estudio del efecto sinérgico entre fármacos no
TRANSCRIPT
1
Estudio del efecto sinérgico entre fármacos no convencionales y
doxorrubicina para el tratamiento en células de carcinoma
colorrectal
Trabajo de grado en química
Juan David Galofre Benitez
Director:
Elizabeth Jiménez Díaz, Ph.D.
Palabras clave: Doxorubicina, Metformina, Losartan, Taurina, HCT-116.
Grupo de Investigación en Bioquímica Aplicada
Departamento de Química
Facultad de Ciencias
Universidad de Los Andes
Diciembre 2019
2
Agradecimientos
Quiero agradecer a mi mamá, Olga María Benitez, ya que sin ella nada de esto hubiera sido posible.
Su esfuerzo y dedicación día tras día han forjado lo mejor de mí. También quiero agradecer en
especial a mi primo, Ronald Romero Reyes, ya que siempre, de alguna forma estuvo pendiente de mi
educación superior. Quiero agradecer a mis tíos, a mis primos, y a toda mi familia por el apoyo en
estos años. También quisiera agradecer a la Dra. Elizabeth Jiménez Diaz por recibirme en el
laboratorio, escucharme, enseñarme y guiarme a lo largo de este trabajo. Quiero agradecer también a
Carol Melo por su paciencia, atención y colaboración a lo largo no solo en el proyecto, sino como
persona, amiga y parte fundamental de este proyecto. Agradecer también a Catherine Cabrera por el
apoyo incondicional que me brindó, a Felipe Alvarado y María Fernanda Gaviria por el apoyo y las
vivencias en el laboratorio. También agradecer a mis amigos por su apoyo, su constancia, su atención,
el tiempo y las experiencias que me llevaré. A Juan Pablo Diaz, Alejandro Velandia, Santiago Tijaro,
Valentina Gómez, Daniel Bustos y Miguel Beltrán. Agradecer también a Jhorman Farid Hernandez
y Maria Camila Rodriguez por el soporte que me brindaron en estos años y el tiempo compartido.
Agradezco al Departamento de Química de la universidad de los Andes, a los profesores y
laboratoristas, por brindarme la oportunidad de realizar el pregrado, brindar los espacios y formarme
como un profesional integral.
3
Contenido
1. Introducción…………………………………………………………………………
1.1 Las características del cáncer…………………………………………………...
1.1.1 Sostener una señal proliferativa………………………………………….
1.1.2 Evasión de supresión del crecimiento y resistir la muerte celular……….
1.1.3 Angiogénesis y metástasis……………………………………………….
1.1.4 Desregulación energética celular…………………………………………
1.2 Desarrollo de anticancerígenos…………………………………………………
1.3 Medicamentos no convencionales en cáncer………………………………….
1.3.1 Metformina……………………………………………………………….
1.3.2 Losartán………………………………………………………………….
1.3.3 Taurina……………………………………………………………………
3
5
6
7
8
9
11
13
13
16
16
2. Objetivos…………………………………………………………………………….
2.1 Objetivo general……………………………………………………………….
2.2 Objetivos específicos…………………………………………………………...
18
18
18
3. Métodos…………………………………………………………………………….
3.1 Extracción medicamentos……………………………………………………….
3.1.1 Extracción taurina…………………………………………………………
3.1.2 Extracción metformina……………………………………………………
3.1.3 Extracción losartán……………………………………………………….
3.2 Preparación de reactivos para cultivo celular…………………………………...
3.3 Procedimiento de pasaje celular………………………………………………...
3.4 Procedimiento conteo celular…………………………………………………...
3.5 Ensayo de viabilidad celular…………………………………………………….
19
19
19
19
19
19
20
20
21
4. Resultados y discusión……………………………………………………………...
4.1 Extracciones…………………………………………………………………….
4.2 Generación de líneas celulares hiperglucémicas……………………………….
4.3 Resultados IC50…………………………………………………………………
4.4 Ensayos de sinergia combinatoria de los fármacos…………………………….
23
23
30
31
36
5. Conclusiones………………………………………………………………………...
40
6. Referencias………………………………………………………………………….
41
7. Información suplementaria………………………………………………………….
45
4
1. Introducción
Cáncer es un grupo de más de 100 enfermedades las cuales se desarrollan a través del tiempo y su
principal característica es una reproducción no controlada de las células del cuerpo, además de la
capacidad invasiva celular1. Se puede clasificar esta enfermedad según el tejido de origen, puede ser
pulmón, colón, estomago, etc. Así también según el tipo de célula del cual se originaron, como
carcinomas, sarcomas, leucemias, etc2. El cáncer puede ser causado por múltiples factores3 que
pueden generar fenómenos en las células como inestabilidad genética, inflamación crónica o un
cambio en el metabolismo celular4,5. Es una enfermedad que afecta a la población mundial y es la
segunda enfermedad con mayor índice de mortalidad en el mundo (Figura 1). Los tipos de cáncer,
según tejido de origen, con una mayor tasa de mortalidad son: Seno, pulmón y colon, para el 20196.
Según proyecciones hechas por la WHO (World Health Organization) para el 2020 el cáncer seguirá
siendo la segunda enfermedad con mayor tasa de mortalidad, siendo pulmón con mayor mortalidad,
seguido de hígado y finalmente colorrectal7.Frente a la situación local, en Colombia se encuentra el
cáncer en la décima posición de mortalidad8, siendo los más comunes estómago, pulmón y
colorrectal9. Debido a la tasa de mortalidad, la incidencia mundial y el impacto local de esta
enfermedad, se considera importante investigar en el cáncer y diferentes formas de tratarlo.
Figura 1. Estimaciones de nuevos casos y muertes para 20196.
5
En la investigación sobre esta enfermedad, al tratar de explicar su alta incidencia en las personas a
nivel global y su consecuente mortalidad, se han llegado a diferentes puntos que permiten explicar
estos comportamientos. Se desarrollaron entonces 10 características del cáncer10 (Figura 2) que se
encuentran en común entre la mayoría de casos y que permiten explicar los comportamientos
encontrados en la enfermedad. A continuación, se comentarán algunos de los mas relevantes para el
enfoque de esta investigación
Figura 2. Las características del cáncer10,11.
1.1 Las Características del Cáncer
1.1.1 Sostener una señal proliferativa
Normalmente una célula prolifera en respuesta a diferentes factores de crecimiento, dependiendo del
tejido donde se encuentre , puede encontrarse el factor de crecimiento epidérmico (EFG) o el (FGF)
en el caso de los fibroblastos, en el caso de las plaquetas el (PDGF), etc12. Estos factores de
crecimiento se unen a sus receptores y provocan cascadas de señalización que resulta en diferentes
estímulos para el inicio del ciclo celular. Esto se ve controlado extensivamente desde la generación y
liberación de este tipo de señales para mantener una homeostasis celular a lo largo del tejido. Entonces
en el caso de las células cancerígenas, se necesita que esta señal se genere de manera independiente,
ya que de lo contrario no se daría un estímulo mitótico para la célula y no se tendría la generación de
un tumor10.
Esta independencia se puede lograr a partir de muchas maneras. Puede que la célula produzca el
propio factor de crecimiento, o que aumente la cantidad de receptores del factor de crecimiento lo
6
que ocasiona que la estimulación basal genere un efecto mayor en estas células. Puede también
interactuar con las células alrededor del tumor enviando señales para estimularlas y recibir a cambio
factores de crecimiento10.
Entrando en casos más específicos con algunas proteínas importantes para el desarrollo del cáncer,
en los sarcomas (tumores en los huesos o en los tejidos blandos) se genera una sobre expresión de la
(PDGF) lo que aumenta los estímulos de replicación celular. Esta sobre expresión de los factores tiene
que ver con mutaciones en las proteínas reguladoras del ciclo celular. Una de esas proteínas es la P53,
y mutaciones en esta proteína se han encontrado en 50% de los casos de cancer13. Otra forma en la
que se puede generar el estímulo proliferativo de manera independiente es por medio de la mutación
de la proteína ras. La proteína mutada está ampliamente encontrada en tumores de páncreas 90%,
50% en tumores de colon y 30% en tumores de pulmón. Ras es GTP (Guanosin trifosfato) dependiente
y funciona como un medio para transducción de señales. Al actuar con GTP se produce un cambio
conformacional que permite a esta proteína interactuar con las moléculas de señalamiento celular.
Finalmente se hidroliza el GTP a GDP(Guanosin difosfato) lo que ocasiona que esta se desactive. En
la forma mutada de ras, lo que sucede es que pierde la capacidad de hidrolizar el GTP por lo que se
mantiene activada. Esto ocasiona su interacción con cascadas de señalización mitogénica provocando
un estímulo constante para el crecimiento de la célula14.
1.1.2 Evasión de supresión del crecimiento y resistir la muerte celular
Como se estableció anteriormente, ciertas proteínas están encargadas de vigilar el ciclo celular para
que si se presenta alguna anormalidad como mutaciones o daños en el ADN, no se complete el ciclo
hasta su reparación o se dirija la célula hacia la apoptosis. Los genes que dan paso a las proteínas se
conocen como los genes supresores de tumores. Ejemplos de esta tipo de proteínas pueden ser la P53,
RB(Proteina del retinoblasto, PUMA, etc14,15.
La proteína RB está encargada de controlar un factor de transcripción llamado E2F, el cual activa los
genes necesarios para entrar en la fase S. Cuando se presenta un estímulo mitogénico se libera una
familia de proteínas llamadas ciclinas, específicamente la Ciclina D/ Cdk4, estas proteínas fosforilan
a la RB en el extremo C terminal lo que ocasiona un cambio conformacional generando la liberación
del E2F dando paso a la replicación. Las mutaciones encontradas en las células de cáncer provocan
cambios en los sitios responsables de la unión y la fosforilación, provocando así una falla en la
regulación a la fase S del ciclo celular14,15.
Por otro lado, la proteína p53 mencionada anteriormente, es llamada “ guardián del genoma”16 ya que
esta responde a múltiples estímulos como la presencia de nucleótidos insuficientes para la síntesis de
7
ADN, la sobre expresión de oncogenes, y lesiones al ADN como rompimientos de cadena sencilla,
aductos, longitud de los telómeros, etc. Ante estos estímulos, esta proteína puede responder mediante
el arresto del ciclo celular o la apoptosis. En su forma natural, esta proteína se encuentra asociada con
otra llamada Mdm2(Murine double minute-2) la cual la marca para la degradación. En presencia de
cualquiera de los estímulos, se presenta la acetilación y la fosforilación la cual la libera de la Mdm2
y pasa a actuar como un factor de transcripción. En el caso de daños en el ADN, las “Quinasas del
punto de control” al censar el daño, pasan a fosforilar a la p53 para que detenga el ciclo celular. Esto
sucede a partir de la liberación de la p21, la cual se une a los complejos Ciclina D/Cdk2 y Ciclina
D/Cdk4 inhibiendo la fosforilación de la pRB lo que impide la liberación del E2F inhibiendo el inicio
del ciclo celular.17Además de esto, esta proteína también está encargada de la apoptosis celular por
medio de varias cadenas de señalización incluyendo las proteínas FAS y FAS-L las cuales generan
proteínas llamadas caspasas las cuales son proteasas que generan el desmantelamiento de los
organelos. La mutación de la proteina FAS genera incapacidad de responder a estos estímulos, por lo
que la deleción o la mutación de esta provoca grandes desequilibrios en la célula18.
1.1.3 Angiogénesis y metástasis
Al igual que las células normales, los tumores requieren suplementación de oxígeno y nutrientes,
además de las vías de desecho para metabolitos y dióxido de carbono. En el desarrollo normal de una
persona, la generación de vasos sanguíneos se da cuando se generan heridas y en el ciclo reproductivo
femenino, pero este se ve sobre expresado en el ambiente de los tumores sólidos19.
En la figura 3 se puede ver la angiogénesis gracias a la expresión de factores de crecimiento secretados
por las células cancerígenas, en especial el VEGF y la angiopoietina los cuales regulan su crecimiento.
La extensión de estos vasos sanguíneos se da gracias a las proteasas segregadas en las células
epiteliales las cuales rompen la estructura base de la vena formando un espacio en donde se vuelven
a agregar estas células. Después de esto, proliferan las células epiteliales hasta formar una cavidad
vascular en donde se acumularán más células para formar la conexión entre la masa del tumor y la
vena (Figura 4).
8
Figura 3. Angiogénesis generada por células de cancer20.
Figura 4. Mecanismo de la angiogénesis19.
El origen de estos vasos sanguíneos no solo influencia en la adquisición de nutrientes, sino que
también influye en la invasión y la metástasis. Estas dos son un proceso por el cual la célula
cancerígena invade el tejido, luego algunas células penetran el vaso sanguíneo y son transportadas
hasta otro punto del cuerpo en donde puede llegar a formar micro tumores que en el caso de progresar
se convierte en una colonización10.
Para que esto suceda, se deben dar varias modificaciones en la célula para ser capaz de despegarse
del tejido en donde se encuentra y ser vascularizada. La E-cadherina es una de las responsables de
garantizar la estabilidad de la capa mediante uniones célula-celula, y esto se ha encontrado gracias a
una baja expresión en los tumores . Como contraparte se produce la N-cadherina la cual se presenta
solo en las migraciones durante la organogénesis la cual permite despegarse de la matriz extracelular
y permitir que la célula pase al vaso sanguíneo o al módulo linfático10.
Un ejemplo de este proceso es la transición epitelio-mesenquimal, la cual se puede observar en la
(Figura 5). Esta transición puede ser activada por diferentes factores, como puede ser la hipoxia, la
estimulación por factores de crecimiento, por citoquinas o por cambios metabólicos. Esta transición
consiste básicamente en la represión de las proteínas como la E-cadherina que liberan las uniones
9
célula-célula. Se expresa la N-cadherina y se desinhiben proteínas como Snail o Slug que permiten a
la célula individualizarse y la capacidad de migración5,21,22.
Figura 5. Transición epitelio-mesenquimal23.
1.1.4 Desregulación energética celular
Finalmente, la característica principal en la cual se enfocará este artículo es a la desregulación
metabólica que se genera en las células de cáncer. Como bien se mencionó anteriormente, se generan
vías de transporte nuevas para suministrar nutrientes a las grandes necesidades de la replicación
incesante cancerígena. Lo conlleva a la necesidad de una ruta alterna para recibir estos nutrientes y
convertirlos en materia prima para el desarrollo de nuevas células tanto como para el mantenimiento
de las pre-existentes10.
Las células normales en condiciones aeróbicas convierten la glucosa en piruvato en el citosol y luego
a dióxido de carbono en la mitocondria gracias al complejo respiratorio, mientras que en condiciones
anaerobias se reduce el consumo de oxígeno al máximo utilizando la glicolisis para luego terminar el
proceso con fermentación láctica24. En las células de cáncer, en condiciones aerobias, se presenta la
fermentación láctica. Lo que es contradictorio debido a que hay una gran diferencia en la cantidad de
ATP producida por las dos vías, siendo la vía de la fosforilación oxidativa la mayor productora de
esta molécula. Una posible explicación a este fenómeno es debido al gasto de biomoléculas necesario
para mantener la replicación celular incesante10.
Esta ruta ha sido estudiada como posible objetivo terapéutico utilizando el ácido bromo pirúvico25, el
cual es un inhibidor efectivo del gliceraldehido fosfato hidrogenasa, la cual permite acoplar la
segunda molécula de ATP al gliceraldehido-3-fosfato y así empezar la fase de ganancia energética de
la glucolisis. Lo que se encontró26 fue que no funciono tan bien con todos los pacientes a los que se
10
les trató y además se determinó que algunas células de cáncer de mama tenían la mitocondria activa.
Por lo que se encontró una discrepancia.
Análisis posteriores demostraron la importancia de los fibroblastos que rodean las células
cancerígenas, debido a que se encuentran cerca al microambiente del tumor26. A partir de estos se
postuló el efecto Warburg reverso, el cual consta de un efecto entre las células cancerígenas y los
fibroblastos. En donde las células de cáncer liberan ROS al medio produciendo estrés oxidativo en
las células normales adyacentes lo cual produce un efecto de glicolisis aeróbica en estas debido a la
desregulación de la caevolina-1. Esto hace que se liberen múltiples moléculas como piruvato, lactato,
cuerpos cetónicos y ácidos grasos al ambiente. Los cuales pueden ser reabsorbidos por la célula
cancerígena y procesados en la mitocondria para obtener la producción de ATP de la fosforilación
oxidativa. Por lo que, al estar frente a dos procesos relativamente inversos, se llega a la pregunta de
cómo se distribuyen estos dos en la célula de cáncer.
La respuesta que se ha encontrado es que se crea una flexibilidad celular lo cual permite una simbiosis
en la medida en la que el tumor se desarrolla27. En la figura 6 se observa las dos poblaciones que se
pueden observar en un tumor sólido, la primera representada con el color azul, son las células con
bajas concentraciones de oxígeno debido a la posición relativa a la vena. Las células de color rojo son
las más cercanas a la vena por lo cual contienen mayor oxigenación. Entonces se da un efecto
Warburg en las células poco oxigenadas lo cual hace un uso eficiente del poco oxigeno disponible
liberando grandes cantidades de lactato hacia el medio en donde las células cercanas a la vena usan
un proceso de Warburg reverso utilizando la mitocondria para producir energía eficientemente.
Figura 6. Simbiosis celular27
11
Este balance entre Warburg y Warburg reverso se ve determinado en las enzimas que se sobren
expresen, lo cual está relacionado con el ambiente del tumor, Por ejemplo, las células más alejadas
de las venas van a tener aumentando el marcador de hipoxia HIF-1 , un factor de transcripción que
responde a las concentraciones de oxígeno28. Este heterodímero cuenta con dos subunidades, y en
condiciones normales la subunidad 1 se ve hidroxilada por la 4-prolil-hidroxilasa, la cual hidroxila
residuos de prolina. Esta proteína modificada es rápidamente ubiquitinada por la ligasa E3. Una vez
pasa por este proceso, es degradada en la proteasoma 26S. Además de esto, también hay un inhibidor
del HIF-1 el cual es el FIH-1(factor de inhibición 1) el cual funciona hidroxilando residuos de
asparagina en el HIF-1 por lo que está ya puede cumplir su función de factor de transcripción. Estas
dos necesitan oxigeno como cofactor, por lo que una vez bajan las concentraciones de oxígeno, los
dos procesos disminuyen y este factor de transcripción queda libre para actuar.
Al estar en concentraciones bajas de oxígeno entonces, la HIF-1 activa la transcripción de proteínas
como el LDH-A, MCT-4, GLUT-1 y PDK. LDH-A codifica para el lactato deshidrogenasa, por lo
que todo piruvato que salga de la glucolisis va a ser orientada a la fermentación láctica, disminuyendo
la concentración de este para transformarse en acetil-CoA, por lo que hay menos sustrato para el ciclo
del ácido cítrico, lo que quiere decir poca fosforilación oxidativa. El transportador MCT-4 libera el
ácido láctico de la célula, del cual podrán aprovechar las células más cercanas a las fuentes de
oxígeno29. El GLUT-1 es el transportado de glucosa que se sobre expresa aumentando la entrada de
glucosa a la célula, lo cual aumenta la concentración de piruvato y es necesario para la supervivencia
de la célula debido a la diferencia en producción de ATP de la fermentación láctica vs la fosforilación
oxidativa. Finalmente, la PDK actúa como un inhibidor de la piruvato deshidrogenasa, lo que inhibe
la conversión de piruvato en acetil-CoA28.
1.2 Desarrollo de anticancerígenos
Gracias al conocimiento de todos estos procesos celulares y la forma de caracterizarlos, se han podido
desarrollar cada vez drogas más selectivas para las células cancerígenas y menos dañinas para el
hospedero. En 1940 se empezó usando Mostaza nitrogenada, el cual es un derivado del gas mostaza
altamente mutagénico. Este funciona, a grandes rasgos, haciendo un puente entre dos guanidinas
mediante la generación de un anillo de aziridinio gracias al ataque nucleofílico del nitrógeno de la
amina. Esto genera una densidad de carga positiva en el carbono alfa al nitrógeno el cual es atacado
por el nitrógeno de la guanidina. El proceso se repite dos veces y se crea un crosslink en el ADN entre
dos guaninas como se puede observar en la Figura 7. Un mecanismo similar sigue una droga más
actual como el cisplatino.
12
Figura 7. Mecanismo de Mostaza nitrogenada y cisplatino30.
Después se encontró una droga. el paclitaxol en 1970. En aspectos generales, el paclitaxol afecta la
tubulina, la cual crea microtúbulos a partir de la acumulación de heterodímeros alfa y beta tubulina.
Estos son cruciales para la mitosis ya se inhibe su despolimerización lo que conlleva a que el
cromosoma no pueda alcanzar la configuración necesaria para alcanzar la siguiente fase31. Drogas
similares como las taxinas y los vinca alcaloides actúan de manera similar.
Junto con las taxinas se crearon las antraciclinas, una de las cuales es la doxorrubicina, esta se usa
hasta el día de hoy. Este tipo de medicamento actúa por medio de la intercalación en el ADN por lo
que estabiliza el complejo del ADN con la topoisomerasa II lo que conlleva a bloquear la religación,
generando rompimientos de la doble cadena y estrés oxidativo y finalmente a apoptosis. Aparte de
este se han generado muchos otros mecanismos, incluyendo también la generación de radicales libres
o más recientemente la inhibición de la síntesis de ceramida, lo cual lleva a un factor de transcripción
CREB3L1 a activarse en el núcleo activando la p21 lo cual conlleva a un arresto celular según se vio
anteriormente32,33.
Pero conforme se descubrieron estos medicamentos, se descubría que algunos no eran tan eficientes
como otros. Generalmente puede venir de dos lados, factores del paciente y factores del cáncer como
tal. Lo primero se refiere a la absorción, metabolismo y excreción diferencial entre las personas, ya
que si un individuo lo metaboliza bastante rápido la concentración en el suero será baja por lo que no
estará a la concentración adecuada para ejercer el efecto terapéutico, También se refiere a la edad del
paciente, ya que en pacientes más ancianos se dificulta aplicar las dosis correctas por sensibilidad al
medicamento, así que las dosis deben ser reducidas. Por otro lado, puede deberse al metabolismo del
medicamento por células sanas adyacentes al tumor, la dificultad de penetración en un tumor solido
debido al tamaño de ciertos medicamentos (como anticuerpos monoclonales) y finalmente a la
heterogeneidad del cáncer como tal, Esto quiere decir que aun en el mismo tumor, puede que existan
13
dos o más líneas de mutaciones en las células, por lo que se puede encontrar que una parte del tumor
es resistente mientras que la otra no. Además, la naturaleza y las mutaciones del cáncer varían de
paciente a paciente, y de tejido a tejido, por lo que una cura definitiva a esta enfermedad es complicada
de obtener34.
1.3 Medicamentos no convencionales en cáncer
También se ha encontrado que usando medicamentos para otros fines se ha podido reducir la
viabilidad de las células de cáncer. Por ejemplo, usando sirosingopina el cual es un antihipertensivo
en conjunto con metformina, un inhibidor del complejo II de la mitocondria, se encontró una
inhibición en el crecimiento de diferentes líneas de cancer35.
1.3.1 Metformina
La metformina es un medicamento ampliamente usado en el tratamiento de la diabetes mellitus tipo
II. Aunque también se ha encontrado que reduce la probabilidad de cáncer en pacientes que la usan
regularmente. Se cree que este efecto de la metformina es debido a la inhibición del complejo
oxidativo en las células de cáncer lo que activa la AMPk debido al desbalance en la relación entre
ATP:ADP. Una vez se activa la AMPk(Quinasa dependiente de AMP), se inhibe el complejo de
MTORC1 anteriormente mencionado lo que resulta en una inhibición del crecimiento celular y una
reducción en la síntesis de proteínas. Además de esto, puede que la metformina también inhiba el
complejo de MTORC1 por medio de la ruta I/IGF haciendo que la actividad del receptor disminuya36.
Si se da el caso que únicamente la vía PI3K/Akt/mTORC137,38 se activa por medio de los receptores
de IGFR, puede incluso que la metformina inhiba la síntesis de biomasa como colesterol y ácidos
grasos debido a que se inhibiría la activación del metabolismo mitocondrial necesario para crear esa
biomasa de manera anabólica.
Además de esto, se han venido encontrando relaciones entre el cáncer y la diabetes. Como se conoce
bien, la hiperglicemia es un estado de alta concentración de glucosa en el cuerpo. En un humano
puede deberse a la insuficiencia de la insulina (diabetes mellitus tipo 1) o la resistencia progresiva
que adquiere el cuerpo a la insulina por acción de diferentes factores (diabetes mellitus tipo 2), uno
de ellos, los liposomas, pueden unirse a los receptores de insulina anulando la acción del ligando.
Este estadio de hiperglicemia favorece los factores de crecimiento I/IGF los cuales dan paso a la
cascada de señalización P13K/Akt resultando en una absorción mayor de glucosa en la célula
provocando el efecto Warburg. No solo se encuentra este fenómeno en común, la reprogramación
metabólica, sino que también se encuentra la inflamación como una constante en los pacientes, lo que
genera que factores como las interleucinas se encuentren presentes en una mayor concentración en
14
pacientes con diabetes, lo que a la larga explica la relación entre diabetes y cáncer, con un índice de
riesgo relativo de 1.3 aproximadamente39.
Teniendo en cuenta esto, la importancia que toma la hiperglicemia en el desarrollo cáncer es alta, ya
que se sobre estimulan factores de crecimiento, como el EGF en el caso del cáncer del páncreas y
factores transportadores de glucosa. Esto a su vez aumenta la expresión de genes como D
Ciclina/Cdk2 y el E2F que en un ambiente donde la pRB o la p5313 se encuentren mutados, aumentara
la proliferación lo que incrementara las probabilidades de desarrollo de cáncer en las células
hijas40.Sin embargo, se ha encontrado que las concentraciones para que la metformina sea efectiva
como anticancerígeno son muy altas y dependientes del tipo de tejido al cual será sometido. Por esta
razón es la que Benjamin et all35 utilizaron la sirosingopina, ya que les permite bajar la concentración
de metformina a niveles aceptables para el uso.
Figura 8. Sirosingopina y metformina frente a líneas de cáncer: HL60 Leucemia promielotica, OPM
2 mieloma múltiple, HT1080 fibrosarcoma, ex vivo AML7991 mieloblastos leucémicos y PBC1
células de sangre periféricas35.
En la Figura 8 se encontraron diferentes concentraciones de sirosingopina contra 4mM de
metformina. Se encontró que es efectivo para líneas de cáncer como HL60, OPM y no obtuvo un
resultado tan marcado para las PBC1. Se realizó un ensayo de viabilidad celular con anexina V para
las células HL60 para observar la cantidad de células apoptóticas con las diferentes concentraciones
y se encontraró una mayor cantidad de celulas apoptóticas en los tratamientos metformina más
sirosingopina que en los tratamientos indivudales. Se repitió el ensayo, esta vez con una concentración
constante de sirosingopina de 5 μM. En este encontraron que la concentración mínima de metformina
15
con esta concentración del antihipertensivo fue de 2 mM, como se puede ver en la Figura 9,
comparado con metformina sola que esta alrededor de 30mM. Encontraron una concentración de 2nM
con respecto al análogo más fuerte de la metformina, la fenformina. A estos efectos sinérgicos se les
atribuye que los inhibidores del complejo mitocondrial se le suma la inhibición de la alfa enolasa por
parte de la sirosingopina. La alfa enolasa es la enzima encargada de transformar fosfoenolpiruvato en
2-fosfoglicerato en la glicolisis, por lo que esto proporciona un decaimiento en el suplemento tanto
de ATP como de biomasa para las células cancerígenas lo cual resulta en la apoptosis de estas.
Figura 9. Ensayo de viabilidad celular con anexina V. En las gráficas de citometría el lado inferior
derecho, encerrado en un cuadro negro, se encuentran las células pro apoptóticas y el lado inferior
izquierdo, encerrado en un cuadro rojo se encuentran las células viables.
Figura 10. Diferentes concentraciones de metformina y otros antidiabéticos con 5μM de
sirosingopina, ensayos hechos en contra de células HL6035
Debido a los resultados encontrados en este artículo, se evaluaron otros posibles inhibidores de la alfa
enolasa. Se encontraron varias tetraciclinas como posibles inhibidores de la alfa enolasa según Jung
et all41 como se puede observar en la Figura 11. A partir los resultados del docking molecular se
16
encontró que el Losartan, medicamento aprobado por la FDA que se una contra la hipertensión, en su
estructura posee este motivo estructural. Y a partir de los inhibidores ya encontrados se puede
observar que un heteroátomo se encuentra siempre en la posición 4 a partir del grupo fosforo, por lo
que se pensó en un compuesto común como la taurina.
Figura 11. Resultados del screening virtual. Moléculas en línea punteada son ligandos naturales y
moléculas en línea solida son inhibidores ya conocidos41.
1.3.2 Taurina
Estos dos componentes per se tienen acciones sobre las células de cáncer42. Se ha encontrado que la
taurina tiene potencial anticancerígeno, es útil en tratamientos contra cataratas, diabetes y
enfermedades cardiovasculares. Se ha encontrado una baja concentración de taurina en los pacientes
con cáncer de mama, por lo que puede servir como un biomarcador para este tipo de cáncer. También
se ha reportado el potencial anti-oxidativo de la taurina y su protección a la mitocondria, por lo que
hacer un tratamiento junto con un agente quimioterapéutico garantiza el bienestar de las células
normales y por otro lado selectivamente promovería la apoptosis en células cancerígenas43.
1.3.3 Losartán
Frente al Losartan, es un inhibidor de la angiotensina II, un factor importante ya que a partir de la
activación del AT1R (receptor de angiotensina 1) se desprenden muchas cascadas de señalización
importantes para el control de la angiogénesis, el re-modelamiento vascular, la proliferación y
diferenciación celular44. Según Coulson et all45, al provocarle cáncer a roedores de manera química,
se encontró que el tratamiento con Losartan dejaba el 20% de los individuos sin tumores visibles 100
días después del evento carcinogénico. Por lo que se cree que el Losartan, ejerciendo su actividad
17
anti-angiogenica pudo ayudar a mantener estable la enfermedad en la mayoría de los ratones. Al ser
un inhibidor de la angiotensina 1, tiene otra consecuencia en el ambiente tumoral y es la reducción
de la producción de colágeno a partir de la reducción de la expresión del gen TGF-B1. Se encontró46
que reducía la actividad de la proteína un 90%, pero reducía de manera leve la presencia de la proteína
en el citoplasma. Debido a que no se ha reportado actividad meramente antitumoral, cabe la
posibilidad de que se desarrolle resistencia al Losartan en las células de cáncer a partir de los
mecanismos anteriormente mencionados.
Tanto la Taurina como el Losartan tienen prospectos antitumorales característicos; como la apoptosis
producida por la taurina y el estrés oxidativo reducido en las células no-cancerígenas y la reducción
de la angiotensina la cual afecta la penetración del medicamento en los estudios realizados47. Además
de esto ambos medicamentos tienen estructuras similares a las encontradas para la inhibición de la
alfa-enolasa por lo que se presentaría la posibilidad de un mecanismo antitumoral aun no reportado.
Así mismo se estudiará la influencia de estos fármacos en la resistencia de las células cancerígenas,
para observar formas alternativas y comunes, los dos medicamentos son aprobados por la FDA y
tienen venta libre en el país.
Debido a lo anterior, en este proyecto se pretende evaluar la sinergia entre un inhibidor del complejo
mitocondrial, como la metformina e inhibidores de la glicolisis como pueden ser la taurina o el
losartán. Además de esto se evaluarán las actividades de estos medicamentos tanto en medios
normoglucémicas como hiperglucémicos para determinar si existe una diferencia en la respuesta
frente a los medicamentos, debido a la influencia metabólica del medio y de los fármacos.
18
2. Objetivos
2.1 Objetivo general
• Estudiar el efecto de fármacos no convencionales en células de cáncer colorrectal
(HCT-116) y su sinergia en medio normoglucémico e hiperglucémico.
2.2 Objetivos específicos
• Extraer Metformina y Losartan de pastillas comerciales.
• Desarrollar líneas de cáncer hiperglucémicas
• Evaluar los IC 50 de la Metformina, Losartan, Taurina y Doxorrubicina en líneas de
cáncer (Medio con glucosa basal e hiperglucémico)
• Evaluar las combinaciones de los medicamentos mediante un ensayo MTT
19
3. Metodos
3.1 Extracción de medicamentos
3.1.1 Extracción Taurina
Se adquirió la taurina comercialmente y se le tomó un espectro de H1RMN y ESI-QTOF para
comprobar su pureza.
3.1.2 Extracción Metformina
Para la extracción de la Metformina se maceró una pastilla en un mortero, se transvasó a un beaker y
se disolvió en 20 mL de diclorometano. Luego, se filtró la solución y se descartó el filtrado.
Al residuo se le adicionaron 40 mL de agua y se volvió a filtrar, esta vez recuperando el filtrado.
Posteriormente, se retiró el agua a presión reducida, y para esto se adicionó una pequeña cantidad de
etanol para formar el azeotropo y facilitar la extracción. Finalmente, se lavó el polvo obtenido con
3x10 mL de etanol, obteniendo la Metformina HCl.
3.1.3 Extracción Losartan
Para la extracción del Losartan se maceraron 3 pastillas en un mortero, se pasaron a un vaso de
precipitado y se disolvieron en 30mL de diclorometano. Luego de filtrar, se disolvió el filtrado en 20
mL de etanol. La solución se volvió a filtrar conservando esta vez el residuo. Se retiró el etanol a
presión reducida para obtener un sólido blanco.
Este solido se disolvió en la menor cantidad de agua posible y se bajó el pH de la solución hasta 1.3
aproximadamente. Se dejó agitar por 1 hora para luego dejar reposar la solución durante toda la noche.
Se realizaron 3 lavados con 5 mL de agua al precipitado obtenido. Finalmente se disolvió el
precipitado en etanol y se agrega una cantidad equimolar de KOH con la cantidad de Losartan que se
encontraba en las pastillas. Se agitó la solución por 2 horas, se filtra y se retiró el solvente a presión
reducida para obtener Losartan potásico.
3.2 Preparación de reactivos para cultivo celular
Para el crecimiento de las células de cáncer colorrectal, se requiere el medio RPMI (Roswell Park
Memorial Institute) el cual se prepara a partir de la suspensión de un paquete de medio en polvo en
900mL de agua tipo 1. Se añaden 2 g de bicarbonato de sodio y se ajusta el pH a 7.1-7.4 con una
solución de HCl para después filtrarlo a través de un filtro de 0.22 μm.
Después se añade una solución de suero fetal bovino al 10% V/V junto con una solución al 1% V/V
de penicilina/estreptomicina. Estos también se filtran a través del filtro de 0.22 μm. Esto se añade a
890 mL del medio anteriormente preparado. Esta solución se puede almacenar a 4°C. Para preparar
20
el medio de cultivo hiperglucémicos se añadieron 0.126 g a 50 mL de la solución de medio y se
guardaron en un falcón para su uso.
3.3 Procedimiento de pasaje celular
Para el pasaje celular se requieren dos soluciones, PBS(buffer fosfato-salino) 1X y tripsina. El PBS
se prepara usando 8g de NaCl, 0.2g de KCl, 1.44g de Na2HPO4 y 0.24g de KH2PO4. Esto se ajusta a
un pH de 7.4 con una solución de NaOH 1M. Se afora la solución, se esteriliza por medio de una
autoclave y se filtra con un filtro de 0.22 μm. Finalmente se llevó la solución a 1L usando agua tipo
1. Esta solución se puede almacenar a 4°C.
La solución de tripsina se prepara diluyendo una solución de tripsina 100x en HBSS, la cual consiste
de 8g de NaCl, 0.2g de KCl, 1.44g de Na2HPO4 y 0.24g de KH2PO4, 1g de glucosa y 0.35g de
NaHCO3. A 800mL de esta solución, se le añaden 100 mL de tripsina/EDTA y se ajusta el pH a 7 con
una solución de 1M NaOH. Se aforó a 1 L y se filtró con un filtro de 0.22 μm. Este se puede almacenar
a -20°C.
Una vez preparadas estas soluciones, el pasaje celular se realiza de la siguiente manera:
a. Se retira el medio presente.
b. Se realizan lavados sucesivos con PBS 1x (3x4 mL) para retirar completamente el
medio,
c. Se agregan 1.5 mL de tripsina y se incuba de 5 a 10 minutos dependiendo de la
cantidad de células presentes.
d. Una vez pasado el tiempo, se agrega una cantidad igual de PBS 1X en la caja para
neutralizar la tripsina y se retira la solución en la caja de cultivo a un falcón.
e. Se centrifuga a 1,300 rpm por 3 minutos.
f. Se retira el sobrenadante y se resuspende el pellet en 2 mL de medio.
g. En el caso de querer realizar un “Split” de las células, se toma 1 mL de este y se
regresa a la caja original mientras que el otro mililitro se adiciona en la nueva caja.
h. Se adiciona 4mL de medio a las cajas donde se realizaron los pasajes.
3.4 Procedimiento conteo celular
Para la conocer la densidad celular presente necesaria para poder realizar cualquier ensayo celular de
manera reproducible, se necesita contar el número de células presentes en cierto volumen de la
solución. Esto se realiza utilizando una cámara de Neubauer con una profundidad de 0.1mm. Se
21
calcula el volumen de la cámara asumiendo una forma rectangular, por lo que el volumen total es de
0.0001mL.
Volviendo al paso 6 del procedimiento de pasaje celular se resuspende el pellet pero esta vez en 3 mL
de medio y se agregan estos 3 mL a la caja original. Se toman 40 μL de la solución de células y se
colocan en un pozo de una placa de 96-pozos. Se adicionan 20 μL de azul de tripano 0.4%W/V en el
pozo contiguo y realiza una dilución 1:1 con 20 μL de cada caja. Finalmente se coloca una laminilla
en la cámara y en el espacio resultante se adicionan 10 μL de la dilución previamente realizada. Se
realizar el conteo de células en la cámara, el cual se realiza en los cuadrantes superior izquierdo,
superior derecho, inferior izquierdo e inferior derecho.
Finalmente, para la determinación de la densidad celular, se puede utilizar la siguiente formula
(Ecuación 1)
𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
0.0001𝑥2 = #𝐶𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠/𝑚𝐿
3.5 Ensayo de viabilidad celular.
El ensayo más común para detectar células viables es el ensayo con MTT (bromuro de 3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio). En este ensayo se utilizan una variedad de derivados de
tetrazoles como el MTS, XTT y WST. Se diferencian en que el MTT al estar cargado positivamente
puede penetrar las células mientras que MTS, XTT y WST son cargados negativamente y no logran
penetrar la célula. Además de esto, estos últimos son usados con un intermediario, el más común es
fenazina metosulfato, el cual es un aceptor de electrones que facilita la reducción del tetrazol fuera
de la célula.
El principio de este ensayo radica en que las células viables metabólicamente podrán reducir el MTT
en una molécula de formazan la cual forma un precipitado elcual absorbe a 570nm. Esto se realiza a
través de la actividad encontrada en la mitocondria, específicamente cualquier enzima reductasa que
puede tener como cofactor NAD(P)H puede realizar la reducción al formazan (El esquema se puede
encontrar en la Figura 12). La cantidad de formazan producido depende del tiempo de incubación al
que se someta a las células con este compuesto y a la viabilidad de las células.
El formazan es insoluble y se precipita tanto dentro de la célula como en la superficie de esta y en el
medio celular, por lo que se debe solubilizar para realizar una lectura espectrofotométrica. Con este
fin, se usa DMSO, SDS o isopropanol acidificado. Teniendo en cuenta que la mayoría de los cultivos
22
celulares utilizan medios con rojo de fenol, se puede usar el isopropanol para eliminar la posible
interferencia de este en la medición.
Figura 12. Mecanismo de reducción del formazan en un ensayo MTT.
Para realizar el ensayo de MTT, se realiza el siguiente] procedimiento.
a. En una caja de 96-pozos, se añaden 100 μL de una solución de células, de tal
manera que queden 10.000 células por pozo. Es decir, con una densidad de
2,000 células por mililitro.
b. Transcurridas 24 horas de las células en la incubadora, se adicionan los
tratamientos a evaluar (100 μL). En el caso de este proyecto, se adicionaría
la Metformina, Metformina +Taurina, etc.
c. A las 72 horas de la etapa previa, se adicionan 25 25 μL de una solución de
1mg/mL de MTT dejando en incubación por 3 horas.
d. Una vez pasadas las 3 horas, se retira la solución del pozo y se disuelve el
MTT precipitado en 200 μL de DMSO. Una vez terminado esto, se puede leer
el ensayo a 595nm.
Con este ensayo, se puede medir la concentración inhibitoria al 50%, es decir IC 50. Realizando una
gráfica donde se tomen 6 puntos a diferentes concentraciones del reactivo que se desee evaluar, en
este caso la DOX, se realiza una curva de calibración con un porcentaje de inhibición relativo a la
absorbancia del control del ensayo. A partir de esto, se interpola el 50% en la ecuación para conocer
este dato. Puede darse el caso en que la curva sea lineal, por lo que se usara una interpolación del
mismo tipo, o que no sea lineal. En el caso en que no es lineal se comparará entre diferentes
modelos(Polinómico, 3 a 5 parámetros, exponencial, asintótico) mediante el uso de estadísticos como
el criterio de información de akaike(AIC) o el lack-of-fit test los cuales proponen la mejor relación
entre el numero de parámetros y el ajuste del modelo a los datos.
23
4. Análisis de resultados y discusión
4.1 Extracciones
Para la extracción del hidrocloruro de metformina, la metodología se planteó a partir de los
excipientes de la pastilla Diglufor ®. Los excipientes no se encontraban disponibles en la información
provísta por la farmacéutica. Por lo cual, se recopilaron las listas de excipientes de varias
pastillas con principio activo para plantear la ruta con los componentes más comunes48–52. Después
de la revisión, se clasificaron los excipientes según su localización en la pastilla (núcleo o recubierta):
Núcleo
• Celulosa microcristalina
• Almidón glicolato de sodio
• Povidona
• Estearato de magnesio
• Metformina
Recubierta de la pastilla
• Hipromelosa
• Dióxido de titanio
• Macrogol 6000
Teniendo esta lista de excipientes se revisó su solubilidad53, y se diseñó la extracción de forma que
estos se iban retirando a partir de extracciones solido-liquido. Partiendo de lo anterior,
se buscó solventes en donde se disolvieran los excipientes, pero el principio activo no, y viceversa.
Tabla 1. Tabla de solubilidad para los componentes de la metformina14.Las convenciones de la tabla
son X = No soluble, O = Soluble. *No se encontraron características relevantes.
Listado Agua Etanol DCM Comentarios
1 Celulosa microcristalina X X X Soluble en medio básico
2 Almidón glicolato de sodio X X X *
3 Povidona O O O *
4 Estearato de magnesio X X X Soluble en etanol caliente
5 Metformina O O X Medianamente soluble en etanol
6 Hipromelosa O X X Soluble en mezclas de agua y etanol
7 Dióxido de titanio X X X Sólo soluble en ácidos
8 Macrogol O O O *
24
Se maceró la pastilla de Diglufor®, hasta que esta fue homogenizada por completo y se agregaron 20
mL de diclorometano. Se filtró al vacío la suspensión, y el sólido remanente fue lavado de nuevo con
5 ml de diclorometano. Según las solubilidades, al aplicar diclorometano se retiraron povidona y
Macrogol, mientras que en el solido se conservarían los demás. Se filtró la solución, y al filtrado se
le agregó etanol, en proporción 1:3, para la formación de un azeótropo que facilitará el proceso de
evaporación a presión reducida.
Se agrego 30 mL de etanol al sólido obtenido posterior a la evaporación, se agitó la solución y fue
filtrada nuevamente. En solución se esperaba que quedara la metformina y en forma solida quedara
la hipromelosa. Por lo cual, el filtrado se sometió a evaporación a presión reducida y se caracterizó
el sólido obtenido por medio de RMN y con ESI-QToF. Las señales obtenidas tanto en el espectro de
RMN (Figura 13) corresponden a lo reportado para la metformina54,55; adicionalmente, en estos
espectros no se detectó la presencia de otra sustancia sugiriendo que el sólido obtenido es puro.
Figura 13. Espectro de RMN. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.22 (s, 2H), 6.81 (s,4H),
2.90 (s, 6H). La señal de 3.5 ppm corresponde a agua y 2.5 ppm a DMSO.
Finalmente, debido a la sensibilidad de los equipos de masas se decidió tomar un ESI-QToF. En la
(Figura 14) se puede ver el TIC (Total Ion Current ) en donde solo se observan dos señales, las cuales
corresponden a la fragmentación de la metformina (Figura 15). Además, esto corresponde a lo
reportado en la literatura56,57.
25
Figura 14. TIC del extracto de metformina y lista de señales.
Figura 15. Posible fragmentación de metformina.
Para la extracción del principio activo del losartán potásico, se utilizó una pastilla de
marca Sandoz. La razón por la cual se escogió esta formulación es porque a diferencia de la
metformina esta tenía una lista de excipientes58. Para el diseño de la extracción se realizó un
procedimiento similar a la extracción de la metformina. La tabla de solubilidades de los excipientes
con respecto al losartán se encuentra a continuación (Tabla 3).
Tabla 3. Tabla de solubilidad para los componentes del losartán potásico formulación de Sandoz. Las
convenciones de la tabla son X = No soluble, O = Soluble. *No se encontraron características
relevantes.
# Listado Agua Etanol DCM Comentarios
1 Celulosa microcristalina X X X Soluble en medio básico
2 Almidón glicolato de sodio X X X *
3 Povidona O O O *
26
4 Estearato de magnesio X X X Soluble en etanol caliente
5 Losartán O O X *
6 Hipromelosa O X X Soluble en mezclas de agua y etanol
7 Dióxido de titanio X X X Solo soluble en ácidos
8 Macrogol O O O *
9 Carboximetilcelulosa sodica O X X *
10 Dióxido de silicio X X X Formas coloides con el agua
11 Lactosa monohidrato O X X *
12 Índigo Carmin O O O *
Se macero la pastilla de losartán y se realizaron 3 lavados de 10 mL cada uno con diclorometano,
eliminando así el índigo carmín, el macrogol y la Povidona. Se filtro al vacío y se conservó el solido.
Después se agregaron 30 mL de etanol, se filtró y se guardó la solución. Según la tabla de
solubilidades de excipientes, en etanol solo debería ser soluble el losartán. Por lo que a la solución se
le retiró el solvente a presión reducida. Debido a que cuando se tomó el espectro se encontraron
señales para el índigo carmín se decidió realizar una extracción acido-base utilizando la diferencia de
pKa entre el Losartan potásico y el índigo.
Entonces se solubilizo el extracto obtenido hasta este punto en agua y se colocó el pH en 1.3 con
ácido clorhídrico. Esta solución se dejó 16 horas para obtener un precipitado el cual es el Losartán en
forma acida. Se realizaron lavados con agua (3 lavados de 10 mL) para retirar cualquier sustancia
soluble. Finalmente, para devolver el Losartan a su forma potásica se pesó la cantidad de precipitado
obtenido, se solubilizo en isopropanol y se hizo reaccionar cantidades equimolares con KOH en
acetonitrilo durante dos horas. Una vez terminada la reacción, se retiró a presión reducida el solvente
para obtener Losartan potásico libre de índigo carmín.
Para la confirmación de la molécula de Losartan, se tomó un espectro de H1RMN (Figura 16) y ESI-
QToF (Figura 17). En el espectro de H1RMN se pueden observar las señales correspondientes con
los reportados en la literatura para el losartán potásico, varias señales satélites alrededor de 2.5 ppm,
los cuales pueden corresponder al intercambio de protones entre el solvente (DMSO) y agua presente
en el mismo. La presencia de agua se puede evidenciar en la señal 3.5 ppm. Además de estas señales,
se puede observar la presencia de etanol en la muestra a partir de la señal en 1.0 ppm la cual acopla
con una señal alrededor de 3.44 ppm lo que corresponde a los dos hidrógenos adyacentes del etanol59.
27
Figura 16. Espectro de RMN. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.54 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 7.32
(d, J = 24.9 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 7.1 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 7.9 Hz,
1H), 5.21 (s, 1H), 4.31 (s, 1H), 2.51 (t, J = 13.8 Hz, 9H), 1.58 – 1.40 (m, 1H), 1.24 (dt, J =
14.6, 7.4 Hz, 1H), 1.06 (s, 1H), 0.81 (t, J = 7.3 Hz, 1H). La señal de 3.5 ppm corresponde a
agua y 2.5 ppm a DMSO.
28
Figura 17. TIC del extracto de losartán potásico y lista de señales
Frente al TIC, se encontraron dos señales principales para la fragmentación del Losartán. En 423.1693
se encuentra la molécula completa, teniendo en cuenta que es un +ESI, y en 207.0920 se encuentra la
siguiente fragmentación. Estas señales tuvieron alta correlación con la literatura60,61.
Figura 18. Fragmentación del Losartán61.
Entonces, se lograron obtener los extractos del hidrocloruro de metformina y del losartán potásico
con una pureza de alrededor del 95% ya que no se encontraron otras señales aparte de las del
compuesto y al comparar con el espectro del estándar se encontró una alta similitud. En el caso de la
metformina, la estrategia de recolectar la mayoría de los excipientes comunes entre las pastillas
funcionó. A modo de perspectivas futuras, se podría implementar otras rutas de extracción para
utilizar un menor número de pasos utilizando otro tipo de equipos, como el Speed Vac. Este permite
29
retirar solventes que son difíciles de retirar por evaporación a presión reducida como el DMSO o el
DMF ya que estos tienen una mayor selectividad hacia el losartán. Aunque no se mencionó el
rendimiento de estas extracciones, porque el objetivo no iba por la cantidad sino por la pureza, se
pueden utilizar técnicas para aumentar el rendimiento de estas la cual estuvo alrededor del 50% para
la metformina y 30% para el losartán. La extracción por ultrasonido o microondas mediante la
cavitación o la transferencia de masa aumentan el paso del analito del solido al líquido.
Finalmente, frente a la taurina, esta fue comprada a partir de un proveedor de suplementos, por lo que
se le tomo un H1RMN (Figura 19) y un ESI-QToF (Figura 20) al igual que los otros dos para verificar
su pureza. Frente al H1RMN se encontró una alta correlación en lo encontrado en la literatura62,
mientras que en el Q-ToF se encontraron más señales de las esperadas63, pero estas no corresponden
a ningún polímero encontrado en los plastificantes o en el empaque de la taurina o en alguna
contaminación externa, por lo que se requiere realizar una columna de HPLC acoplada a ESI-QToF
para verificar si es ruido proveniente del equipo o es parte de la muestra de taurina.
Figura 19. H1RMN para la taurina. 1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.66 (s, 1H), 3.37 (s, 3H), 3.05 (t,
J = 6.2 Hz, 1H), 2.72 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 2.53 (d, J = 15.7 Hz, 1H).
30
Figura 20. TIC del extracto de la taurina y lista de señales.
4.2 Generación de líneas celulares hiperglucémicas
Para generar la línea celular hiperglucémica se cultivaron las células en medio RPMI con 25 mM de
glucosa. Esto se dejó por 2 semanas para que estas se acostumbraran al medio y se comprobó que
estas células se acoplaron al medio a través de una curva de crecimiento, teniendo en cuenta que el
tiempo de doblaje de la línea HCT-116 es de 21 horas64. Por lo que se tomaron 3 puntos desde las
12h hasta las 28h. Los puntos de esta curva de crecimiento se tomaron a partir de un ensayo MTT, en
donde se midió la absorbancia de un pozo (por triplicado) para conocer un aproximado del número
de células que en el pozo se encontraban. La grafica se puede observar a continuación Figura 21. De
una forma cualitativa se puede observar la diferencia entre las pendientes en el crecimiento entre la
línea hiperglucémica y la línea normoglucémico aproximadamente para el momento en que se cumple
el tiempo de doblaje. Esta diferencia en el crecimiento celular se debe a la disponibilidad de glucosa
en el medio, la cual puede interactuar con proteínas censoras de recursos como lo es la MTORC1,
complejos de hipoxia como el HIF-1 o inducir factores de crecimiento (EGF) lo cual promovería un
estímulo mitótico que aumentaría la división celular65.
31
Figura 21. Curva de crecimiento de comparación entre células en medio normoglucémico y medio
hiperglucémico
Una vez establecida la línea hiperglucémica, se pasó a evaluar los IC50 de cada uno de los
medicamentos para las dos líneas celulares (normo e hiperglucémica).
4.3 Resultados IC50
Tabla 4. IC50 para los tratamientos en medio normo glucémico e híperglucémico.
Línea/Medicamento Normoglucémicas Hiperglucémicas
Doxorrubicina(uM) 2.4±0,8 0,9±0,5
Metformina(mM) 3,8±1,7 0.2-10
Taurina(mM) 157±13 162±20
Losartán(mM) 1,4±1 0,9±0,3
Los IC50 para Dox(Doxorrubicina), Los(Losartán potasico) y Met(Metformina) fueron determinados
a partir del acoplamiento de los datos del MTT a una curva de 4 parámetros conocida como la
ecuación de Hill(Eq 1).
𝑓(𝑥) = 𝑐 + (𝑑 − 𝑐)/ (1 + 𝑒log(
𝑥
𝑒))𝑏(Eq 1)
Para los demás ensayos se utilizaron diferentes modelos. Para la metformina hiperglucémica se
encontró una gráfica singular, la cual se observa a continuación. Debido a esto, se decidió realizar un
ajuste polinomial el cual se puede observar en la Figura 22. A partir de este se puede observar que
se encuentran 3 puntos en donde la concentración alcanza el 50% de la viabilidad, por lo que se decide
32
tomar el rango de estas concentraciones como el IC50 de la metformina en medio hiperglucémico, el
cual sería desde 0,2 mM hasta 10 mM.
Figura 22. Ajuste polinomial de la curva de metformina en medio hiperglucémico.
Para la curva hiperglucémica de la taurina se observó un comportamiento polinómico, por lo que se
consideró a partir del criterio de información de akaike y un “lack-of-fit” test acoplarle un modelo
polinomial para la predicción del IC50.
Entonces a partir de las curvas encontradas anteriormente y sus IC50, se encontró una sensibilidad a
la Dox y Tau en el caso de las líneas híper glucémicas. Mientras que para la Metformina y el Los se
necesita estudiarlos más. Esta sensibilidad se podría analizar desde el mecanismo de cada uno de los
medicamentos usados.
En el caso de la doxorrubicina, los dos mecanismos principales son intercalación con el ADN y la
generación de especies reactivas de oxígeno32. Si consideramos el primer mecanismo, se esperaría
encontrar una diferencia ya que debido a la alta tasa de replicación celular en las células
hiperglicemicas., la Dox podría interactuar con mayor frecuencia con células en estado replicativo
haciendo que aumente su efectividad frente a este tipo de células. Mientras que, en el segundo
mecanismo, podríamos encontrar un aumento considerable en la producción de ROS. Ya que, al estar
en un medio con mayor cantidad de glucosa, usarían la fosforilación oxidativa con mayor frecuencia
si se le compara con el medio normal, por lo que las concentraciones de ROS podrían alcanzar niveles
tóxicos más rápido, lo que conllevaría a una menor concentración de DOX. Sin embargo, esto se
podría comprobar a partir de un ensayo de citometría de flujo usando el marcador CellROX el cual
aumenta su emisión (483nm) cuando reacciona con las especies de oxígeno.
y = -0,1215x3 + 0,1513x2 + 0,0317x + 0,4752R² = 0,9896
-0,2000
0,0000
0,2000
0,4000
0,6000
0,8000
1,0000
-1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5
Via
bili
dad
Log(Concentración(mM)
HGMet
33
Frente a la metformina, en células normoglucémicas, se debe tener en cuenta que la concentración
correspondiente al 50% de la viabilidad se extiende desde 0.2mM hasta 10mM según el modelo
obtenido. Esto se podría interpretar como un equilibrio entre la generación de ATP y su gasto hasta
que la concentración de metformina es demasiado alta como para que la mayoría de las células pueda
sobrevivir . Recordando el mecanismo de la metformina, se conoce que su principal efecto es, a partir
de la inhibición de la fosforilación oxidativa, la cual se hace de manera reversible, se genera una
diferencia importante entre la proporción de ATP/AMP. Esta diferencia activa la cAMPK que se
extiende tanto a la p53 como a mTORc1 como a BAX-BAC lo que termina en la inducción de
apoptosis. Al basarse en un equilibrio entre el ATP y el AMP, las células pueden utilizar otros
mecanismos para aumentar las concentraciones de ATP y no llegar al estado crítico en donde la
cAMPK se activa. Estos otros mecanismos pueden ser el efecto Warburg, la glutamina presente en el
medio o la β-oxidación de ácidos grasos. Se ha reportado que células cancerígenas en altas
concentraciones de glucosa en modelos in vitro tienden a recurrir a la glicolisis aerobia, por lo que
generarían ATP a través de la fermentación láctica.
Entonces entre las concentraciones de 0.2mM y 10mM se podría plantear que se tiene la suficiente
concentración como para matar una proporción importante de células, pero mediante el balance entre
la fermentación láctica, y el hecho de la reversibilidad de la metformina, no se logra matar el restante.
Llegado al punto donde la concentración es lo suficientemente alta, la metformina podría actuar como
inhibidor irreversible de la enzima de la fosforilación oxidativa (NADH: Ubiquinona oxorreductasa)
y es en este momento donde se rompe el equilibrio formado matando a las células restantes.
Ahora el efecto de la concentración de glucosa en el hecho de que la gráfica de metformina para NG
(Figura 23) se pueda acoplar a un modelo de 4 parámetros y la de HG no, puede derivarse de la
fermentación láctica. Debido a que en altas concentraciones de glucosa las células tienden a hacer
glucolisis aerobia, es decir fermentación láctica, el efecto de equilibrio propuesto en células crecidas
en medio de glucosa normal sería mucho menor, por lo que pudo haber pasado desapercibido debido
al rango de concentraciones usadas. Por lo que si se desea visualizar este efecto en el cultivo
normoglucemico se debería tomar una mayor cantidad de concentraciones o puntos en la curva de
MTT. Finalmente, para poder comprobar este efecto de equilibrio se podría realizar evaluar la
presencia del ácido láctico en el medio de cultivo, y lo que se esperaría es encontrar un aumento en
la concentración de este a medida que la concentración de metformina aumenta como medio de
compensación.
34
Figura 23. Comparación de las curvas de en medio hiperglucémico y normoglucémico para la
metformina.
Frente a la taurina (Figura 24), se puede ver a partir de la forma de la curva ,una sensibilización en el
caso de las normglucémicas. A parte del efecto que tiene la taurina en la p53 basado en la proteína
PUMA, se ha encontrado que afecta el metabolismo de las células de cáncer atenuándolo. Debido a
la glucosa en el medio hiperglucémico, las células en este medio tenderían a la glicolisis aeróbica. Si
la taurina llegará a atenuar el metabolismo de la glucosa, afectarían de mayor medida a las celulas
normglucémicas debido a que la cantidad de energía que podrían sacar seria casi nulo . Sin embargo,
falta estudiar los mecanismos de la taurina como agente anticancerígeno, ya que aunque se ha
encontrado un transportador en específico para esta molécula, y al inhibir este transportador se reduce
la proliferación de líneas cancerígenas, no se tiene gran conocimiento del rol de la taurina en las
células cancerigenas66.
35
Figura 24. Comparación de las curvas en medio normoglucémico e hiperglucémico para la taurina.
Finalmente, frente al losartán (Figura 25), se encontró que no hay una diferencia significativa al 95%
de confianza entre los IC50 para las células normglucémicas e hiperglucémicas. Se han reportado
experimentos in vitro con análogos anti-hipertensivos como la sirosingipina en donde este inhibe la
σ-enolasa en la glicolisis y por medio de esto inhibe el crecimiento de diferentes líneas cancerígenas35.
Por lo que se esperarían resultados diferentes para las líneas normglucémicas vs las hiperglucémicas.
Se nota en las gráficas, el error que tienen los puntos y la falta de concentraciones en la zona media
de la curva. Estos dos factores provocan un aumento en la desviación estándar del modelo cuando se
quiere hallar el IC50. Y esto entonces repercute en la falta de diferenciación entre los efectos en
células normglucémicas vs las hiperglucémicas. Ahora, se podría pensar que no hay necesidad de
utilizar un amplio rango de concentraciones a la hora de hallar el IC50, ya que solo se necesitan los
puntos en el rango lineal para realizar un cálculo preciso de este. Pero el comportamiento de la curva
en el rango de concentraciones nos señala datos importantes de las células, como en el caso de la
metformina o de la taurina. Y es el hecho de que la pendiente de las curvas sea tan pronunciada
implica que hay una diferencia muy baja entre la concentración de losartán que deja la viabilidad
celular cerca a100% y la concentración que baja la viabilidad en 0% . Esto último implica que un
cambio pequeño en la concentración es suficiente para empezar a bloquear procesos importantes en
la célula, y que si se aumenta el tratamiento, la célula morirá. Debido a la poca información sobre la
acción in vitro de losartán no se puede determinar un mecanismo tentativo ya que no se sabe con
certeza si el losartán afecta de la misma manera a ambos tipos de células.
36
Finalmente, para remediar estas desviaciones se pueden realizar dos curvas. Una para observar el
comportamiento celular a lo largo de un gran rango de concentraciones y la otra para encontrar con
exactitud el IC50.
Figura 25. Comparación de las curvas en medio normoglucémico e hiperglucémico para el losartán.
A modo de proyección, y en vista de la poca información sobre el mecanismo de losartán como de
taurina se podría comprobar las proteínas objetivo a partir de un ensayo DARTS(por sus siglas en
ingles “Drug Affinity Responsive Target Stability”), en el cual se extraen las proteínas y se evalúa la
estabilidad del enlace proteina-medicamento a partir de una electroforesis.
4.4 Ensayos de sinergia combinatoria de los fármacos.
Una vez realizados los ensayos de sinergia por medio del MTT, para comparar y evaluar los datos
obtenidos se realizó un test de Levenne para confirmar la normalidad de estos. Se obtuvo que la
distribución no era normal por lo que se decidió utilizar una prueba de Kruskal Wallis seguido de un
test de Dann para organizar los datos entre grupos similares. Esto se graficó en forma de “boxplot” y
se clasificaron en grupos similares entre sí. Esto se puede observar en las figuras 25-28. en las cuales
se encuentran los tratamientos con los fármacos individuales, fármacos en conjunto con
doxorrubicina, combinaciones de los fármacos y combinaciones de los fármacos con doxorrubicina.
En cada una de las figuras (HG) indica que el tratamiento se realizó sobre células en medio
hiperglucémico y cada fármaco se indica por su inicial de la siguiente manera: doxorrubicina como
D, losartán como L, taurina como T y metformina como M.
En la Figura 26 podemos observar el tratamiento del fármaco individual en cultivos normo e
hiperglucémicos es importante observar es que las concentraciones de los fármacos no estan al 50%
de viabilidad. En consecuencia, las desviaciones en las curvas de IC50 y la cantidad de puntos en la
zona lineal de las gráficas derivan en una alta incertidumbre en las predicciones de los modelos. Las
37
abreviaciones utilizadas fueron: C para control, L para losartán, M para metformina y entre paréntesis
se encuentran los tratamientos que no son significativamente diferentes. Por lo que, en el caso de los
tratamientos de metformina, metformina en medio normoglucémico no es significativamente
diferente del tratamiento de control, del tratamiento de losartán y del tratamiento con taurina. El hecho
de su similaridad con el control y el tratamiento con losartán indica que se necesita una mayor
precisión en las medidas, ya que estas se encuentran alrededor del 100% y el 20%, por lo que la
desviación estándar de las medidas debe ser lo suficientemente grande para hacer comparables. Junto
con esto, hay que tener en cuenta que el test de Kruskall Wallis es óptimo para un n de 5, por lo que
se podría aumentar el número de n en futuras pruebas para permitir una mejor interpretación de los
datos.
Figura 26. Ensayos de sinergia, en este caso farmacos individuales al IC50 encontrado
anteriormente en cultivo normoglucemico e hiperglucemico(HG).
En la figura 27 podemos observarlos tratamientos combinados entre los farmacos Losartan,
Metformina y Taurina comparados con los tratamientos individuales de estos . La forma en que estan
puestos los encabezados de los boxplots es la siguiente: Tomando los primeros dos tratamientos, L-
T y L-T (HG), se estableció a partir de los test mencionados anteriormente que no eran
significativamente diferentes, por lo que se les establece un nombre que represente la similiaridad
entre estos dos, y este es LT. Despues entre parentesis, al igual que en el caso pasado, se encuentran
los tratamientos que no son significativamente diferentes. Cuando se presenta una mayuscula,
siguiendo con el ejemplo LT(M-L(HG),MLT), significa que tanto el tratamiento M-L-T como el M-
38
L-T (HG) no difieren de LT. Y cuando se encuentra como el nombre del tratamiento indica que no
difere exclusivamente de ese tratamiento.
Teniendo encuenta esto, podemos observar que el losartán, gracias a que la viabilidad de las celulas
con el tratamiento del losartán esta en 20%, fue similar a todos los tratamientos combinados,
independiente del medio de cultivo, lo cual indica que no hay diferencia entre la aplicación de
Losartan y la aplicación de Losartan en combinacion con Metformina y Taurina en celulas
canerigenas para este ensayo.Observando el tratamiento M-T en celulas cancerigenas en medio
normoglucimenico e hiperglucemico se observa similiradidad con los tratamientos individuales,
tambien se asemejan al tratamiento de los tres farmacos juntos. Esto retoma el problema de tener un
numero bajo de n y la desviación de los datos. Por lo que para futuros experimentos se requerirá de
una mayor precisión en las medidas para que sus comparaciones por medio de los test de Kruskal-
Willis y Dunn sean utiles para discernir entre los tratamientos que tienen una sinergia y los que no.
Figura 27. Ensayos de sinergia, tratamientos combinados sin doxorrubicina. En cultivo
normoglucemico e hiperglucemico.
Frente a los tratamientos de los farmacos con doxrrubicina (Figura 27), se obseraron tendencias
similares con la grafica anterior, pero con una varianza mayor en cada dato. Se encontró que el
tratamiento solo con doxorrubicina no es significativamente diferente a los tratamientos de
doxorrubicina-losartán-taurina en medio hiperglucemico, doxorrubicina -metformina- losartán en
medio hiperglucemico y demás tratamientos que no incluyan losartán. Sucedió lo mismo que en la
39
grafica anterior, en donde los tratamientos con losartán no son significativamente diferentes de este,
la tabla la pueden observar en información complementaria tabla 2. A pesar de que la viabilidad del
IC50 del losartán fue del 20% y sus repercursiones, siempre se puede observar que el porcentaje de
la combinación Metformina-Losartán-Taurina y Doxorrubicina-Metformina-Losartán-Taurina es
mucho más bajo que todos los demas, por lo que esto da un indicio de que si existe una clase de
sinergia entre los medicamentos. De lo contrario el porcentaje no tendria porque ser más bajo que el
del losartán, solo hace falta una mayor precisión para demostarlo estadisticamente.
Figura 28. Ensayos de sinergia, tratamientos combinados con doxorrubicina. En cultivo
normoglucemico e hiperglucemico. *1=D(D-L-T(HG),D-M,D-M-L(HG),D-M-T,D-T)
Para poder dimensionar estos resultados a una aplicación medica, se consultó la concentración en
plasma de cada uno de los medicamentos utilizados y se comparó con la concentración IC50 aquí
encontrada. La concentración en plasma despues de la ingesition de una pastilla de 800 mg de
metformina puede variar desde 0.5 hasta 2mg/L via oral67, aunque se han encontrado dosis
terapeuticas de hasta 18mg/mL68 via intravenosa lo que representa 0.012mM y 0.1mM
respectivamente. Para el losartán via oral se registran concentraciones hasta de 0.3 µg /L via oral
(200mg) lo que representa una concentración de 100 nm aproximadamente69,70. Finalmente la
concentración en plasma despues de la ingestión de 4 g de taurina en pacientes sanos es alrededor de
81.6mg/L lo que corresponde a 0.6mM71. Frente a estas concentraciones se encuentra una diferencia
de varios ordenes de magnitud, por lo que su administración via oral no se hace viable para cada
40
tratamiento individual. Una vez se confirme la sinergia entre los medicamentos, los valores pueden
cambiar considerablemente, ya que se necesitaria menos cantidad de cada uno para lograr el efecto
deseado. Para encontrar esta cantidad se puede hacer una curva de IC50 con dos medicamentos, uno
de ellos con la concentración fija.
Aunque el modelo que se utilizó en este articulo es HTS72 ( High-throughput screening) y una de sus
limitaciones es el hecho de no poder contar con un ambiente igual al del tumor (fibroblastos, sistema
inmune, metabolismo, etc) y el hecho de la utilización de un cultivo in vitro 2D, reduce las relaciones
que se pueden dar entre las células y el efecto Warburg inverso ya que no se encuentran capas sobre
capas de células (gradiente de diferenciación de oxígeno). Estos resultados funcionan como una
prueba de concepto de que se puede afectar la viabilidad de las células cancerígenas a partir de
fármacos de uso común y que su sinergia puede potenciar los agentes quimioterapéuticos.
5. Conclusiones
Se llevo a cabo el estudio del efecto sinérgico entre losartán, metformina, taurina y doxorrubicina por
medio de ensayos MTT para la determinación del efecto de estos medicamentos de forma individual
y conjunta en las células de carcinoma colorrectal HCT-116 en medio normo e hiperglucémico. En
primera instancia se llevaron a cabo las extracciones de losartán y metformina a partir de pastillas
comerciales. Se plantearon las extracciones a partir de los excipientes encontrados o proporcionados
y se caracterizaron los extractos, junto con la taurina adquirida comercialmente. A partir de H1RMN
y ESI-QTOF, se obtuvo una pureza del 95% por H1RMN y TIC. Finalmente, frente a la taurina se
encontró que el espectro de H1RMN coincidía con el reportado, pero el TIC contenía algunas señales
que no correspondían con ningún compuesto presente en los solventes o plastificantes que pudiesen
estar presentes en la muestra.
Los ensayos de IC50 para cada uno de los medicamentos nos permitió visualizar el comportamiento
de las células en un amplio rango de concentraciones y se propuso en el caso de la metformina en
medio hiperglucémico un mecanismo de equilibrio para la estabilización de la viabilidad celular
alrededor del 50% en un rango amplio de concentraciones. Frente al losartán se encontró que se
necesitan concentraciones en el rango lineal para bajar la incertidumbre en la predicción del IC50 y
se encontraron repercusiones de esta varianza en los ensayos posteriores. Frente a la taurina y a la
doxorrubicina se encontró que hay una mayor sensibilidad en lineas hiperglucémicas frente a la
doxorrubicina, debido a la replicación aumentada y en la taurina se encontró que la línea
41
normoglucémica es más sensible posiblemente debido a una reducción en la producción de ATP si la
taurina actuara sobre la glucolisis.
Finalmente, frente a los ensayos de sinergia se encontró que puede existir entre las combinaciones
metformina-losartán-taurina y doxorrubicina-metformina-losartán-taurina, pero debido a la
incertidumbre en la determinación del IC50 del losartán no se puede atribuir totalmente a la
combinación entre estos.
6. Referencias
(1) Health (US), N. I. of; Study, B. S. C. Understanding Cancer; National Institutes of Health (US), 2007.
(2) Types of cancer https://www.cancerresearchuk.org/what-is-cancer/how-cancer-starts/types-of-cancer (accessed Jan 1, 2020).
(3) Blackadar, C. B. Historical Review of the Causes of Cancer. World J. Clin. Oncol. 2016, 7 (1), 54–86. https://doi.org/10.5306/wjco.v7.i1.54.
(4) Dang, C. V. Links between Metabolism and Cancer. Genes Dev. 2012, 26 (9), 877–890. https://doi.org/10.1101/gad.189365.112.
(5) Afify, S. M.; Seno, M. Conversion of Stem Cells to Cancer Stem Cells: Undercurrent of Cancer Initiation. Cancers 2019, 11 (3). https://doi.org/10.3390/cancers11030345.
(6) Siegel, R. L.; Miller, K. D.; Jemal, A. Cancer Statistics, 2019. CA. Cancer J. Clin. 2019, 69 (1), 7–34. https://doi.org/10.3322/caac.21551.
(7) WHO | Projections of mortality and causes of death, <br>2016 to 2060 http://www.who.int/healthinfo/global_burden_disease/projections/en/ (accessed Jan 1, 2020).
(8) Nacimientos y defunciones https://www.dane.gov.co/index.php/estadisticas-por-tema/salud/nacimientos-y-defunciones (accessed Jan 1, 2020).
(9) Pardo Ramos et al. - 2017 - Atlas de Mortalidad Por Cáncer En Colombia.Pdf. (10) Hanahan, D.; Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell 2011, 144 (5),
646–674. https://doi.org/10.1016/j.cell.2011.02.013. (11) (PDF) Sistema inmune y daño por inflamación. Eduardo Chuluyán, Mercedes L. Sánchez,
Diego Guerrieri, Nella Ambrosi. Revista Ciencia e Investigación. Divulgación. Tomo 63 N˚1. Mayo 2013. https://www.researchgate.net/publication/249008674_Sistema_inmune_y_dano_por_inflamacion_Eduardo_Chuluyan_Mercedes_L_Sanchez_Diego_Guerrieri_Nella_Ambrosi_Revista_Ciencia_e_Investigacion_Divulgacion_Tomo_63_N1_Mayo_2013 (accessed Jan 21, 2020).
(12) Antoniades, H. N.; Owen, A. J. Growth Factors and Regulation of Cell Growth. Annu. Rev. Med. 1982, 33, 445–463. https://doi.org/10.1146/annurev.me.33.020182.002305.
(13) Ozaki, T.; Nakagawara, A. Role of P53 in Cell Death and Human Cancers. Cancers 2011, 3 (1), 994–1013. https://doi.org/10.3390/cancers3010994.
(14) Fernández-Medarde, A.; Santos, E. Ras in Cancer and Developmental Diseases. Genes Cancer 2011, 2 (3), 344–358. https://doi.org/10.1177/1947601911411084.
42
(15) Bertram, J. S. The Molecular Biology of Cancer. Mol. Aspects Med. 2000, 21 (6), 167–223. https://doi.org/10.1016/S0098-2997(00)00007-8.
(16) Role of p53 in Cell Death and Human Cancers https://www-ncbi-nlm-nih-gov.ezproxy.uniandes.edu.co:8443/pmc/articles/PMC3756401/ (accessed May 11, 2019).
(17) Chen, J. The Cell-Cycle Arrest and Apoptotic Functions of P53 in Tumor Initiation and Progression. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2016, 6 (3). https://doi.org/10.1101/cshperspect.a026104.
(18) Robles, R. G.; Ramírez, P. A.; Vega, N. A. Alteración en la regulación de la apoptosis vía Fas/FasL en cáncer gástrico. 12.
(19) Nishida, N.; Yano, H.; Nishida, T.; Kamura, T.; Kojiro, M. Angiogenesis in Cancer. Vasc. Health Risk Manag. 2006, 2 (3), 213–219.
(20) Nishida, N.; Yano, H.; Nishida, T.; Kamura, T.; Kojiro, M. Angiogenesis in Cancer. Vasc. Health Risk Manag. 2006, 2 (3), 213–219.
(21) Wang, Y.; Shi, J.; Chai, K.; Ying, X.; Zhou, B. P. The Role of Snail in EMT and Tumorigenesis. Curr. Cancer Drug Targets 2013, 13 (9), 963–972.
(22) Roche, J. The Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Cancer. Cancers 2018, 10 (2). https://doi.org/10.3390/cancers10020052.
(23) Kao, S.-H.; Wu, K.-J.; Lee, W.-H. Hypoxia, Epithelial-Mesenchymal Transition, and TET-Mediated Epigenetic Changes. J. Clin. Med. 2016, 5, 24. https://doi.org/10.3390/jcm5020024.
(24) Albert L. Lehninger, David L. Nelson, Michael M Cox. Principles of Biochemistry. (25) Wilde, L.; Roche, M.; Domingo-Vidal, M.; Tanson, K.; Philp, N.; Curry, J.; Martinez-
Outschoorn, U. Metabolic Coupling and the Reverse Warburg Effect in Cancer, Implications for Novel Biomarker and Anticancer Agent Development. Semin. Oncol. 2017, 44 (3), 198–203. https://doi.org/10.1053/j.seminoncol.2017.10.004.
(26) Fu, Y.; Liu, S.; Yin, S.; Niu, W.; Xiong, W.; Tan, M.; Li, G.; Zhou, M. The Reverse Warburg Effect Is Likely to Be an Achilles’ Heel of Cancer That Can Be Exploited for Cancer Therapy. Oncotarget 2017, 8 (34), 57813–57825. https://doi.org/10.18632/oncotarget.18175.
(27) Semenza, G. L. Tumor Metabolism: Cancer Cells Give and Take Lactate. J. Clin. Invest. 2008, 118 (12), 3835–3837. https://doi.org/10.1172/JCI37373.
(28) Jun, J. C.; Rathore, A.; Younas, H.; Gilkes, D.; Polotsky, V. Y. Hypoxia-Inducible Factors and Cancer. Curr. Sleep Med. Rep. 2017, 3 (1), 1–10. https://doi.org/10.1007/s40675-017-0062-7.
(29) Overexpression of hypoxia-inducible factor and metabolic pathways: possible targets of cancer | Cell & Bioscience | Full Text https://cellandbioscience.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13578-017-0190-2 (accessed Jan 2, 2020).
(30) Karmakar, S.; Purkait, K.; Chatterjee, S.; Mukherjee, A. Anticancer Activity of a Cis -Dichloridoplatinum( Ii ) Complex of a Chelating Nitrogen Mustard: Insight into Unusual Guanine Binding Mode and Low Deactivation by Glutathione. Dalton Trans. 2016, 45 (8), 3599–3615. https://doi.org/10.1039/C5DT04459F.
(31) Weaver, B. A. How Taxol/Paclitaxel Kills Cancer Cells. Mol. Biol. Cell 2014, 25 (18), 2677–2681. https://doi.org/10.1091/mbc.E14-04-0916.
(32) Thorn, C. F.; Oshiro, C.; Marsh, S.; Hernandez-Boussard, T.; McLeod, H.; Klein, T. E.; Altman, R. B. Doxorubicin Pathways: Pharmacodynamics and Adverse Effects. Pharmacogenet. Genomics 2011, 21 (7), 440–446. https://doi.org/10.1097/FPC.0b013e32833ffb56.
(33) Patel, A. G.; Kaufmann, S. H. How Does Doxorubicin Work? eLife 2012, 1. https://doi.org/10.7554/eLife.00387.
43
(34) Gottesman, M. M. Mechanisms of Cancer Drug Resistance. Annu. Rev. Med. 2002, 53, 615–627. https://doi.org/10.1146/annurev.med.53.082901.103929.
(35) Syrosingopine sensitizes cancer cells to killing by metformin https://www-ncbi-nlm-nih-gov.ezproxy.uniandes.edu.co:8443/pmc/articles/PMC5182053/ (accessed Jan 8, 2020).
(36) Rena, G.; Hardie, D. G.; Pearson, E. R. The Mechanisms of Action of Metformin. Diabetologia 2017, 60 (9), 1577–1585. https://doi.org/10.1007/s00125-017-4342-z.
(37) Inhibition of insulin‐like growth factor 1 receptor enhances the efficacy of sorafenib in inhibiting hepatocellular carcinoma cell growth and survival https://www-ncbi-nlm-nih-gov.ezproxy.uniandes.edu.co:8443/pmc/articles/PMC5983153/ (accessed Jan 8, 2020).
(38) Resistance to Trastuzumab in Breast Cancer https://www-ncbi-nlm-nih-gov.ezproxy.uniandes.edu.co:8443/pmc/articles/PMC3471537/ (accessed Jan 8, 2020).
(39) Jiang, Y.; Ben, Q.; Shen, H.; Lu, W.; Zhang, Y.; Zhu, J. Diabetes Mellitus and Incidence and Mortality of Colorectal Cancer: A Systematic Review and Meta-Analysis of Cohort Studies. Eur. J. Epidemiol. 2011, 26 (11), 863–876. https://doi.org/10.1007/s10654-011-9617-y.
(40) Diabetes and Cancer https://www-ncbi-nlm-nih-gov.ezproxy.uniandes.edu.co:8443/pmc/articles/PMC2890380/ (accessed Jan 8, 2020).
(41) In silico-based identification of human α-enolase inhibitors to block cancer cell growth metabolically. - PubMed - NCBI https://www-ncbi-nlm-nih-gov.ezproxy.uniandes.edu.co:8443/pubmed/29180852 (accessed Jan 8, 2020).
(42) Effect of taurine on cell proliferation and apoptosis human lung cancer A549 cells https://www-ncbi-nlm-nih-gov.ezproxy.uniandes.edu.co:8443/pmc/articles/PMC5840730/ (accessed Jan 8, 2020).
(43) Hamaguchi, T.; Azuma, J.; Harada, H.; Takahashi, K.; Kishimoto, S.; Schaffer, S. Protective Effect of Taurine against Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity in Perfused Chick Hearts. Pharmacol. Res. 1989, 21 (6), 729–734. https://doi.org/10.1016/1043-6618(89)90232-6.
(44) Mulla, S.; Siddiqui, W. J. Losartan. In StatPearls; StatPearls Publishing: Treasure Island (FL), 2019.
(45) The angiotensin receptor blocker, Losartan, inhibits mammary tumor development and progression to invasive carcinoma https://www-ncbi-nlm-nih-gov.ezproxy.uniandes.edu.co:8443/pmc/articles/PMC5386636/ (accessed Jan 8, 2020).
(46) Diop-Frimpong, B.; Chauhan, V. P.; Krane, S.; Boucher, Y.; Jain, R. K. Losartan Inhibits Collagen I Synthesis and Improves the Distribution and Efficacy of Nanotherapeutics in Tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. 2011, 108 (7), 2909–2914. https://doi.org/10.1073/pnas.1018892108.
(47) Losartan improves the distribution and efficacy of doxorubicin in CT26 tumor. - PubMed - NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26502868 (accessed Jan 21, 2020).
(48) 80970.Pdf. (49) FT_70557.Pdf. (50) Metformin 500mg tablets - Summary of Product Characteristics (SmPC) - (emc)
https://www.medicines.org.uk/emc/product/594/smpc (accessed Jan 9, 2020). (51) Metformintab.Pdf. (52) Metformina-Clorhidrato-850-Mg.Pdf. (53) Handbook of Pharmaceutical Excipients, 6. ed.; Rowe, R. C., Ed.; APhA, (PhP)
Pharmaceutical Press: London, 2009. (54) Sarath, K. K. Salts of N,n-Dimethylbiguanide and Preparation Methods Thereof.
WO2017195086 (A1). (55) Jia, L.; Wu, S.; Gong, J. A Tolbutamide–Metformin Salt Based on Antidiabetic Drug
Combinations: Synthesis, Crystal Structure Analysis and Pharmaceutical Properties. Acta
44
Crystallogr. Sect. C Struct. Chem. 2019, 75 (9), 1250–1258. https://doi.org/10.1107/S2053229619010647.
(56) Sawada, Y.; Akiyama, K.; Sakata, A.; Kuwahara, A.; Otsuki, H.; Sakurai, T.; Saito, K.; Hirai, M. Y. Widely Targeted Metabolomics Based on Large-Scale MS/MS Data for Elucidating Metabolite Accumulation Patterns in Plants. Plant Cell Physiol. 2009, 50 (1), 37–47. https://doi.org/10.1093/pcp/pcn183.
(57) Metformin Mass Spectrum https://massbank.eu/MassBank/RecordDisplay.jsp?id=TUE00511&dsn=Env_Anal_Chem_U_Tuebingen (accessed Jan 9, 2020).
(58) 67631_ft.Pdf. (59) Gottlieb, H. E.; Kotlyar, V.; Nudelman, A. NMR Chemical Shifts of Common Laboratory
Solvents as Trace Impurities. J. Org. Chem. 1997, 62 (21), 7512–7515. https://doi.org/10.1021/jo971176v.
(60) Losartan Mass Spectrum http://www.massbank.jp/RecordDisplay.jsp?id=AU228001&dsn=Athens_Univ (accessed Jan 9, 2020).
(61) Zhao, Z. (Zack); Wang, Q.; Tsai, E. W.; Qin, X.-Z.; Ip, D. Identification of Losartan Degradates in Stressed Tablets by LC-MS and LC-MS/MS. J. Pharm. Biomed. Anal. 1999, 20 (1), 129–136. https://doi.org/10.1016/S0731-7085(99)00004-7.
(62) Human Metabolome Database: 1H NMR Spectrum (HMDB0000251) http://www.hmdb.ca/spectra/nmr_one_d/2107 (accessed Jan 9, 2020).
(63) Taurine Mass Spectrum http://www.massbank.jp/RecordDisplay.jsp?id=KNA00034&dsn=NAIST (accessed Jan 9, 2020).
(64) SOP: Thawing, Propagation and Cryopreservation of NCI-PBCF-CCL247 (HCT 116). 24. (65) Li, W.; Zhang, X.; Sang, H.; Zhou, Y.; Shang, C.; Wang, Y.; Zhu, H. Effects of Hyperglycemia on
the Progression of Tumor Diseases. J. Exp. Clin. Cancer Res. 2019, 38 (1), 327. https://doi.org/10.1186/s13046-019-1309-6.
(66) He, Y.; Li, Q. Q.; Guo, S. C. Taurine Attenuates Dimethylbenz[a]Anthracene-Induced Breast Tumorigenesis in Rats: A Plasma Metabolomic Study. Anticancer Res. 2016, 36 (2), 533–543.
(67) Scheen, A. J. Clinical Pharmacokinetics of Metformin. Clin. Pharmacokinet. 1996, 30 (5), 359–371. https://doi.org/10.2165/00003088-199630050-00003.
(68) Kajbaf, F.; De Broe, M. E.; Lalau, J.-D. Therapeutic Concentrations of Metformin: A Systematic Review. Clin. Pharmacokinet. 2016, 55 (4), 439–459. https://doi.org/10.1007/s40262-015-0323-x.
(69) Ohtawa, M.; Takayama, F.; Saitoh, K.; Yoshinaga, T.; Nakashima, M. Pharmacokinetics and Biochemical Efficacy after Single and Multiple Oral Administration of Losartan, an Orally Active Nonpeptide Angiotensin II Receptor Antagonist, in Humans. Br. J. Clin. Pharmacol. 1993, 35 (3), 290–297. https://doi.org/10.1111/j.1365-2125.1993.tb05696.x.
(70) Sica, D. A.; Gehr, T. W. B.; Ghosh, S. Clinical Pharmacokinetics of Losartan: Clin. Pharmacokinet. 2005, 44 (8), 797–814. https://doi.org/10.2165/00003088-200544080-00003.
(71) Ghandforoush-Sattari, M.; Mashayekhi, S.; Krishna, C. V.; Thompson, J. P.; Routledge, P. A. Pharmacokinetics of Oral Taurine in Healthy Volunteers https://www.hindawi.com/journals/jaa/2010/346237/ (accessed Jan 13, 2020). https://doi.org/10.4061/2010/346237.
(72) Broach, J. R.; Thorner, J. High-Throughput Screening for Drug Discovery. 3.
45
6. Información suplementaria.
IS Tabla 1. Resultados del test de Dunn para la figura 26.
Comparison of x by group (No adjustment) Col Mean-| Row Mean | C Los LosHG LosTau LosTauHG Met ---------+------------------------------------------------------------------ Los | 2.238011 | 0.0126* | LosHG | 2.331262 0.093250 | 0.0099* 0.4629 | LosTau | 3.792186 1.554174 1.460924 | 0.0001* 0.0601 0.0720 | LosTauHG | 3.046182 0.808170 0.714920 -0.746003 | 0.0012* 0.2095 0.2373 0.2278 | Met | 0.683836 -1.554174 -1.647425 -3.108349 -2.362345 | 0.2470 0.0601 0.0497 0.0009* 0.0091* | MetHG | 0.341918 -1.896093 -1.989343 -3.450267 -2.704263 -0.341918 | 0.3662 0.0290 0.0233* 0.0003* 0.0034* 0.3662 | MetLos | 2.424512 0.186500 0.093250 -1.367673 -0.621669 1.740675 | 0.0077* 0.4260 0.4629 0.0857 0.2671 0.0409 | MetLosHG | 2.766430 0.528419 0.435168 -1.025755 -0.279751 2.082594 | 0.0028* 0.2986 0.3317 0.1525 0.3898 0.0186* | MetLosTa | 3.761102 1.523091 1.429840 -0.031083 0.714920 3.077265 | 0.0001* 0.0639 0.0764 0.4876 0.2373 0.0010* | MetLosTa | 2.766430 0.528419 0.435168 -1.025755 -0.279751 2.082594 | 0.0028* 0.2986 0.3317 0.1525 0.3898 0.0186* | MetTau | 1.087922 -1.150089 -1.243339 -2.704263 -1.958260 0.404085 | 0.1383 0.1251 0.1069 0.0034* 0.0251 0.3431 | MetTauHG | 2.051510 -0.186500 -0.279751 -1.740675 -0.994671 1.367673
46
| 0.0201* 0.4260 0.3898 0.0409 0.1599 0.0857 | Tau | 0.746003 -1.492007 -1.585258 -3.046182 -2.300178 0.062166 | 0.2278 0.0678 0.0565 0.0012* 0.0107* 0.4752 | TauHG | 1.336590 -0.901421 -0.994671 -2.455595 -1.709592 0.652753 | 0.0907 0.1837 0.1599 0.0070* 0.0437 0.2570 Col Mean-| Row Mean | MetHG MetLos MetLosHG MetLosTa MetLosTa MetTau ---------+------------------------------------------------------------------ MetLos | 2.082594 | 0.0186* | MetLosHG | 2.424512 0.341918 | 0.0077* 0.3662 | MetLosTa | 3.419184 1.336590 0.994671 | 0.0003* 0.0907 0.1599 | MetLosTa | 2.424512 0.341918 0.000000 -0.994671 | 0.0077* 0.3662 0.5000 0.1599 | MetTau | 0.746003 -1.336590 -1.678508 -2.673180 -1.678508 | 0.2278 0.0907 0.0466 0.0038* 0.0466 | MetTauHG | 1.709592 -0.373001 -0.714920 -1.709592 -0.714920 0.963588 | 0.0437 0.3546 0.2373 0.0437 0.2373 0.1676 | Tau | 0.404085 -1.678508 -2.020427 -3.015098 -2.020427 -0.341918 | 0.3431 0.0466 0.0217* 0.0013* 0.0217* 0.3662 | TauHG | 0.994671 -1.087922 -1.429840 -2.424512 -1.429840 0.248667 | 0.1599 0.1383 0.0764 0.0077* 0.0764 0.4018 Col Mean-| Row Mean | MetTauHG Tau ---------+---------------------- Tau | -1.305506 | 0.0959 | TauHG | -0.714920 0.590586 | 0.2373 0.2774
47
IS Tabla 2. Resultados del test de Dunn para la figura 27.
Comparison of x by group (No adjustment) Col Mean-| Row Mean | C Dox DoxHG DoxLos DoxLosHG DoxLosTa ---------+------------------------------------------------------------------ Dox | 0.773259 | 0.2197 | DoxHG | 1.302331 0.529072 | 0.0964 0.2984 | DoxLos | 3.479665 2.706406 2.177334 | 0.0003* 0.0034* 0.0147* | DoxLosHG | 3.296525 2.523266 1.994194 -0.183140 | 0.0005* 0.0058* 0.0231* 0.4273 | DoxLosTa | 3.561061 2.787802 2.258730 0.081395 0.264536 | 0.0002* 0.0027* 0.0120* 0.4676 0.3957 | DoxLosTa | 2.340126 1.566867 1.037795 -1.139539 -0.956399 -1.220935 | 0.0096* 0.0586 0.1497 0.1272 0.1694 0.1111 | DoxMet | 0.773259 0.000000 -0.529072 -2.706406 -2.523266 -2.787802 | 0.2197 0.5000 0.2984 0.0034* 0.0058* 0.0027* | DoxMetHG | 1.261633 0.488374 -0.040697 -2.218032 -2.034892 -2.299428 | 0.1035 0.3126 0.4838 0.0133* 0.0209* 0.0107* | DoxMetLo | 3.113385 2.340126 1.811054 -0.366280 -0.183140 -0.447676 | 0.0009* 0.0096* 0.0351 0.3571 0.4273 0.3272 | DoxMetLo | 2.177334 1.404075 0.875003 -1.302331 -1.119190 -1.383726 | 0.0147* 0.0801 0.1908 0.0964 0.1315 0.0832 | DoxMetLo | 4.029086 3.255827 2.726755 0.549420 0.732561 0.468025 | 0.0000* 0.0006* 0.0032* 0.2914 0.2319 0.3199 | DoxMetLo | 3.540712 2.767453 2.238381 0.061046 0.244187 -0.020348
48
| 0.0002* 0.0028* 0.0126* 0.4757 0.4035 0.4919 | DoxMetTa | 1.729658 0.956399 0.427327 -1.750007 -1.566867 -1.831403 | 0.0418 0.1694 0.3346 0.0401 0.0586 0.0335 | DoxMetTa | 2.482568 1.709309 1.180237 -0.997097 -0.813956 -1.078492 | 0.0065* 0.0437 0.1190 0.1594 0.2078 0.1404 | DoxTau | 1.058144 0.284884 -0.244187 -2.421521 -2.238381 -2.502917 | 0.1450 0.3879 0.4035 0.0077* 0.0126* 0.0062* | DoxTauHG | 2.197683 1.424424 0.895352 -1.281982 -1.098841 -1.363377 | 0.0140* 0.0772 0.1853 0.0999 0.1359 0.0864 | Los | 2.991291 2.218032 1.688960 -0.488374 -0.305233 -0.569769 | 0.0014* 0.0133* 0.0456 0.3126 0.3801 0.2844 | LosHG | 2.991291 2.218032 1.688960 -0.488374 -0.305233 -0.569769 | 0.0014* 0.0133* 0.0456 0.3126 0.3801 0.2844 | Met | 0.590118 -0.183140 -0.712212 -2.889547 -2.706406 -2.970942 | 0.2776 0.4273 0.2382 0.0019* 0.0034* 0.0015* | MetHG | 0.264536 -0.508723 -1.037795 -3.215129 -3.031989 -3.296525 | 0.3957 0.3055 0.1497 0.0007* 0.0012* 0.0005* | Tau | 0.732561 -0.040697 -0.569769 -2.747104 -2.563964 -2.828500 | 0.2319 0.4838 0.2844 0.0030* 0.0052* 0.0023* | TauHG | 1.648262 0.875003 0.345931 -1.831403 -1.648262 -1.912798 | 0.0496 0.1908 0.3647 0.0335 0.0496 0.0279 Col Mean-| Row Mean | DoxLosTa DoxMet DoxMetHG DoxMetLo DoxMetLo DoxMetLo ---------+------------------------------------------------------------------ DoxMet | -1.566867 | 0.0586 | DoxMetHG | -1.078492 0.488374 | 0.1404 0.3126 | DoxMetLo | 0.773259 2.340126 1.851752 | 0.2197 0.0096* 0.0320
49
| DoxMetLo | -0.162791 1.404075 0.915701 -0.936050 | 0.4353 0.0801 0.1799 0.1746 | DoxMetLo | 1.688960 3.255827 2.767453 0.915701 1.851752 | 0.0456 0.0006* 0.0028* 0.1799 0.0320 | DoxMetLo | 1.200586 2.767453 2.279079 0.427327 1.363377 -0.488374 | 0.1150 0.0028* 0.0113* 0.3346 0.0864 0.3126 | DoxMetTa | -0.610467 0.956399 0.468025 -1.383726 -0.447676 -2.299428 | 0.2708 0.1694 0.3199 0.0832 0.3272 0.0107* | DoxMetTa | 0.142442 1.709309 1.220935 -0.630816 0.305233 -1.546518 | 0.4434 0.0437 0.1111 0.2641 0.3801 0.0610 | DoxTau | -1.281982 0.284884 -0.203489 -2.055241 -1.119190 -2.970942 | 0.0999 0.3879 0.4194 0.0199* 0.1315 0.0015* | DoxTauHG | -0.142442 1.424424 0.936050 -0.915701 0.020348 -1.831403 | 0.4434 0.0772 0.1746 0.1799 0.4919 0.0335 | Los | 0.651165 2.218032 1.729658 -0.122093 0.813956 -1.037795 | 0.2575 0.0133* 0.0418 0.4514 0.2078 0.1497 | LosHG | 0.651165 2.218032 1.729658 -0.122093 0.813956 -1.037795 | 0.2575 0.0133* 0.0418 0.4514 0.2078 0.1497 | Met | -1.750007 -0.183140 -0.671514 -2.523266 -1.587216 -3.438968 | 0.0401 0.4273 0.2509 0.0058* 0.0562 0.0003* | MetHG | -2.075590 -0.508723 -0.997097 -2.848849 -1.912798 -3.764550 | 0.0190* 0.3055 0.1594 0.0022* 0.0279 0.0001* | Tau | -1.607564 -0.040697 -0.529072 -2.380824 -1.444773 -3.296525 | 0.0540 0.4838 0.2984 0.0086* 0.0743 0.0005* | TauHG | -0.691863 0.875003 0.386629 -1.465122 -0.529072 -2.380824 | 0.2445 0.1908 0.3495 0.0714 0.2984 0.0086* Col Mean-| Row Mean | DoxMetLo DoxMetTa DoxMetTa DoxTau DoxTauHG Los
50
---------+------------------------------------------------------------------ DoxMetTa | -1.811054 | 0.0351 | DoxMetTa | -1.058144 0.752910 | 0.1450 0.2258 | DoxTau | -2.482568 -0.671514 -1.424424 | 0.0065* 0.2509 0.0772 | DoxTauHG | -1.343028 0.468025 -0.284884 1.139539 | 0.0896 0.3199 0.3879 0.1272 | Los | -0.549420 1.261633 0.508723 1.933147 0.793608 | 0.2914 0.1035 0.3055 0.0266 0.2137 | LosHG | -0.549420 1.261633 0.508723 1.933147 0.793608 0.000000 | 0.2914 0.1035 0.3055 0.0266 0.2137 0.5000 | Met | -2.950593 -1.139539 -1.892449 -0.468025 -1.607564 -2.401172 | 0.0016* 0.1272 0.0292 0.3199 0.0540 0.0082* | MetHG | -3.276176 -1.465122 -2.218032 -0.793608 -1.933147 -2.726755 | 0.0005* 0.0714 0.0133* 0.2137 0.0266 0.0032* | Tau | -2.808151 -0.997097 -1.750007 -0.325582 -1.465122 -2.258730 | 0.0025* 0.1594 0.0401 0.3724 0.0714 0.0120* | TauHG | -1.892449 -0.081395 -0.834305 0.590118 -0.549420 -1.343028 | 0.0292 0.4676 0.2021 0.2776 0.2914 0.0896 Col Mean-| Row Mean | LosHG Met MetHG Tau ---------+-------------------------------------------- Met | -2.401172 | 0.0082* | MetHG | -2.726755 -0.325582 | 0.0032* 0.3724 | Tau | -2.258730 0.142442 0.468025 | 0.0120* 0.4434 0.3199 | TauHG | -1.343028 1.058144 1.383726 0.915701 | 0.0896 0.1450 0.0832 0.1799 alpha = 0.05 Reject Ho if p <= alpha/2 >
51