-ScXKS-pPGK-pTEF-Xi-BS10764 bp

XI-Bs

Amp RpUC ori

XII-5-UP

Kl. URA3

Primer ccdB Rew

XII-5-Down

S.cer XKS

pPGK

pTEF

Swa I (1292)

Swa I (9248)

XII-5b-XKS-pPGK-pTEF-Xi-Cp10761 bp

XI-Cp

Amp RpUC ori

XII-5-UP

Kl. URA3

Primer ccdB Rew

XII-5-Down

S.cer XKS

pPGK

pTEF

Swa I (1292)Swa I (9245)

XII-5b-ScXKS-pPGK-pTEF-Xi-Cy10761 bp

Xi-Cy

Amp RpUC ori

XII-5-UP

Kl. URA3

Primer ccdB Rew

XII-5-Down

S.cer XKS

pPGK

pTEF

Swa I (1292)

Swa I (9245)

XII-5b-XKS-pPGK-pTEF-Xi-Pi10757 bp

XI-Pi

Amp RpUC ori

XII-5-UP

Kl. URA3

Primer ccdB Rew

XII-5-Down

S.cer XKS

pPGK

pTEF

Swa I (1292)Swa I (9241)

CEN.PK 113-5D. MAT a; ura3-52; HIS3; LEU2 TRP1; MAL2-8c; SUC2. Originated from CEN.PK113-7D. deleted in URA3.

XII-5b-XKS-Xi-Pi8875 bp

XI-Pi

XII-5-UP

Kl. URA3

Primer ccdB Rew XII-5-Down

S.cer XKS pPGK pTEFSwa I (387) Swa I (8336)

wt 1 2 3 4

Construct purification and yeast transformation

Wt. Construct1. Construct URA3-XKS-Xi-Pi2. Construct URA3-XKS-Xi-Cy3. Construct URA3-XKS-Xi-Bs4. Construct URA3-XKS-Xi-Cp

Selective media: SOD-URA

Fermentation in Shake flask  within YPX medium

YPX medium composition- Yeast extract 10g/L- Peptone 20g/L- Xylose 22g/L

Conditions- 100ml Shake Flask fermentation- Aerobic conditions.- 200 rpm.- 30°C.- 172 hours

Xylose consumption YPX mediumXylose consumption YPX medium

The best strain consuming xylose is that which carrying Clostridium phytophermentas Xilose Isomease. 20g/L of xylose were consumed in 96 hours under aerobic conditions using complex media YPX. It was observed the yeast strain carring Piromyces xilose isomerase consuming 7g/L of xylose at 172h

Fermentation in Shake flask  within YPX medium

Biomass production YPX mediumBiomass production YPX medium

YPX medium compositionYeast extract 10g/LPeptone 20g/LXylose 22g/L

Strains-CEN.PK 113-5D-Xi-Pi-CEN.PK 113-5D-Xi-Cy-CEN.PK 113-5D-Xi-Bs-CEN.PK 113-5D-Xi-Cp-CEN.PK 113-5D-Empty

It was observed higher O.D. in the strain carrying Cp Xilose isomease which one reach a kind of stationary phase at 144h. While that strain carrying Pyromyces XI approaches to an O.D. of 4 at 172 hours in aerobic conditions.

Fermentation in Shake flask  within YPX medium

Comp RT: 11.3min production YPX mediumComp RT: 11.3min production YPX medium

YPX medium compositionYeast extract 10g/LPeptone 20g/LXylose 22g/L

A maximum production of Compound with 11.3min of Retention time was observed at 96 hours in which the Xi-Cp strain which reached 1,4g/L, followed by Xi-Pi which produce 0,7g/L at 172 hours of aerobic fermentation

Xylulose-5-phosphate

PPPXKSXKS

Xylitol RT: 11.6

XIXI

Xylose

RT: 12.5

Xylulose

?

Possible pathway to Xylitol formation from xylulose

xylitol dehydrogenas

e 

Gracias