estudio del genotipo del síndrome de gilbert por reversión con cebador, polimorfismo de ugt1a1...

•Estudio del Genotipo del Síndrome de Gilbert por reversión con cebador, Polimorfismo de UGT1A1 (TA)n Promotor con Fusión de Alta Resolución

J.S. Farrar, R.A. Palais y C.T. Wittwer

www.clinchem.org/cgi/content/article/57/9/1303

Septiembre 2011

© Copyright 2011 by the American Association for Clinical Chemistry


IntroducciónIntroducción

Síndrome de Gilbert Una hiperbilirrubinemia hemolítica no conjugada crónica

Asociada con inserciones de timina- adenina (TA) en el promotor UGT1A1

El genotipo promotor UGT1A1 también está correlacionado con toxicidad inducida por la droga terapéutica irinotecan


IntroducciónIntroducción

Polimorfismo del UGT1A1 (TA)n promotor

Variaciones en longitud en las repeticiones: (TA)5 , (TA)6 , (TA)7 , (TA)8

La frecuencia y longitud de repeticiones depende de la etnicidad.

Los alelos (TA)5 y (TA)8 están restringidos a descendientes de africanos.

Métodos actuales para determinar el genotipo

Pasos manuales múltiples, sondas múltiples etiquetadas y/o dificultan el análisis del enotipo de los alelos (TA)5 y (TA)8


Introducción (contIntroducción (cont))

Estudio del genotipo por reversión con cebador Método de fusión de alta resolución, tubo cerrado

Usa un colorante de ADN saturado de doble espiral en lugar de los cebadores/sondas modificados covalentemente

Solo se requieren dos cebadores estándar de PCR (uno con una adición de 5’)

Previamente se han aplicado a variantes de base simple y pequeñas delaciones


PreguntaPregunta

¿Porqué es importante que los ensayos de tipificación de UGT1A1 (TA)n sean validados para la repetición de los alelos (TA)5 y (TA)8?

© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry© Copyright 2009 by the American Association for Clinical Chemistry

Alcance de la reversión por cebador para el genotipo promotor de polimorfismo de UGT1A1 (TA)n. A una sonda complementaria a la repetición de (TA)5 se le adicionan 5’ al cebador de PCR previo (gris). PCR asimétrico sobre produce un producto de ADN de cadena sencilla que forma una horquilla intramolecular. Los productos con repeticiones mayores de (TA)5 forman lazos protuberantes que progresivamente desestabilizan la estructura de horquilla. La estabilidad de la horquilla (Hairpin Stability) se revela por análisis de fusión de alta resolución.

Materiales y MétodosMateriales y Métodos


Materiales y Métodos(cont)Materiales y Métodos(cont)

100 muestras de ADN de afroamericanos Población de estudio enriquecida para los alelos

(TA)5 y (TA)8

Nuevo método de análisis de fusión Localiza la desviación específica de la decaída

exponencial de manera que pueda removerse la fluorescencia de respaldo

Mejora la agrupación de genotipos


Materiales y Métodos(cont)Materiales y Métodos(cont)

3 métodos diferentes de obtención del genotipo Análisis fragmentario (método de referencia)

Fusión de pequeña ampliación

Estudio del genotipo de reversión con cebador

2 estudios bloqueados Estudio del genotipo por fusión de pequeña ampliación y

reversión con cebador en un instrumento basado en capilaridad.

Comparación instrumental para el estudio del genotipo de reversión con cebador (capilaridad vs. placa)


PreguntaPregunta

¿Qué estructura forma una reversión por cebador después de PCR y cómo revela esta estructura la repetición del genotipo (TA)n?


ResultadosResultados

Estudio del genotipo de reversión con cebador en un instrumento por capilaridad

99% son concordantes con los resultados del genotipo por análisis fragmentario

Un re análisis de la única muestra discordante reveló un error en el análisis fragmentario

100% de precisión después de la corrección del error en el fragmento


Resultados (cont)Resultados (cont)

Estudio del genotipo de reversión con cebador en un instrumento por capilaridad

Aún cuando las diferencias de temperatura de fusión son pequeñas, la precisión de la temperatura absoluta del instrumento y los trazos de las curvas de fusión permiten el estudio del genotipo



Genotipo Actual nGenotipo mal

clasificado n

(TA)5/(TA)6 6

(TA)5/(TA)7 7 (TA)5/(TA)6 1

(TA)5/(TA)8 2

(TA)6/(TA)6 22 (TA)5/(TA)6 1

(TA)6/(TA)7 34 (TA)6/(TA)6 4 (TA)7/(TA)7 1

(TA)6/(TA)8 7 (TA)6/(TA)7 3(TA)7/(TA)7 1(TA)7/(TA)8 1

(TA)7/(TA)7 15 (TA)6/(TA)7 1

(TA)7/(TA)8 7 (TA)7/(TA)7 3Total 100 16

Estudio del genotipo de pequeña ampliación en un instrumento por capilaridad

84% de precisión comparada con el análisis fragmentario después de la corrección del error



Genotipo actual n Genotipo mal clasificado n

(TA)5/(TA)6 5 0

(TA)5/(TA)7 6 (TA)6/(TA)7 2

(TA)5/(TA)8 2 (TA)5/(TA)7 1

(TA)6/(TA)6 21 (TA)5/(TA)7 1

(TA)6/(TA)7 1

(TA)6/(TA)7 33 (TA)7/(TA)7 3

(TA)6/(TA)8 7 (TA)6/(TA)7 1

(TA)7/(TA)7 3

(TA)7/(TA)7 15 (TA)6/(TA)8 3

(TA)7/(TA)8 3

(TA)7/(TA)8 6 0

Total 95 18

Estudio del genotipo por reversión con cebador en un instrumento de placa

100% de precisión en el instrumento por capilaridad cae al 81% en un instrumento de placa


PreguntaPregunta

¿Porqué depende la precisión del genotipo del instrumento?


ConclusionesConclusiones El instrumento y método para estudiar el genotipo son críticos para tener éxito

El resultado del instrumento de fusión de alta resolución de placa no fue tan bueno como el de capilaridad

La precisión de temperatura absoluta del instrumento es crítica

El desempeño de del genotipo por reversión con cebador fue mejor que la de pequeña ampliación

Los cebadores de reversión pueden ser usados para repeticiones de genotipo de secuencia simple en <30 min


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