estudio de la disponibilidad del transportador de …
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Profesor Patrocinante
Dra. Maite A. Castro Instituto de Bioquímica
y Microbiología
Facultad de Ciencias
Profesor Copatrocinante
Dr. Sebastián Brauchi Instituto de Fisiología
Facultad de Medicina
ESTUDIO DE LA DISPONIBILIDAD DEL TRANSPORTADOR
DE ÁCIDO ASCÓRBICO, SVCT2, EN LA MEMBRANA
PLASMÁTICA
Tesis de Grado presentada como parte
de los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y
Título Profesional de Bioquímico.
Magdalena Abigail Esparza Cerda
Valdivia – Chile
2012
''Queda prohibido no sonreír a los problemas,
no luchar por lo que quieres,
abandonarlo todo por miedo,
no convertir en realidad tus sueños.
Queda prohibido no buscar la felicidad,
no vivir tu vida con una actitud positiva,
no pensar en que podemos ser mejores,
sentir que sin ti este mundo sería igual''
Pablo Neruda
Agradecimientos
Existen muchas personas que directa o indirectamente han estado siempre apoyándome
de forma desinteresada pero con mucho corazón. Muy particularmente a la Dra. Maite Castro por
permitirme ser parte de su laboratorio, siempre estaré agradecida de su gentileza, apoyo total y
por facilitarme todo para llevar a cabo esta tesis. Todo el esfuerzo y logro conseguido en esta
investigación, siempre fue acompañado con dedicación, cariño y confianza, espero no haberla
defraudado. También agradecer a cada integrante del laboratorio, con quienes compartí alegrías,
penas, triunfos y risas en cada día de trabajo: Felipe Beltrán, María Paz Miró, Aníbal Acuña,
Macarena Solís, Pablo Moll, Alejandra Parra, Paulina Troncoso, Bryan Gunter y Adriana
Covarrubias.
Además quisiera agradecer al laboratorio de la Dra. Ilona Concha con quienes también compartí
durante el desarrollo de mi tesis, en especial a la Dra. Constanza Angulo y a Dr (c). Franz
Villarroel quienes me brindaron su apoyo académico y por sobre todo su amistad.
Finalmente agradecer a mi familia quienes siempre me dieron su apoyo y fuerza durante
todos estos años de estudios: Tomás y María mis padres, Tomasito mi hermano y Pascual. A
Carlos Kramm por ser más que un compañero de laboratorio, por todo su amor y cariño.
Agradecer a mis amigos que durante toda esta etapa y mis años estudios me dieron su confianza
y compañia. En especial a mis amigas del corazón Pamela Sotelo, Daniela y Paulina Ramirez,
siempre a mi lado.
Agradecimientos a las fuentes de financiamiento: los proyectos DID-UACh S-200745,
FONDECYT 1110571 & 1110906 y al Centro virtual DID-UACh CISNe (Centro de
Iinvestigación Sur-Austral en Enfermedades del Sistema Nervioso).
1. ÍNDICE DE CONTENIDOS.
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1. ÍNDICE DE CONTENIDOS. 1
2. ÍNDICE DE FIGURAS. 4
3. ÍNDICE DE ABREVIATURAS. 6
4. RESUMEN. 7
5. SUMMARY. 9
6. INTRODUCCIÓN.
6.1 Generalidades sobre vitamina C. 11
6.2 Distribución de vitamina C. 11
6.3 Transporte vitamina C.
6.3.1 Transporte facilitativo Vitamina C: Sistema de transportadores
facilitativos de hexosas, GLUT. 18
6.3.2 Transporte activo de Vitamina C: Sistema de co-transportadores
de Vitamina C y sodio, SVCTs. 19
6.4 Vitamina C y su relación con el Sistema Nervioso Central. 24
6.5 Modulación en la expresión de SVCTs. 26
7. HIPÓTESIS. 27
8. OBJETIVOS. 27
8.1 Objetivo General. 27
8.2Objetivos Específicos. 27
9. MATERIALES Y MÉTODOS.
9.1 Materiales. 28
1
9.1.1. Reactivos químicos. 28
9.2 Métodos.
9.2.1 Cultivos celulares. 30
9.2.1.1 Cultivo de la línea celular HEK293T y NG 108. 30
9.2.2 Tratamiento de placas de cultivo con poli-L-lisina. 30
9.2.3 Transfección en líneas celulares. 30
9.2.4 Ensayos de transporte. 31
9.2.5 Inmunofluorescencia en HEK293T. 31
9.2.6 Recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP). 32
9.2.7 Microscopía de Reflexión Total Interna (TIRM). 33
9.2.8 Ensayos de Biotinilación. 33
9.2.9 Separación electroforética de proteínas. 34
9.2.10 Transferencia de proteínas a membranas de PVDF. 34
9.2.11 Análisis de Western blot. 35
9.2.12 Transformación bacteriana y purificación plasmidial. 35
10.RESULTADOS.
10.1. Análisis de la expresión y funcionalidad del transportador de vitamina C
y sodio isoforma 2 (SVCT2). 36
10.2. Análisis del efecto de la exposición previa a sustrato sobre el transporte
de ácido ascórbico en células HEK293T. 38
10.3. Análisis de la recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo
(FRAP) en células HEK293T transfectadas con SVCT2-EGFP. 40
2
10.4. Análisis de la disponibilidad de SVCT2-EGFP a nivel de la membrana
plasmática en células NG-108 mediante microscopía de reflexión total interna
(TIRFM) y estudios de biotinilación. 44
10.5. Estudio del efecto de citocalasina D y óxido fenil arsino sobre el transporte
de ácido ascórbico en células HEK293T. 54
10.6. Estudio de la localización subcelular de SVCT2 frente a la exposición
aguda con ácido ascórbico e inhibidores de endo y exocitocis. 57
11. DISCUSIÓN 63
12. BIBLIOGRAFÍA. 74
3
2. ÍNDICE DE FIGURAS.
PÁGINA
Figura 1. Diferentes formas de la vitamina C en la naturaleza. 12
Figura 2. Biosíntesis de ácido ascórbico. 14
Figura 3. Contenido de ácido ascórbico en plasma y en varios
órganos de vertebrados. 17
Figura 4. Estructura y distribución de SVCTs en el cuerpo humano. 21
Figura 5. Distribución y metabolismo de vitamina C en sistema nervioso. 23
Figura 6: Análisis de expresión y funcionalidad de SVCT2 en células HEK293T. 37
Figura 7: Análisis del transporte de ácido ascórbico en células HEK293T previa
exposición a sustrato. 39
Figura 8. Microscopía confocal y ensayos de recuperación de fluorescencia
después del fotoblanqueo (FRAP) para medir movilidad de una
proteína en la membrana plasmática. 41
Figura 9. Análisis de la recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo
(FRAP) en presencia de ácido ascórbico en células HEK293T transfectadas
con SVCT2-EGFP . 43
Figura 10. Microscopía de reflexión total interna (TIRM). 45
Figura 11. Análisis del efecto de ácido ascórbico, citocalasina D y PAO en células
NG108 transfectadas con SVCT2-EGFP mediante (TIRM). 48
Figura 12. Análisis de la translocación de SVCT2 en respuesta a exposición
aguda a sustrato. 52
4
PÁGINA
Figura 13. Análisis del efecto de citocalasina D y PAO sobre el transporte de
ácido ascórbico en células HEK293T. 55
Figura 14. Análisis de inmunofluorescencia para la localización subcelular de
SVCT2, MCT1 y EEA1 en células HEK293T. 58
Figura 15. Análisis de la colocalización e histograma de distribución para
SVCT2, MCT1 y EEA1 en células HEK293T tratadas con ácido ascórbico. 59
Figura 16. Análisis de inmunofluorescencia para la localización subcelular de SVCT2,
MCT1 y EEA1 en células HEK293T frente a la exposición aguda y/o ácido
ascórbico, y/o citocalasina D y/o PAO. 62
Figura 17. Un aumento del ácido ascórbico extracelular es capaz de estimular un
incremento en la disponibilidad de SVCT2 en la membrana plasmática. 73
5
3. ÍNDICE DE ABREVIATURAS.
Asc: Ácido ascórbico.
AP-2: Adaptador de proteína tipo 2.
BHE: Barrera hemato-encefálica.
BSA: Albúmina de suero de bovino.
Cito D: Citocalasina D
DHA: Ácido deshidroascórbico.
DMSO: Dimetilsulfóxido.
DTT: 1,4-ditiotreitol.
EEA1: Marcador de endosoma temprano asociado a proteína 1.
FBS: Suero fetal de bovino.
FRAP: Recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo.
GFP: Proteína verde fluorescente.
GLUT: Transportador facilitativo de hexosas.
Km: Constante de Michaelis-Menten
MCT: Transportador de monocarboxilatos.
LCR: líquido cefalorraquídeo
PAO: Óxido fenil arsino.
PKC: Proteína kinasa C.
SNC: Sistema nervioso central
SVCT: Transportador de vitamina C y sodio.
TIRFM: Microscopía de reflexión total interna.
Vmax: Velocidad máxima.
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4. RESUMEN
La vitamina C es un importante antioxidante soluble en agua, concentrado en cerebro y
otros órganos. Siendo esencial para el mantenimiento de la fisiología humana ya sea actuando
como un cofactor enzimático en la biosíntesis de colágeno, carnitina, catecolaminas, o como un
antioxidante, reduciendo las especies reactivas del oxigeno a moléculas estables. En el organismo
humano, la vitamina C se encuentra principalmente reducida en la forma de ácido ascórbico, el
cual es capaz de ser adquirido por diferentes células gracias a la expresión de transportadores de
sodio y vitamina C (SVCTs). Hasta la fecha se conocen dos isoformas de este sistema de
transporte: SVCT1 y SVCT2, los cuales son expresados ampliamente en diversos tipos celulares
de mamíferos. En cerebro SVCT2 se expresa exclusivamente en neuronas, células gliales del
hipotálamo y células epiteliales de los plexos coroídeos. Las propiedades cinéticas y expresión de
SVCT2 han sido estudiadas en distintos tejidos y tipos celulares, pero no existe información de su
localización en la célula a nivel de la membrana plasmática.
La expresión de SVCT2 puede ser modulada por diversos estímulos como glucocorticoides,
factores de crecimiento, oxidantes y antioxidantes. Este mecanismo de adaptación ayuda a
mantener el equilibrio redox. Sin embargo, la existencia de mecanismos de modulación aguda de
la función o localización de este transportador en respuesta a estímulos locales es desconocida.
Bajo actividad sináptica glutamatérgica se desencadena la liberación de ácido ascórbico desde
compartimientos gliales, aumentando la concentracion de acido ascorbico extracelular cerebral,
lo que podria ser considerado como un estimulo local.
Con el motivo de analizar el efecto del aumento de ácido ascórbico extracelular, se
estudiaron cambios en la distribución subcelular y la disponibilidad del transportador en la
membrana plasmática en respuesta a la exposición aguda a su sustrato. En cultivos celulares
expresando SVCT2-GFP se evaluó la recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo
7
(FRAP) a modo de determinar las características del ambiente lipídico en el cual se encuentra
SVCT2 en presencia y ausencia de ácido ascórbico extracelular. Además, se midió la
disponibilidad de SVCT2 y SVCT2-EGFP en la superficie celular utilizando microscopía de
reflexión total interna, ensayos de biotinilación y ánalisis funcionales basados en el uso de
radioisótopos demostrando que SVCT2 es translocado hacia la membrana plasmática en
respuesta a la exposición aguda a su sustrato. Estos análisis fueron complementados con
inmunofluorescencia utilizando marcadores de distintos compartimentos subcelulares.
Adicionalmente, se utilizaron inhibidores de la exocitocis y endocitosis, citocalasina D y óxido
fenil arsina (PAO). Observándose en presencia de citocalasina D una disminución de la
localización de SVCT2 en la superficie celular después del estímulo con sustrato, y en presencia
de PAO se observó un aumento de ésta en las mismas condiciones.
Por consiguiente, estos resultados sugieren que SVCT2 es reciclado entre la superficie celular y
compartimentos intracelulares constantemente. Frente a un aumento de la concentración
extracelular de ácido ascórbico aumentaría la disponibilidad del transportador en la superficie
celular debido a un aumento de la translocación hacia la membrana plasmática y de una
disminución en la tasa de endocitosis. Esto se vuelve importante en órganos expuestos a
variaciones en las concentraciones locales de ácido ascórbico como el cerebro, permitiendo un
aumento en la eficiencia del transporte en específicas circunstancias fisiológicas.
8
5. SUMMARY.
Vitamin C is an important water-soluble antioxidant. It is concentrated in brain and other
organs. Vitamin C is essential for human physiology by acting as an enzymatic cofactor in the
biosynthesis of collagen, carnitine and catecholamines, or as an antioxidant, reducing the reactive
oxygen species to stable molecules. In the human body, vitamin C is found mainly in its reduced
form as ascorbic acid. Ascorbic acid is taken up through sodium and vitamin C transporters
(SVCTs). To date, only two isoforms of this transport system are known: SVCT1 and SVCT2.
They are expressed by several types of mammalian cells. In brain, SVCT2 is exclusively
expressed in neurons, hypothalamic glial cells and epithelial cells from the choroid plexus. The
kinetic properties and expression of SVCT2 has been studied in several tissues and cell types,
however no information exists about changes on its localization at plasma membrane.
The expression of SVCT2 can be modulated by diverse stimuli, such as glucocorticoids, growth
factors, oxidants and antioxidants. This mechanism of adaptation helps in maintaing the redox
state. However, acute mechanisms regulating the function or localization of this transporter in
response to local stimuli are unknown. Under glutamatergic synaptic activity, glutamate is able to
stimulate ascorbic acid release from glial compartments. The increased extracellular ascorbic acid
concentration could be considered a local stimulus.
In order to analyze the effect of an increased extracellular ascorbic acid concentration, we studied
changes in subcellular distribution and plasma membrane availability of this transporter in
response to an acute substrate exposure. We studied Fluorescence Recovery after Photobleaching
assays (FRAP) in cell cultures expressing SVCT2-EGFP to determine the characteristics of the
lipid environment in which SVCT2 is in absence or presence of extracellular ascorbic acid. Using
biotinylation assays, real-time studies with total internal reflection microscopy (TIRF) and
functional assays using radioisotopes we demonstrated SVCT2 translocation to plasma
9
membrane in response to extracellular ascorbic acid exposure. These analyses were
complemented with immunofluorescence analyses using markers for subcelullar compartments.
Finally, we used inhibitors of exocytosis and endocytosis, cytochalasin D and phenyl arsine oxide
(PAO) respectively. We observed a decrease of SVCT2 presence at plasma membrane in cells
preincubated with cytochalasin D. On the other hand, an increase of SVCT2 at plasma membrane
was observed when PAO was utilized.
Therefore, these results suggest that SVCT2 is constantly being recycled between the cell
surface and intracellular compartments. An increased extracellular ascorbic acid concentration
would cause an increase in exocytosis rate and a decrease in endocytosis rate of SVCT2 thus
inducing an increase on the availability of this transporter on the cell surface. This phenomenon
could be of importance in organs exposed to local changes of ascorbic acid concentrations, such
as the brain, responding with an increased vitamin C transport efficiency under specific
physiological circumstances.
10
6. INTRODUCCIÓN
6.1 Generalidades sobre Vitamina C.
La vitamina C, o ácido ascórbico, es una vitamina soluble en agua implicada en una
amplia variedad de reacciones bioquímicas en células y tejidos de la mayoría de los organismos
vivos (Corti et al., 2010; Hodges et al., 1969; Hodges et al., 1971; Englard et al., 1986). La
vitamina C es una lactona de seis carbonos con un peso molecular de 176,13 g/mol. Esta
molécula presenta 2 grupos ionizables con valores de pKa de 4,2 y 11,8, por lo cual, a pH
fisiológico (Aller C, Ehmann S, Gilman-Sachs A, et al. (1997)) dependiendo de su estado redox,
las dos formas moleculares en que se puede encontrar la vitamina C son: una reducida
denominada ácido ascórbico y otra oxidada llamada ácido dehidroascórbico (Kyrtopoulos et al.,
1991). Ambas se encuentran en equilibrio y presentan actividad biológica (Fennema, 1976),
(Figura 1). La principal forma de vitamina C encontrada en los organismos vivos es la forma
reducida (Schorah et al., 1996). La forma oxidada puede ser reciclada a su forma reducida por
distintos mecanismos enzimáticos dentro de la célula, dependientes (Himmelreich et al., 1998;
Ishikawa et al., 1998; Park y Levine, 1996) o independientes (Guaiquil et al., 1997; May et al.,
1998; Savini et al., 2000) de glutatión. En el caso de los mecanismos dependientes de Glutatión
(GSH), esto es por medio de una intervención enzimática (dehidroascorbato-reductasa, tiol-
transferasa o proteína-ditiol-isomerasa) que reduce el ácido dehidroascórbico a ácido ascórbico
(Montecinos et al., 2007). En aquellos casos donde la reducción es independiente de glutatión, las
células de mamíferos expresan la NADPH-dependiente de tiorredoxina reductasa y aldo ceto
reductasa (Linster y Schaftingen, 2007).
11
Figura 1. Diferentes formas de la vitamina C en la naturaleza. Las dos formas moleculares
principales de la vitamina C (ácido ascórbico y ácido dehidroascórbico) se encuentran en
equilibrio y ambas presentan actividad biológica. Dos radicales libres ascorbilos pueden generar
una molécula de ascorbato y una de ácido deshidroascórbico. Este último, es mucho menos
estable que el ascorbato, por lo que se hidroliza con gran facilidad para producir ácido 2, 3
dicetogulónico, que posteriormente puede degradarse por descarboxilación.
12
El ácido ascórbico es sintetizado a partir de glucosa en el hígado de la mayoría de los mamíferos
(Padayatty et al., 2003). Los cuyes, los murciélagos y los primates, incluidos los seres humanos,
no pueden sintetizarla (Kiuchi et al., 1982; Grunewald et al., 1993) debido a que carecen de la
enzima L-gulonolactona oxidasa (E.C. 1.1.3.8; Corti et al., 2010), que es esencial para la síntesis
de 2-ceto-l-gulonolactona precursor inmediato del ácido ascórbico (Figura 2).
13
Figura 2. Biosíntesis de ácido ascórbico. La mayor parte de los mamíferos sintetizan el ácido
ascórbico en el hígado, donde la enzima L-gulono-lactona oxidasa después de diversos pasos,
convierte la glucosa o galactosa en ácido ascórbico. Los humanos, algunos otros primates y los
cuyes no son capaces de sintetizar la L-gulono-lactona oxidasa debido a un defecto genético, y
son por tanto incapaces de sintetizar ácido ascórbico en el hígado.
14
El segmento de ADN que codifica para la oxidasa gulonolactona ha sufrido una mutación
sustancial, resultando en la ausencia de la enzima funcional (Nishikimi et al., 1994 y 1997), y por
lo tanto dependen de la dieta, especialmente en frutas y verduras para satisfacer las necesidades
de ácido ascórbico (Corti et al., 2010).
En humanos la vitamina C está involucrada en procesos enzimáticos como la biosíntesis de
colágeno (Peterkofsky et al., 1991) y de carnitina (Path, 1990), en la conversión del
neurotransmisor dopamina a noradrenalina (Rice, 2000; Harrison y May, 2009), en el
metabolismo de tirosina y amidación de hormonas peptídicas (Corti et al., 2010). El ácido
ascórbico también participa en la protección de los tejidos contra el daño oxidativo por radicales
libres puesto que es un poderoso antioxidante (May et al., 1998; Carr et al., 1999; Rice, 2000). En
este punto destaca su acción neuroprotectora (Wilson y Wilson, 1991; Reiter, 1995).
El cerebro es un órgano altamente oxigenado, lo que lo vuelve sensible a la producción
endógena de radicales libres. Este también contiene una alta proporción de ácidos grasos
insaturados susceptible a la peroxidación. Además, de catecolaminas que son extremadamente
vulnerables a la generación de radicales libres, los cuales producen estrés oxidativo. La relación
que existe en el cerebro entre el nivel de vitamina C y el estrés oxidativo, se debe a que las
neuronas parecen ser especialmente sensibles a los déficit de ácido ascórbico (Harrison et al.,
2009), tal vez porque poseen un metabolismo oxidativo de tasas 10 veces mayores a las demás
células que las acompañan (Wilson, 1997; Hediger, 2002). Esta sensibilidad neuronal es más
evidente cuando el suministro de ácido ascórbico es bajo en las condiciones en las que hay
exceso de estrés oxidativo, esto puede tener importancia para enfermedades neurodegenerativas
tales como Alzheimer, Parkinson y Huntington en las cuales el estrés oxidativo y el desequilibrio
con antioxidantes están fuertemente implicados en su etiología (Makar et al., 1994; Halliwell,
15
2006). De hecho, es sabido que en pacientes que padecen la enfermedad de Alzheimer se han
detectado bajos niveles de ácido ascórbico en plasma (Riviere et al., 1998) y líquido
cefalorraquídeo (Schippling et al., 2000).
6.2 Distribución de Vitamina C.
En los seres humanos, el ácido ascórbico es obtenido desde la dieta y absorbido a nivel
del intestino (Siliprandi et al., 1979), pasando a la circulación sanguínea. Cualquier exceso es
eliminado por filtración glomerular y es excretado por el riñón (Levine et al., 2011). La vida
media del ácido ascórbico es aproximadamente de 16 días en humanos, y se requieren alrededor
de 1 mg/Kg/día para mantener una reserva adecuada (Linster y Van Shaftingen, 2007). Análisis
de los niveles de ácido ascórbico revelarón que se puede acumular en diferentes tejidos y
órganos. Alcanzando la mayor concentración en las glándulas suprarrenales, glándula pituitaria,
los ojos (retina), el cerebro y el hígado, (Horning, 1975; Heike, 2007) (Figura 3). En la mayoría
de estos tejidos los altos niveles de ácido ascórbico son probablemente importantes para mantener
la integridad estructural a través de las fibras de colágeno, así como para funciones más
específicas, por ejemplo, la síntesis de hormonas, en procesos relacionados a la respuesta inmune,
en la modulación de la transmisión sináptica y la protección antioxidante (Heike, 2007).
16
Figura 3. Contenido de ácido ascórbico en plasma y en varios órganos de vertebrados. El
ácido ascórbico esta ampliamente distribuido en el cuerpo humano, con tendencia a concentrarse
en diversos órganos tales como glándula adrenal, intestino, hígado, músculo y cerebro.
17
6.3 Transporte de Vitamina C.
Existen dos mecanismos que permiten el transporte de las distintas formas redox de la
vitamina C al interior de las células: transporte activo, donde el ácido ascórbico es incorporado
mediante transportadores dependientes de sodio (SVCTs); y difusión facilitada, donde el ácido
dehidroascórbico es incorporado a la célula a través de los transportadores de hexosas (GLUTS),
y su posterior reducción intracelular.
6.3.1 Transporte facilitativo de vitamina C: Sistema de transportadores facilitativos
de hexosas, GLUTs.
Los transportadores facilitativos de hexosas, constituyen una familia de proteínas de
membrana de entre 45 a 55 kDa, de las cuales se han identificado 14 isoformas funcionales,
GLUT 1-14 (Doege et al., 2000; Ibberson et al., 2000; Vie-Wyle et al., 2001; Freeze, 2002).
Estas proteínas tienen 12 dominios transmembrana con el carboxilo y el amino terminal hacia el
espacio intracelular de la membrana plasmática (Uldry et al., 2001).
Su principal substrato es la glucosa (Thorens et al.,1988; Thorens et al., 2010) y hasta la
fecha de estas 14 isoformas se ha descrito que las isoformas GLUT1, GLUT2, GLUT3 y GLUT4
serian capaces de reconocer como sustrato alternativo al ácido dehidroascórbico (Vera et al.,1993;
Rumsey et al., 1997; Doege et al., 2001; Rogers et al., 2002.) y transportarlo a favor del gradiente
de concentración (Vera et al., 1993). Este transporte sería un mecanismo de baja afinidad con
valores de KM que van entre 1-4 mM. Además, es inhibido competitivamente por D-glucosa y por
citocalasina B (Vera et al., 1993; Vera et al., 1995; Rumsey et al., 2000; Nualart et al., 2003).
Para que este tipo de transporte sea efectivo, es necesaria la oxidación local de ácido
ascórbico (Himmelreich et al., 1998; Vera et al., 1998; Agus et al., 1999; Nualart et al., 2003),
puesto que en los organismos vivos prácticamente el 100% de este compuesto se encuentra en su
forma reducida, ácido ascórbico (Schorah et al., 1996). El ácido dehidroascórbico al ser
18
transportado sufre en el espacio intracelular una rápida reducción que mantendría un gradiente
favorable para la entrada de este compuesto (Corti et al., 2010). Sin embargo, es poco probable
que estos transportadores permitan la absorción de cantidades significativas de vitamina C en
condiciones fisiológicas normales, debido a la competencia por glucosa y por lo mencionado
anteriormente que la vitamina C está presente en el plasma esencialmente en su forma reducida
(Tsakaguchi et al., 1999; Corti et al., 2010).
6.3.2 Transporte activo de Vitamina C: Sistema de co-transportadores de Vitamina C
y sodio, SVCTs.
Los co-transportadores de vitamina C y sodio (SVCTs) permiten al ácido ascórbico cruzar
la membrana plasmática gracias a un gradiente electroquímico de sodio. Hasta la fecha, se
conocen dos isoformas de este sistema de transporte: SVCT1 y SVCT2 (Faaland et al., 1998;
Daruwala et al., 1999; Tsukaguchi et al., 1999; Castro et al., 2001) los cuales son
esteroespecíficos (Liang et al., 2001) y de alta afinidad (Tsukaguchi et al., 1999).
Ambos transportadores son estrictamente dependientes de iones de sodio, por lo cual sólo
permiten el ingreso de ácido ascórbico a la célula.(Wang et al., 1999; Daruwala et al., 1999). Al
reemplazar el sodio con otros iones como Li+,K+, colina o al utilizar un inhibidor específico de la
Na+.K+-ATP-asa, como Ouabaína, el cual corrompe la gradiente de sodio, se produce la
inhibición del transporte de ácido ascórbico (García et al., 2005; Reidling et al.,2008). Los
valores de Km descritos para SVCT1 fluctúan entre 100-300 μM (Wang et al., 1999, 2000),
mientras que para SVCT2 varían entre 20-100 μM (Duruwala et al., 1999; Castro et al., 2001).
Estos transportadores poseen 12 segmentos transmembrana, con sus dominios amino
(NH2-) y carboxilo (COOH-) terminal localizados en el citoplasma (Liang et al., 2001; Savini et
al., 2007; Subramanian et al., 2008; Harrison et al., 2009; Corti et al., 2010) así como múltiples
19
sitios para glicosilación y fosforilación (Liang et al., 2001; Subramanian et al., 2008) (Figura 4).
De acuerdo a su masa molecular se han registrado para las isoformas de ratón y de rata valores
entre 65 y 75 kDa (Wu et al., 2003; Jin et al., 2005; May et al., 2005). En cuanto a los SVCTs
humanos la información es controversial, pero según datos que derivan de la sobre expresión de
SVCTs en células humanas, los valores de tamaño se encontrarían dentro de los mismos valores
que en ratón y rata (Liang et al, 2002;. Lutsenko et al, 2004;.. Kang et al, 2007). Mediante
ensayos de Western blot para SVCT2 a partir de extractos proteicos obtenidos de neuronas,
plaquetas y melanoma, se ha observado una sola banda aproximadamente de 50-60 kDa. (Castro
et al., 2007; Li et al, 2003; Godoy et al., 2007; Savini et al, 2007). SVCT1 es una proteína de 604
residuos de aminoácidos que es expresado en células epiteliales de riñón, ovarios, próstata,
intestino e hígado (Faaland et al., 1998; Daruwala et al., 1999; Rajan et al., 1999). Por otra parte,
SVCT2 es una proteína de 592 residuos, que ha sido detectada en tejido cerebral endocrino y
ocular. En cerebro, SVCT2 se expresa en neuronas glutamatérgicas (Castro et al., 2001),
GABAérgicas (Tsakaguchi et al., 1999) y células ependimarias (García et al., 2005). Mientras que
en astrocitos, solo se ha demostrado la expresión de SVCT2 en células mantenidas en cultivo
(Astuya et al., 2005; Berger et al., 2000).
20
Figura 4. Estructura y distribución de SVCTs en el cuerpo humano. El transporte de ácido
ascórbico a través de la membrana plasmática de las células ocurre gracias a transportadores
específicos de ácido ascórbico. Se conocen 2 isoformas de este transportador, denominados
SVCT1 (producto del gen SLC23A1 en humanos) y SVCT2 (producto del gen SLC23A2 en
humanos), y se encuentran ampliamente distribuidos en el cuerpo humano. Adaptación de Savini
et al., 2007.
21
Es posible que ambos mecanismos de transporte, SVCT y GLUTs, sean utilizados en las
células neuronales para mantener altas concentraciones de ácido ascórbico intracelular. Ya que
durante la propagación del impulso nervioso, se produce la activación metabólica neuronal
necesaria para restituir los potenciales de reposo. Esto se acompaña de la producción de especies
oxidantes producto tanto del metabolismo mitocondrial acelerado, como del metabolismo de los
propios neurotransmisores. Por este motivo, las células neuronales deben adquirir constantemente
ácido ascórbico de manera de mantener niveles adecuados de antioxidantes. Puesto que los
GLUTs son transportadores del tipo facilitativo, es posible especular que SVCT2 contribuye en
mayor medida a la acumulación de ácido ascórbico en neuronas (Figura 5).
22
Figura 5. Distribución y metabolismo de vitamina C en sistema nervioso. El ácido ascórbico
ingresa a la sangre gracias a la expresión de SVCT1 a nivel del intestino. Luego puede
distribuirse a otros órganos, tales como el cerebro gracias a la expresión de SVCT2. Las células
neuronales adquieren ácido ascórbico puesto que expresan SVCT2. El ácido ascórbico oxidado a
ácido dehidroascórbico en estas células puede ser liberado al espacio extracelular a través de
transportadores facilitativos de hexosas, GLUTs. Las células gliales captarían este ácido
dehidroascórbico y lo reducirían a ácido ascórbico gracias al alto contenido de glutatión que
poseen estas células. Adaptado de Hediger, 2002.
23
6.4 Vitamina C y su relación con el Sistema Nervioso Central.
La concentración de ácido ascórbico en el sistema nervioso central alcanzán una
concentración promedio de 2-10 mM, varias veces superior a la encontrada en el plasma que
alcanzaría los 40-60 μM (Spector y Lorenzo, 1973; Rice, 2000; Harrison et al., 2009) .Una vez en
el líquido cefalorraquídeo (LCR), el ácido ascórbico parece entrar en el intersticio del cerebro por
difusión, ya que en éste las concentraciones de ácido ascórbico intersticial van aproximadamente
desde 200 – 400 μM, similar a lo observado en LCR (Schenk et al., 1982; Miele et al., 1996;
Harrison et al.,2009). El nivel de retención de ácido ascórbico en el cerebro es casi constante, en
condiciones de déficit de vitamina C (escorbuto), se observan pérdidas diarias menores al 2% de
la concentración total del cerebro (Rice, 2000).
Las funciones del ácido ascórbico en el sistema nervioso y el cerebro son numerosas, una
de las más reconocidas es su acción antioxidante, donde trabaja sinérgicamente con otros
antioxidantes, como la vitamina E y el glutatión, protegiendo del daño por estrés oxidativo
causado por radicales libres (Harrison et al., 2010). En el cerebro, los astrocitos son los
encargados de colaborar con el metabolismo de las neuronas y proteger a éstas, además de estar
implicados en la función de la barrera hemato-encefálica (Fields y Stevens-Graham, 2002).
También están presentes en las terminaciones sinápticas y en los nódulos de Ranvier (Fields y
Stevens-Graham, 2002) . Estos pueden tomar ácido dehidroascórbico a través de GLUT1, y
reducirlo a ácido ascórbico para luego guardarlo como antioxidante intracelular o liberarlo al
líquido extracelular (Korcok et al, 2003; Wilson y Dragan, 2005) (Figura 5). De este modo, el
reciclaje de ácido ascórbico por parte de los astrocitos lleva a la sustitución de ácido
dehidroascórbico extracelular por ácido ascórbico, evitando el efecto tóxico directo de ácido
dehidroascórbico (Wilson, 2002). La vitamina C también puede actuar como un neuromodulador,
afectando la neurotransmisión mediante el bloqueo de la unión de algunos neurotransmisores
24
como acetilcolina, dopamina y glutamato, a sus receptores específicos (Todd et al., 1988;
Majewska et al., 1990a, 1990b). Además, se ha descrito capaz de modular los sistemas de
liberación y captación de neurotransmisores (Levine et al., 1985) y actuando como cofactor en la
síntesis de los mismos. También se ha descrito que el ácido ascórbico promueve la formación de
mielina en las células de Schwann (Eldridge et al., 1987).
Se ha demostrado que un aumento de la concentración extracelular de ácido ascórbico se
produciría en respuesta a actividad cerebral, (Boutelle et al., 1898; Ghasemzadeh et al., 1991;
Rebec et al., 1994) y que este flujo de ácido ascórbico estaría directamente relacionado con la
actividad de neuronas glutamatérgicas (O'Neill et al., 1984; Ghasemzadeh et al., 1991). Los
astrocitos desempeñarían un papel fundamental en la liberación de ácido ascórbico en respuesta a
glutamato (Wilson., et al 2000; Portugal et al., 2009). Por lo tanto, bajo episodios de actividad
sináptica existiría un aumento en el flujo de ácido ascórbico desde astrocitos hacia las neuronas
(Castro et al., 2007). Esto sería fundamental para que las neuronas adquieran poder antioxidante
en momentos de alta producción de radicales libres como lo es la neurotransmisión. Puesto que la
KM de SVCT2 expresado en neuronas se ha descrito entre 20 y 100 mM y que la concentración
de ácido ascórbico extracelular cerebral en episodios de reposos se ha estimado en 300 mM, es
posible predecir que los transportadores SVCT2 neuronales estarían todo el tiempo saturados. Por
lo tanto, para que exista un aumento en el flujo de ácido ascórbico desde las células gliales hacia
las neuronales debieran existir mecanismos que activen a estos transportadores (modificando su
afinidad por ejemplo) o que aumenten la disponibilidad de este transportador en la membrana
plasmática
25
6.5 Regulación de la disponibilidad de SVCT2.
Se ha demostrado que la expresión de los transportadores SVCTs puede ser modulada por
estímulos tales como glucocorticoides, factores de crecimiento, agentes oxidantes y antioxidantes
(Fujita et al., 2001; Savini et al., 2007), constituyendo mecanismos de respuestas adaptativas
frente al desbalance óxido-reducción (redox). Tanto in vitro como in vivo se ha observado un
mecanismo de control transcripcional de la actividad de SVCTs por hormonas y moléculas de
señalización celular. Por ejemplo, los niveles de mRNA de SVCT2 se incrementan en presencia
de suero fetal de bovino y un factor de crecimiento epidermal en una línea celular humana de
trofoblastos (Biondi, 2007). Del mismo modo, se ha observado un fenómeno similar en cultivos
de astrocitos de rata en presencia de elevaciones del AMP cíclico (Siushansian et al., 1997;
Korcok et al., 2000; Corti et al., 2010). Se ha observado también que el mRNA de SVCT2 es
sobre expresado posteriormente a una lesión por isquemia cerebral (Berger, 2003).
Sin embargo, considerando que la propagación del impulso nervioso lleva milisegundos,
la modulación a nivel de expresión génica no sería capaz de responder cómo las neuronas podrían
aumentar su capacidad de transporte de ácido ascórbico bajo condiciones de actividad sináptica.
Se ha descrito que existen transportadores capaces de reciclar constitutivamente desde y
hacia la membrana plasmática como por ejemplo el transportador de aminoácidos excitatorios 1
(EAAC1, (González et al., 2007) y el transportador de GABA 1 (GAT1, Bernstein y Quick, 1999)
inducidos por ciertas moléculas y sustratos (Davis et al., 1998; Gonzáles et al., 2002; Bernstein y
Quick, 1999).
Por este motivo, en el presente trabajo se plantea como hipótesis que la localización
subcelular del transportador SVCT2 varia en respuesta a un aumento agudo de la
concentración extracelular de ácido ascórbico.
26
Para demostrar esto, se pretende estudiar cambios en la distribución subcelular o un
aumento de la disponibilidad del transportador en la membrana plasmática, en respuesta aguda a
sustrato.
7. HIPÓTESIS.
La localización subcelular del transportador SVCT2 varía en respuesta a un aumento
agudo de la concentración extracelular de ácido ascórbico.
8. OBJETIVOS.
8.1 Objetivo General.
Estudiar cambios en la distribución subcelular o un aumento de la disponibilidad del
transportador en la membrana plasmática, en respuesta aguda a ácido ascórbico.
8.2 Objetivos Específicos.
1.a. Estudio de la localización en tiempo real de SVCT2 en la vecindad de la membrana
plasmática y los cambios de la movilidad relativa de estas moléculas.
1.b. Estudios utilizando microscopía de reflexión total interna y ensayo de la recuperación
de la fluorescencia después del fotoblanqueo.
1.c. Ensayos de biotinilación.
2. Estudios de la funcionalidad de SVCT2 frente a la exposición a sustrato. Ensayos
cinéticos basados en el uso de radioisótopos.
3. Estudio de los cambios en la localización subcelular de SVCT2 frente a la exposición a
sustrato. Inmunofluorescencia indirecta utilizando marcadores membrana plasmática y de
endosomas temprano.
27
9. MATERIALES Y MÉTODOS
9.1. MATERIALES
9.1.1. REACTIVOS QUÍMICOS
De Sigma Chemical Co. (USA) se obtuvieron los siguientes reactivos: azul de
Coomassie G-250, poli-L-lisina (peso molecular >350kDa), D-(+)-glucosa, sacarosa, NP40,
cloruro de colina, Histochoice (fijador de tejido), ioduro de propidio, citocalasina B (cito B),
citocalasina D (cito D), óxido fenil arsino (PAO), L-ácido ascórbico (Asc), Tritón X-100, rojo
fenol y Tripan Blue.
De Merck & Co, Inc. (Alemania) se obtuvieron los siguientes reactivos: cloruro de
mercurio II, ácido clorhídrico, cloruro de potasio, alcohol metílico, alcohol etílico, fosfato diácido
de sodio, fosfato dihidrógeno de potasio, acrilamida, bis acrilamida, alcohol isopropílico,
hidróxido de sodio.
De Millipore Co. (USA) se obtuvo el anticuerpo anti MCT1.
De Winkler Ltda. se adquirió albúmina de suero de bovino (BSA), glicina, Tris,
carbonato de sodio, dodecilsulfato de sodio (SDS), persulfato de amonio, cloruro de sodio,
cloruro de calcio, cloruro de magnesio, reactivo de Bradford, tampón de carga de proteínas 2X.
De Gibco-BRL Laboratorios Life Technologies, Inc. (USA) se adquirió: tripsina-
EDTA, L-glutamina, penicilina/estreptomicina/fungizona, OPTIMEM-I.
De Hyclone (USA), se obtuvo medio de cultivo Dulbelco ́s Eagle modificado enriquecido con F-12 (DMEM-F12) y Vs Eagle modificado
enriquecido con F-12 (DMEM-F12) y suero fetal bovino (FBS).
De Santa Cruz Biotechnology (USA), se obtuvieron los siguientes anticuerpos: anti
SVCT2 (sc-9927) y anti EEA1 (sc-33585).
De INVITROGEN Corporation (USA), se obtuvieron los siguientes anticuerpos: anti-
IgG de cabra conjugado a Alexa flúor 568, anti IgG de pollo conjugado a Alexa flúor 488 y anti
28
IgG de conejo conjugado a Alexa flúor 633. De DAKO (USA) se adquirió medio de montaje
para fluorescencia.
De Pierce Biotechnology, Inc. (USA) (Thermo Scientific), se adquirieron los
anticuerpos secundarios conjugados a peroxidasa, anti-IgG de ratón, anti-IgG de cabra y anti-IgG
de conejo, reactivo ECL para quimioluminiscencia, cocktail de inhibidores de proteasas 100X y
Sulfo-NHS-SS-Biotin para ensayos de biotinilación.
De MBI Fermentas (USA), fue obtenido el estándar de peso molecular preteñido para
geles de poliacrilamida-SDS. De MO Bio Lab, Inc se obtuvo medio LB.
De bioWORLD (USA), se adquirió TEMED.
De Calbiochem, EMD Chemicals Inc (USA), se adquirió Tween 20 y β-mercaptoetanol.
el análogo radioactivo 1-14C-L-ácido ascórbico (14C-AA) en Perkin Elmer Inc, (USA).
De National diagnostics (USA) Ecoscint, se adquirió el líquido de centelleo y viales para
radiactividad.
Finalmente los equipos utilizados fueron los siguientes: pH metro WTW Inolab pH720,
balanza precisa AND GR-200, cámara de Neubauer VWR, gabinete de cultivo NuaireTM class II
UN-425-600-E, incubador NuaireTM DH Autoflow, baño termorregulado Memmert, centrífuga
SIGMA 2-16PK, centrífuga SIGMA 1-14, contador de Centelleo Perkin Elmer Tri-Carb 2910 TR,
microscopío confocal OLYMPUS FLUOVIEW FV100, microscopío invertido OLYMPUS
CKX41, microscopío OLYMPUS IX70 , fuente de poder Bio-Rad Power PacTM basic, agitador
magnético IKA RH basic 2, sonicador Ultrasonic Homogenizer 4710 Cole Parmer instruments
Co, Espectrofotómetro Thermo Scientific Evolution 60, Sistema de electroforesis Mini proteanR
Tri-Carb 1600 TR, Freezer -80°C Foma Scientific Bio- freezer 8425, Freezer -20°C Consul,
Refrigeradores Fensa y Whirlpool, NANODROP.
29
9.2 MÉTODOS
9.2.1 CULTIVOS CELULARES.
En todos los casos las células fueron cultivadas en incubador a 37º C y en un ambiente 5%
de CO2.
9.2.1.1 CULTIVO DE LA LÍNEA CELULAR HEK293T y NG108.
Las líneas celulares HEK293T (ATCC® CRL-11268TM) y NG108 (ATCC® HB-
12317TM) fueron cultivadas en medio DMEM-F12 suplementado con FBS 10%, penicilina 50
U/ml, estreptomicina 50 mg/ml, fungizona 50 ng/ml y L-glutamina 2 mM. Además las células
NG108 fueron suplementadas con HAT (concentración final: 0.1 mM Hipoxanthina, 400 nM
Aminopterina, 0.016 mM Thymidine). Para su uso las células fueron mantenidas en un 80% de
confluencia para posteriormente ser sembradas.
9.2.2 TRATAMIENTO DE PLACAS DE CULTIVO CON POLI-L-LISINA.
Las respectivas placas de cultivo fueron tratadas con una solución 0.01% de poli- l-lisina
(peso molecular > 350 kDa) durante 20 minutos en estufa a 37º C y luego fueron lavadas 3 veces
por periodos de 10 minutos con agua estéril.
9.2.3 TRANSFECCIÓN DE LINEAS CELULARES.
Las transfecciones para SVCT2-EGFP se realizaron con Lipofectamina 2000. Las células
fueron sembradas en placas de cultivo de 40 mm y mantenidas en medio sin antibióticos por 12
horas antes de la transfección. Para la transfección se utilizó un tubo con 250 μl de OPTIMEM-I
y 1,0 μg del plasmidio correspondiente, y un segundo tubo con 100 μl de OPTIMEM-I y 7 μl de
Lipofectamina 2000. Después de 12 horas en cultivo se procedió a cambiar medio en ausencia de
antibióticos. Las células fueron utilizadas 12-48 horas post -transfección.
30
9.2.4 ENSAYOS DE TRANSPORTE
Para los experimentos de transporte las respectivas células se sembraron en placas de
cultivo de 12 pocillos previamente tratadas con poli-L-lisina a una densidad de 0,1–0,2 x 106
células por pocillo. Previo a cada ensayo, se seleccionaron bajo microscopio sólo aquellos
pocillos con densidad celular uniforme. Estas fueron tratadas con los estímulos correspondientes
de ácido ascórbico y/o drogas y posteriormente se realizaron los ensayo de captación en 500 ul de
solución de incubación ( (Hepes 15 mM, NaCl 135 mM, KCl 5 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 0,8
mM, pH 7,4)) conteniendo 0.1 a 0.4 uCi de ácido-L-14C-ascórbico. La reacción fue detenida con
una solución de incubación fría (4ºC) conteniendo HgCl2 0,2 mM. Luego, las células fueron
tratadas con tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, SDS 0,2%) y el lisado celular fue cargado
en un vial que contenía líquido de centelleo biodegradable Ecoscint. La radioactividad
incorporada se cuantificó mediante un contador de centelleo líquido. Todos los ensayos utilizando
radioisótopos fueron realizados de acuerdo a las medidas de bioseguridad del “Manual de
Normas de Bioseguridad” de CONICYT de 2008. Los residuos contaminados fueron
almacenados en bodegas especiales destinadas para ello en las instalaciones del PAAC (Proyecto
de Administración Ambiental Corporativo), de acuerdo al Manual de Procedimiento para el
Manejo de Residuos de la UACh.
9.2.5 INMUNOFLUORESCENCIA DE CÉLULAS HEK293T.
Las células fueron cultivadas sobre cubreobjetos tratados con poli-L-lisina. Estas fueron
tratadas con los correspondiente tratamientos, en presencia o ausencia de ácido ascórbico y/o
drogas (citocalasina D y óxido de fenil arsina), para luego ser fijadas con Histochoice. Se
permeabilizaron las membranas celulares con Tritón X-100 al 0,3% en PBS 0,1 M para facilitar
la entrada de los anticuerpos que reconocían epitopes intracelulares. Se utilizó una solución de
bloqueo (BSA 1% en PBS 0,1M) por 1 hora a temperatura ambiente y posteriormente se incubó
31
con los diferentes anticuerpos por toda la noche en cámara húmeda a 4ºC. Como anticuerpos
secundarios se ocuparon anti-IgG de pollo, cabra y conejo conjugado con Alexa Flúor 488, 568 Y
633 respectivamente, en una dilución de 1:200 en solución de bloqueo por 2 horas a temperatura
ambiente. Las muestras fueron montadas sobre portaobjetos de vidrio usando medio de montaje
para fluorescencia DAKO y visualizadas en un microscopío confocal invertido FluoView
FV1000.
9.2.6 RECUPERACIÓN DE LA FLUORESCENCIA DESPUÉS DEL
FOTOBLANQUEO (FRAP).
Las células previamente transfectadas y expresando SVCT2-EGFPs se visualizaron en un
microscopio confocal OLYMPUS Fluoview 1000. Luego de los tratamientos correspondientes
con ácido ascórbico y/o drogas fueron fotoblanqueadas utilizando áreas específicas de un tamaño
alrededor de 0.18±0.06 nm2. El fotoblanqueo se llevo a cabo utilizando las líneas de laser de 488,
515 y 633 nm al 100% durante aproximadamente 7 s . Los datos experimentales fueron tratados
para corregir el fotoblanqueo natural normalizándolos a una intensidad de fluorescencia pre-
blanqueo Fi=1, y ajustados a la ecuación:
F(t) = 100*[F0 + F∞(t/t1/2)/(1+t/t1/2)] (Ec. 1)
Donde F0 corresponde la intensidad de fluorescencia inmediatamente después del
fotoblanqueo, F∞ es la intensidad en la asíntota de la recuperación de la fluorescencia, t es el
tiempo requerido para la recuperación de la fluorescencia y t1/2 es la mitad de tiempo para la
recuperación de la fluorescencia (Kenworthy, 2007).
La fracción móvil (Mf), se calculó a partir de los datos obtenidos de la normalización (Ec. 1)
según la ecuación,
Mf = (F∞-F0)/(Fi-F0) (Ec.2) (Kenworthy, 2007).
32
9.2.7 MICROSCOPÍA DE REFLEXIÓN TOTAL INTERNA (TIRM)
Las células expresando SVCT2- EGFP se visualizaron en un microscopío de TIRM
basado en objetivo. Se utilizó un láser de diodo de 473 nm en estado sólido que está enfocado en
una fibra óptica de modo único y es transmitida por la entrada de iluminación trasera de un
microscopio Olympus IX70. La luz emitida por el láser se refleja en un espejo dicroico doble
(Z488/532RPC; Chroma Tech) y pasa a través de un objetivo de gran apertura numérica (60x,
N.A. 1,45, aceite; Olympus) y es reflejado internamente por completo por la interfase vidrio-
agua. Bajo estas condiciones experimentales, los objetos fluorescentes se encontraron dentro de
250nm desde la interface vidrio-agua (Brauchi et al., 2008). Luego de la incubación con ácido
ascórbico y/o drogas se registraron series de 100 cuadros de 100 ms de exposición por cuadro y
se tomaron registros de la misma forma a los 5, 10 y 15 minutos desde el estimulo, ya sea con
ácido ascórbico o con las drogas ya antes mencionadas.
9.2.8 ENSAYOS DE BIOTINILACIÓN.
Los ensayos de biotinilación se realizaron como fue descrito por Zambrano et al. 2010.
Las placas confluentes de 60 mm fueron cambiadas a tampón de incubación e incubadas con los
tratamientos correspondientes de ácido ascórbico y/o drogas. Luego fueron lavadas en PBS (pH
8,0) a 4 °C y se les agregó 240 ul de Sulfo-NHS-SS-Biotina 10mM (Thermo Scientific,
Rockford, IL, USA). Se incubaron durante 30 minutos y se lavaron tres veces en PBS 0,1M (pH
8,0) a 4º C. Las células marcadas se homogeneizaron en 200 ul de buffer A con Tritón X-100 y
luego fueron precipitadas con 40 ul de proteína Neutravidina (Thermo Scientific, Rockford, IL,
USA) durante dos horas a temperatura ambiente. El complejo unido a la resina se resuspendió en
tampón de muestra para SDS-PAGE.
33
9.2.9 SEPARACIÓN ELECTROFORETICA DE PROTEÍNAS.
Las muestras de proteínas fueron separadas electroforéticamente en geles de
poliacrilamida al 10%. El gel separador y el espaciador se prepararan a partir de una solución de
acrilamida:bisacrilamida 30:0,8%. El gel separador se preparo con una concentración final de
poliacrilamida de 10% conteniendo Tris (pH 8,8) 375 mM; SDS 0,1%, persulfato de amonio
0,04% y TEMED 0,03%. Mientras que el gel espaciador se preparó con una concentración final
de poliacrilamida de 3,8% incluyendo Tris 125 mM (pH 6,8), 0,1% SDS, 0,01% persulfato de
amonio y 0,04% TEMED. Se tomaron muestras obtenidas en la biotinilación y se les agregó
tampón carga 2X Winkler (Tris 100 mM, 2-mercaptoetanol 2%, SDS 4%, glicerol 20%, azul
bromofenol 0,2%, pH 6,8) Las muestras fueron cargadas en el gel realizándose la electroforesis a
90 V por 2 horas en tampón de corrida (Tris 25 mM, glicina 190 mM, SDS 0,1%, pH 8,3). Las
proteínas separadas fueron transferidas a membranas de PVDF.
9.2.10 TRANSFERENCIA DE PROTEÍNAS A MEMBRANAS DE PVDF.
Finalizada la electroforesis, las muestras fueron electrotransferidas a membranas de
PVDF (difluoruro de polivinildeno; 0,45 micrones de poro, 100-145 μm de espesor). Sobre una
esponja embebida en tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 190 mM, SDS 0,1%, metanol
20%, pH 8,3) se depositó secuencialmente: un trozo de papel de filtro (Whatman n° 1), la
membrana de PVDF (previa activación de la membrana en metanol por 15 segundos), el gel a
transferir, otro papel de filtro y luego otra esponja embebida en el misma tampón. Esto se colocó
en una cámara de electrotransferencia conteniendo el tampón mencionado y se aplicó una
intensidad de corriente de 400 mA por 1 hora. Una vez cumplido el tiempo la membrana se dejara
secar a temperatura ambiente. Para verificar el buen resultado de la transferencia, el gel fue
teñido con solución de azul de Coomassie (30% metanol y 10% ácido acético) durante tres horas,
y luego desteñido en una solución que contiene 30% de metanol y 10% de ácido acético.
34
9.2.11 ANÁLISIS DE WESTERN BLOT.
Las membranas de PVDF fueron incubadas con los respectivos anticuerpos primarios
diluidos 1:1000 – 1:2000 en tampón anticuerpo (BSA 1%, Tween-20 0,3% en PBS 0,1 M pH 7,4)
por 10 horas en agitación constante a temperatura ambiente. Posteriormente, las membranas se
lavaron 3 veces con PBS-Tween (PBS 0,1 M, 0,3% Tween-20, pH 7,4) por 20 minutos cada
lavado y se incubaron con el respectivo anticuerpo secundario (anti- IgG de conejo, cabra o
ratón) conjugado a peroxidasa (dilución 1:2000, en tampón anticuerpo) durante 2 horas a
temperatura ambiente. Finalmente, las membranas se lavaron 3 veces con PBS-Tween (PBS 0,1
M, 0,3% Tween-20, pH 7,4) por 20 minutos cada lavado más un lavado final con PBS 0,1 M. El
revelado del conjugado se realizo utilizando un método de quimioluminiscencia ocupando una
solución de peróxido de hidrógeno y luminol. En el caso de revelado clásico, luego de 1 minuto
se expuso un film fotográfico sobre la membrana y se revelara con reactivo D72 y fijada con
reactivo U3. En el caso de captura digital del revelado se utilizó el equipo Omega ULTRALUM.
9.2.12 TRANSFORMACIÓN BACTERIANA Y PURIFICACIÓN PLASMIDIAL.
Las células competentes JM109 fueron transformadas utilizando el plásmidio pEGFP-
SVCT2. Las bacterias fueron almacenadas en un volumen de 50 μL a -80oC y se descongelaron
en hielo durante 5 minutos, luego se mezclaron con 1 μL del plasmidio durante 30 minutos.
Después se aplicó un “shock” térmico a 42ºC durante 90 segundos y posteriormente se incubó
por 2 minutos en hielo. Luego se agregaron 450 μL de medio LB (10 g de peptona, 5 g de bacto-
extracto levadura, 5 g de NaCl pH7,0 para un litro de solución) sin antibiótico y se agitó la
mezcla a 225 rpm por 1h a 37ºC. Posteriormente se sembraron 200 μL de esta mezcla en una
placa de medio LB-agar, a la cual se le agregó 12 μL de kanamicina 50 ng/ml, y se dejo
incubando a 37 °C por 16- 24 h aproximadamente. Una vez obtenidas las colonias se procedió
con el protocolo escrito por el fabricante para el kit AxyPrep Plasmid Midiprep, para purificación
de DNA plasmidial.
35
10. RESULTADOS.
10.1 Análisis de la expresión y funcionalidad del transportador de vitamina C y sodio
isoforma 2 (SVCT2).
Las células HEK293T es una línea celular derivada de células embrionarias de riñón
humano. Puesto que son una línea celular de fácil manejo en el laboratorio fue elegida como
modelo para la mayoría de los estudios realizados en esta tesis. En primer lugar, se procedió a
estudiar la presencia y localización endógena del transportador SVCT2 mediante análisis de
Western blot e inmunofluorescencia. Mediante Microscopía confocal, se confirmó la presencia
del transportador SVCT2 en células HEK293T, observándose la presencia con una reacción
positiva tanto a nivel de la membrana plasmática como en el citoplasma (Figura 6). La presencia
de SVCT2 en estas células fue confirmada mediante análisis de Western blot observándose un
tamaño aproximado de 50 kDa lo que concuerda con los descrito en la literatura (Li et al., 2003;
Godoy et al., 2007; Savini et al., 2007).
Luego, se realizaron ensayos con ácido ascórbico radiactivo con el fin de determinar la
funcionalidad de SVCT2. Para esto se midió la captación de 1-14C-L-ácido ascórbico 100 mM en
condiciones zero-trans en el tiempo a 37º C. La incorporación resultó ser lineal hasta
aproximadamente los 3 minutos, observándose la llegada al equilibrio a los 6 minutos. El valor de
velocidad inicial fue 25.7 ± 1.9pmol/min × 106 células x minuto. La incorporación de ácido
ascórbico 100 μM fue inhibida en presencia de ouabaína 10 μM en aproximadamente un 60% con
respecto al control, lo que corrobora la dependencia de sodio observada en este transporte. En
cambio, la incorporación de ácido ascórbico en presencia de citocalasina B, un inhibidor de los
GLUTs, no se ve afectada. Esto último, confirma que el transporte observado no es debido a la
incorporación de ácido dehidroascórbico por parte de los GLUTs, ya que en esta línea celular
encontramos la expresión de GLUT1 y GLUT3 (Castro et al., 2008).
36
Figura 6: Análisis de la expresión y función de SVCT2 en células HEK293T. A. Análisis de
inmunofluorescencia para SVCT2 en células HEK293T. B. Western blot realizado desde
extractos de proteínas totales de células HEK293T en cultivo, utilizando un anticuerpo anti-
SVCT2. C. Análisis del transporte de 1-14C-L-ácido ascórbico 100 mM a 37 ºC, la curva fue
ajustada usando una regresión no linear (R>0.99). D. Gráfica de barras del efecto de distintos
inhibidores sobre la incorporación de 1-14C-L-ácido ascórbico. CitoB: citocalasina B. Los datos
son representativos de una media ± DS de cuatro experimentos independientes. ***p<0.001.
37
10.2 Análisis del efecto de la exposición previa a sustrato sobre el transporte de ácido
ascórbico en células HEK293T.
Tal como fue explicado en la introducción, en algunos tejidos, como en el cerebro, se
observan oscilaciones de la concentración de ácido ascórbico extracelular. Puesto que
observamos una importante localización citoplasmática de SVCT2 en las células HEK293T, se
realizaron ensayos de captación de 1-14C-L-ácido ascórbico 100 μM por 2 min a 37°C, previa
exposición a ácido ascórbico extracelular no radiactivo. Estas exposiciones previas a sustrato no
marcado fueron realizadas a diferentes tiempos de preincubación (1, 5, 10 minutos) y
concentraciones (0,1; 0,5; 1 mM). Se observó un aumento de la captación de 1-14C-L-ácido
ascórbico cuando las células fueron preincubadas durante 10 minutos con ácido ascórbico no
radiactivo 0,1; 0,5 y 1 mM (Figura 7). El aumento de captación observado resultó ser reversible,
observándose una incorporación similar Al control, cuando las células fueron tratadas con ácido
ascórbico no radiactivo durante 10 minutos y luego lavadas utilizando la misma solución de
transporte en ausencia de sustrato no radiactivo, pero en presencia de sustrato radiactivo durante
2 minutos (Figura 7).
38
Figura 7: Análisis del transporte de ácido ascórbico en células HEK293T previa exposición
a sustrato. En cada uno de los casos de incorporación de 1-14C-L-ácido ascórbico este se midió
durante 2 minutos a 37 ºC. Las células fueron previamente tratadas con ácido ascórbico no
radiactivo 0, 0.1, 0.5 y 1 mM durante 1, 5 o 10 minutos previo al ensayo de incorporación. Los
datos corresponden a la media ± DS de tres experimentos independientes (*p<0,5;**p<0,01).
39
10.3 Análisis de la recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) en
células HEK293T transfectadas con SVCT2-EGFP
En células HEK293T, expresando el transportador SVCT2-EGFP, se realizaron ensayos
de la recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP), utilizando microscopía
confocal. Este tipo de ensayos nos permite medir la movilidad de una proteína. Esta técnica se
basa en fotoblanquear una zona específica de interés y medir la recuperación de la fluorescencia
en dicha zona a través del tiempo. En la Figura 8A se muestra un esquema de una célula que tiene
representados fluoróforos en verde, al fotoblanquear una zona específica (región de interés), los
fluoróforos que se encontraban en ese lugar no son capaces de seguir emitiendo fluorescencia. En
el tiempo, dichos fluoroforos difundirán (si son capaces de hacerlo) y se mezclaran con los
fluoroforos vecinos a la región de interes que no fueron fotoblanqueados. Las gráficas obtenidas,
muestran curvas de la recuperación de la fluorescencia en función del tiempo, estas curvas se
ajustan a una curva de tipo exponencial, de la cual podemos calcular la movilidad relativa de una
proteína unida a un fluoroforo (ver material y métodos). Para algunas proteínas la recuperación
llega al 100% (figura 8B), entonces hablamos de moléculas que son altamente móviles. En otros
casos se observa una recuperación no supera el 50% lo que indica que estaríamos frente a una
proteína que tiene una movilidad intermedia. Si la recuperación es menor que el 50 % entonces
se considera que las proteínas en cuestión son prácticamente inmóviles. Entonces el porcentaje de
recuperación que se obtiene de una proteína después del fotoblanqueo, nos da la idea de la
movilidad que tiene esa proteína y esto puede a cambiar según el microambiente que rodee a
dicha proteína.
40
Figura 8. Ensayos de recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP)
para medir movilidad relativa de una proteína unida a un fluoroforo. A. Esquema general de
un experimento de FRAP. A una célula expresando proteínas de fusión (fluorescente) se le
fotoblanquea una definida región de interés (ROI). La recuperación de la señal de fluorescencia
en el ROI se monitorea a través del tiempo. La curva obtenida por FRAP muestra la intensidad
del fotoblanqueo y la recuperación de la señal. B. La fracción inmóvil se determina como la
diferencia entre la señal previa al fotoblanqueo y la señal obtenida después de la recuperación
completa. Sobre la base de los diferentes perfiles de curvas de recuperación obtenidos las
proteínas pueden ser consideradas con movilidad media o altamente móviles con presencia casi
nula de fracciones inmóviles.
41
Los ensayos de FRAP realizados en células HEK293T expresando SVCT2-EGFP
revelaron cambios en la movilidad relativa de SVCT2 después de una preincubación de 10
minutos con ácido ascórbico 1 mM. Se observó una disminución del 60% con respecto al control
en la fracción móvil (Mf) cuando las células fueron preincubadas con ácido ascórbico (Mf control
102,0 ± 9,9 %, Mf en presencia de ácido ascórbico 38,2 ± 13,5 %) (Figura 9). Nosotros
razonamos que la disminución en la Mf se podría deber a a) El movimiento lateral del
transportador en la membrana plasmática, entrando o saliendo de dominios de membrana (se han
descrito aumento y disminuciones de la movilidad relativa de diferentes proteínas de membrana
cuando son reclutadas en dominios de membrana, (Kenworthy et al., 2004; Adkins et al., 2007) o
b) Es posible que el transportador, localizado intracelularmente en algún tipo de vesículas
cercanas a la membrana plasmática, sea translocado a dicha membrana en respuesta a la
exposición aguda a sustrato (González et al., 2007). Este último razonamiento se basa en la lógica
que una proteína en la membrana plasmática presenta movilidad lateral, mientras que una
proteína en una vesícula debiera presentar una mayor movilidad (lateral en la membrana de la
vesícula sumada a la movilidad de la vesícula misma). En consideración a resultados no
publicados de nuestro laboratorio decidimos inclinarnos por testear el segundo razonamiento.
Para ello, desarrollamos una serie de experimentos utilizando microscopía de reflexión total
interna y análisis de biotinilación de manera de estudiar la disponibilidad del transportador en la
membrana plasmática, como se describe a continuación.
42
Figura 9. Análisis de la recuperación de la fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP)
en presencia de ácido ascórbico en células HEK293T transfectadas con SVCT2-EGFP.
Curva de recuperación de la fluorescencia para SVCT2-EGFP expresado en células HEK293T
control (izquierda) y en presencia de ácido ascórbico 1 Mm (derecha). Sobre cada gráfica se
muestra una secuencia de fotos representativas de cada cinética de recuperación. En la parte
inferior se muestra una grafica de barras correspondiente a las fracciones móviles (Mf) calculadas
desde los experimentos de FRAP obtenidos anteriormente. Los datos corresponden a la media ±
DS del análisis de 10 células en 4 experimentos independientes para cada caso estudiado.
43
10.4 Análisis de la disponibilidad de SVCT2-EGFP a nivel de la membrana plasmática en
células NG-108 mediante microscopía de reflexión total interna (TIRFM) y estudios de
biotinilación.
La microscopía de fluorescencia por reflexión interna total (TIRFM), se basa en el
principio de la reflexión total interna y generación de una onda evanescente. Cuando la luz pasa
de un medio con índice de refracción n1 a otro medio con índice de refracción n 2 < n1, con un
ángulo de incidencia θ1 (Axelrod, 2001), existe cierto ángulo de incidencia llamado ángulo
critico θc, para el cual el ángulo refractado se hace igual a 90°, es decir, el rayo refractado se
desliza a lo largo de la superficie de separación de los medios sin entrar en el segundo medio.
Cuando el ángulo de incidencia es mayor θc entonces la totalidad de la luz será reflejada
internamente (Schneckenburger, 2005) (Figura 10).
Un efecto secundario importante de la reflexión interna total es la propagación de la onda
evanescente a través de la superficie del límite entre los dos medios donde la luz es reflejada.
Aun cuando la onda entera del incidente se refleja internamente, existe una cierta penetración en
el segundo medio causando la excitación de aquellos fluoróforos cercanos a dicho límite. De este
modo, se logra la visualización de un delgado corte óptico en la vecindad (150-200 nm) del límite
entre los dos medios mencionados anteriormente (Axelrod, 2001).
44
Figura 10. Ángulo critico y principio de la microscopia de reflexión total interna (TIRMF).
Este tipo de microscopía se basa en el principio de la reflexión total y generación de una onda
evanescente. Al proyectar un haz de luz (rayo incidente) sobre una superficie pulida constituida
de un material transparente con distinto índice de refracción (n) es posible encontrar un ángulo de
incidencia tal que la totalidad de la luz proyectada es reflejada. Este ángulo se denomina ángulo
crítico θc y en el punto donde se produce la reflexión total que genera una onda electromagnética
(la onda evanescente), de igual frecuencia que la luz incidente, que progresa perpendicularmente
hacia el lado de opuesto y decae exponencialmente con la distancia de avance. La onda evanes-
cente es capaz de excitar aquellos fluoróforos que se encuentren a una distancia no superior a 200
nm de la superficie de reflexión.
45
Se tomaron imágenes de TIRFM de células NG108 expresando SVCT2 EGFP. Las células
NG108 corresponden a una línea celular proveniente de la hibridación de células de un
neuroblastoma y un glioblastoma. Se eligió esta línea celular para este tipo de experimentos
puesto que se adhieren mejor al vidrio en que crecen, cualidad de importancia para la
visualización mediante TIRFM, caracteristica que es limitada en las células HEK293T. La
imágenes de TIRFM mostraron que en presencia de ácido ascórbico, se ve un aumento de la
intensidad de la fluorescencia en comparación al control a través del tiempo (5 y 10 minutos)
(figura 11A). Dado que el tamaño del corte óptico es aproximadamente de 150-200 nm, podemos
decir que se produce un aumento de SVCT2 en las cercanías de la superficie celular. En forma
inversa, se observo una disminución de la intensidad de la fluorescencia cuando las células fueron
preincubadas con ácido ascórbico 1 mM y citocalasina D 1 μg/ml (CitoD, Figura 11, D) un
inhibidor de la polimerización de los filamentos de actina (Rubtsova et al., 1998), el cual afecta
tanto la exocitosis de la proteína como su endocitosis (Omata et al., 2000; Valentijn et al., 1999;
Merrifiel et al., 2004). Para observar lo que sucedería con la presencia de un inhibidor solo de la
internalización de la proteína se utilizó para la preincubación, óxido de fenil arsina (PAO) un
inhibidor de la endocitosis (Gibson et al, .1989) en una concentración 1 μg/ml (Figura 11, C). En
presencia de PAO y ácido ascórbico 1mM se observo un aumento de la intensidad de
fluorescencia similar a lo observado solo en presencia de ácido ascórbico, pero aun más intenso y
prolongado en el tiempo.
Se describió anteriormente que SVCT2 es un transportador dependiente de la gradiente
electroquímica de sodio, por lo que es vital la presencia de catión sodio en el medio para realizar
el transporte de ácido ascórbico. Se ha descrito que es necesaria la unión de un catión sodio
incialmente para que el ión ascorbato se una al sitio activo del transportador (Godoy et al., 2006).
46
Por lo tanto, con la idea de determinar si la sola presencia del ácido ascórbico o la unión
de este mismo al transportador son necesarias para el reclutamiento de SVCT2 en la superficie
celular, se realizaron estudios en ausencia de sodio reemplazando dicho catión por otro inerte
como lo es colina (Figura 11, D). Cuando impedimos la unión del sustrato al transportador
(ausencia de sodio) no observamos el efecto de aumento de SVCT2 a nivel de la membrana
plasmática, lo que apoya la idea del reclutamiento del transportador por unión de su sustrato.
47
48
Figura 11. Análisis del efecto de ácido ascórbico, citocalasina D y PAO en células NG108
transfectadas con SVCT2-EGFP mediante TIRFM. A. Imágenes de TIRFM muestran
células NG108 expresando SVCT2-EGFP. Las células fueron preincubadas usando 1mM de
ácido ascórbico (Asc), 1 μg/ml inhibidor de la exocitosis (cito D), 1 μg/ml inhibidor de
endocitosis (PAO) o sin sodio en el medio (el catión fue remplazado por colina). B. Gráfica de los
cambios de intensidad de fluorescencia de SVCT2-EGFP en función del tiempo. Estos datos son
representativos ± SD de 16 células en 5 experimentos independientes (*p<0,05; **p<0,01;
***p<0,001;****p<0,00001).
49
Debido al límite del corte óptico del microscopio TIRFM, solo podemos determinar que el
aumento del transportador es en las cercanías de la membrana plasmática, para determinar si
realmente el transportador SVCT2 es translocado hacia la membrana plasmática se realizaron
ensayos de biotinilación frente a diferentes tratamientos (ácido ascórbico, citocalasina D y óxido
fenil arsina).
La biotinilación de proteínas se llevó a cabo mediante un kit de biotinilación y
purificación de proteínas de superficie celular. En esta técnica, las proteínas de superficie celular
son marcadas con biotina (EZ-Link-Sulfo-NHS-SS- Biotin), que reconoce los grupos amino de
las proteínas. Las proteínas marcadas se aíslan mediante la neutravidina, que se une a la biotina,
posteriormente las proteínas marcadas son separadas mediante electroforesis y detectadas
mediante el uso de anticuerpos específicos a través de un Western blot. Del Western blot
representativo para SVCT2 a partir de los extractos biotinilados, se obtuvieron resultados semi-
cuantitativos mediante análisis de densitometría los que fueron normalizados frente β-actina
(presente en los sobrenadantes). Antes de realizar los ensayos de biotinilación en algunos casos,
las células fueron preincubadas con diferentes tratamientos. La banda obtenida para SVCT2 es de
un tamaño de 50 kDa, lo que concuerda con lo descrito en la literatura (Li et al., 2003; Godoy et
al., 2007; Savini et al., 2007).
Mediante el análisis de densitometría que cuantifica las intensidades de pixeles
correspondiente a las bandas para SVCT2, se observó un aumento de aproximadamente un 20%
de la intensidad de la banda con la preincubación de ácido ascórbico a una concentración 1 mM
por 5 minutos en comparación al Control. Por el contrario, cuando se preincubó con citocalasina
D con una concentración 1μg/ml por 15 minutos, se observó una disminución de la intensidad de
la banda y en el caso del inhibidor de la endocitosis PAO con una concentración de 1μg/ml por
50
15 minutos se produjo un aumento, todo esto en comparación al Control proveniente de extractos
biotinilados no sometidos a ningún tipo de preincubación (figura 12). Estos resultados
demuestrán que existe un aumento de la translocación de SVCT2 a nivel de la membrana
plasmática en presencia de ácido ascórbico extracelular.
51
52
Figura 12. Análisis de la translocación de SVCT2 en respuesta a exposición aguda a
sustrato. La fotografía superior corresponde a un Western blot representativo para SVCT2 a
partir de extractos biotinilados, mientras que la fotografía inferior corresponde a un análisis de
Western blot para β-actina a partir del sobrenadante descartado en el ensayo de biotinilación. En
algunos casos, previo a los ensayos de biotinilación las células fueron tratadas con ácido
ascórbico 1mM y/o citocalasina D 1μg/ml y/o PAO 1μg/ml durante 15 minutos. El gráfico
corresponde a la cuantificación densitométrica de tres ensayos normalizada según la cantidad
relativa de β-actina en el sobrenadante (intracelular). Estos datos son representativos ± SD de 3
experimentos independientes (*p<0,5;**p<0,01).
53
10.5 Estudio del efecto de citocalasina D y óxido fenil arsino sobre el transporte de ácido
ascórbico en células HEK293T.
Para determinar si los transportadores translocados a la membrana plasmática debido a la
preincubación con ácido ascórbico son funcionales, se realizaron ensayos de transporte con un
análogo radiactivo de ácido ascórbico 1-14C-L-ácido ascórbico en una concentración de 100 μM
en células HEK293T a 37 °C por dos minutos. Se realizó una preincubación de ácido ascórbico
no radiactivo a una concentración de 1 mM por un tiempo de 5 minutos a 37ºC y en los casos
indicados las células fueron preincubadas además, con las drogas indicadas por 15 minutos
previos al ensayo de transporte a 37 °C (Figura 13) La incorporación de ácido ascórbico 1-14C-L-
ácido ascórbico se vio aumentada previa exposición al sustrato en un 100% en comparación al
control. En el caso de la preincubación con citocalasina D (1μg/ml) se produjo una disminución
de la incorporación de ácido ascórbico de alrededor de un 40% en relación al control.
Adicionalmente a la preincubación con citocalasina D, se preincubó con ácido ascórbico 1
mM por 5 minutos también a 37 °C y se realizó el ensayo de transporte, observándose una leve
disminución en el transporte con respecto al control.
En aquellos experimentos en los que se utilizo PAO 1μg/ml observamos un aumento de la
incorporación del análogo de ácido ascórbico de aproximadamente un 200% en comparación al
control. Mientras que al realizar la preincubación adicional de ácido ascórbico en la misma
concentración y tiempo que en el caso de citocalasina D, se observa un aumento aun mayor de la
incorporación de 1-14C-L-ácido ascórbico. También se realizaron ensayos de transporte con un
tampón libre de sodio, con y sin preincubación de ácido ascórbico 1mM por 5 minutos.
Observándose una disminución en la incorporación de 1-14C-L-ácido ascórbico en
comparación al control en ambos ensayos (figura 13). Estos ensayos de incorporación
demuestran que el aumento de la traslocación de SVCT2 a nivel de la membrana plasmática en
presencia de ácido ascórbico, observados en los ensayos de biotinilación, son funcionales.
54
Figura 13. Análisis del efecto de citocalasina D y PAO sobre el transporte de ácido ascórbico
en células HEK293T. Ensayo de captación de ácido ascórbico en células HEK293T tratadas
previamente con ácido ascórbico 1mM (no radiactivo), citocalasina D 1μg/ml y PAO 1μg/ml y/o
en ausencia de sodio. Luego de 15 minutos de tratamiento con las sustancias se midió la
incorporación de 1-14C-L-ácido ascórbico (AA*) durante 2 minutos a 37ºC. Los datos
corresponden a la media ± DS de 3 experimentos independientes. (*p<0,05; **p<0,01;
***p<0,001; ****p<0,00001).
**
55
Por lo que sería interesante un análisis de la distribución subcelular de esta proteína en
presencia de su substrato y con los inhibidores de exocitosis y endocitosis.
56
10.6 Estudio de la localización subcelular de SVCT2 frente a la exposición aguda con
ácido ascórbico e inhibidores de endo y exocitocis.
Con el fin de estudiar la localización subcelular de SVCT2 en células HEK293T bajo
exposición aguda a substrato, citocalasina D y/o PAO, se realizaron análisis de
inmunofluorescencia. Según lo observado, para las células en caso del control se obtiene una
reacción positiva (en rojo) para SVCT2 a nivel de la membrana plasmática y en el citosol con
aspecto punteado. También se utilizaron para el análisis de inmunofluorescencia, anticuerpos
específicos contra MCT1 y EEA1. El primero corresponde a una isoforma del transportador de
monocarboxilato tipo 1 (en verde) que se ubica en forma abundante en la membrana plasmática y
el segundo que corresponde a EEA1 un marcador de endosoma temprano asociado a proteína 1
(en azul) el cual posee un patrón inmunoreactivo abundante y de estilo punteado en la zona del
citoplasma (Figura 14).
Cuando las células son expuestas a ácido ascórbico 1mM por 10 minutos a 37 °C, se
obtiene un aumento de la localización de SVCT2 a nivel de la membrana plasmática, y aumento
de la colocalización con MCT1. Esto fue corroborado mediante histogramas de distribución
basados en la intensidad de pixeles, elegidos arbitrariamente, correspondientes a cada una de las
tres señales obtenidas de los patrones inmunoreactivos de SVCT2, MCT1 y EEA1 (Figura 15).
Podemos observar que existen tres tipos de colocalizaciones, una entre SVCT2 y EEA1
que es de color magenta, también hay una colocalización en amarillo a nivel de la membrana
plasmática entre SVCT2 y MCT1. Y por último una triple colocación que se observa en color
blanco para SVCT2, MCT1 y EEA1 (Figura 15).
57
Figura 14. Análisis de inmunofluorescencia para la localización subcelular de SVCT2,
MCT1 y EEA1 en células HEK293T. Análisis para SVCT2, MCT1 (transportador de
monocarboxilato 1, expresado principalmente en la membrana plasmática) y EEA1 (marcador de
endosomas tempranos asociado a proteína 1) en cultivos de células HEK293T. La barra de
magnificación corresponde a 20 um.
58
59
Figura 15. Análisis de la colocalización e histograma de distribución para SVCT2, MCT1 y
EEA1 en células HEK293T tratadas con ácido ascórbico. Análisis de inmunofluorescencia
para la obtención de gráficas de histograma para SVCT2, MCT1 (transportador de
monocarboxilato 1, expresado principalmente en la membrana plasmática) y EEA1 (marcador de
endosoma temprano asociado a proteína 1) en cultivos de células HEK293T. En el caso de la
preincubación con ácido ascórbico fue a una concentración 1 mM por 5 minutos a 37 °C. La
línea roja en la imagen superior corresponde a la línea de toma de datos (zona donde se
obtuvieron las longitudes de pixeles). La barra de magnificación corresponde a 10 um.
60
Finalmente, estudiamos los patrones de distribución subcelular de SVCT2 en presencia de
citocalasina D y ácido ascórbico extracelular. Con respecto a las preincubaciones con citocalasina
D (1ug/ml por 10 minutos) con y sin la preincubación adicional de ácido ascórbico 1mM por 5
minutos, observamos una perdida del patrón inmunoreactivo punteado observado para EEA1, lo
que se explica por las alteraciones causadas en el citoesqueleto de actina por esta droga. Al
mismo tiempo, observamos que la colocalizacion de SVCT2 y MCT1 a nivel de la membrana
plasmática disminuye en los tratamientos con citocalasina D (Figura 16) lo que concuerda con los
estudios en biotinilación y TIRFM.
61
Figura 16. Análisis de inmunofluorescencia para la localización subcelular de SVCT2,
MCT1 y EEA1 en células HEK293T frente a la exposición aguda y/o ácido ascórbico, y/o
citocalasina D y/o PAO. Análisis para SVCT2, MCT1 (transportador de monocarboxilato 1,
expresado principalmente en la membrana plasmática) y EEA1 (marcador de endosoma temprano
asociado a proteína 1) en cultivos de células HEK293T. La barra de magnificación corresponde a
10 um.
62
11. DISCUSIÓN
Las funciones del ácido ascórbico en el sistema nervioso central y en el cerebro son
numerosas, estas se pueden dividir según su naturaleza en funciones antioxidantes y no
antioxidantes. La vitamina C trabaja como antioxidante en forma sinérgica con otros
antioxidantes, como la vitamina E y el glutatión, protegiendo a las células cerebrales del daño por
estrés oxidativo causado por radicales libres (Harrison., et al 2010). Tal vez el estrés oxidante más
agudo que se puede producir en el SNC son las lesiones por isquemia y reperfusión. La
administración de ácido ascórbico disminuye el tamaño de la zona del infarto en modelos
animales (Harrison et al., 2010). Desde un punto de vista mas fisiológico, otras actividades
naturales de las neuronas son causales de un aumento de las especies oxidantes en esta células
como la propagación del impulso nervioso y todas las tareas celulares que le acompañan
(aumento del metabolismo energético, reciclaje y metabolismo de neurotransmisores, etc). El
ácido ascórbico también tiene una función neuromoduladora, interaccionando con numerosos
sistemas de neurotransmisores incluyendo acetilcolina, dopamina y glutamato (Harrison y May,
2009; Rice, 2000).
Se ha demostrado que el eflujo de ácido ascórbico en el SNC está fuertemente relacionado
con la actividad glutamatérgica (O´Neill et al., 1984; Basse-Tomusk A y Rebec, 1999). Los
astrocitos desempeñan un papel fundamental en este flujo de salida, relacionando la liberación de
ácido ascórbico en respuesta a glutamato, es decir, estimulada por la actividad sináptica (Upston
et al., 1999; VanDuijin et al., 2000; Yusa, 2001). Este ácido ascorbico puede ser incorporado por
la neuronas debido a que estas expresan el transportador SVCT2 (Castro et al., 2001), donde
actúa como antioxidante y modulador metabólico, inhibiendo el transporte de glucosa y
estimulando el transporte de lactato en estas células (Castro et al., 2007; Castro et al., 2008;
Castro et al., 2009; Beltrán et al., 2011). Bajo las concentraciones extracelulares cerebrales de
63
ácido ascórbico (200-300 uM) en estadios de reposo el transportador SVCT2 debiera encontrarse
saturado. Por consiguiente, para que la concentración de ácido ascórbico intracelular neuronal
aumente bajo episodios de actividad sináptica debiera ser necesario una activación del transporte
de este metabolito mediado por SVCT2. Esto es, un aumento en la capacidad de transporte, lo
que puede ocurrir debido a un aumento de la constante catalítica del transportador, o bien, un
aumento de la disponibilidad del transportador en la membrana. Por tal razón, se planteó evaluar
la localización subcelular del transportador SVCT2 en respuesta a un aumento agudo de la
concentración extracelular de ácido ascórbico.
Las tasa de transporte y los niveles de localización subcelular de transportadores en la
superficie de las células están reguladas por interacciones proteína-proteína (Deken et al., 2000;
Geerlings et al., 2000; Torres et al., 2001). La exposición a agonistas y antagonistas produce la
modulación de los transportadores en el caso de células neuronales. Esta regulación ocurre por
una redistribución de los transportadores desde sitios en la membrana plasmática a sitios de
almacenamiento intracelular, o vice versa (Bernstein y Quick, 1999). Los procesos generales de
la endocitosis, la clasificación intracelular y la exocitosis en células de mamíferos, más
concretamente, las neuronas, son cada vez más claros (Buckley et al., 2000). En algunos
transportadores presentes en células neuronales se ha demostrado, que posteriormente a su
presencia en la membrana plasmática se dirigen a endosomas, después de una endocitosis
mediada por clatrina (Daniels y Amara, 1999; Melikian y Buckley, 1999).
La línea celular HEK293T fue la elegida como modelo de estudio para determinar los
cambios de localización y funcionalidad de SVCT2 inducidas por la exposición aguda a substrato
debido a que expresan de forma endógena el transportador SVCT2 (Castro et al., 2008). En
primera instancia, los patrones de expresión obtenidos para esta proteína por medio de
64
inmunofluoresencia y Western blot, concuerdan con lo descrito en literatura (Castro et al., 2001;
Castro et al., 2008). La banda obtenida mediante Western blot es de aproximadamente 50 kDa
que concuerda con lo obtenido en diferentes modelos de células humanas como neuronas,
plaquetas y melanoma (Li et al., 2003; Godoy et al., 2007; Savini et al., 2007). La velocidad de
transporte para ácido ascórbico fue de 25.7 ± 1.9 pmol/min x 106 células, se han descrito
similares características en el transporte de ácido ascórbico en neuronas y varios tipos celulares
(Castro et al., 2001; García et al., 2005, Maulen et al., 2003).
Se observó de forma interesante que al preincubar células HEK293T con distintas
concentraciones de ácido ascórbico (0,1; 0,5; 1 mM) y posteriormente realizar ensayos de
captación de 1-14C-L-ácido ascórbico 100 M, ocurrió un aumento en el transporte neto, lo que se
observó con un máximo a los 10 minutos (Figura 13). Estos resultados sugieren que podría
existir un aumento de la disponibilidad del transportador en la superficie celular. Numerosos
estudios describen que, aunque algunos transportadores parecen tener una expresión
relativamente estable en la membrana plasmática, existen muchos otros capaces de reciclar
constitutivamente desde y hacia la membrana como por ejemplo el transportador de aminoácidos
excitatorios 1 (EAAC1, (González et al., 2007) y el transportador de GABA 1 (GAT1, Bernstein
y Quick, 1999). Varios miembros de la familia de transportadores de neurotransmisores son
capaces de reciclar constitutivamente entre compartimientos intracelulares y la membrana
plasmática, pero muchos detalles de estos procesos no son aún conocidos (Melikian, 2004;
Robinson, 2006; Loder y Melikian, 2003; Fournier et al., 2004; Wang y Quick, 2005).
Las proteínas situadas en la membrana plasmática pueden someterse a dos clases de
movimientos: difusión rotacional y lateral. La primera se refiere a la rotación de las proteínas
alrededor del eje que es perpendicular al plano de la membrana plasmática, mientras que el
65
último se refiere a la difusión dentro de la membrana (González et al., 2007). Mediante
experimentos de FRAP se pueden inferir, ciertas propiedades e interacciones de las moléculas
dentro del ambiente celular, como la existencia de dominios (balsas lipídicas), o cuando la
proteína está difundiendo en un dominio cuya viscosidad es diferente a otras regiones de la
membrana o espacio intracelular (Axelrod et al., 1976; Spector et al., 1997). Según experimentos
de FRAP en células HEK293T tratadas con ácido ascórbico, se obtiene una disminución de la
movilidad relativa en comparación al control, en este se obtuvo una movilidad relativa de
aproximadamente 102% y en el caso de la preincubación de ácido ascórbico de un 38%
aproximadamente, por lo que tenemos un porcentaje cercano al 64% que se encuentra inmóvil
(Figura 9). Esto sugiere un cambio en la vecindad o ambiente subcelular en presencia del
sustrato. Por tanto, podriamos especular que el transportador en presencia de ácido ascórbico se
estaría moviendo desde un dominio que podrían ser vesículas de secreción o endosomas (mas
movil) hacia la membrana plasmática (dominio menos móvil). También es posible que el
transportador se esté moviendo desde dominios mas móviles de la misma membrana plasmática
hacia dominios menos móviles dentro la misma. Sin embargo, los resultados de biotinilación y de
TIRF apoyan nuestra hipótesis inicial.
Mediante microscopía de reflexión total interna (TIRFM) se obtuvo información sobre la
localización y dinámica de SVCT2 que ocurre cerca de la membrana plasmática, observándose
un incremento de la intensidad de fluorescencia con la preincubación de ácido ascórbico. Según
Allersma y colaboradores (2006), los cambios en la intensidad de fluorescencia pueden ser
debido a variaciones en parámetros como: el numero de fluoróforos, los movimientos en el eje Z
o a la orientación del objeto. En algunos casos, el contexto biológico específico del experimento
puede ayudar a aclarar la fuente del cambio de intensidad; por ejemplo el número de fluoróforos
66
en el interior de una vesícula secretora típicamente permanece constante y, por consiguiente, la
alteración en intensidad generalmente se puede interpretar como un movimiento en el eje Z
(Allersma et al., 2006). Estos antecedentes nos permiten sugerir que el aumento de la intensidad
de fluorescencia en presencia de ácido ascórbico (Figura 11), se traduciría en un aumento de
SVCT2 en las cercanías de la membrana plasmática. Esto también se correlaciona con el aumento
de la intensidad de fluorescencia con preincubaciones de ácido ascórbico y PAO, este es un
inhibidor de la endocitosis dependiente de clatrina (Yumoto et al., 2006; Cosson et al., 1989;
Gibson et al., 1989; Sturrock et al., 1990). Por lo que este aumento de intensidad de fluorescencia
estaría indicando que los transportadores se localizan en la membrana plasmática en respuesta a
su sustrato, pero no logran endocitar, permaneciendo en la superficie celular. Para el caso de las
imágenes obtenida con la preincubación de ácido ascórbico y citocalasina D, la cual bloquea la
polimerización de los filamentos de actina (Peterson et al., 2002; Montaner et al., 1999) se
observó una disminución de la intensidad de fluorescencia (Figura 11). Una perdida de
fluorescencia puede ser interpretado como una internalización de la proteína ( Saffarian y
Kirchhausen, 2008). Cabe destacar, que citocalasina D al bloquear la polimerización de los
filementos de actina, provoca una inhibición de la exocitosis (Omata et al., 2000; Valentijn et al.,
1999; Merrifiel et al., 2004), pero además existen papers que apoyan el hecho de que afecta al
tráfico vesícular en general por lo que inhibe la endocitosis también. Por lo tanto, no se puede
descartar la idea que citocalasina D sea capaz de colapsar el sistema de tráfico vesicular
completamente (Kaksonen et al., 2006; Merrifield et al., 2004).
Un aproximación más bioquímica para determinar cambios en los niveles de una proteína
en la superficie celular, son los ensayos de biotinilación. Los niveles plasmáticos del
transportador se pueden analizar directamente antes y después de tratamientos donde se espera
67
que el movimiento de este hacia la superficie celular (Altin y Pagler, 1995). Qian y colaboradores
utilizaron ensayos de biotinilación para determinar los niveles de expresión del transportador de
serotonina humano (SERT) en células antes y después del tratamiento con un activador de
Proteína Kinasa C (PKC). Se encontró que la activación de PKC provoca una reducción en la
cantidad de SERT en la superficie celular (Qian et al., 1997). Davis y colaboradores también
utilizaron esta técnica para demostrar un incremento de los niveles del transportador de glutamato
en la membrana plasmática por la activación de PKC en células de gliomas C6 (Davis et al.,
1998). Los ensayos de biotinilación para el transportador SVCT2 revelaron un incremento de éste
en la membrana plasmática en presencia de ácido ascórbico (Figura 12). Esto es consistente con
nuestros ensayos funcionales y de imagenología, demostrando que estos transportadores son
translocados a la membrana plasmática en respuesta a la exposición aguda a sustrato.
Se ha propuesto que el proceso de endocitosis se clasifica generalmente en las vías de
“dependiente de clatrina” e “independiente de clatrina” (Mellman, 1996; Mousavi et al., 2004;
Kirkham y Parton, 2005). La endocitosis dependiente de clatrina requiere una variedad de
adaptadores de proteínas y la generación de depresiones revestidas que brotan en las vesículas
(Conner y Schmid, 2003). El adaptador de proteínas tipo 2 (AP-2) facilita el montaje de cubiertas
de clatrina y recluta a otras proteínas accesorias necesarias para la endocitosis (Conner y Schmid,
2003). La vía independiente de clatrina representa un grupo heterogéneo de mecanismos, y al
menos algunos de ellos parecen depender de dominios presentes en las membranas plasmática,
conocidos como balsas lipídicas. Estos dominios son ricos en colesterol, esfingolípidos y
caveolina (Navi y Le, 2003). Tomando en consideración los resultados obtenidos por TIRFM y
ensayos de biotinilaciones para SVCT2 en presencia de ácido ascórbico y con el uso de PAO,
nosotros proponemos que el transportador SVCT2 se encuentra reciclando constantemente entre
68
compartimentos intracelulares y la membrana plasmática.
La dinamina es una GTPasa que participa tanto de la endocitosis dependiente de clatrina y
caveolina, principalmente en la escisión de las vesículas recién formadas en la membrana
plasmática (Conner y Schmid, 2003; Nichols, 2003). González y colaboradores (2007),
demostraron mediante el uso de un dominante negativo de dinamina, que esta GTPasa contribuye
al tráfico de EAAC1. Estudios preliminares no publicados de nuestro laboratorio usando un
dominante negativo similar parecen indicar que dinamina tambien facilita el tráfico de SVCT2
(Covarrubias et al., 2012).
Para determinar en forma más precisa que una proteína es endocitada vía clatrina se pueden
estudiar los efectos de un dominante negativo de una proteína encontrada en vesículas recubiertas
de clatrina, llamada Eps15, y que es un adaptador necesario en las primeras etapas de la
endocitosis dependiente de clatrina (Benmerah et al., 2000). Experimentos como este, quedan en
el tintero para ser realizados mas adelante en nuestro laboratorio.
Después de ocurrida la endocitosis, el destino de las proteínas de la membrana plasmática
es determinado por un mecanismo de clasificación endosomal que dirigen a las proteínas ya sea
para la degradación en lisosomas o para reciclaje y dirigirse nuevamente a la membrana
plasmática (Wilcke et al., 2000; Maxfield y MacGraw, 2004). En el compartimiento endosomal,
las proteínas pueden volver directamente a la membrana plasmática o pueden reciclarse de nuevo
a la superficie de la célula después del tránsito a través del compartimiento de reciclaje endocítico
(REC) (Wilcke et al, 2000; Maxfield y MacGraw, 2004). La fusión inicial de las vesículas
endocíticas recubiertas de clatrina con los diferentes endosomas está regulada en parte por Rab5,
marcador de endosoma temprano asociado a proteína 1 (EEA1) y SNAREs (Wilcke et al, 2000;
Maxfield y MacGraw, 2004). Los endosomas tempranos son un importante compartimiento de
69
clasificación, en el cual se decide si su contenido va a ser transportado y liberado a lisosomas o
para ser reciclados hacia la membrana plasmática (Shepherd, 1989). El reciclado directo de la
moléculas parece implicar a Rab4, para el correcto tráfico desde los diferentes endosomas hacia
la membrana plasmática, y el reciclaje de proteínas desde el REC a la membrana plasmática
dependería de Rab11 (Wilcke et al., 2000; Maxfield y MacGraw, 2004). En el caso que seguir una
ruta hacia endosomas tardíos para su degradación, encontramos la presencia de Rab7 (Chavrier et
al., 1990; Gould, 1992).
Con los ensayos de inmunofluorescencia pudimos determinar la presencia de SVCT2 en
endosomas tempranos, ¿pero que estaría pasando después con el tráfico de este transportador?,
¿cuál sería su destino en la clasificación endosomal, a una posterior ruta de reciclaje o
degradación?. En endosomas tempranos, las proteínas pueden dirigirse a reciclaje para su vuelta a
la membrana plasmática o a lisosomas para su degradación (Wilcke et al 2000, Maxfield y
McGraw, 2004). Para estudiar la localización de SVCT2 en alguna de estas dos opciones; sería
necesario determinar si SVCT2 es dependiente de Rab11 para realizar su reciclaje o dependiente
de Rab7 para seguir una ruta hacia endosomas tardios para su degradación (Chavrier et al., 1990;
Gould, 1992). González y colaboradores (2007), determinaron que el reciclaje de EEAC1 es
dependiente de Rab11, utilizando el dominante negativo o una variante constitutiva activa de
Rab11 a través de ensayos de biotinilación y Western blot. Estos resultados sugirieron la idea que
EAAC1 es reciclado devuelta a la membrana plasmática via ERC en un proceso dependiente de
Rab11 (González et al.,2007).
Existen numerosas estrategias adicionales descritas a las realizadas en esta tesis para el
estudio de la regulación y el tráfico de transportadores que nos serían útiles, para tener más
claridad del tráfico de SVCT2. El fraccionamiento de la células es una forma útil para estudiar la
70
distribución y el tráfico subcelular de proteínas. El ensayo de fraccionamiento consta de dos
pasos principalmente: la desorganización de la membrana celular y el aislamiento de
determinados organelos celulares (Dealtry y Rickwood, 1992). Los transportadores de dopamina
han sido estudiados de esta manera para determinar su localización intracelular, por medio del
fraccionamiento de sinaptosomas purificados (Melikian y Buckey, 1999). El transportador de
dopamina no se encontró en las fracciones grandes y densas de vesículas o vesículas sinápticas,
pero si se encontró en endosomas. Específicamente en los endosomas fraccionados con el
receptor de transferrina, EEA1 y Rab5, que son marcadores de endosomas tempranos (Melikian y
Buckey, 1999). Utilizando la misma técnica se demostró que EEAC1 (transportador de
glutamato, aminoácidos excitatorios 1) se localiza junto a EEA1 en células C6 y cultivos
neuronales (González et al., 2007). Existe evidencia de que EAAC1 recicla dentro y fuera de la
membrana plasmática con una vida media de 5-7 minutos aproximadamente (Fournier et al.,
2004). Por lo que una inhibición de la endocitosis de EAAC1 debe resultar en una acumulación
de EAAC1 en la superficie celular (González et al 2007). Estas evidencias más las obtenidas por
González y colaboradores al usar sacarosa y concavalina A que causan una acumulación de
EEAC1 en la superficie celular en células C6 y el cultivos primarios de neuronas, son
consistentes con la idea que esta acumulación es causada por la inhibición de la endocitosis
constitutiva a través de una vía dependiente de clatrina.
Con lo expuesto anteriormente y la relación existente entre el ácido ascórbico y el
metabolismo cerebral, se plantean muchas interrogantes sobre la regulación aguda y el tráfico de
esta proteína: ¿Dónde esta el compartimiento intracelular de almacenamiento de SVCT2?, ¿Qué
señales inducen la endocitosis y exocitosis de SVCT2?, ¿Cuáles son los mecanismos por los
cuales SVCT2 seria internalizado?. Estas son algunas preguntas que faltan por responder que
71
envuelven a este transportador y su importancia en el sistema nervioso central y que dejan abierto
el tema para su estudio.
Con todos los resultados obtenidos durante el transcurso de esta tesis y a modo de
resumen podemos concluir que mediante análisis de TIRFM, inmunofluorescencia, ensayos de
biotinilación y ensayos funcionales se demuestra que SVCT2 es translocado a la membrana
plasmática en respuesta a la preincubación con ácido ascórbico. La inhibición de la endocitosis
produce un aumento de la localización de este transportador en la superficie celular causando un
aumento en el transporte de ácido ascórbico (figura 17). Nuestros resultados indican que la tasa
de reciclamiento de SVCT2 cambia y que se produce una disminución de su endocitosis. Esto
cobra importancia en órganos expuestos a variaciones agudas de la concentración de ácido
ascórbico como el cerebro, permitiendo un aumento en la eficiencia del transporte en
determinadas circunstancias fisiológicas.
72
Figura 17. Un aumento del ácido ascórbico extracelular es capaz de estimular un
incremento en la disponibilidad de SVCT2 en la membrana plasmática. A. En ausencia de
ácido ascórbico extracelular, SVCT2 debe estar reciclándose entre la membrana plasmática y
compartimientos vesiculares (endosomas). B. Cuando el ácido ascórbico extracelular aumenta la
concentración (por ejemplo, bajo activación sináptica) la endocitosis de SVCT2 es inhibida y la
disponibilidad de SVCT2 se incrementa en la membrana plasmática.
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