estrazione ed analisi dei lipidi lezione del 17- 5- 07
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Estrazione ed analisi dei lipidi
Lezione del 17- 5- 07
centrifuga
H2O/CH3OH/CHCl3 0,8 2 1
+
CELLULE o MEMBRANEin soluzione fisiologica
Estrazione dei lipidi
CH3OH
(Bligh & Dyer)
Agitazione per 15’
+ CHCl3
Agitazione per 15’
SISTEMA MONOFASICO
SN1
CHCl3 + H2O +
ESTRATTOLIPIDICO
pellet
CH3OH / CHCl3 / H2O 1 1 0,9
SISTEMA BIFASICO
+ H2O /CH3OH/ CHCl3
0,8 2 1
centrifuga
SN2
SN1+SN2
CH3OH+H2O
CHCl3
Cos’e’ la Cromatografia ?
La cromatografia e’ una tecnica che serve a separare i singoli componenti di una miscela omogenea.
E’ basato sulla diversa ripartizione di molecole tra una fase mobile (liquida o gassosa) ed una fase stazionaria (solida o liquida)
• Analisi qualitativa
• Analisi quantitativa
• PurificazioneComponentiMiscela
Differenti tipi di cromatografia
• Cromatografia liquida ( cromatografia su colonna, su strato sottile o TLC, e HPLC)– Fase stazionaria: gel di silice, allumina, etc.
– Fase mobile: solventi organici
– importanti proprieta’: polarita’
• Gas cromatografia– Fase stazionaria: un polimero impaccato o capillare.
– Fase mobile: gas inerte (Elio)
– importanti proprieta’: punto di ebollizione (evaporazione soluti)
Cromatografia su strato sottile (TLC)
Il gel di silice o di allumina (fase stazionaria) e’ deposto in strato sottile su una lastra di vetro. La silice e’ molto polare. La superficie dei granuli di silice è caratterizzata dalla presenza di gruppi silanolici (Si-OH) e di gruppi silossanici (Si-O-Si). Sui primi ha luogo l’interazione tra fase fissa e soluto
SiO
OH
O
O
SiO
SiO
OHO
OHO
Si Si Si
La silice è resa attiva dai gruppi silanolici ≡Si-OH. Questi, però, sono bloccati da molecole di acqua legate mediante legami idrogeno
SiOHO
H
H
SiOH
SiOH
+ SiSiO
+ H2O
Quindi, è necessario essiccare in stufa ( 180 °C) per eliminare le molecole di acqua, senza però superare i 300 °C, perché si avrebbe la condensazione interna con formazione nuovamente di gruppi silossanici
La fase mobile dovrà avere caratteristiche tali da competere, con il soluto, per l’adsorbimento sulla fase stazionaria. L’effetto della fase mobile è quello di differenziare la capacità dei vari soluti di essere adsorbiti. Un soluto molto polare interagisce fortemente con la fase fissa e, per far si che la fase mobile competa con il soluto, dovra’ anch’essa essere abbastanza polare.
Affinità di classi di composticon fasi stazionarie polari
Composto
Gruppo funzionale
forza di assorbimento crescente
Acidi
Alcoli
Ammine
Mercaptani
Aldeidi
Chetoni
Esteri
Eteri
Alcheni
Alcani
C
OH
O
OH
NH2
SH
C
O
H
C O
C
O
O R
O
RH
C C
H
R
fosfolipidi
R1, R2= catene acidi grassi non polari
Glicerolo, gruppi fosfato e X = parte polare
R O CH2C
O
CHOCR'
O H2C O P
O
O-
O CH2 C NH3+
H
COO-
FosfatidilserinaFosfatidiletanolammina
NH3+O
O-
O
POH2CO
R C O CH'
O
C CH2OR
CH2 CH2
Fosfatidilcolina
CH2O
O-
O
POH2CO
R C O CH
O
C CH2OR
'
CH2 N+(CH3)3
H
Fosfatidilinositolo
CH2O
O-
O
PO
OHOH
OH
OH
O
H
H
H
HH
H
CH
CH2
O
O
O
O
C
C R
R'
Cromatografia su strato sottile (TLC)
• Applicazione del campione
• Corsa cromatografica
• Visualizzazione
• Interpretazione dei risultati
“fronte del solvente” 1 cm.
A. Disegnare la linea di deposizione e il fronte del solvente con una matita
“linea di deposizione” 1 cm.
B. Risospendere i campioni in cloroformio
C. Depositare il campione mediante capillari o siringhe tipo Hamilton
1. Applicazione del campione
2. Corsa cromatografica
Lastra cromatografica
Camera di slivuppo
A. La lastra viene posta in una vaschetta chiusa saturata dai vapori del solvente di sviluppo
B. Il campione viene trasportato attraverso la fase stazionaria
C. Rimuovere la lastra dalla cameretta quando il solvente ha raggiunto la linea superiore
Solvente disviluppo
(fase mobile)
}
3. Visualizzazione dei risultati
A. Attendere l’evaporazione del solvente dalla superficie della lastra
C. Un metodo fisico si basa sull’osservazione della lastra alla luce ultravioletta (254 nm 365 nm). I metodi chimici consistono nello spruzzare sulla lastra reagenti cromogeni come soluzioni di H2SO4, di iodio, blu di molibdeno ecc..
B. Per rilevare la posizione dei componenti esistono metodi chimici e metodi fisici
4. Interpretazione dei risultati
A. Determinare il fattore di ritenzione (Rf) per ciascuna macchia.
B. I componenti incogniti vengono identificati per confronto con gli Rf degli standard .
miscela std std std incognita
distanza tra macchia e linea di deposizione
distanza tra il fronte del solvente e linea di deposizione Rf =
1
3
2
?
?
?
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
dS
dB
dA
dc
Rf componente A =
Rf componente B =
dA
dS
dB
dS
+ polare!
- polare!
componente B
componente A
component B
component A
Corsa cromatografica
Fronte del solvente
Linea di deposizioneMiscela incognita
Fronte del solvente
Linea di deposizione
I componenti meno polari presentano una minore interazione con la silice e migrano piu’ velocemente
I componenti piu’ polari stabiliscono maggiori interazioni con la silice e migrano piu’ lentamente
I componenti neutri migrano con il fronte del solvente
TLC preparativa (purificazione dei singoli componenti)
Estrazione dei lipidi(Bligh & Dyer)
Scraping della silice
Retta di calibrazione
microgrammi
0 2 4 6 8 10
area
mac
chia
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Analisi quantitativa