ESTUDO CRÔNICO DO COMPORTAMENTO DE VÁLVULAS BIOLÓGICAS LIOFILIZADAS EM MODELO ANIMAL

Marina J. S. Maizato1, Fábio P. Taniguchi 1, Rafael F. Ambar1, Ronaldo R. N. M. Pitombo2,

Adolfo A. Leirner1, Idágene A. Cestari1, Noedir A. G. Stolf3

1 Bioengenharia - Instituto do Coração (InCor) HC-FMUSP, São Paulo, Brasil - e-mail de contato: marina.maizato@incor.usp.br

2 Departamento de Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica, Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP, São Paulo, Brasil

3 Divisão de Cirurgia Cardiovascular - Instituto do Coração (InCor) HC-FMUSP, São Paulo

Resumo. O glutaraldeído é utilizado com a finalidade de melhorar as propriedades mecânicas e imunogênicas dos tecidos biológicos como as membranas de pericárdio bovino com as quais se confeccionam as biopróteses valvulares. A liofilização pode ser definida como sendo um processo de secagem de um produto previamente congelado onde o solvente é removido por sublimação, através deste processo podem ser obtidos materiais biológicos secos de fácil manipulação. Os tecidos biológicos tratados por glutaraldeído quando submetidos à liofilização sofrem diminuição dos radicais aldeídos, consequentemente promovendo diminuição da citotoxicidade, melhorando a resistência aos mecanismos inflamatórios e provável diminuição do potencial para calcificação. Objetivo: Avaliar cronicamente, em modelo animal, a calcificação de biopróteses valvulares de pericárdio bovino liofilizadas comparativamente às válvulas biológicas não liofilizadas. Metodologia: O estudo foi delineado para que 16 animais atingissem 90 dias de seguimento. Próteses liofilizadas e não liofilizadas foram implantadas em posição pulmonar com circulação extracorpórea, em carneiros jovens com seis meses de idade. Foram medidos os gradientes de pressão ventrículo direito/tronco pulmonar (VD/AP) no implante e explante; cálcio tecidual; inflamação; trombose e pannus. Foi utilizado o teste t para análise das amostras. Resultado: Doze animais chegaram ao final do experimento, sendo que um dos animais do grupo controle apresentou endocardite e foi excluído dos dados. Quatro animais tiveram morte prematura. O gradiente médio VD/AP no implante para o grupo não liofilizado foi 2,0±1,6 mmHg e no grupo de liofilizado 6,2±4,1 mmHg (p=0,064). Esse gradiente aumentou para 7,7±3,9 mmHg e 8,6±5,8 mmHg respectivamente (p=0,777) no explante. O teor de cálcio médio em mg Ca+2/g de peso seco, após 3 meses, no grupo controle foi 21,6±42,1 e 41,2±57,8 no grupo liofilizado (p=0,068). Conclusão: No modelo estudado não se observou redução da calcificação após a liofilização. A análise histológica mostrou um menor processo inflamatório do tecido liofilizado em comparação com o controle. Apoio financeiro FAPESP (processo n º 04/09566-8).

Palavras chave: Experimentação animal, Bioprótese, Procedimentos cirúrgicos cardíacos, Liofilização.

1. INTRODUÇÃO

Próteses valvulares biológicas ou mecânicas são utilizadas em cirurgia cardiovascular como alternativas viáveis para a substituição de válvulas humanas quando estes apresentam disfunção morfológica e funcional significativa [Rahimtoola, 2010 e Fradet, 1995]. As próteses valvulares mecânicas possuem uma vida útil longa, mas necessitam de uma anticoagulação permanente. As próteses valvulares biológicas de pericárdio bovino (PB) ou suíno possuem um tempo de vida útil menor, em média 15 anos, mas com a vantagem de não necessitarem de uma anticoagulação, entretanto a disfunção estrutural valvular pode ocorrer precocemente pela calcificação das estruturas protéticas [Grunkemeier, 1994, David, 2010, Akins, 2008 e Vesely, 2003].

A necessidade de reoperação por disfunção estrutural valvular tem sido inferior a 5% em 5 anos; inferior a 10% em 10 anos e superior a 70% em 15 anos. Quando esta disfunção

estrutural valvular ocorre é necessária a substituição da bioprótese com aumento da morbi-mortalidade cirúrgica [Rahimtoola, 2010, Ruel, 2004 e Poirer, 1998].

O objetivo deste estudo foi avaliar a disfunção estrutural valvular em biopróteses liofilizadas implantadas em modelo animal crônico.

A liofilização é um processo de secagem de um produto previamente congelado onde o solvente é removido por sublimação. Por meio desse processo podem ser obtidos produtos desidratados de alta qualidade, preservando as suas estruturas e minimizando a perda de produtos voláteis que não são observados durante a secagem por meios convencionais. Diversos autores têm recentemente aplicado a técnica de liofilização a biomateriais com a finalidade de substituir ou restaurar órgãos e tecidos danificados fazendo com que estes materiais sejam biocompatíveis com o local de aplicação [Palmer, 2003, Kumar, 2002, Zaleske, 2003, Webb, 2002].

Trabalhos anteriores do grupo mostram que o processo de liofilização não altera significativamente as características mecânicas do PB, mas diminuem significativamente a quantidade de aldeídos residuais [Maizato, 2003], considerado como uma das causas da disfunção estrutural, que resulta do tratamento realizado com glutaraldeído nos tecidos de PB utilizados na confecção de biopróteses valvulares, para melhorar as qualidades mecânicas e imunogênicas [Braile, 1990].

Dentre os vários protocolos de liofilização de tecidos de PB estudados pelo grupo, o protocolo de liofilização com annealing apresentou melhores resultados [Borgognoni, 2009]. Utilizando esse protocolo algumas próteses valvulares biológicas de PB foram liofilizadas para posterior implante em modelo animal crônico. Ovinos jovens foram utilizados como modelo para este estudo, pela semelhança do sistema hidrodinâmico dos ovinos com os humanos, e serem considerados animais de eleição para avaliação da calcificação e consequente disfunção estrutural valvular [Sillas, 2008, Ozaki, 2004, Flameng, 2006 e Hopkins, 2009].

Esta pesquisa foi aprovada pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa da Diretoria Clínica do Hospital das Clínicas e da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Todos os animais utilizados neste estudo foram tratados com base no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicado pelo Instituto Nacional de Saúde dos EUA.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1 Definição dos grupos de estudo e dos animais utilizados

Os animais de experimentação foram divididos em dois grupos: Um grupo liofilizado que recebeu o implante das biopróteses valvulares de PB liofilizadas e um outro grupo controle que recebeu os implantes das biopróteses valvulares de PB não liofilizadas.

Todos os dois grupos tiveram um seguimento de 3 meses antes da retirada das biopróteses valvulares implantadas.

Animais utilizados no estudo. Foram utilizados 16 carneiros jovens com 6 meses de idade da raça Santa Inês, macho, com peso médio de 36,53 ± 3,42 kg (28,5 a 42 kg).

Os ovinos utilizados foram todos vermifugados, submetidos ao exame clínico e mantidos em observação por 10 dias antes de serem submetidos ao processo cirúrgico.

2.2 Bioprótese utilizado

Pelo porte do animal a ser utilizado no implante e prevendo o aumento de peso dos animais durante o seguimento de 3 meses, foi definida a utilização de válvulas biológicas de pericárdio bovino nº. 23 (Braile Biomédica, São José do Rio Preto, SP).

Preparo das biopróteses valvulares liofilizadas. Inicialmente, a bioprótese de pericárdio bovino foi lavada em solução salina de NaCl a 0,9% por 15 min com 5 trocas de solução para remover todo o excesso de aldeído. Após a lavagem a bioprótese foi liofilizada (FTS Systems, modelo TDS-00209-A; Dura-Stop, Dura-Dry-MP, STF Systems, Stone Ridge, NY, EUA), utilizando o protocolo de liofilização com annealing. O processo de congelamento foi iniciado colocando-se a bioprótese em um freezer por 2 horas a -50°C. Na sequência, foi aquecida a -20°C durante 1 hora. O secamento primário foi realizado a -5°C com pressão atmosférica de 0,16mmHg e temperatura do condensador a -80°C. Ao final da sublimação foi realizada a secagem secundária a 25°C e pressão atmosférica de 0,16 mmHg. As biopróteses assim liofilizadas foram esterilizadas em radiação gama.

Implante das biopróteses. Todas as biopróteses valvulares liofilizadas antes do implante foram reidratadas em solução salina de NaCl 0,9% por 30 min. As biopróteses valvulares não liofilizadas foram lavadas exaustivamente por 30 min em solução salina de NaCl 0,9%, com 5 trocas de solução, para eliminar a solução de aldeído no qual elas vem preservadas.

2.3 Procedimento cirúrgico

Os animais permaneceram por 36 horas em jejum, sendo 24 horas só de sólidos e mais 12 horas em jejum total (sólidos e líquidos). Todos foram anestesiados, entubados com sonda endotraqueal, colocados em ventilação mecânica e seus parâmetros hemodinâmicos monitorados, e registrados em um sistema de aquisição de dados Windaq® (Dataq Instruments, Inc. Akron, EUA), em sala cirúrgica para experimentação animal.

Anestesia. A anestesia foi induzida com ketamina (8mg/kg) e midazolan (0,5 mg/kg). Isoflurano e fentanil (5mg/kg) foram utilizados na manutenção da anestesia. Na indução cefuroxima (750mg) foi administrado por via intravenosa como antibiótico profilático.

Circulação extracorpórea (CEC). O circuito da CEC foi preenchido com 400 mL de Ringer lactato, 50 mL de manitol 20%, 10 mL de gluconato de cálcio 10%, 10 mL de sulfato de magnésio 10%, 500 mg de hidrocortisona, 750 mg de cefuroxima e 5000 UI de heparina.Normotermia a 36ºC foi empregada durante a circulação com fluxo não-pulsátil arterial de 2,4 L/min/m2 com uma bomba centrífuga (FlowPump 6000S, IBC, Austin, Texas, EUA) para manter a pressão de perfusão entre 60 a 80 mmHg. Um conjunto de tubos, reservatório infantil de sangue venoso e filtro arterial (Braile Biomédica, São José do Rio Preto, SP) foram utilizados.

Cirurgia. Após a indução anestésica no ovino, foi realizada toracotomia anterolateral esquerda no quarto espaço intercostal para exposição do coração após a pericardiotomia. Heparina sódica foi administrada (4mg/kg) para alcançar um tempo de coagulação ativado (TCA) superior a 480s. Para a realização do desvio circulatório do átrio direito para tronco da artéria pulmonar, uma cânula arterial 20F foi posicionada na artéria pulmonar 1 cm abaixo do ramo esquerdo e uma cânula venosa 34F foi posicionada no átrio direito e colocado em assistência circulatória mecânica com CEC. Não foi realizada parada cardíaca e foi mantida a ventilação pulmonar.

A artéria pulmonar foi pinçada, procedendo-se a arteriotomia longitudinal no tronco pulmonar com secção do anel valvular e via de saída do ventrículo direito. As cúspides pulmonares foram retiradas. A bioprótese valvular de pericárdio bovino nº. 23 foi implantada no anel valvular com sutura contínua de polipropileno 5-0. Um patch de pericárdio bovino tratado com glutaraldeído (não liofilizado) foi utilizado para ampliar a via saída do ventrículo direito e artéria pulmonar (Fig. 1). A CEC foi interrompida e todo o volume foi infundido para atingir uma pressão arterial média de 80 mmHg. Sulfato de protamina não foi administrado em nenhum animal. Na finalização do procedimento cirúrgico foi feita uma verificação criteriosa de hemostasia. Antes de fechar o animal as pressões foram avaliadas e registradas para a determinação do gradiente de pressão transvalvular do ventrículo direito/tronco pulmonar (gradiente VD/AP). Terminado os registros de pressões o animal foi suturado por planos e esperou-se a recuperação anestésica antes de encaminhar o animal para o biotério.

Figura 1. (a) Implante da prótese valvular de pericárdio bovino nº. 23 em posição pulmonar em carneiro. (b) Ampliação feita com patch de pericárdio bovino.

Avaliação do gradiente de pressão. Na avaliação do gradiente transvalvar puncionou-se o tronco pulmonar e via de saída do VD com uma agulha de 0,9 mm conectada a um analisador multiparamétrico (5900 CAGE Signal Conditioner, Gould Inc., Valley View, Ohio, EUA). Foram analisados 10 ciclos com um sistema de software (WINDAQ v.2.19, DATAQ Instruments, Inc., Akron, OH, EUA) que utilizou a média das pressões sistólicas nos 10 ciclos para análise. O mesmo procedimento foi realizado no momento da eutanásia.

2.4 Exérese da prótese e análises realizadas

A eutanásia ocorreu 3 meses após o implante das biopróteses valvulares. Os animais receberam anestesia geral e antes da eutanásia ser efetivada foram registrados os gradientes de pressões, conforme descrito acima.

Todos os animais foram eutanasiados sob anestesia geral. O coração foi dissecado e através do átrio direito todo o sangue foi drenado. A excisão da prótese foi realizada com um segmento da artéria pulmonar, parede anterior do ventrículo direito e o patch de pericárdio bovino não liofilizado.

As cúspides da prótese foram removidas, divididas em duas partes simétricas, sendo que uma das metades foi utilizada para a realização de exames histológicos e a outra metade para a quantificação de cálcio por espectrofotometria de absorção atômica. O patch de pericárdio bovino não liofilizado também foi igualmente analisado.

Avaliação macroscópica. Cada bioprótese foi cuidadosamente examinada post mortem para a avaliação morfológica após o implante. Foi avaliada a mobilidade das cúspides, lacerações, pannus, calcificação, vegetações e formação de trombos.

Avaliação microscópica. Foram realizados exames anatomopatológicos com coloração hematoxilina-eosina e von Kossa para análise específica de cálcio. Nos segmentos examinados foram avaliados a inflamação, a presença de trombo, pannus e intensidade da calcificação.

A intensidade foi utilizada como critério, sendo classificada em (-) ausente, (+) detecção rara; (++) dispersa, porém consistente; (+++) presente com uniformidade e (++++) distribuição generalizada.

Quantificação do cálcio. A determinação da quantidade de cálcio foi realizada após hidrólise ácida em um espectrofotômetro de absorção atômica por chama (Analytik Jena, AAS Vario 6, Jena, Alemanha). Os resultados foram expressos em mg Ca+2/g de peso da amostra seca.

Análise estatística. Dados de espectroscopia de absorção atômica foram expressos como média ± desvio padrão. Comparações entre os grupos foram realizadas usando o teste t de Student para dados não pareados. O nível de significância estabelecido foi de 5%.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Dos 16 ovinos submetidos à cirurgia, 12 atingiram a sobrevida prevista. No grupo controle, seis ovinos atingiram o tempo de sobrevida (91 a 99 dias), dois

animais morreram com 37 e 48 dias por pneumonia. Um animal que sobreviveu 91 dias não foi considerado na análise para quantificação de cálcio, pois foi evidenciada a presença de endocardite.

No grupo liofilizado dois animais morreram com 51 e 68 dias devido à pneumonia sendo que o de 51 dias de sobrevida apresentou também endocardite e seis animais atingiram a sobrevida esperada (91 a 93 dias).

Clinicamente, todos os animais que completaram o estudo apresentaram atividade física na normalidade desde o primeiro dia de pós-operatório. Estes animais não apresentaram quaisquer sintomas de insuficiência cardíaca ou problemas de saúde geral no decorrer do estudo.

3.1 Gradiente de pressão ventrículo direito / artéria pulmonar (VD/AP)

Grupo controle. No implante o gradiente médio VD/AP foi 2,0 ± 1,6 mmHg (0 a 4,38 mmHg). Após 3 meses houve aumento do gradiente para 7,7 ± 3,9 mmHg (3,25 a 11,95 mmHg).

Grupo Liofilizado. No implante o gradiente médio VD/AP foi 6,2 ± 4,1 mmHg (4,55 a 11,84 mmHg). Após 3 meses houve aumento do gradiente para 8,6 ± 5,8 mmHg (3,78 a 17,48 mmHg).

As próteses valvulares de PB liofilizadas quando reidratadas por 30 minutos apresentou aspecto visual e tátil semelhante às próteses valvulares não liofilizadas, porém, no momento do implante o gradiente de pressão do grupo liofilizado quando comparado ao grupo controle apresentou valores 3 vezes superiores. Este fato sugere que 30 minutos de reidratação não foram suficientes para uma total hidratação dos folhetos de PB, causando uma maior rigidez de suas cúspides na fase inicial, provocando uma diferença significativa entre os dois grupos estudados (p<0,05), podendo inclusive ter havido alterações provocadas nas próteses valvulares liofilizadas, como as observadas nos resultados dos ensaios in vitro [Maizato, 2011]. Há, no entanto referências de que gradientes VD/AP de 10 a 15 mmHg são aceitáveis resultando em desempenho da válvula pulmonar satisfatório [Maluf, 1993 e Pinto Jr, 1999]. Observando-se os gradientes dos dois grupos após 3 meses, quando as próteses valvulares apresentavam danos estruturais e enrijecidos devido à calcificação, o gradiente dos grupos se equivalem (p>0,05), o que sugere uma continuidade no processo de hidratação das válvulas liofilizadas nas horas subsequentes ao implante.

3.2 Observações post mortem

Na eutanásia, todos os animais apresentavam aderências firmes entre a pleura, o pericárdio e o coração. O patch de pericárdio bovino encontrava-se flexível com pontos de calcificação dispersos.

Avaliação macroscópica. Não foi observada a presença de trombos ou lacerações visíveis em qualquer bioprótese implantada. As cúspides dos dois grupos apresentavam mobilidade parcial prejudicada com focos de calcificação não homogêneos. Todas as próteses no grupo controle e liofilizado desenvolveram pannus (Fig. 2 e 3).

Figura 2. Explante da válvula controle. (a) Válvula posicionada no coração, antes da exérese. (b) Válvula retirada, com o patch de pericárdio bovino, a seta aponta para a formação de pannus. (c) Válvula explantada, totalmente deformada e calcificada.

Figura 3. Explante da válvula liofilizada. (a) Vista interna da válvula antes da exérese. (b) Válvula pouco deformada após o explante, a seta aponta uma pequena formação de pannus. (c) Válvula após o explante, muito deformada e calcificada, com formação de pannus.

Avaliação Microscópica. Houve desenvolvimento significativo de pannus nas biopróteses em ambos os grupos. Foi observada maior intensidade de inflamação nas biopróteses do grupo controle em relação às biopróteses do grupo liofilizado (Tabela 1) que apresentaram menor infiltrado inflamatório. A presença de calcificações foi evidenciada nas próteses do grupo controle e grupo de liofilizado (Fig. 4).

Tabela 1: Alterações encontradas no exame histológico

Bioprótese implantada Formação de pannus Inflamação da prótese Inflamação no patch PB

C ++++ +++ ++++

C ++++ +++ ++++

C ++++ +++ ++++

C ++++ + ++++

C +++++ + ++++

C ++++ - -

L +++++ - +

L ++ - +

L +++ + +

L ++++ - +

L ++++ - ++

L +++ + +++

C = controle, L = liofilizado, (-) = ausente, (+) = raro, (++) = disperso, (+++) = uniforme, (++++) = generalizado

Figura 4. Resultado histoquímico, coloração Von Kossa, revelam em preto, pontos de calcificações. (a) Grupo controle. (b) Grupo liofilizado.

Análise quantitativa de Cálcio. A quantidade média de cálcio nas cúspides no grupo controle foi 21,60 ± 39,12 mg Ca+2/g de peso seco (0,92 a 91,43 mg Ca+2/g de peso seco), em comparação com uma quantidade média de 41,19 ± 46,85 mg Ca+2/g de peso seco (1,23 a 114,6 mg Ca+2/g de peso seco) no grupo liofilizado (p = 0,478). O animal que chegou aos 90 dias de sobrevida mas que desenvolveu endocardite crônica foi excluído da análise estatística.

O patch de pericárdio bovino utilizado para ampliar a via de saída no grupo controle a média de quantidade de cálcio no patch foi de 1,52 ± 0,98 mg Ca+2/g de peso seco (0,44 a 2,83 mg Ca+2/g de peso seco), no grupo liofilizado foi 1,14 ± 0,51 mg Ca+2/g de peso seco (0,67 a 1,92 mg Ca+2/g de peso seco). Não houve diferença estatística entre os grupos (p = 0,433).

Apesar dos avanços tecnológicos nas técnicas de processamento e manuseio dos tecidos biológicos, os estudos clínicos continuam demonstrando que os pacientes ainda sofrem com a deterioração estrutural da bioprótese [McClure, 2010, Jamieson, 2011 e Isthmus, 2011]. Trabalhos anteriores mostraram que a quantidade dos aldeídos residuais dos PB, provenientes do tratamento com glutaraldeído para melhorar as propriedades mecânicas e imunogênicas [Braile, 1990], diminuiu consideravelmente quando submetidos à liofilização [Maizato, 2003]. Segundo a literatura o glutaraldeído residual é uma das causas de calcificações das próteses biológicas [Beauchamp, 1992 e Grabenwöger, 1998].

Nas biopróteses de pericárdio bovino a presença de células inflamatórias relaciona-se ao aumento da degeneração estrutural valvar resultando em lacerações das cúspides [Zilla, 2008, Dahm, 1990 e Dahm, 1995]. Neste estudo observou-se que o grupo controle apresentou maior intensidade da resposta inflamatória quando comparados ao grupo liofilizado evidenciando possível mecanismo protetor do processo de lioflização na resposta inflamatória.

Neste estudo, a formação de pannus foi relevante nas biopróteses sejam elas liofilizadas ou não, talvez a formação do pannus neste estudo possa estar relacionada à baixa pressão no átrio direito e ao tronco pulmonar [Cannegieter, 1994]. A endocardite sub-clínica é uma complicação relatada no modelo animal crônico com carneiros [Thiene, 1989] sendo que nesta série dois animais apresentaram endocardite sub-clínica por cocos Gram positivos descritos na histologia.

O estudo foi conduzido com uma amostragem pequena de animais o que permitiu apenas um segmento pós-operatório de 90 dias, apesar de discutível, o acompanhamento da calcificação por um período maior poderia trazer uma diferenciação estatística. O implante da bioprótese na posição pulmonar, num sistema de baixa pressão, reduziu a degeneração

estrutural da bioprótese, uma troca de posicionamento do implante em sistema de alta pressão (posição mitral) seria desejável.

4. CONCLUSÕES

Este estudo não conseguiu demonstrar o mecanismo protetor da liofilização como agente anticalcificante do pericárdio bovino tratado com glutaraldeído, apesar do processo de liofilização diminuir significativamente a quantidade de aldeídos residuais das válvulas de pericárdio bovino, estatisticamente não houve diferença significativa entre o controle e o grupo liofilizado. Nas avaliações histológicas ficou evidenciado menor processo inflamatório do grupo liofilizado quando comparado ao grupo controle.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o apoio financeiro da FAPESP (Projeto Temático - processo nº. 04/09566-8) e a toda equipe que participou desse trabalho de pesquisa.

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BEHAVIOR OF THE LYOPHILIZED BIOLOGICAL VALVES IN ANIMAL MODEL - CHRONIC STUDY

Maizato, M.J.S.1; Taniguchi, F.P.1; Ambar, R.F.1; Pitombo, R.N.M.2; Leirner, A.A.1; Cestari, I.A.1; Stolf, N.A.G.3

1 Bioengineering Division, Heart Institute (InCor), University of São Paulo Medical School, São Paulo, Brazil - e-mail: marina.maizato@incor.usp.br

2 Department of Biochemical and Pharmaceutical Technology, School of Pharmaceutical Sciences, University of São Paulo, USP, São Paulo, Brazil

3 Cardiothoracic Surgery Division, Heart Institute (InCor), University of São Paulo Medical School, São Paulo, Brazil

Abstract. Glutaraldehyde is used in order to improve the mechanical and immunogenic properties of biological tissues since bovine pericardium membranes are used to manufacture

heart valve bioprostheses. Lyophilization, also known as freeze-drying, preserves the biological material without damage, by freezing the enclosed water and removing ice by sublimation. Through this process it may be obtained dehydrated products of high quality also the material may be easily handled. The lyophilization process decreases aldehyde residues of biological tissue previously treated with glutaraldehyde, thus promoting reduction of cytotoxicity, increasing the resistance to inflammation and maybe decreasing the potential for tissue calcification. Objective: Chronically evaluate in an animal model, the calcification of bovine pericardium heart valve prostheses previously lyophilized or not (control group). Methodology: Six months old sheep received implants of lyophilized and non lyophilized heart valve prostheses in the pulmonary position with right bypass. The study followed 16 animals for a period of 90 days. Right ventricle–pulmonary artery transvalvular pressure gradient (RV–PA) immediately after the implantion and before explantation, tissue calcium, inflammation intensity, thrombosis and pannus formation were evaluated. T test was used for statistic analysis. Results: Twelve animals reached the end of the experiment, but one of the animals in the control group had endocarditis and was excluded from the data. Four animals had early death. The mean gradient RV/PA at the implantation in control group was 2.0 ± 1.6 mmHg and in lyophilized group was 6.2 ± 4.1 mmHg (p = 0.064). This mean gradient at de explantation increased to 7.7 ± 3.9 mmHg and 8.6 ± 5.8 mmHg respectively (p = 0.777). The average calcium content in the tissue leaflets after three months in the control group was 21.6 ± 42.1 mg Ca+2/g dry weight, compared with an average content of 41.2 ± 57.8 mg Ca+2/g dry weight in the lyophilized group (p = 0.068). Conclusion: In this experimental study there was no reduction of calcification after lyophilization. However, histological analysis showed less inflammation over the lyophilized tissue when compared with the control. Financial support by FAPESP (process n º 04/09566-8).

Keywords: Animal experimentation, Bioprosthesis, Cardiac surgical procedures, Lyophilization.