estudio estructural y funcional de proteínas con técnicas...

Estudio estructural y funcional de

proteínas con técnicas biofísicas

Alessio Ausili, PhD

Prometeo de la Sección de Genética Humana,

Microbiología y Bioquímica Clínica

Loja, 7 de Mayo 2015

Por qué…

• Estructura secundaria

• Estructura tridimensional

• Cambios conformacionales

• Entornos de determinados aminoácidos

• Secuencia aminoacídica

• Identificación de proteínas

• Tamaño, forma y peso molecular de las proteínas

• Dinámicas moleculares

• Interacciones proteína-proteína, enzima-sustrato, proteína-

membrana, proteína-DNA, etc.

• Estabilidad

1. Espectroscopía Ultravioleta-Visible (UV/Vis)

2. Espectroscopía de Fluorescencia

3. Dicroísmo circular (CD)

4. Resonancia Magnética Nuclear (NMR)

5. Difracción de Rayos X

6. Espectrometría de Masas (MS)

7. Dispersión Dinámica de Luz (DLS)

8. Resonancia de Plasmones Superficiales (SPR)

9. Calorimetría Isotérmica de Titulación (ITC)

10.Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC)

Técnicas

Se basa en la absorción de las radiaciones electromagnéticas

monocromáticas en el intervalo de UV (200-350 nm) y visible (350-700

nm) por parte de las moléculas. Esta absorción es producida por un

salto electrónico del estado normal al excitado y sigue la ley de

Lambert-Beer:

A = -log10 I1 /I0 = ecl

A = Absorbancia

l = camino óptico (cm)

c = concentración (mol L-1)

e = coeficiente de extinción molar (L mol-1 cm-1)

Espectroscopía Ultravioleta-Visible Principios

I0 I1

Equipo

Lámpara Monocromador

Intensidad

luz incidente

I0

Intensidad

luz transmitida

I1

Cubeta Detector

Espectrómetro

Varian Cary 100

Cubetas

de cuarzo o plástico

Espectroscopía Ultravioleta-Visible

Aplicación en estudio de proteínas

Espectroscopía Ultravioleta-Visible

• Determinación de concentración y pureza de proteínas en solución

• Información sobre el microentorno de los aminoácidos aromáticos

• Cambios conformacionales: desplegamiento y dinámica molecular

LIMITES:

• Muy poco usada en análisis estructurales

• Cambios de absorbancia de los aminoácidos aromáticos muy bajo

durante el desplegamiento

• Espectros poco específicos

Espectroscopía de Fluorescencia Principios

Se basa en la propiedad de algunas moléculas de reemitir a una

longitud de onda mayor las radiaciones electromagnéticas absorbidas.

Los electrones de las moléculas excitadas pasan del nivel energético

fundamental a uno excitado y cuando vuelven al estado fundamental lo

hacen emitiendo una radiación a menor frecuencia de la inicial

Equipo

Espectroscopía de Fluorescencia

Lámpara

Monocromador

de excitación Monocromador

de emisión

Divisor

de haz

Lente Lente

Cubeta lecc

lem

Fotomultiplicadores Detector

Fluorímetro

Varian Cary Eclipse

Cubetas

de cuarzo



• Información sobre la estructura terciaria

• Cambios en el microentorno del triptófano


• Estabilidad (T, pH, sal, agentes desnaturalizantes, etc.)

• Plegamiento

• Estudio de binding

LIMITES:

• Información limitada al microentorno de los aminoácidos aromáticos

• Depende de las condiciones del solvente

Ejemplos


mKO ArgBP

Cambios conformacionales y plegamiento Binding

Arg

Dicroísmo Circular (CD) Principios

Se basa en el fenómeno físico de la diferente absorción por parte de

una molécula quiral de las dos componentes, derecha e izquierda, de

la luz polarizada circularmente. Los espectros de dicroísmo circular son

espectros diferenciales miden la diferencia de absorción (DA) de la luz

polarizada circularmente a la derecha (AR) y a la izquierda (AL). DA se

expresa en elipticidad (q) definida por:

DA = AL – AR

DA = Decl

q = [q]cl

[q] es la elipticidad molar

Luz polarizada

Circularmente a la izquierda

Luz polarizada

Circularmente a la derecha

Equipo

Dicroísmo Circular (CD)

Fuente de luz Monocromador Polarizador lineal Modulador

fotoelástico (PEM)

Fotomultiplicador Cubeta

Cubeta

Far UV

Cubeta

Near UV Espectrómetro

Jasco J-815



UV lejano (180-260 nm), enlace peptídico:

• Información sobre la estructura secundaria

• Porcentajes estructuras secundarias

• Plegamiento-desplegamiento

• Estabilidad (T, pH, sal, agentes desnaturalizantes, etc.)

UV cercano (240-360 nm), aminoácidos aromáticos:

• Información sobre la estructura terciaria


LIMITES:

• Baja resolución

• Baja sensibilidad a cambios de estructuras hoja-b

• Inadecuado para estudio de proteínas no en solución

Ejemplos


AGP

Termoestabilidad

UV cercano

UV lejano

ArgBP

Estructura secundaria

WT Mutante

WT: 36% a, 14% b

Mut: 31% a, 16% b

Resonancia Magnética Nuclear (NMR) Principios

Se basa en las propiedades magnéticas (spin nuclear) de los núcleos

de algunos átomos e isotopos que sometidos a un campo magnético

externo absorben diferentes frecuencias de señales de radio. La

absorción de estos núcleos depende de su entorno dentro de la

molécula y de los átomos adyacentes (desplazamiento químico). Esto

proporciona información sobre como los núcleos están enlazados

químicamente, sus distancia espacial y la velocidad con la cual se

mueven. De estos datos se obtiene un mapa con el que se determina

la estructura global de la proteína.

Resonancia Magnética Nuclear (NMR) Equipo

Transmisor de

radiofrecuencias Receptor de

radiofrecuencias

Generador

de pulsos

Polo del

imán

Polo del

imán

Control y

registrador

Bobinas

de barrido Bobinas

de barrido

Tubo de

muestra

Espectrómetro NMR

Bruker Avance 800

Tubos de NMR

• Estructura 3D de alta resolución

• Información sobre dinámica molecular

• Interacciones con otras moléculas

LIMITES:

• Complejidad de los cálculos

• No sirve en proteínas grandes (max 30 kDa)

• Muestra muy concentrada (15 mg/ml)


Resonancia Magnética Nuclear (NMR)

Resonancia Magnética Nuclear (NMR)

10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 -2.0 Desplazamiento químico de 1H (ppm) 10.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0.0 -2.0

Desplazamiento químico de 1H (ppm)

-2.0

0.0

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

Despla

zam

iento

quím

ico d

e 1

H (

ppm

)

Globina

Ejemplos

Estructura 3D

Principios

Difracción de Rayos X

Se basa en el fenómeno de difracción de un haz de rayos X por parte

de un retículo atómico en un cristal. Los rayos X son difractados por los

electrones que rodean los átomos siendo la longitud de onda del

mismo orden del radio atómico y pueden ser detectado por películas

fotográficas o placas de imagen. Según los ángulos y las intensidades

de los rayos difractados se puede producir una imagen tridimensional

de la densidad de electrones en el cristal

Equipo

Cristal

Placa de imagen

Haz de rayos X

enfocados

Monocromadores

Rayos X

sin enfocar

Generador

de rayos X

Goniómetro


Difractometro

Nonius Kappa

Sincrotrón ESRF

Grenoble - Francia



• Estructura 3D de alta resolución

• Estudio de proteínas de grandes dimensiones

LIMITES:

• Complejidad de obtener el cristal

• Conformación interna del cristal puede ser modificada por factores

no fisiológicos

• Complejidad de los cálculos

• Costes elevados

Difracción de Rayos X Ejemplos

Mioglobina

Estructura 3D

Espectrometría de Masas (MS) Principios

Se basa en la posibilidad de separar una mezcla de iones en función

de sus relación masa/carga a través de un campo magnético. Las

moléculas se pueden ionizar por diferentes técnicas (MALDI, ESI, etc.),

se aceleran mediante potencial eléctrico y se pueden separar por

diferentes métodos (sector magnético, trampa de iones cuadrupolar,

TOF, etc.).


Ionización

MALDI (Desorción/ionización láser asistida por matriz) ESI (Ionización por electrospray)


Separación de los iones

Analizador de sector magnético

Generador y acelerador

de iones

Campo magnético

Seleccionador

de iones

Detector

𝑚

𝑒=𝐻2𝑟2

2𝑉

m es la masa del ion

e es la carga del ion

H es el campo magnético

r es el radio de la curva

V es el voltaje

TOF (Tiempo de vuelo)

Cámara

de vacío Camino de vuelo

Generador y acelerador

de iones

Área de

aceleración

Iones pesados

Detector

Iones ligeros

𝑣 =2𝑒𝑉

𝑚 𝑡 = 𝑘

𝑚

𝑒

v es la velocidad

e es la carga del ion

V es el voltaje

m es la masa del ion

T es el tiempo de vuelo

k es una constante del aparato

Espectrometría de Masas (MS) Equipo

Cámara de

ionización

Acelerador

de iones

Detector

de iones

Inyector

de muestra Análisis de

espectros

Módulos de un aparato de espectrometría de masas

Espectro

Espectrómetro de

masas MSD-TOF,

Agilent Technologies

Espectrómetro de

masas trampa de iones

Trap XCT Plus, Agilent

Technologies

Espectrometría de Masas (MS) Aplicación en estudio de proteínas

• Identificación de proteínas

• Determinación del peso molecular

• Determinación de la secuencia aminoacídica

• Estudios de proteómica

• Modificaciones postraduccionales

LIMITES:

• Análisis destructivo

• Costes elevados

• Problemas con análisis de mezclas

• Interferencia de la matriz (MALDI)

Espectrometría de Masas (MS) Ejemplos

¿Que proteínas

son?

SDS-PAGE

Banda de la proteína

Proteína desconocida

Péptidos trípticos Espectro de masas

Espectro de masas

teórico Secuencia de la proteína

Péptidos trípticos

teóricos

Identificación Búsqueda

vía database

Identificación de proteínas

Electroforesis en 2-D

Proteínas reguladas diferencialmente

Se basa en la dispersión de Rayleigh que es el fenómeno por el cual

cuando la luz golpea pequeñas partículas en suspensión se dispersa

en todas las direcciones si el tamaño de las partículas es menor que la

longitud de onda de la luz. Las fluctuaciones de la intensidad de la luz

dispersada dependen del movimiento Browniano de las partículas. De

la velocidad del movimiento Browniano deriva el radio hidrodinámico

de las partículas a través de la ecuación de Stokes-Einstein:

𝐷 =𝑘𝐵𝑇

6𝜋η𝑟

D es la velocidad de difusión

kB es la constante de Boltzmann

T es la temperatura

h es la viscosidad del medio

r es el radio hidrodinámico

Dispersión Dinámica de Luz (DLS) Principios

Equipo

Dispersión Dinámica de Luz (DLS)

Espectrómetro AutoSizer 4800, Malvern Instruments Laser

Polarizador

Detector

Muestra

Partículas pequeñas

Intensidad de las fluctuaciones rápida

Partículas grandes

Intensidad de las fluctuaciones lenta


Dispersión Dinámica de Luz (DLS)

• Determinación del tamaño de las proteínas

• Monitoreo de la agregación, oligomerización y formación de

amiloides

• Estudio de estabilidad térmica

• Efecto de la concentración de las proteínas

LIMITES:

• No sensible a pequeños cambios de tamaño

• Sensible a viscosidad y concentración

Dispersión Dinámica de Luz (DLS) Ejemplos

BSA

Desnaturalización y agregación

Resonancia de Plasmones Superficiales (SPR) Principios

Se basa en el fenómeno óptico por el cual los plasmones de superficie

(ondas electromagnéticas que se propagan paralelamente a la

superficie de un material metálico plano) excitados por una radiación

luminosa, modifican la reflexión de la radiación. La resonancia de los

plasmones es sensible a cualquier cambio en la superficie que

modifique el índice de refracción local. Esto se refleja en cambios en el

ángulo de reflexión de la radiación.

Angulo critico

Angulo SPR

Angulo critico

Angulo SPR

Angulo Incidente (deg) In

tensid

ad L

uz R

efleja

da

Onda plasmonica

de superficie

Equipo

Resonancia de Plasmones Superficiales (SPR)

Fuente

de luz Luz

polarizada

Prisma

Luz

reflejada

Detector

óptico

Chip sensor

con film de oro

Canal

de flujo

Sensorgrama

Tiempo

Angulo

Resonancia

Intensidad

Biacore 3000

Chip sensor


Resonancia de Plasmones Superficiales (SPR)

• Estudio interacciones (real-time) proteína-proteína, proteína-

membrana, proteína-ADN, etc.

• Estudio de afinidad y cinética de las interacciones

LIMITES:

• Problemas en la inmovilización de las proteínas de manera estable

y funcional

• Dificultad en discriminar uniones especificas y no-especificas

• Baja sensibilidad para compuesto de bajo peso molecular

• Costes elevados de aparato y chips sensores

Resonancia de Plasmones Superficiales (SPR) Ejemplos

Interacción proteína-proteína

Proteína Morfogénica Ósea (BMP) - Folistatina

Calorimetría Isotérmica de Titulación (ITC) Principios

Se basa en la posibilidad de cuantificar directamente la entalpía de

unión de dos o mas moléculas midiendo el calor absorbido o liberado

durante la reacción. Esta técnica permite la determinación directa de la

estequiometria, la diferencia de entalpía y la constante de afinidad de

la unión entre moléculas en solución y indirecta de los cambios energía

libre de Gibbs y de entropía según la relación:

∆𝐺 = ∆𝐻 − 𝑇∆𝑆

G es la energía libre de Gibbs

H es la entalpía

T es la temperatura absoluta

S es la entropía

Calorimetría Isotérmica de Titulación (ITC) Equipo

Microcalorímetro VP-ITC, MicroCal

Celda de

la muestra

Celda de

referencia

Jeringa automática

Termopares

Termopar

Cubierta aislante

Alimentador

T constante Alimentador

compensación DT


Calorimetría Isotérmica de Titulación (ITC)

• Completa caracterización termodinámica en un solo experimento de

las interacciones proteína-proteína, enzima-ligando, proteína-

membrana, etc. sin marcaje, inmovilización o limite de peso

molecular

• Determinación del numero de sitios de unión de las proteínas

LIMITES:

• Requiere un alto grado de pureza de las muestras

• Requiere una gran cantidad de proteína

• Requiere alta solubilidad de todas las moléculas en el mismo

solvente

Calorimetría Isotérmica de Titulación (ITC) Ejemplos

Interacción proteína-proteína

ERK2 – PTP-SL

Termograma

Isoterma de unión

Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) Principios

Se basa en la posibilidad de obtener información termodinámica de

una o más moléculas calentando o enfriando la muestra. El DSC se

basa en la diferencia de flujo térmico que hay entre la muestra y una

referencia para mantener la misma temperatura. Esta técnica permite

la determinación directa de la entalpía asociada al proceso e indirecta

de los cambios energía libre de Gibbs y de entropía según la relación:

∆𝐺 = ∆𝐻 − 𝑇∆𝑆

G es la energía libre de Gibbs

H es la entalpía

T es la temperatura absoluta

S es la entropía

Equipo

Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC)

Celda de

la muestra

Celda de

referencia

DT

Termopares

Cubierta aislante

Microcalorímetro VP-DSC, MicroCal

Celda

Heater Heater

Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) Aplicación en estudio de proteínas

• Estudio de estabilidad térmica de las proteínas

• Información sobre los parámetros termodinámicos de las

transiciones térmicas de las proteínas

• Estudio de desplegamiento y replegamiento

LIMITES:

• Resultados dependen de muchos parámetros incluido el operador

• Muy sensible hasta a pequeños cambios

Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) Ejemplos

Estudio termodinámico de proteínas

Tm = 96.9°C

DH = 690 kcal/mol

Tm = 52.5°C

DH = 9.8 kcal/mol

Tm = 22°C

DH = 5.3 kcal/mol

ADH

Muchas Gracias!

Alessio Ausili Caracterización de Proteínas con Métodos Biofísicos

estudio estructural y funcional de proteínas con técnicas...

Documents