estrutura de membranas de polÍmeros … · materiais poliméricos bioabsorvíveis de maior...
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CONGRESSO BRASILEIRO DE ENGENHARIA E CIÊNCIA DOS MATERIAIS, 14., 2000, São Pedro - SP. Anais 57401
ESTRUTURA DE MEMBRANAS DE POLÍMEROS BIOABSORVÍVEIS
Barbanti, S.H. ; Zavaglia, C.A.C. ; Duek, E.A.R.
Depto. Eng. de Materiais (DEMA) - Faculdade Eng. Mecânica (FEM)
Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP
Cidade Universitária - CP 6122 - Campinas - S.P. - Brasil.
E-mail: [email protected] ; [email protected]
Dentre as atuais aplicações dos biomateriais a utilização de polímeros
bioabsorvíveis como suporte para cultura de células destaca-se como alternativa para
tratamento de lesões e perda de tecidos. O objetivo principal desse trabalho foi estudar
a degradação in vitro de estruturas tridimensionais de polímeros bioabsorvíveis. Foram
confeccionadas estruturas densas e porosas de poli(L-ácido lático) (PLLA) e poli(ácido
lático-co-ácido glicólico) (PLGA) e submetidas a degradação em meio de cultura HAM-
F10. Os resultados morfológicos indicam que as propriedades do material, como
porosidade, estão diretamente relacionadas com processo de síntese e que são alteradas
durante a degradação. As análises térmicas de DSC indicam que materiais preparados
com PLLA são semicristalinos e PLGA amorfos. Dessa forma, pelas análises realizadas,
as estruturas apresentam estabilidade térmica e morfologia adequada para a sua
utilização como suporte para cultura de condrócitos.
Abstract
Polyesters based on lactic and glycolic acid have proved safe for humans as suture
materials and are know to be biodegradable. They are now used or being developed for
many medical applications such as drug carriers in controlled drug release systems, as
orthopaedic implants or as support for cells culture. The aim of this study was synthesis,
degradation in vitro and characterization of dense and porous membranes of poly(L-
lactic acid) and poly(lactic acid-co-glycolic acid), a bioresorbable material. PLLA
membranes were obtained by casting of polymer solution in chloroform. For in vitro
study, samples were immersed in HAM-F10 cultured medium (37oC) for 2 weeks.
Degradation process was characterized by DSC (Differential Scanning Calorimetry) and
Scanning Electron Microscopy. DSC results showed that PLLA samples are
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semicrystallines and PLGA samples are amorphous. It was verified an increase in the
crystallinity degree for PLLA samples in function of degradation time and this is more
evident for dense membranes. Micrographies observed by SEM showed that the salt
addition provoked a porous material, and that the morphology of dense and porous
membranes of PLGA changed during the degradation process while PLLA membranes
remained unchanged. We can conclude that the prepared scaffolds present thermal
stability and morphology appropriated to be use as support for condrocites culture.
1. Introdução
O uso dos polímeros na medicina é antigo e tem se destacado em pesquisas e
aplicações nas últimas décadas. Polímeros tradicionais, como nylon, PMMA,
polietileno, e outros são utilizados como biomateriais em diversas aplicações como
dispositivos protéticos permanentes, como por exemplo, as lentes intra-oculares
artificiais, cateteres vasculares, e outros. As pesquisas nessa área continuam e visão
primordialmente a otimização, estabilidade e desempenho desses materiais in vivo.
(GRIFFITH, 2000)
Aplicações no qual o implante deva ser temporário sugere uma outra
característica no desenvolvimento de materiais: a de que possa ser degradado pelos
fluidos orgânicos e reabsorvidos pelo corpo sem nenhum efeito nocivo ao doente. Com
essas características tem-se os poli(α-hidróxi ácidos), representante de uma classe de
poliésteres sintéticos biodegradáveis, bioabsorvíveis e que satisfazem as condições de
um biomaterial.
Os polímeros biodegradáveis sofrem cisões hidrolíticas na cadeia principal
originando produtos na forma de oligômeros (ou monômeros) solúveis e não tóxicos. A
literatura (LI, 1999) tem mostrado que polímeros da classe dos poli(α-hidróxi ácidos)
apresentam excelente biocompatibilidade tanto na forma não degradada, como dos
produtos e subprodutos de degradação. A degradação poderá prosseguir por um
processo biologicamente ativo (por enzimas dos fluidos orgânicos) ou pela clivagem
hidrolítica passiva.
Como exemplos de polímeros pertencentes à classe dos poli(α-hidróxi ácidos)
temos principalmente materiais derivados dos monômeros: ácido lático e ácido
glicólico. Atualmente são materiais comuns no uso cirúrgicos e podem ser representados
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através da fórmula estrutural conforme a figura 1. Outros exemplos de polímeros
pertencentes à classe de poliésteres sintéticos são: poli(dioxanona) (PD), poli(ε-
caprolactona) (PCL), poli(β-hidróxibutirato) (PHB), e copolímeros destes.
No caso do ácido lático, a quiralidade do carbono α permite sintetizar compostos
enantiômeros, dando origem à uma família de polímeros: poli(D- ácido lático) (PDLA),
poli(L-ácido lático) (PLLA) e poli(D,L-ácido lático) em diferentes proporções. No caso
do poli(ácido glicólico)(PGA) não é possível a síntese de composto enantioméricos
devido a ausência de centros quirais. Neste trabalho enfocamos nosso estudo nos
materiais: poli(L-ácido lático) e no copolímeros de ácido lático e ácido glicólico, o
poli(ácido lático-co-ácido glicólico).
Materiais poliméricos bioabsorvíveis de maior aplicação nas áreas de saúde são aqueles
que quando degradados geram monômeros com as características dos ácidos do Ciclo de
Krebs. No ciclo, a degradação segue o processo de oxidação à ácido lático (para o PLA)
que por sua vez é convertido em ácido pirúvico (para PLA e PGA). Na presença da
acetil coenzima A ocorre a liberação de CO2 e consequentemente a decomposição em
citrato. Este citrato será então incorporado no ciclo dos ácidos tricarboxílicos,
resultando na eliminação, novamente de CO2 e de H2O (HOLLINGER, 1888)
Em se tratando do tempo de degradação, a taxa de hidrólise é influenciada por
vários fatores que variam desde a formulação do material (composição química e
estrutural) até o local de implante. Além do local de implante as diferenças na taxa de
degradação entre os polímeros bioabsorvíveis são atribuídas às diferenças no acesso da
água à ligação éster. Este acesso é relacionado diretamente com a hidrofobicidade dos
monômeros, a cristalinidade do material e as dimensões da amostra. O efeito
plastificante da água durante o processo de degradação conduz a alterações
morfológicas do material. A degradação é caracterizada geralmente pela perda de
massa, diminuição de Mw ou em muitos casos pelo empobrecimentos das suas
propriedades mecânicas, como a resistência à tensão. (GRIZZIA et al., 1995)
A cristalinidade de materiais bioabsorvíveis como o poli(ácido lático) tem sido
estudada e avaliada nas últimas duas décadas. Durante a degradação, a maior
susceptibilidade do ataque às ligações ésteres das regiões amorfas fazem aumentar o
percentual relativo de cristalinidade do material. Partículas cristalinas de PLA são
observadas em implantes in vivo mesmo após longos períodos de experimentação.
(VERT et al., 1994)
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Os implantes de polímeros apresentam grande potencial de uso, pois são,
geralmente, fáceis de produzir, manusear e com características mecânicas semelhantes
aos materiais biológicos. Devido as propriedades de biodegradação e bioabsorção novas
aplicações tem sido propostas. Fundamentalmente qualquer trabalho terapêutico em
implantes, liberação controlada de drogas ou mimetização de funções visa à
aproximação da estrutura sintética com a orgânica original. Idealmente a melhor terapia
é aquela em que o tecido, ou órgão, volte a desempenhar suas funções normais. Embora
muitos dispositivos protéticos artificiais estejam disponíveis para substituir tecidos,
como as próteses de junções (joelho, cotovelo), válvulas do coração, etc., poucos desses
dispositivos sintéticos podem substituir completamente todas as funções do tecido
original. Em situações clínicas mais severas somente o transplante do órgão retoma as
atividades orgânicas.
A técnica consiste no desenvolvimento de estruturas tridimensionais de
polímeros bioabsorvíveis utilizados como suporte para o crescimento celular. As fontes
são os materiais biológicos (tecidos) do próprio paciente, ou tecidos estrangeiros, e
estruturas tridimensionais sintéticas. A forma/estrutura e a composição dos materiais
utilizados como suporte estimulam e induzem o crescimento e a diferenciação celular.
Os desafios atuais estão relacionados no projeto e processamento dessas estruturas
tridimensionais de modo que o tecido formado seja o desejado, que a função original
seja restabelecida e que o procedimento seja reprodutível e de baixos custos.
(VACANTI et al., 1996).
Em se tratando da regeneração de tecidos, seja através do recrutamento de
células de tecido vizinho sadio, ou através de transplante de células sadias, é necessária
a existência de um substrato que sirva como suporte para o crescimento celular. Este
suporte pode ser de material reabsorvível, o qual desaparece à medida que o tecido se
regenere, ou de um material bioinerte, com características semelhantes as da matriz
extracelular.
A influencia da morfologia do material é relatada na literatura e diversas técnicas
têm sido utilizadas na preparação de estruturas porosas ou densas de PLA e PLGA com
aplicações na Engenharia de Tecidos. Os esforços de engenharia de tecido estão sendo
empreendidos atualmente para tipos específicos de tecido e as aplicações terapêuticas
em seres humanos começaram a ser avaliadas nos últimos anos. Diversos autores
relatam experimentos que visam à reprodução total ou parcial de estruturas anatômicas
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em aplicações e terapias de reconstrução, como por exemplo: reconstrução da
cartilagem na região nasal (PUELACHER et al.,1994), crescimento de condrócitos em
estruturas no formato de uma orelha humana (CAO et al., 1997), mamilo feminino
(CAO et al., 1998), válvulas e dutos urológicos (ATALA, 2000) e outros.
Compreender como a morfologia dos polímeros bioabsorvíveis se altera ao longo
da cultura de células representa um avanço no entendimento da interação entre o
material sintético e o crescimento e diferenciação celular.
A seguir é apresentada a metodologia utilizada neste trabalho e resultados
obtidos.
2. Metodologia - Materiais e Métodos
Para síntese das estruturas tridimensionais utilizou-se poli (L-ácido lático) (PLLA)
(Mw = 100 000) e poli(ácido lático-co-ácido glicólico) (50:50) (PLGA 50/50), ambos na
forma de pellets, fornecidos pela PURAC (Groninger – Holanda).
2.1. Síntese dos Suportes Tridimensionais: Foram confeccionados 2 tipos de
estruturas: Membranas Densas, Membranas Porosas
O procedimento a seguir foi realizado separadamente para ambos os materiais:
Membranas Densas: dissolveu-se o polímero sob agitação, em cloreto de metileno
(H2CCl2) (MERCK) na concentração 10% (w / v). A solução foi em seguida vertida
sobre placas de vidro, limpas e secas com etanol para evaporação do solvente.
Membranas Porosas: foram preparadas de modo análogo às densas, com o mesmo
solvente e mesma concentração em porcentagem em massa. Incluiu-se após a dissolução
do polímero, citrato trissódico di-hidratado (C6H5Na3O7.2H2O) (MERCK) com uma
granulometria do sal previamente estabelecida por um sistema de peneiras que
permitiram reter partículas na faixa de 180 a 250 µm. Após a secagem, as membranas
porosas foram lavadas, sob agitação, em água destilada por aproximadamente 20 horas,
e em seguida em álcool etílico por mais 2 horas. O etanol foi seco à temperatura
ambiente e as membranas submetidas a vácuo.
Para padronização do processo de evaporação do solvente, placas de vidro
contendo as soluções de polímero foram acondicionadas em uma cuba saturada de
solvente, conectadas à uma linha de ar comprimido (seco e filtrado por um sistema de
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sílica e lã de vidro) com vazão 0,01 nm3 / h. O controle da espessura pode ser obtido
pela variação da porcentagem em massa da solução polímero–solvente. Devido a
degradabilidade do material, todas as membranas foram acondicionadas em sacos
plásticos e armazenadas num dessecador sob vácuo até o momento da sua utilização.
Estudo da degradação In Vitro: Amostras de ambos os polímeros foram imersas em
meio de cultura HAM-F10 (Nutriente) e mantidas em banho a 37 °C. As análises foram
efetuadas em intervalos de 1 e 2 semanas de degradação (identificadas por: t=1, t=2). Ao
ser retirado o material foi lavado em água destilada, posteriormente em etanol, e seco a
vácuo.
2.2. Técnicas de Caracterização
2.2.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV): Analisou-se a superfície
superior, inferior e fratura das amostras de PLA e PLGA utilizando-se microscópio
eletrônico modelo JEOL JXA 840A. As amostras foram fraturadas em N2 líquido e
recobertas com Au-Pd com metalizador Sputer Coater BAL-TEC SCD 050.
2.2.2 Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC): A caracterização térmica foi
realizada através de dois aquecimentos no intervalo de varredura de 25 a 200 °C (com
taxa 10°C.min-1), sob atmosfera de Hélio. O equipamento utilizado foi o STA 409C da
NETZSCH – Geratebau Gmbh Thermal Analysis.
Para o cálculo do grau de cristalinidade das amostras, considerou-se a relação (CAM et
al., 1995):
%100(%)%100
×∆
∆−∆=H
HHdadeCristalini çãocristalizafusão
onde ∆Hfusão = Entalpia de fusão experimental (J/g);
∆Hcristalização = Entalpia de cristalização experimental (J/g);
∆H 100 % = 93,7 J.g-1 (Entalpia de fusão para um polímero
teoricamente 100% cristalino, ALI et al., 1993).
3. Resultados e Discussão
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3.1. DSC - Calorimetria Diferencial de Varredura
A técnica de Calorimetria Diferencial de Varredura foi útil para a caracterização
do material em estudo na determinação de variações da cristalinidade durante o processo
de degradação. Foram realizadas análises de DSC para membranas densas e porosas no
tempo t = 0, t=1 e t=2 semanas.
Tabela 1 - Dados de DSC para amostras de PLLA e PLGA degradadas e não
degradadas.
PLLA Membrana
Densa
Tempo
(semanas)
Tg ( oC ) Tfusão ( oC ) ∆∆∆∆Hfusão ( J/g
)
% Cristalinidade
0 63 178 35 37%
1 57 179 48 52%
2 58 180 72 77%
PLLA Membrana
Porosa
Tempo
(semanas)
Tg ( oC ) Tfusão ( oC ) ∆∆∆∆Hfusão ( J/g
)
% C
0 62 178 33 35%
1 61 178 37 39%
2 56 178 41 44%
PLGA Membrana
Densa
Tempo
(semanas)
Tg ( oC ) Tfusão ( oC ) ∆∆∆∆Hfusão ( J/g
)
% C
0 48 - - Amorfo
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1 46 - - Amorfo
2 47 - - Amorfo
PLGA Membrana
Porosa
Tempo
(semanas)
Tg ( oC ) Tfusão ( oC ) ∆∆∆∆Hfusão ( J/g
)
% C
0 49 - - Amorfo
1 48 - - Amorfo
2 47 - - Amorfo
As análises térmicas de DSC confirmam dados da literatura a respeito da
cristalinidade do material. De maneira geral, estruturas de PLLA são semi-cristalinas e
de PLGA são amorfas. (REED e GILDING, 1981).
Pela tabela 1 é possível observarmos que há diferença no comportamento entre
os materiais, PLLA e PLGA, mas não há diferença significativa que diferencie o tipo de
preparação das estruturas. Os valores para as temperaturas de transição vítrea,
cristalização e fusão não apresentaram diferenças em relação à estrutura do material.
Como conclusão preliminar a respeito dos dados fornecidos pela técnica de DSC
podemos afirmar que a metodologia empregada foi padronizada e gerou estruturas
semelhantes em relação às características térmicas.
Valores do grau de cristalinidade apresentados pela tabela 1 demonstram uma
nítida diferença entre as estruturas durante o processo de degradação.
Quando os dados são comparados entre os polímeros é possível verificarmos que
há um aumento no grau de cristalinidade do PLLA e que esse aumento é mais acentuado
em estruturas não porosas.
Quando comparados entre si, o PLGA e o PLLA não alteraram suas
características originais (t=0). O PLLA possui uma fase amorfa e uma cristalina,
identificada pela temperatura de transição vítrea e pela temperatura de fusão,
respectivamente. O PLGA, entretanto, é amorfo e durante o processo de degradação não
apresentou características cristalinas.
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O processo de degradação visto pelas fotos sugere um ataque preferencial das
regiões amorfas, sendo gradual e diretamente proporcional com o tempo de degradação
in vitro. Devido a configuração espacial das cadeias poliméricas, as moléculas de água
penetram com maior facilidade nas porções amorfas do material, dando início ao
processo de hidrólise preferencialmente nestas regiões.(DUEK et al. , 1999)
Outro fator a ser considerado em nossos resultados é a pequena variação nos
valores de Tg, explicado pelo efeito plastificante da água.
3.2. MEV - Microscopia Eletrônica de Varredura
A análise da Microscopia Eletrônica de Varredura permite caracterizar o material
segundo os aspectos morfológicos, relacionando o processo de preparação com a
estrutura-morfologia e consequentemente a biofuncionalidade. Foram realizadas
análises observando-se a morfologia das superfícies superior-inferior e da fratura das
membranas de PLLA e PLGA.
Os dados apresentados refletem um comportamento médio das estruturas
preparadas. Os aumentos e a barra de escala são indicadas na legenda de cada foto.
Membranas Porosas
Foto 1 – PLGA Porosa t=0 Foto 2 – PLLA Porosa t=0
Sup. Superior Fratura
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Foto 3 – PLGA Porosa t=1 Foto 4 – PLLA Porosa t=1
Sup. Superior Fratura
Foto 5 – PLGA Porosa t=2 Foto 6 – PLLA Porosa t=2
Sup. Superior Sup. Superior
Membranas confeccionadas com adição de sal (fotos 1 e 2) possuem morfologia
semelhante: as superfícies superiores são irregulares e repletas de concavidades. O
material continua a apresentar regiões globulares e aglomeradas, mas agora recobrindo
partículas de aproximadamente 200 µm. O material apresenta ainda pequenas fissuras
nessas superfícies indicando uma região de penetração da água no processo de
dissociação e retirada do sal adicionado na solução polímero-solvente. A fratura da
amostra reafirma a presença e a interconexão de poros em toda a espessura do material
verificando-se ainda que é heterogênea quanto ao seu formato e distribuição. O tamanho
dos poros e sua distribuição variaram conforme a granulometria de sal utilizado
(tamanhos de poros de aproximadamente 200 µm). A análise reafirma também que não
há partículas de sal presentes no material, indicando que o tempo de lavagem foi
adequado.
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Durante o processo de degradação as estruturas de PLLA não sofreram
modificações morfológicas significativas (foto 4 e 6). O tamanho dos poros permanece
inalterado. Entretanto as estruturas de PLGA sofrem modificações significativas. A
membrana perde a característica porosa, apesar de manter a superfície irregular (fotos 3
e 5).
Membranas Densas
Foto 7 – PLGA Densa t=0 Foto 8 – PLLA Densa t=0
Fratura Sup. Superior
Foto 9 – PLGA Densa t=1 Foto 10 – PLLA Densa t=1
Fratura Fratura
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Foto 11 – PLGA Densa t=2 Foto 12 – PLLA Densa t=2
Sup. Superior Sup. Superior
As micrografias obtidas das amostras de membranas de PLLA e PLGA, sem a
adição de sal, indicam um material denso com superfície superior irregular com
pequenas concavidades (fotos 7 e 8). Membranas de PLLA apresentam morfologia
superficial diferente das de PLGA, isto é: possuem aglomerados que se juntam em toda
a sua extensão. A análise da fratura das estruturas de PLLA (foto 10) confirma a
existência dos aglomerados esféricos que geram concavidades na superfície. A estrutura
interna das membranas (PLLA e PLGA) é compacta.
O processo de degradação é evidenciado morfologicamente para as estruturas de
PLGA, como pode ser observado pelas fotos 9 e 11 e indica que o processo ocorre
principalmente no interior do material, e não na sua superfície. Apesar dos dados de DSC
sugerirem que há degradação das estruturas de PLLA, através do aumento da
porcentagem de cristalinidade, esta não pode ser observada de forma significativa pelo
MEV.
4. Conclusões
A Microscopia Eletrônica de Varredura permitiu a caracterização morfológica do
material inicial e durante o processo de degradação. Através das técnicas foi possível
distinguirmos membranas densas e porosas, tamanho de poros e distribuição do
tamanho de poros. Membranas densas PLLA e PLGA não possuem poros internos, para
período zero de degradação. Membranas de PLLA, ao contrário do PLGA, possui
superfície superior irregular apresentando concavidades ao longo da superfície do
material. Membranas com a adição de sal são porosas internamente. A superfície do
material é densa mas as fraturas indicam majoritariamente poros dentro dos limite da
granulometria preestabelecida.
As análises térmicas de DSC mostram que os materiais são diferentes em relação
a estabilidade térmica e à cristalinidade. Estruturas de PLLA são semi-cristalinas e de
PLGA amorfas. Ambos os materiais possuem temperatura de transição vítrea (Tg)
acima da temperatura corpórea e podem ser utilizadas como suporte para a cultura de
células.
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O processo de degradação é mais acentuado morfologicamente nas estruturas de
PLGA, entretanto é evidenciado também no PLLA, através do aumento relativo da
cristalinidade do material.
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