º2.0 DESCRIPCION DEL PROGRAMA

2.1 Denominación:“ESTUDIO MORFOLOGICO Y FUNCIONAL DE LAS CELULAS DENDRITICAS EN MUCOSA BUCAL SANA E INFLAMADA POR HISTOLOGIA, INMUNOHISTOQUÍMICA Y MICROSCOPIA ELECTRONICA CON TECNICA MODIFICADA”.

2.2 Marco teórico: Las células dendríticas (CD) forman parte de un sistema celular que por una doble función inicia una respuesta inmune. Por un lado actúan como “ centilenas” periféricas , de piel y de mucosas, ubicadas en el estrato suprabasal de los epitelios. .Por otro, vehiculizan señales a los ganglios linfáticos periféricos relacionándose allí con las demas células inmunitarias por lo cual se pueden detectar también en los tejidos conectivos subepiteliales. Se las encuentra también en epitelios escamosos estratificados de vagina, ectocervix, faringe, esófago, en los intersticios de terjido cardíaco y en la dermis(1,2,3,4,5))

Todas estas CD expresan las figuras citológicas comunes de las CD: débiles receptores para la FC de las Igs, no adherencia al plástico, altos niveles de Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC II). La presencia de grandes cantidades del CMH tipo II provoca en la célula inmadura la formación de grandes vacuolas endocíticas (entre 6 y 8 hrs) (6) Las CD , se sabe hoy que derivan de un precursor común reconocido como CD34+ y pueden pertenecer a un linaje mieloide linfoide. A este linaje pertenecn las células conocidas como plasmocitoides, las cuales son productoras de grandes cantidades de Interferón Gama (IL3R+ CD1a-CD11c-) y las mieloides .Estas se diferencian de las CD intersticiales CD1a-CD1a+ de los epitelios y la piel.De todas maneras, ambas células provenientes de ambos linajes son CD periféricas las cuales migran desde los tejidos a los folículos linfoides, a la zona marginal del bazo y el timo. (7)Son células que no abundan , en comparación con los leucocitos por ejemplo, y constituyen un 0,2% de éstos , encontrándose en proporciones menores en piel y mucosas. Fueron identoificadas por Paul Langhjerans en 1868 , anátomo patólogo alemán quien las confundió con terminaciones nerviosas de la piel. Ciento cinco años después, en 1973, Ralph M Steiman and Cohn (8) las redescubrieron en el bazo delratón y como un elemento del Sistema Inmune. .Por sus características morfológicas fueron denominadas células dentríticas (CD).Desde esta descripción, han asumido paulativamente un papel cada vez más importante en la Inmunología. Como células presentadora de antígenos (9,10) en la respuesta inmune versus tolerancia e inmunodesviación (11), como asociadas a los NK (12), en la regulación de la síntesis de anticuepos, en la inmunidad innata,(13) en cáncer de la mucosa bucal y expresión en carcinomas orales a células escamosas(14) , en la captasión de microrganismos invasores (15), en la destrucción inmediata de virus con secreción de IFNalpha , en procesos de autoinmunidad y utilizadas en el tratamiento como vacunas en distintos de tipos de cánceres muy dispares como melanoma(15,16) , de riñón.(17) y otros.Localizadas generalmente en los estratos suprabasales de los epitelios, en condiciones de no estimulación (quiesencia) la CD residen en un espacio aunque conocido, es un espacio transitorio por su carácter migratorio.Esta migración y colonización en las áreas cercanas a los linfocitos T les brindan la oportunidad de presentárseles apropiadamente. Las propiedades esenciales de la CD son la endocitosis, la captación de antígenos, su motilidad, el proceso sináptico descripto para la presentación, todo lo cual la lleva a estar asociada a altas funciones dinámicas de la membrana.La generación de las CD a partir de sus precursores está regulada por citoquinas y factores de crecimiento (IL-4 y TGFb). (18)La maduración implica : la transformación de la célula captadora de Ag en célula presentadora , en este cambio se producen variaciones metabólicas y morfológicas.Hace una década se interpretaba la primera evidencia sobre la capacidad de la CD a unirse a la IgE en sitios lesionados y no lesionados de la piel y los epitelios. Esto ha sido confirmado posteriormente por la demostración sobre que exiten recpetores en su membrana para la zona Fc de la IgE.Se identifica un subtipo de la CD dentro de las epidermales dendríticas inflamatorias (IDEC) . la activación ocurre cuandoo una CD reconoce un patógeno en un foco infeccioso , en un microclima modificado y con productor de citoquinas como IL-1 o TNF alpha. La CD en estas circunstancias migra, madura y adopta la capacidad para iniciar una respuesta en el ganglio.

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Por otro lado la CD puede también captar un Ag inocuo en un tejido sano. En este caso migrará, pero tendrá una maduración parcial . La expresión de moléculas estimuladoras o de citoquinas será pobre y se determina una anergia o fenómeno de tolerancia hacia ese Ag.(19) Conocida la actuación de las Moléculas de Adhesión (MA) en los focos de inflamación y vasculitis , su relación con las CD estaría hablando de la participación de las CD con las MA, tales ICAM-1/CD54, ICAM3 (CD50), Ag de función de los linfocitos (FA1 CD11a, LFA2, LFA3 y B7 molécula) en estas situaciones de estimulación (20)La familia de las CD tiene la habilidad más potente para iniciar la proliferación linfocítica de célulasT en respuesta al estímulo de un antígeno.Este es una de las características más importantes por no decir la más importante de la célula dendrítica.(21)En síntesis, su actividad puede realizarse a través de: 1) una `resentación primaria del antígeno, 2) la migración de la CD desde el sitio primario de exposición del Ag a las áreas ricas en células T de los órganos linfáticos., 3)unión o liga del antígeno a la

célula T específica y 4) activación o estimulación de la CD para inducir el crecimiento de la célula T y la función efectora.

2.3:APORTE ORIGINAL AL TEMA:Creemos que las células dendríticas han sido poco estudiadas en la mucosa bucal. Si bien existen referencias sobre la existencia y localización de estas células en los dos tejidos que conforman la mucosa de la cavidad oral, no existen referencias sobre su participación en lesiones inflamatorias, ampollares o proliferativas. Las características morfológicas en su estado de quiescencia y las que corresponden a su movimiento o traslación en su camino hacia los ganglios linfáticos, podrían ser observados en la mucosa bucal en estados patológicos.

2.4 OBJETIVOS Identificar mediante la utilización de la técnica de Histología, Inmunohistoquímica y Microscopia de barrido modificada, algún o algunas características o modificaciones estructurales o funcionales que se presenten en forma diferencial entre las muestras de células dendríticas incluídas en tejido sano y tejido inflamado de mucosa bucal

2.5 METODOLOGIA: El trabajo de investigación se realizará sobre 20 pacientes, bajo consentimiento informado.Se realizará distribución de sexos, edad, localización de la lesión, y diagnóstico de las mismas. 1- Se tomarán 10 biopsias de mucosa bucal de tejido sano para conformar un grupo control. 2- Se tomarán 20 biopsias de tejido inflamado de la mucosa bucal de lesiones inflamatorias diferentes ( gingivitis, aftas, líquen, mucosistis).A ambos grupos se aplicarán las mismas técnicas de estudio a saber:a) Estudio histológico para microscopía óptica. Tinción hematoxilina-eosinab) Estudio inmunohistoquímico, método PAP, con marcador anticuerpo monoclonal para CDc) Estudio de cortes de tejido fresco para observación por microscopio de barrido con técnica modificada .( Este método permite la observación de elementos celulares vivos pasivos y en actividad en forma directa. Se utiliza una suspensión del tejido obtenido en oro paladio coloidal, previa fijación mediante punto crítico.)Debido a que con esta última técnica los ejemplares deben ser procesados casi inmediatamente , con un tiempo límite de minutos para su fijación, y esta tarea se realizará en el Observatorio de la ciudad de La Plata, es que , por esas razón, los pacientes provendrán de esta ciudad y las biopsias serán realizadas serán realizadas en la Asignatura de Patología y Clínica Estomatológica de esa ciudad.Se realizará estudio fotográfico de todas las imágenes obtenidas por las tres técnicas. Utilizadas.Los resultados serán tabulados y se les aplicará estudio estadístico.

2.6 METAS / RESULTADO ESPERADO EN EL DESARROLLO DEL PROYECTO.Detección de áreas de tejido mucoso bucal con o sin centros linfoideos y en donde pudieran aparecer las células dendríticas acompañadas de detalles significativos para

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gránulos de Birbel como expresión reactiva a un medio inflamado dentro de la mucosa bucal. Una vez identificadas como células en estado de “migración” , si presentan alteraciones morfológicas podrían relacionarse con diferentes estados de enfermedad tisular específos.

3. ANTECEDENTES: La Dra.Masyocchi Karina ha utilizado la técnica de microscopía electrónica de barrido modificada para la realizaci´pon de su Tesis de Doctorado.Las técnicas de histología e Inmunohistoquímica son técnicas de rutina utilizadas en nuestra Asignatura, en el laboratorio de Anatomía Patológica y que aplicamos regularmente a todos los trabajos de investigación

4. APORTES POTENCIALES

4.1 Contribución al avance del conocimiento científico y/o tecnólogico y/o creativo. Los resultados del presente estudio de investigación están destinados a relacionar aquellos previos y actuales, publicados en artículos nacionales e internacionales y en libros científicos de la

materia . Queremos enfatizar el papel que juegan las células dendríticas en los diferentes niveles en que participan, histo-patológico, inmunológico y molecular. La nueva tecnología, especialmente la de microscopía electrónica de barrido modificada permitirá probablemente aportar nuevos conceptos a este tema.

4.2 Contribución a la formación de Recursos Humanos

El hacer formar parte de este proyecto a gente jóven que recién se inicia en programas de investigación en el cvampo de la patología oral acrecienta el nivel de nuestra Asignatura, revaloriza la información docente y los convierte en verdaderos agentes multiplicadores de concocimiento y de prácticas de información científica. Creemos en la necesidad de desarrollar la Investigación Científica como una de las metas de la Universidad y de la implementación de nuevas ideas y nuevas técnicas.

4.3 Transferencia prevista de los resultados, aplicaciones o conocimientos derivados del Proyecto ( si corresponde).

Los mecanismos que existen relacionados con la inmunogenicidad de las células dendríticas son criterios científicos del presente y más aún de un futuro cercano de trascendencia.. Incicialmente los inmunólogos creían que la activación de la Interleuquina 1 (IL-1) era todo lo que se necesitaba para activar a los linfocitos T ante la presentación de un Antígeno. Sin embargo este concepto ha variado ante el reconocimiento de las variadas propiedades que tiene las CD. Existe la evidencia de la importancia de las CD quienes son capaces de reclutar antígenos de células que están muriendo por apoptosis, de tumores, de transplantes de tejidos propios y de células bajo procesos infecciosos., habiéndose también visto en lugares de replicación del VIH-1 en las superficies mucosas y tonsilas en donde las CD se han visualizado, especialmente durante la fase crónica asintomática de la infección .La visualización de distinta morfología y/o de cambios en la migración, podrían quizá estadificarse y tener significación en la evolución de las patologías mencionadas.

5. PLAN DE TRABAJO

Año 1: Se tomarán muestras en 10 pacientes recepcionados en Patología y Clínica Estomatológica, por biopsia excisión. En todos los casos con consentimiento informado de los pacientes.Se tomarán dos tipos de material de muestras:tejido con patologíatejido de mucosa oral sana extraído del área vecina a una patología determinada que implique margen.El material será acondicionado en frascos de vidrio transparentes con gluataraldehido.Los resultados serán sistematizados y analizadosSe realizará documentación de los mismos a través de microfotografíasSe hará permamente actualización sobre el tema.

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Se acondicionarán las muestras en formol al 10% para el estudio histopatológico convencional por microscopía óptica. con inclusión en Parafina, tinción con Hematoxilina –Eosina y observación microscópica óptica.Se separarán secciones de las muestras para el estudio por técnica Inmunohistoquímica , Peroxidasa-Antiperoxidasa (PAP) con los antisueros monoclonales específicos oara células dendríticas.En ambas situaciones se ordenarán y evaluarán los resultados obtenidosSe compararán los datos con otros de la literatura nacional e internacionalSe elaborarán las conclusiones, difundiendo las mismas.

6.RECURSOS HUMANOS INTERVINIENTES

6.1 Director Casariego Zulema Juana Profesora TitularDedicación semi exclusivaFacultad de OdontologíaUniversidad Nacional de La PlataCategoría Docente –Investigador III

6.2 Co-Director

Micinquevich Susana BeatrizProfesora AdjuntaDedicación ExclujsivaFacultad de OdontologíaUniversidad Nacional de La PlataCategoría Docente Investigador II

6.3 Investigadores formados:Masyocchi Karina AlejandraAyudante DiplomadoDedicación SimpleFacultad de Odontología Universidad nacional de La PlataCategoría Docente Investigador :D

6.4 Investigadores en formación:Salvatori MagdalenaAyudante DiplomadoDedicación simpleFacultad de OdontologíaUniversidad Nacional de La PlataNo posee

Técnica HistólogaSilvia Del VisoFacultad de Odontología Universidad Nacional de La Plata.

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