estudo da diversidade comestudo da diversidade com ... · estudo do dna por sequenciação...
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Estudo da diversidade comEstudo da diversidade com sequências de DNAq
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estudo do DNA por sequenciação
extracção de DNAextracção de DNA
PCR do fragmento desejado
sequenciação
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estudo do DNA por sequenciação
sequenciação
1 2 3
indivíduo A
1 3
indivíduo A
indivíduo B
indivíduo C
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Alguns índices de diversidade:Alguns índices de diversidade:
π (diversidade nucleotídica):Número médio de diferenças (por site) entre duas sequências retiradas ao acasoNúmero médio de diferenças (por site) entre duas sequências retiradas ao acasode uma amostra.
H (diversidade haplotípica):Probabilidade de, retirando aleatoriamente dois haplótipos de uma amostra, estesserem diferentes
S (número de sítios variáveis)S (número de sítios variáveis)
θ (population mutation parameter)Nível esperado de variabilidade assumindo equilíbrio entre mutação e deriva eausência de selecção. Estabelece uma relação entre o efectivo populacional e ataxa de mutação.
θ = 4Neμ autossomasθ 4Neμ autossomasθ = 3Neμ cromossoma Xθ = Neμ cromossoma Y, mitocondrial
E d ó i d l l i dif i dEm vez de uma só maneira de o calcular, existem diferentes estimadores que aproximam este valor (exemplo: θ de Watterson (1975)). Usa-se este valor para estimar o Ne.
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PROGRAMAS QUE CALCULAM PARÂMETROS DE DIVERSIDADE
DNAsp
Arlequin
SITESSITES
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‐ A diversidade diminui nas populações mais a norte.
0.8
Hd
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Construção de redes deConstrução de redes de haplótiposp p
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3 52 41
A
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F3 5
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C, H
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Softwares que fazem redes de haplótipos:Softwares que fazem redes de haplótipos:
-Networket o-TCS-(Arlequin)…
( ét d dif t )(usam métodos diferentes)
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h25
h24h19
h20h21
h26
h16h28
h24
h23
N t
h30
h22
h14h11 h29
h18
h17
h27
h15
NorteSul
h30
h4h1
h9h13
h10
h14h11 h29h17
h8
10
9
BU
Rede de haplótipos
h3
h7 h2
h4h12
h5
haplótipos
(700bp )h1h6Distribuição geográfica
dos grupos
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Pi
0 008
0.009
0.01
0.006
0.007
0.008
B
0.003
0.004
0.005Pi
Buçaco
0
0.001
0.002
0 2 4 6 8 10 12 14
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Subestruturação ao nível de çsequências do DNA
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Distância entre populaçõesDistância entre populações
Dxy: distância média entre elementos dos dois grupos.
Da: distância média entre elementos dos dois grupos, corrigida para a distância observada dentro de cada grupo.
Grupo 1 Grupo 2
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ResultadosResultados
Dxy = 1,268%Da =0,996%Nº de posições fixas 6Nº de posições fixas = 6
Etc. etc.
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RecapitulandoRecapitulando…
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‐ Calculámos diferentes índices de diversidade para populações de C. lusitanica
‐ Verificámos que, tal como nos marcadores nucleares, a diversidade diminui nas populações mais a norte.
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Hd
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0.6
0.7
0.8
0.1
0.2
0.3
0.4Hd
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‐ Verificámos que existem dois grandes grupos de‐ Verificámos que existem dois grandes grupos de haplótipos que ocupam áreas geográficas diferentes.
h25
h24h19
h20h21
h26
h16h28
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Norte
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NorteSul
h3 h4h1
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BU
Rede de haplótipos
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h7 h2
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ã áhaplótipos
(700bp )h1h6Distribuição geográfica
dos grupos
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0 01
Pi
0.007
0.008
0.009
0.01
B
0.003
0.004
0.005
0.006
Pi
Buçaco
0
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0.002
0 2 4 6 8 10 12 14
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‐ Iniciámos ainda a análise de subestruturação‐ Iniciámos ainda a análise de subestruturação calculando a distância genética entre os grupos.
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Subestruturação ao nível de çsequências do DNA
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Diferenciação entre populações
Pop 1
As estatísticas F (Fst, Fit, Fis) foram desenvolvidas a pensar em dados alélicos (como proteínas), mas podemos fazer um paralelo com sequências de DNA.
Existem diversas medidas análogas ao Fst para sequências de DNA. Algumas incorporam informação
Pop 2
sobre o número de mutações (distância) entre alelos (ex. Fst de Hudson et al. (1992)), outras contemplam apenas frequências (como as medidas “clássicas”).
Pop 2
No fundo, o que estes valores nos medem é a proporção de variação que está entre as unidades que consideramos (ex populações) por oposição à proporção que está(ex. populações) por oposição à proporção que está dentro dessas unidades.
O DNAsp e o Arlequin calculam nos estes valores de FstO DNAsp e o Arlequin calculam-nos estes valores de Fst (mas para isto temos primeiro de definir populações).
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Diferenciação entre populações
E se quisermos pensar a mais do que um nível?
Qual a % de variação explicada por diferenças:
q p q
Pop 1 Pop 3 diferenças:
entre grupos?entre populações dentro de cada grupo?
Grupo 2Grupo 1AMOVA – analysis of molecular variance (E coffier et al 1992)
entre populações dentro de cada grupo?dentro das populações?
Pop 2 Pop 4
Grupo 2Grupo 1 (Excoffier et al. 1992)
Pode ser feita não só para sequências de DNA mas também para outros dadosDNA mas também para outros dados (proteínas, microssatélites, etc.).
Software ArlequinSoftware Arlequin
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Diferenciação entre populações
E se quisermos pensar a mais do que um nível?
Qual a % de variação explicada por diferenças:
q p q
Pop 1 Pop 3 diferenças:
entre grupos?entre populações dentro de cada grupo?
Grupo 1 AMOVA – analysis of molecular variance (E coffier et al 1992)
entre populações dentro de cada grupo?dentro das populações?
Pop 2 Pop 4
(Excoffier et al. 1992)
Pode ser feita não só para sequências de DNA mas também para outros dados
Grupo 2
DNA mas também para outros dados (proteínas, microssatélites, etc.).
Software ArlequinGrupo 2 Software Arlequin
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Diferenciação entre populações
Output do Arlequin:
-% de variação em cada nível hierárquico
- índices de fixação
í i d i ifi â i- níveis de significância determinados por permutações
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ResultadosResultados
AMOVA norte vs. sul(ignorando a população do Buçaco):
‐ % variação entre grupos: 77,91%‐ % variação entre pops dentro dos grupos: 12,07%‐% variação dentro das pops: 10,02%
(todos os valores estimados para os índices)de fixação são significativos)