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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Estudo de fatores de risco, sororreatividade e perfil clínico
de pacientes HIV/Aids co-infectados com Toxoplasma
gondii em Natal, Rio Grande do Norte.
MARIANNE GARCIA DE OLIVEIRA
NATAL/RN
2016
MARIANNE GARCIA DE OLIVEIRA
Estudo de fatores de risco, sororreatividade e perfil clínico de pacientes
HIV/Aids co-infectados com Toxoplasma gondii em Natal, Rio Grande do
Norte.
Orientador: Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto
Co – orientadora: Profᵃ MD Mônica Baumgardt Bay
NATAL/RN
2016
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Ciências Biológicas da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte como requisito parcial à obtenção do
título de Mestre em Ciências Biológicas. Área de
concentração: Biodiversidade.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro de Biociências - CB
Oliveira, Marianne Garcia de.
Estudo de fatores de risco, sororreatividade e perfil clínico de pacientes HIV/Aids co-infectados com Toxoplasma gondii em
Natal, Rio Grande do Norte / Marianne Garcia de Oliveira. -
Natal, 2016.
103 f.: il.
Dissertação(Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do
Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em
Ciências Biológicas. Orientador: Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto.
Coorientadora: Profa. Ma. Mônica Baumgardt Bay.
1. Toxoplasma gondii - Dissertação. 2. Neurotoxoplasmose -
Dissertação. 3. HIV - Dissertação. 4. Imunossuprimidos -
Dissertação. I. Andrade Neto, Valter Ferreira de. II. Bay, Mônica Baumgardt. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV.
Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 616.993.1
MARIANNE GARCIA DE OLIVEIRA
Estudo de fatores de risco, sororreatividade e perfil clínico de pacientes
HIV/Aids co-infectados com Toxoplasma gondii em Natal, Rio Grande do Norte.
Dissertação submetida ao corpo docente do Programa de Pós-graduação em
Ciências Biológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte e ao membro
externo a esta universidade, como parte dos requisitos necessários para a obtenção
do grau de Mestre em Ciências Biológicas.
Examinada por:
________________________________________________
Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto
Departamento de Microbiologia e Parasitologia
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
________________________________________________
Profa. Msc. Mônica Baumgardt Bay
Departamento de Infectologia
Hospital Giselda Trigueiro
________________________________________________
Prof. Dr. Paulo Marcos da Matta Guedes
Departamento de Microbiologia e Parasitologia
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
________________________________________________
Profa Dra. Ana Paula Sampaio Feitosa
Departamento de Fisiologia e Patologia
Universidade Federal da Paraíba
NATAL/RN
2016
AGRADECIMENTOS
Antes de tudo, agradeço a Deus por ter me dado forças para a realização deste
trabalho e por guiar cada um dos meus passos, mostrando sempre o melhor caminho
a ser seguido. À Ele toda a minha gratidão e louvor.
Agradeço à minha família, Mariza (mãe), Ivanildo (pai) e Pedro (irmão), pelo
amor incondicional, pelo constante apoio e por sempre acreditarem nos meus sonhos,
lutando ao meu lado. A vocês devo tudo o que conquistei até hoje.
Ao meu namorado, Victor Reis, por toda paciência e compreensão ao longo
desses dois anos de mestrado. Por ter me arrancado sorrisos em meio ao estresse e
aflição.
Ao meu orientador Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto agradeço
imensamente por ter acreditado em mim, e pelos vários anos de ensinamentos, os
quais contribuíram significativamente para o meu crescimento científico e pessoal.
À minha co-orientadora Dra Mônica Bay, por ter aberto as portas do Hospital
Giselda Trigueiro e por sempre se colocar disponível aos meus chamados. Obrigada
pela valiosa colaboração.
À Debora Aloise, agradeço de forma muito especial por toda a sua generosa
contribuição do princípio ao fim deste trabalho. Obrigada pela paciência e imensa
ajuda.
Aos professores André Pinho e Wendel Coura, pela fundamental colaboração
nas análises estatísticas deste trabalho.
Agradeço de modo especial à Kalyne Oliveira pela valiosa ajuda na coleta de
sangue dos pacientes, e pela amizade que construímos durante o trabalho.
Aos 190 pacientes voluntários, por acreditarem na ciência e por terem me
ensinado tantas lições sobre a vida. Obrigada por essa importante experiência.
À equipe LabMaT (Tenille, Rízia, Claudio Bruno, Valber, Ana Glória, Lisianny...)
por anos de parceria, momentos de alegria e troca de conhecimentos. Especialmente
à Thatiany e Jully pela grande ajuda durante os experimentos.
Finalmente, à CAPES pelo apoio financeiro que possibilitou a realização deste
trabalho.
RESUMO
O Toxoplasma gondii é o principal agente etiológico responsável pelo acometimento
do SNC em pacientes HIV/Aids. A triagem de pacientes portadores de HIV/Aids em
relação à positividade para T. gondii, associada à determinação do número de
linfócitos TCD4, pode auxiliar na redução da morbi-mortalidade relacionada a esta co-
infecção. O presente estudo teve como objetivo geral avaliar a frequência da infecção
pelo T. gondii em pacientes HIV positivos e correlacionar aos aspectos clínicos,
sorológicos e epidemiológicos. Para isto, foram avaliados 179 pacientes HIV positivos
acompanhados no Hospital Giselda Trigueiro. As análises sorológicas foram
realizadas através da técnica de ELISA, enquanto que as análises clínicas e
epidemiológicas ocorreram por meio da pesquisa em prontuários e aplicação de
questionário, respectivamente. Além disso, foi realizada análise molecular a partir de
PCR em amostras de sangue periférico de 11 pacientes HIV internados com
neurotoxoplasmose (suspeita ou confirmação). Nossos resultados indicam alta taxa
de infecção por T. gondii entre pacientes portadores de HIV/Aids (83,8%), sendo
detectadas a neurotoxoplasmose (11,7%) e a toxoplasmose ocular (3,35%). A
presença de gatos e a ingestão de salada crua foram fatores de risco identificados,
aumentando a chance de adquirir a infecção em 2,6 e 3,4 vezes, respectivamente. As
manifestações clínicas mais frequentes entre todos os pacientes acometidos pela
toxoplasmose cerebral consistiram em: paresia/hemiparesia (65,62%), cefaleia
(37,50%) e alterações da consciência (28,12%). Além disso, entre os pacientes
HIV/Aids internados, a neurotoxoplasmose foi decorrente de reativação da infecção
latente. A avaliação molecular apresentou limitações quanto ao diagnóstico da
neurotoxoplasmose. Conclui-se que a realização deste trabalho permitiu uma
caracterização epidemiológica e clínica da toxoplasmose em pacientes HIV/Aids do
Rio Grande do Norte, sendo um estudo pioneiro na região.
Palavras chaves: Toxoplasma gondii; HIV; neurotoxoplasmose; imunossuprimidos.
ABSTRACT
Toxoplasma gondii is the main etiological agent responsible for central nervous system
involvement in HIV / AIDS patients. The screening of patients with HIV / AIDS related
to the positivity for T. gondii, associated to the determination of the number of CD4+ T
lymphocytes, may help to reduce the morbidity and mortality related to this co-infection.
The present study had as general objective to evaluate the frequency of T. gondii
infection in HIV positive patients and to correlate clinical, serological and
epidemiological aspects. For this, 179 HIV positive patients were evaluated at the
Hospital Giselda Trigueiro. Serological tests were performed using the ELISA
technique, while the clinical and epidemiological analyzes occured through research
in medical records and questionnaire application, respectively. In addition, molecular
analysis was performed by PCR in peripheral blood samples from 11 HIV patients
hospitalized with neurotoxoplasmosis (suspected or confirmed). Our results indicate a
high rate of T. gondii infection among patients with HIV / AIDS (83.8%), being detected
neurotoxoplasmosis (11.7%) and ocular toxoplasmosis (3.35%). The presence of cats
and raw salad ingestion were identified as risk factors, increasing the chance of
acquiring the infection in 2.6 and 3.4 times, respectively. The most frequent clinical
manifestations among all patients affected by cerebral toxoplasmosis consisted of:
paresis / hemiparesis (65.62%), headache (37.50%) and changes in consciousness
(28.12%). Besides that, among hospitalized HIV / AIDS patients, neurotoxoplasmosis
was due to latent infection reactivation. The molecular evaluation presented limitations
on the diagnosis of neurotoxoplasmosis. It is concluded that the accomplishment of
this work allowed an epidemiological and clinical characterization of the toxoplasmosis
in HIV / AIDS patients of Rio Grande do Norte, being a pioneer study in the region.
Keywords: Toxoplasma gondii; HIV; neurotoxoplasmosis; immunosuppressed.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1. Ciclo biológico do parasito Toxoplasma gondii em hospedeiros
intermediários e definitivos (ROBERT-GANGNEUX; DARDÉ, 2012)........................17
FIGURA 2. Delineamento experimental para os pacientes HIV/Aids acompanhados
no ambulatório (SAE) do HGT, Natal, RN, 2015 – 2016............................................35
FIGURA 3. Delineamento experimental para os pacientes HIV/Aids internados no
HGT com diagnóstico presuntivo ou confirmado de neurotoxoplasmose, Natal, RN,
2015 – 2016...............................................................................................................36
FIGURA 4. Distribuição geográfica dos 179 pacientes HIV/Aids participantes da
pesquisa, Natal, RN, 2015-2016................................................................................47
FIGURA 5. Resultado molecular a partir de 11 amostras de sangue periférico de
pacientes HIV/Aids internados no HGT, Natal, RN, 2015 – 2016. Eletroforese em gel
de agarose a 2%. PM: marcador de peso molecular de 1Kb (Ludwig); C+: (controle
positivo); C-: (controle negativo)................................................................................65
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Características gerais dos pacientes HIV/Aids do Hospital Giselda
Trigueiro, Natal, RN, 2015-2016.................................................................................48
TABELA 2. Aspectos comportamentais relacionados à ingestão de oocisto pelos
pacientes HIV/Aids do Hospital Giselda Trigueiro, Natal, RN, 2015 – 2016..............50
TABELA 3. Aspectos comportamentais de pacientes HIV/Aids do Hospital Giselda
Trigueiro em relação a gatos, Natal, RN, 2015 – 2016..............................................51
TABELA 4. Aspectos comportamentais com relação à ingestão de cistos de T.
gondii peos pacientes HIV/Aids do Hospital Giselda Trigueiro, 2015-2016...............52
TABELA 5. Análise univariada das características gerais dos pacientes HIV/Aids do
Hospital Giselda Trigueiro, Natal, RN, 2015-2016.....................................................54
TABELA 6. Análise univariada dos aspectos comportamentais relacionados à
ingestão de oocisto pelos pacientes HIV/Aids do Hospital Giselda Trigueiro, 2015-
2016............................................................................................................................56
TABELA 7. Análise univariada dos aspectos comportamentais de pacientes
HIV/Aids do Hospital Giselda Trigueiro em relação a gatos, Natal, RN, 2015 -
2016............................................................................................................................57
TABELA 8. Análise univariada dos aspectos comportamentais com relação à
ingestão de cistos de T. gondii pelos pacientes HIV/Aids do Hospital Giselda
Trigueiro, Natal, RN, 2015-2016.................................................................................58
TABELA 9. Análise multivariada dos aspectos relacionados à infecção por T. gondii
em pacientes HIV/Aids do Hospital Giselda Trigueiro, Natal, RN, 2015-2016............59
TABELA 10. Frequência de 179 pacientes HIV-positivos atendidos no SAE do HGT
com diagnósticos soronegativos e soropositivos para Toxoplasma gondii,
relacionados aos níveis de CD4+, CD4/CD8, uso da terapia antirretroviral e carga
viral, em Natal, RN, 2015 – 2016...............................................................................61
TABELA 11. Características clínicas e sorológicas dos pacientes HIV/Aids
internados no HGT com suspeita ou confirmação de Neurotoxoplasme, em Natal,
RN, 2015 – 2016........................................................................................................62
TABELA 12. Características clínicas de todos os pacientes HIV/Aids participantes da
pesquisa que possuem diagnóstico confirmado ou presuntivo para
neurotoxoplasmose, Natal, RN 2015 – 2016..............................................................63
TABELA 13. Estudo retrospectivo: número de internamentos de pacientes HIV/Aids
internados por neurotoxoplasmose no Hospital Giselda Trigueiro entre 2011 e 2015,
Natal, RN....................................................................................................................64
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
DNA – Deoxyribonucleic Acid – Ácido desoxirribonucleico
ELISA – Ezyme-Linked Immunosorbent Assay – Ensaio Imunoenzimático
EDTA – Ethylenediamine tetraacetic acid - ácido etilenodiamino tetra-acético
GRA7 – proteína de grânulo denso 7
HGT – Hospital Giselda Trigueiro
HIV – Human Immunodeficiency Virus – Vírus da Imunodeficiência Humana
IgA – Imunoglobulina da classe A
IgE – Imunoglobulina da classe E
IgG – Imunoglobulina da classe G
IgM – Imunoglobulina da classe M
IL-10 – Interleucina-10
IL-12 – Interleucina-12
IL-17 – Interleucina-17
INF-ɣ – Interferon gama
LCR – Líquido Cefalorraquidiano
NK – Natural Killer
NTX – Neurotoxoplasmose
OR – Odds Ratio
PCR – Polymerase Chain Reaction – Reação em cadeia da P
RIFI – Reação de Imunofluorescência Indireta
SAE – Serviço de Atendimento Especializado
AIDS – Acquired Immune Deficiency Syndrome
SNC – Sistema Nervoso Central
TARV – Terapia antirretroviral
SUMÁRIO
1 INTRUÇÃO.............................................................................................................13
1.1 TOXOPLASMOSE...............................................................................................13
1.1.1 Histórico............................................................................................................13
1.1.2 O parasito.........................................................................................................14
1.1.3 Ciclo biológico...................................................................................................16
1.1.4 Resposta imunológica ao Toxoplasma gondii...................................................18
1.1.5 Mecanismos de transmissão.............................................................................19
1.1.6 Fatores de risco.................................................................................................20
1.1.7 Toxoplasmose humana.....................................................................................22
1.1.8 Epidemiologia em imunocompetentes...............................................................23
1.1.9 Diagnóstico e tratamento...................................................................................24
1.2 TOXOPLASMOSE EM PACIENTES HIV/Aids...................................................26
1.2.1 Neurotoxoplasmose em pacientes HIV/Aids....................................................28
1.2.2 Diagnóstico da neurotoxoplasmose em pacientes HIV/Aids...........................29
1.2.3 Epidemiologia da toxoplasmose em pacientes HIV..........................................31
2 JUSTIFICATIVA......................................................................................................33
3 OBJETIVOS............................................................................................................34
4 METODOLOGIA.....................................................................................................35
4.1 DESENHO DO ESTUDO E POPULAÇÃO ALVO................................................35
4.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL....................................................................35
4.3 CÁLCULO AMOSTRAL........................................................................................36
4.4 COLETA DAS AMOSTRAS DE SANGUE...........................................................37
4.5 ANÁLISE SOROLÓGICA.....................................................................................37
4.6 ANÁLISE EPIDEMIOLÓGICA..............................................................................41
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA......................................................................................42
4.8 AVALIAÇÃO DE PRONTUÁRIOS MÉDICOS......................................................43
4.9 ANÁLISE MOLECULAR.......................................................................................43
5 RESULTADOS........................................................................................................46
5.1 ANÁLISE EPIDEMIOLÓGICA DOS PACIENTES HIV/Aids DO SAE..................46
5.1.1 Características dos pacientes...........................................................................46
5.1.2 Variáveis relacionadas à infecção por oocistos.................................................49
5.1.3 Variáveis relacionadas à infecção por cistos.....................................................52
5.1.4 Sorologia da toxoplasmose em pacientes HIV/Aids do SAE............................52
5.1.5 Análise Univariada............................................................................................53
5.1.6 Análise Multivariada..........................................................................................59
5.2 AVALIAÇÕES CLÍNICAS....................................................................................60
5.2.1 Dados de CD4, CD4/CD8 e carga viral dos pacientes HIV/Aids do SAE.........60
5.2.2 Dados clínicos dos pacientes HIV/Aids do SAE...............................................60
5.2.3 Avaliações sorológicas e clínicas dos pacientes HIV/Aids internados.............61
5.2.4 Análise clínica de pacientes HIV/Aids com diagnóstico presuntivo ou
confirmado para neurotoxoplasmose........................................................................62
5.3 ESTUDO RETROSPECTIVO DE INTERNAMENTOS POR
NEUROTOXOPLASMOSE NO HGT.........................................................................64
5.4 ANÁLISES MOLECULARES...............................................................................65
6 DISCUSSÃO...........................................................................................................66
7 CONCLUSÃO.........................................................................................................78
8 PERSPECTIVAS....................................................................................................79
REFERÊNCIAS.........................................................................................................80
ANEXO A – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO.................96
ANEXO B – PARECER DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA........................98
ANEXO C – QUESTIONÁRIO SOCIOECONÔMICO E BIOLÓGICO.....................101
13
1 INTRODUÇÃO
1.1 TOXOPLASMOSE
1.1.1 Histórico
O Toxoplasma gondii, agente etiológico da toxoplasmose, foi inicialmente
descrito em 1908 por Alfonso Splendore a partir de tecidos de coelhos, no Brasil.
Também em 1908, em Tunis, os franceses Charles Nicolle e Louis Hebert Manceaux
descobriram o T. gondii no baço e no fígado do roedor gundi (Ctenodactylus gundi)
(revisado por WEISS; DUBEY, 2009).
Em 1923, 15 anos após a descrição deste parasito, foi relatado por Janku o
primeiro caso de toxoplasmose humana em uma criança de 11 meses de idade, a qual
apresentava hidrocefalia, microftalmia, dentre outras manifestações clínicas (revisado
por COX, 2002). Em 1927, Torres descreveu um caso semelhante no Brasil. Janku se
referiu ao organismo encontrado como Sporozoa, enquanto Torres descreveu como
Encephalitozoon chagasi; Em 1928, Levaditi sugeriu que ambos os casos estavam
relacionados ao Toxoplasma gondii. Em 1937, Arne Wolf e David Cowen descreveram
um parasito, que denominaram E. hominis, no sistema nervoso e na retina de um
neonato, que por sua vez apresentava encefalite, hidrocefalia e corioretinite. (revisado
por COX, 2002; WEISS; DUBEY, 2009).
Em 1948, Albert Sabin e Harry Feldman desenvolveram um teste sorológico, o
teste do corante. Este foi um importante passo no estudo da toxoplasmose, já que a
partir dessa descoberta foi possível facilitar a identificação de infecção por T. gondii,
bem como realizar pesquisas epidemiológicas (SABIN; FELDMAN, 1948).
Em 1970, o ciclo biológico deste parasito foi então estabelecido de forma
completa, sendo então classificado como um coccídeo tendo os felídeos como
hospedeiros definitivos e animais homeotérmicos como hospedeiros intermediários,
dentre eles estão aves, bovinos, ovinos, caprinos, o homem, entre outros (revisado
por WEISS; DUBEY, 2009).
14
1.1.2 O parasito
A toxoplasmose é causada pelo parasito intracelular obrigatório, Toxoplasma
gondii (DUBEY; LINDSAY; SPEER, 1998), que por sua vez é capaz de infectar
vertebrados homeotérmicos, incluindo humanos (TENTER; HECKEROTH; WEISS,
2000). O T. gondii pertence ao Reino Protista, Sub-reino Protozoa, Filo Apicomplexa,
Classe Sporozoazida, Sub-classe Coccidiasina, Ordem Eucoccidiorida, Família
Sarcocystidae, Sub-família Toxoplasmatinae, Gênero Toxoplasma, Espécie
Toxoplasma gondii (CURRENT et. al., 1990). Recentemente, Ald e colaboradores
(2012) sugeriram uma nova classificação, na qual o parasito Toxoplasma gondii está
inserido dentro de um super grupo denominado SAR, mais especificamente no grupo
Alveolata (primeiro grupo), dentro do qual é classificado como Apicomplexa (segundo
grupo), em seguida como Conoidasida (terceiro grupo), Coccídeo (quarto grupo) e
Eimeriorina (quinto grupo).
Trata-se de um parasito com capacidade de imunomodular o seu hospedeiro,
garantindo seu sucesso na disseminação no organismo (CARRUTHERS; SUZUKI,
2007). Dentre os diversos mecanismos de imunomodulação, está a capacidade que
este protozoário possui de penetrar ativamente em células apresentadoras de
antígenos como os macrófagos (CARRUTHERS; BOOTHROYD, 2007). Além disso,
o Toxoplasma gondii é um importante parasito bem sucedido com vasta distribuição
no meio ambiente, isto se deve a diversos fatores, dentre eles a sua alta capacidade
de adaptação e seus vários mecanismos de transmissão. (DUBEY; SU, 2009).
O T. gondii possui três estágios infectantes, são eles: taquizoítos (livres),
bradizoítos (em cistos teciduais) e esporozoítos (em oocistos). Essas três formas
apresentam organelas citoplasmáticas características do filo Apicomplexa que
constituem o complexo apical: conóide, anéis polares, microtúbulos subpeliculares,
roptrias, micronemas e grânulos densos (SOLDATI e MEISSNER 2004; DUBEY,
2008).
Os taquizoítos se multiplicam rapidamente, além de possuírem a capacidade
de invadir ativamente diversos tipos celulares, onde se multiplicam em vacúolo
parasitóforo, o qual é formado a partir de moléculas do próprio parasito e,
principalmente, de componentes da célula hospedeira (HILL et. al., 2005; MUÑIZ-
15
HERNÁNDEZ, 2011). Os taquizoítos estão presentes principalmente na fase aguda
da infecção (DUBEY; LINDSAY; SPEER, 1998). Quanto à sua morfologia, apresentam
uma forma arqueada, medindo, aproximadamente, 4 a 8 µm de comprimento por 2 a
4 µm de diâmetro. Consistem na forma menos resistente do parasito, de modo que é
facilmente destruído por condições adversas, tais como desidratação e variáveis
osmóticas (MONTOYA e LIESENFELD 2004).
Os bradizoítos dividem-se lentamente dentro de cistos teciduais, que por sua
vez lhes garante resistência; estes cistos podem ser encontrados em diversos tecidos,
principalmente tecido nervoso e muscular, e sua parede consiste de uma membrana
limitante com numerosas invaginações e uma camada subjacente de material granular
eletro-denso (FERGUSON, 2004). Os bradizoítos apresentam metabolismo lento e
induzem resposta imunológica associada à quimiocina CCL21, que por sua vez,
promove a migração de linfócitos TCD4+ para o SNC (PLOIX et. al., 2011). Os cistos
podem permanecer viáveis como infecção latente e assintomática por muitos anos no
hospedeiro (DUBEY; LINDSAY; SPEER, 1998; CRISTINA et. al., 2008;). Além disso,
apresentam grande variação em seu tamanho, essa variação depende do estágio em
que se encontra, da célula hospedeira parasitada, e do número de bradizoítos em seu
interior (WEISS e KIM, 2000; MONTOYA e LIESENFELD 2004). O tamanho varia,
aproximadamente, entre 5 e 70 µm de diâmetro, podendo chegar a 300 µm com
centenas de bradizoítos em seu interior (DUBEY, 1998; INNES, 2010). Os cistos
teciduais estão presentes, principalmente, na fase crônica da infecção.
A infecção crônica persiste latente por toda a vida do indivíduo, sendo
clinicamente assintomática, na maioria dos casos. A infecção latente envolve uma
complexa interação entre o parasito e o hospedeiro, estabelecendo assim um grau de
equilíbrio entre ambos. O T. gondii realiza modificações no ambiente para promover
sua sobrevivência, por outro lado, evita dano tecidual (provocado diretamente pelo
próprio parasito ou indiretamente pela resposta imune) que eventualmente poderia
levar à morte de seu hospedeiro. A variação de fatores por parte do parasito e do
hospedeiro interfere diretamente nesse equilíbrio (CARRUTHERS; SUZUKI, 2007).
Os oocistos contêm os esporozoítos, que por sua vez são formados através do
ciclo sexuado entero-epitelial, nos felinos (hospedeiro definitivo), e eliminados em
suas fezes. A excreção dos oocistos dura de 7 a 20 dias, ocorrendo uma única vez na
vida, normalmente na primo-infecção. Tornam-se infectantes após o processo de
16
esporulação, o qual acontece no ambiente. Estes oocistos permanecem infectantes
no ambiente por até 18 meses, desse modo, permitem a sobrevivência do parasito
por longos períodos no meio externo (DUBEY; LINDSAY; SPEER, 1998; MAI et. al.,
2009).
Classicamente, esse protozoário possui uma estrutura populacional clonal. É
classificado em três diferentes linhagens clonais (I, II e III). Estas linhagens
apresentam padrões distintos de virulência em modelos murinos (SU et. al., 2002;
SIBLEY et. al., 2009). Estudos observaram que as linhagens tipo I apresentam alta
virulência, enquanto que os tipos II e III levam ao desenvolvimento da cronificação da
infecção por meio da formação de cistos (HOWE; SIBLEY, 1995; KIM; WEISS, 2004;
SAEIJ; BOYLE; BOOTHROYD, 2005). Vários estudos sorológicos têm sido relatados
com relação ao tipo clonal de Toxoplasma gondii pelo qual animais e humanos são
infectados (PEYRON et. al., 2006; SOUSA et. al., 2009). Na América do Sul, contudo,
há uma grande diversidade para T. gondii onde a dispersão clonal não é prevalente.
No Brasil, as frequentes trocas genéticas têm gerado uma ampla variedade de
diferentes genótipos (PENA et. al., 2008). Oitenta e oito genótipos já foram
identificados a partir de vários hospedeiros animais no Brasil, e novos genótipos vem
sendo continuamente identificados em diversas espécies de animais, de modo que
isto indica uma elevada diversidade de T. gondii na população (PENA et. al., 2011;
CLEMENTINO-ANDRADE et. al., 2013).
1.1.3 Ciclo biológico
O Toxoplasma gondii é um parasito intracelular obrigatório que apresenta baixa
especificidade (eurixênico), pois possui a capacidade de infectar qualquer animal
homeotérmico, além de invadir diversos tipos de células nucleadas (DUBEY 1994).
Este parasito apresenta um complexo ciclo de vida, do tipo heteroxeno
facultativo (Figura 1), que por sua vez foi descrito somente em 1970, quando foi
descoberto que os hospedeiros definitivos são membros da família Felidae, incluindo
o gato doméstico (FRENKEL et. al., 1970). Além disso, os animais de sangue quente
(mamíferos e aves) consistem nos hospedeiros intermediários, dentre eles, os
humanos (DUBEY, 2004).
17
FIGURA 1. Ciclo biológico do parasito Toxoplasma gondii em hospedeiros
intermediários e definitivos (ROBERT-GANGNEUX; DARDÉ, 2012 modificada).
Sabe-se que o T. gondii apresenta um ciclo biológico com duas fases: a fase
assexuada, a qual ocorre em hospedeiros intermediários (mamíferos e aves); e a fase
sexuada, a qual ocorre somente nos hospedeiros definitivos, especificamente nas
células epiteliais do intestino de felídeos.
Na fase assexuada, o parasito penetra no intestino do hospedeiro, e inicia um
processo de multiplicação, denominado endodiogenia, que por sua vez ocorre dentro
do vacúolo parasitóforo, dando origem à células-filhas a partir de uma célula-mãe.
Desse modo, os taquizoítos se multiplicam rapidamente, e são liberados por meio da
ruptura da célula hospedeira. Posteriormente, os parasitos se disseminam pelo
organismo através do sangue ou linfa, infectando novas células em diversos tecidos.
Este processo inicial consiste na fase aguda da infecção (BEAMAN et. al., 1995).
Ao invadirem novas células, principalmente musculares e nervosas, alguns
taquizoítos se convertem em bradizoítos, dando início à fase crônica da infecção, a
18
qual é caracterizada pela formação de cistos (TENTER et. al, 2000). Estes cistos
permanecem em estado de latência por um longo período, no entanto, podem sofrer
ruptura com posterior liberação dos bradizoítos, os quais podem se converter em
taquizoítos novamente. Esse processo está bastante associado aos níveis de INF-ɣ e
óxido nítrico, e ocorre, principalmente, em indivíduos imunocomprometidos (KIM e
WEISS, 2008; SKARIAH et. al., 2010).
Os oocistos são formados a partir da fase sexuada, após vários processos de
esquizogonia seguida de gametogonia. Após a fecundação dos gametócitos há a
formação do zigoto, que por sua vez, dá origem ao oocisto imaturo (não esporulado),
que posteriormente é eliminado através das fezes do hospedeiro definitivo. Ao
encontrarem condições favoráveis (temperatura, umidade e oxigenação), estes
oocistos tornam-se infectantes através da esporulação, a qual ocorre de 2 a 4 dias
(DUBEY, 1998; LAPPIN, 2000; MONTOYA e LIESENFELD, 2004).
1.1.4 Resposta imunológica ao Toxoplasma gondii
A resposta imune ao T. gondii é complexa, envolvendo mecanismo humoral e,
principalmente, mecanismo celular, sendo este último um significativo fator de
resistência contra a infecção (KAHI et. al., 1998; MUNOZ et. al., 2011).
A resposta imune a este parasito é desencadeada por meio da imunidade inata
que, apesar de inespecífica, desempenha relevante papel na ativação e diferenciação
celular e, consequentemente, no desenvolvimento de uma resposta específica
(DUPONT; CHRISTIAN; HUNTER, 2012; MILLER et. al., 2009). Nesta fase inicial da
infecção, as células dentríticas, monócitos e macrófagos entram em contato com o
parasito, apresentam os antígenos do invasor, e iniciam a produção de IL-12, a qual
induz a produção de IFN-ɣ pelos linfócitos T CD4+, linfócitos T CD8+, e pelas células
Natural Killer (NK) (ALIBERTI, 2005). Essas citocinas promovem a diferenciação e
proliferação de uma resposta imune com perfil Th1, que por sua vez, consiste no
principal mecanismo de resistência aos patógenos intracelulares (GAZZINELLI et. al.,
1993).
Com relação à toxoplasmose, a principal citocina responsável pela resistência
ao T. gondii é o INF-ɣ, o qual é essencial no controle da infecção, tanto na fase aguda
19
(favorecendo a interconversão de taquizoíto em bradizoíto), como na fase crônica
(impedindo a conversão de bradizoíto em taquizoíto) (SUZUKI et. al., 1988; YAP e
SHER, 1999; FUJIGAKI et. al., 2002). O INF-ɣ, por sua vez, possui o papel de ativar
diversas células do hospedeiro, principalmente macrófagos, os quais exercem função
efetora antimicrobianas por meio da produção de radicais tóxicos de oxigênio,
especificamente o óxido nítrico, levando à destruição do parasito (FUJIGAKI, 2002;
MELO, JENSEN, SAEIJ, 2011). Por outro lado, durante uma fase seguida à infecção
aguda, ocorre um processo de imunorregulação, o qual se dá por meio da produção
de IL-10, que por sua vez, ameniza o dano tecidual ao regular a produção de citocinas
pró-inflamatórias, e promovendo o balanceamento entre as respostas Th1 e Th2
(GAZZINELLI et. al., 1996; NEYER et. al., 1997; ALIBERTI, 2005; DAMSKER et.al.,
2010).
Na toxoplasmose, a resposta humoral, isoladamente, não é capaz de promover
proteção no curso da infecção. Sabe-se que essa resposta é também mediada por
linfócitos T, já que a produção de células de memória, bem como a ativação e
diferenciação de linfócitos B, dependem de citocinas produzidas pelos Linfócitos T
CD4+, além da apresentação de antígenos pelas células apresentadoras aos linfócitos
B. De um modo geral, a resposta humoral atua, basicamente, na opsonização de
parasitos (SHARMA, 1990; HUSKINSON et. al., 1990). No início da infecção, há a
produção de anticorpos específicos para o T. gondii da classe IgM, que desaparecem
em algumas semanas ou meses. Por outro lado, os anticorpos anti-T.gondii da classe
IgG têm o seu pico dentro de um a dois meses após a infecção, e permanece em nível
elevado por toda vida (SUBAUSTE e REMINGTON 1993).
1.1.5 Mecanismos de transmissão
A infecção pelo T. gondii se dá através das três formas infectantes: taquizoítos,
bradizoítos e oocistos. A transmissão pode ser horizontal (adquirida) ou vertical
(congênita). No homem (hospedeiro intermediário), a infecção horizontal ocorre pela
ingestão de carne malcozida contendo cistos teciduais provenientes de caprinos,
suínos e ovinos; ocorre também através da ingestão de alimentos ou água
contaminados por oocistos esporulados, que por sua vez são liberados através das
20
fezes de felinos (hospedeiro definitivo), os quais são responsáveis pelo principal
mecanismo de disseminação da toxoplasmose em áreas urbanas, associado aos
hábitos de manipular jardins sem uso de luvas (mãos nuas), conforme avaliado pelo
nosso grupo de pesquisa em toxoplasmose humana e animal (BARBOSA; HOLANDA;
ANDRADE-NETO, 2009). A transmissão vertical consiste no mais importante aspecto
relacionado à toxoplasmose humana (ROBERT-GANGNEUX; DARDÉ, 2012); se dá
por via transplacentária quando a mãe se encontra na fase aguda da infecção.
(CARRUTHERS; SUZUKI, 2007).
1.1.6 Fatores de risco
Muitos fatores estão relacionados ao risco de transmissão da toxoplasmose, de
modo que há uma dificuldade em determinar a fonte da infecção. Como citado
anteriormente, existem vários fatores envolvidos, dentre eles estão: consumo de carne
crua ou malcozida, consumo de alimentos ou água contaminados, manipulação de
carne crua, consumo de leite não pasteurizado, jardinagem sem uso de luvas, contato
com as fezes do gato, exposição ao solo contaminado, entre outros (RIEMANN et. al.,
1975; KAPPERUD et. al., 1996; TENTER et. al., 2000).
Sabe-se hoje que a toxoplasmose é transmitida, principalmente, pelo consumo
de carne crua ou mal passada contendo cistos, ou pela ingestão de oocistos presentes
no ambiente e em água ou alimentos contaminados (DUBEY et. al., 2012; TENTER
et. al., 2000). É importante ressaltar que as principais vias de transmissão podem
divergir em populações com culturas e hábitos alimentares diferentes. Além disso, as
condições ambientais/climáticas influenciam consideravelmente na prevalência
elevada em países tropicais da América do Sul e na África, por exemplo (DUBEY et.
al., 2012).
Há divergências, nos estudos, quanto à importância do gato doméstico como
um significativo fator de risco na transmissão da toxoplasmose. Após a infecção
primária, o felino é capaz de liberar milhões de oocistos (JACKSON, HUTCHISON
1989), tal fato coloca seus proprietários em risco para adquirir a infecção por T. gondii.
Além disso, gatos andarilhos, ou que vivem em fazendas, podem contaminar o
ambiente com oocistos.
21
Nas Américas, alguns surtos de toxoplasmose aguda, em humanos, foram
associados à presença de oocistos no ambiente (TENTER et. al., 2000). Estudos
epidemiológicos evidenciam que um surto de toxoplasmose aguda, em 1995, ocorrido
em 110 indivíduos de Vancouver, Canadá, estaria ligado à contaminação da água
utilizada para consumo (BOWIE et. al., 1997; ARAMINI et. al., 1999). No Brasil, 600
pessoas da cidade Santa Isabel do Ivaí, Paraná, procuraram o serviço de saúde entre
novembro de 2001 e janeiro de 2002, com sintomas compatíveis com toxoplasmose.
Destas, 426 apresentaram diagnóstico sugestivo de infecção aguda por T. gondii. Este
surto ocorreu em virtude da contaminação de um reservatório de água por oocistos
eliminados em fezes de gatos jovens que habitavam o local (BRASIL. MINISTÉRIO
DA SAÚDE. FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE, 2002; DE MOURA et. al., 2006).
Por outro lado, oocistos eliminados pelos gatos não são esporulados. Eles
necessitam de 1 a 5 dias para realizarem a esporulação, e assim tornar-se infecciosos
para outros hospedeiros. Desse modo, o contato direto com o gato, geralmente, não
resulta em infecção por T. gondii, principalmente nos casos onde medidas preventivas
são tomadas, como por exemplo, a higienização diária das fezes do gato doméstico
(TENTER et. al., 2000; DUBEY; ROBERT-GANGNEUX e DARDÉ 2012).
Diversos autores relataram o consumo de carne crua ou malcozida como um
importante fator de risco na transmissão da toxoplasmose (GARCIA et. al., 1999ª;
MILAR et. al, 2008; COOK et. al, 2000; FRAZÃO-TEIXEIRA et. al., 2006; OLIVEIRA
et. al., 2007). O risco associado ao tipo de carne (boi, porco, galinha, etc.) varia entre
os diferentes países, de acordo com os hábitos alimentares local, e de acordo com a
prevalência do T. gondii nesses animais (ROBERT-GANGNEUX e DARDÉ 2012). Na
Europa, por exemplo, um estudo multicêntrico relacionou o consumo de carne crua
com 30 a 68% dos casos de infecção (COOK et. al., 2000).
Com relação aos animais criados em fazenda, a infecção por T. gondii leva à
perda reprodutiva e econômica, e além disso, acarreta danos à saúde pública, já que
o consumo de produtos contaminados derivados desses animais (como carne e leite)
podem ocasionar a transmissão da toxoplasmose (JITTAPALAPONG et al. 2005). No
Brasil, milhões de animais de produção são direcionados para o consumo humano a
cada ano. Avaliações sorológicas mostraram que até 90% dos animais domésticos e
selvagens apresentavam anticorpos para T. gondii no Brasil (DUBEY et al. 2012).
Recentemente, nosso grupo de pesquisa avaliou que 29,41% dos ovinos
22
apresentaram infecção por T.gondii em Lages, município do Rio Grande do Norte,
onde a pecuária ovina consiste em uma das principais atividades econômicas
(CLEMENTINO et al. 2007). Além disso, nosso grupo observou que a prevalência de
toxoplasmose ovina no Rio Grande do Norte foi de 22,1%, sendo 26,3% e 17,8% nas
regiões Leste Potiguar e Central Potiguar, respectivamente (CLEMENTINO-
ANDRADE et. al., 2013).
No Brasil, alguns estudos relacionaram a infecção pelo T. gondii aos fatores
socioeconômicos. Foi observado que 84% da população com baixo nível
socioeconômico do Rio de Janeiro foi soropositiva para T. gondii, enquanto que a
população com nível socioeconômico médio apresentou um valor de 62%, e a
população com alto nível econômico apresentou 23% (BAHIA-OLIVEIRA et. al., 2003).
Esse fato pode estar relacionado não apenas ao poder aquisitivo propriamente dito,
mas aos desdobramentos disso, no que se refere ao acesso à informação e às
escolas, fatores também avaliados pelo nosso grupo (BARBOSA; HOLANDA;
ANDRADE-NETO, 2009).
1.1.7 Toxoplasmose humana
No homem, a toxoplasmose ocorre, na maioria das vezes, de forma
assintomática ou autolimitada em pacientes imunocompetentes, desenvolvendo-se de
modo assintomático na maioria dos casos; pode ainda desenvolver-se de forma
oligossintomática apresentando sintomas como quadro febril, linfoadenopatia dentre
outros. No entanto, em pacientes imunocomprometidos a toxoplasmose desenvolve-
se de modo mais grave, com relevância para as manifestações no sistema nervoso
central (MONTOYA; LIESENFELD, 2004).
A toxoplasmose é potencialmente grave durante a gravidez, a qual consiste em
uma das formas clínicas dessa parasitose, e apresenta especial importância devido
aos sérios danos causados ao desenvolvimento do feto (JONES et. at., 2001). A
gravidade está diretamente relacionada com a capacidade da resposta imune da mãe,
virulência da cepa, período gestacional e com a imaturidade no sistema imune fetal
(REMINGTON et al., 2001). As possíveis consequências da toxoplasmose congênita
são principalmente neurológicas e oftalmológicas (CARRUTHERS; SUZUKI, 2007);
23
podem ocorrer ainda: epilepsia, retardo psicomotor ou mental, anemia, icterícia,
prurido, petéquias, encefalite, pneumonite, calcificação intracraniana, dentre outras
manifestações (REMINGTON et. al., 2001). A retinocoroidite é uma característica
comum na toxoplasmose congênita; sua particularidade consiste na expressão clínica
em longo prazo após o nascimento (ROBERT-GANGNEUX; DARDÉ, 2012). A
ocorrência da transmissão vertical é menor durante o primeiro trimestre de gestação
quando comparada à infecção ocorrida no terceiro trimestre, no entanto, há um risco
de morbidade maior da doença para o feto quando a primo-infecção ocorre no início
do período gestacional. (FIGUEIRÓ-FILHO et al., 2005).
Pacientes portadores da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS)
consistem em um importante grupo de risco relacionado à toxoplasmose; nesses
indivíduos, a toxoplasmose está diretamente relacionada com os baixos níveis de
células TCD4+; tais pacientes apresentam diversas lesões necrosantes
principalmente em núcleos da base (ABEDALTHAGAFI et al., 2010).
Estudo recente, baseado em inquéritos soroepidemiológicos e de
comportamento animal, sugere que a infecção crônica com T. gondii pode ser um fator
de risco para o desenvolvimento de esquizofrenia ou outros distúrbios
comportamentais em humanos (YOLKEN; TORREY, 2008), fato bastante intrigante
no que se refere aos desdobramentos da neurociência.
1.1.8 Epidemiologia em imunocompetentes
A toxoplasmose apresenta-se de forma variada quanto à sua prevalência,
estima-se algo em torno de 25% a 30% em todo o mundo (MONTOYA; LIESENFELD,
2004). Esta prevalência pode variar entre os países (10% a 80%) ou até mesmo entre
diferentes regiões de um mesmo país (PAPPAS; ROUSSOS; FALAGAS, 2009). Foi
observada uma baixa prevalência (10 a 30%) na América do Norte, no sudeste da
Ásia, no norte da Europa e em alguns países (Sahel) da África; prevalência moderada
(30 a 50%) foi encontrada em alguns países da Europa central e do sul; e altas
prevalências foram observadas na América Latina e nos países africanos tropicais
(LIESENFELD, 2010).
24
No Brasil, a prevalência sorológica de infecção por T. gondii é alta, variando em
torno de 50% a 80% na população adulta (BAHIA-OLIVEIRA et. al., 2003; PAPPAS
et. al, 2009). Alguns estudos epidemiológicos foram realizados na população
brasileira, a partir de diversos estados. Foram observadas prevalências de 73% em
São Paulo (GOMES et. al., 1975), 54% em Roraima (FERRARONI et. al., 1980),
78,7% no Rio de Janeiro (COUTINHO et al., 1981), 60% em Goiás (RODRIGUES,
2007), 36% em Minas gerais (MAIA et. al, 2012), dentre outras pesquisas realizadas.
Com relação à toxoplasmose congênita, estudos relataram uma taxa de
incidência no Brasil de 1/3.000 nascimentos (NETO, et al., 2000). No entanto, esse
valor pode variar: em Ribeirão Preto foi encontrada uma prevalência de 0,3/1000
nascimentos, enquanto que em Uberlândia foi visto uma alta prevalência de 5,0/1000
nascimentos (SEGUNDO et. al., 2004).
As lesões oculares representam uma importante manifestação clínica
decorrente da toxoplasmose congênita; um estudo comparativo em crianças
infectadas congenitamente, no Brasil e na Europa, observou que crianças brasileiras
apresentaram um risco cinco vezes maior para desenvolver lesões oculares quando
comparadas às crianças européias, além de que essas lesões se caracterizavam por
serem múltiplas, maiores, mais recorrentes e com comprometimento para a visão
(GILBERT et. al., 2008). Tal fato pode estar associado às características genotípicas
do parasito circulante em nosso meio (CLEMENTINO-ANDRADE et. al., 2013), bem
como ao polimorfismo genético da população humana susceptível, como foi aventado
em estudos conduzidos por nosso grupo, no Rio Grande do Norte (MENDES, 2011).
1.1.9 Diagnóstico e Tratamento
Os exames sorológicos são mais comumente utilizados no diagnóstico da
toxoplasmose. Estes se baseiam na detecção de anticorpos específicos das classes
IgM, IgG, IgA e IgE (CONTRERAS et. al., 2000).
A fase aguda da infecção por T.gondii é caracterizada pelo aumento de
anticorpos IgG (com baixa avidez), além do aumento dos anticorpos IgM, IgA e IgE
(BONFIOLI e OREFICE 2005). Os anticorpos IgM são produzidos na segunda
semana, após a primo-infecção, atingindo níveis máximos no fim do primeiro mês, e
25
desaparecem em 6 a 12 meses, geralmente. No entanto, em alguns casos, ocorre a
persistência desses anticorpos até 18 meses após a infecção, dificultando a
interpretação dos resultados (WILSON et. al., 1997).
Os anticorpos IgA possuem uma cinética semelhante aos anticorpos IgM,
porém com maior sensibilidade. Assim, constituem importantes marcadores
sorológicos, principalmente em gestantes, fetos e recém-nascidos, pois desaparecem
da circulação mais rapidamente que os anticorpos da classe IgM (PINON et. al., 2001;
BORGES e FIGUEIREDO 2004). Por outro lado, aproximadamente 5% das pessoas
não produzem IgA, e além disso, o IgA pode persistir por anos em alguns casos.
Desse modo, esta classe de anticorpos é pouco utilizada para compor o diagnóstico
da infecção recente (MONTOYA e LIESENFELD, 2004). Na fase crônica da infecção,
apenas os anticorpos IgG estão presentes, os quais apresentam alta avidez nessa
fase (MONTOYA e LIESENFELD, 2004).
Atualmente, as técnicas mais utilizadas no diagnóstico laboratorial da
toxoplasmose são a reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e o ensaio
imunoenzimático (ELISA). Ambos os testes apresentam boa especificidade e
sensibilidade (MONTOYA e LIESENFELD, 2004; SHAAPAN et. al., 2008). A RIFI, no
entanto, apresenta uma subjetividade na interpretação da fluorescência, tornando este
método de difícil comparação entre laboratórios, o que justifica vários dados na
literatura com grande variabilidade em uma mesma região (SHAAPAN et. al., 2008;
MACRI et. al., 2009). Por outro lado, o ELISA além de apresentar elevada
sensibilidade e especificidade, possui diversas vantagens como: simplicidade técnica,
versatilidade e objetividade na leitura. Desse modo, o ELISA consiste em um teste
eficiente, principalmente quando os reagentes e os parâmetros do ensaio estão bem
padronizados (CAMARGO, 2001; SANCHEZ, 2001).
A determinação da fase de infecção tem maior relevância em gestantes, uma
vez que o tratamento pode acarretar diversos efeitos adversos, incluindo um potencial
efeito teratogênico, principalmente no primeiro trimestre da gestação (DEGERLI et.
al., 2003). Com intuito de estimar a fase de infecção, o teste de avidez de IgG foi
desenvolvido baseado no aumento da afinidade de um anticorpo específico a um
antígeno ao longo do tempo (HEDMAN et. al., 1993). Deste modo, utiliza-se um agente
dissociante da ligação entre antígeno e anticorpo, como a ureia, para determinar o
índice de avidez. Alguns autores relatam que um índice de avidez maior ou igual a
26
50% indica uma infecção crônica, enquanto que valores abaixo de 50% são
indicadores de infecção recente (ROBERT-GANGNEUX et. al., 1998; COLOMBO et.
al., 2005; MATTOS et. al., 2011).
Nas últimas décadas, além dos avanços das técnicas imunológicas, as técnicas
moleculares vêm passando por um progresso significativo quanto ao diagnóstico de
doenças infecciosas. Alguns estudos têm demonstrado a utilidade da PCR no líquido
cefalorraquidiano (LCR) para o diagnóstico da toxoplasmose cerebral (JULANDER et.
al., 2001; VIDAL et. al., 2004). Além disso, a técnica de PCR demonstrou bons
resultados para o diagnóstico da toxoplasmose ocular, por meio da detecção do DNA
do parasito no humor aquoso e corpo vítreo (MONTOYA e LIESENFELD, 2004). De
modo mais comum, resultados de diversas pesquisas sugerem que infecções fetais
podem ser diagnosticadas cedo na gravidez, por meio da análise do líquido amniótico,
evitando a necessidade de amostra de sangue fetal ou de procedimentos mais
invasivos (GUY et. al., 1996; REMINGTON, THULLIEZ, MONTOYA, 2004).
Os tratamentos voltados para a toxoplasmose encontram-se ainda limitados
devido aos seus significativos efeitos adversos (SONDA; HEHL, 2006). Dentre
algumas drogas conhecidas que atuam contra o T. gondii, estão: sulfadiazina,
pirimetamina, sulfametoxazol/trimetropim; clindamicina; azitromicina (KAYE, 2011).
De um modo geral, os fármacos atuam inibindo enzimas fundamentais para a
replicação do parasito e podem agir de forma combinada. As enzimas dihidropteroato
sintetase e dihidrofolato redutase, importantes na biossíntese de pirimidinas no T.
gondii, são inibidas pela sulfadiazina e pirimetamina, respectivamente, usadas em
larga escala na rotina de tratamento da toxoplasmose (ANDERSON, 2005).
1.2 TOXOPLASMOSE EM PACIENTES HIV/Aids.
A síndrome da imunodeficiência adquirida (Aids), ocasionada pelo HIV (Vírus
da Imunodeficiência Humana), é transmitida por meio de relações sexuais, transfusão
sanguínea, compartilhamento de agulhas, ou ainda de mãe para filho. Esta síndrome
é caracterizada pela destruição dos linfócitos TCD4+, comprometendo a imunidade
celular e, portanto, diminuindo a capacidade do organismo de se defender contra
doenças oportunistas.
27
A introdução da terapia antirretroviral (TARV) proporcionou uma redução na
incidência de doenças oportunistas em pacientes que têm acesso aos cuidados de
saúde, principalmente nos países desenvolvidos. Por outro lado, há diversas razões
que levam à má resposta aos agentes antirretrovirais, dentre elas: a resistência do
HIV a determinados fármacos, má adesão ao tratamento em função dos efeitos
adversos, uso de drogas, bem como interações medicamentosas (BENSON et. al.,
2004).
A Lei Federal nº 9.313, de 13 de novembro de 1996 garantiu o acesso universal
e gratuito ao tratamento antiretroviral no Brasil. Ao longo do tempo, foi também
estruturado, no país, o acesso da população aos exames de monitoramento
laboratorial da infecção pelo HIV - contagem de linfócitos T CD4+ e Carga Viral (CV),
bem como aos insumos e ações de prevenção (BRASIL, 2010). O Brasil foi um dos
primeiros países a adotar políticas de saúde expressivas no atendimento aos
portadores de HIV, destacando-se no âmbito internacional (BRASIL, 2008a).
Atualmente, para o tratamento do HIV, estão disponíveis as seguintes classes
de antirretrovirais: inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleosídeos,
inibidores da transcriptase reversa não análogos de nucleosídeos, inibidores da
protease, inibidores da integrase, antagonistas de CCR5 e inibidores de fusão
(HUGHES et al., 2008). A TARV tem a finalidade de reduzir a carga viral no plasma e
em tecidos linfoides, sustentando a supressão da replicação viral e contribuindo na
reconstituição imunológica. No entanto, em muitos casos, essa recuperação
imunológica não tem sido alcançada, podendo ser decorrente do estágio avançado da
infecção, resistência do vírus ao fármaco, ou talvez o período de acompanhamento
clínico da instituição da terapia tenha sido insuficiente para induzir à recuperação
(PLANA, et. al., 2000).
Nos indivíduos imunocompetentes, a resposta imune da toxoplasmose ocorre
de forma adequada, de modo que a fase aguda da infecção é transiente e evolui
rapidamente para a fase crônica. Esta, por sua vez, persiste latente no indivíduo por
toda a sua vida através de cistos teciduais. Assim, na fase crônica da toxoplasmose,
há um equilíbrio com relação à interação entre o parasito e o hospedeiro
(CARRUTHERS; SUZUKI, 2007). Em indivíduos imunocomprometidos, no entanto, a
infecção pode ser reativada, ocorrendo a interconversão de bradizoítos para
28
taquizoítos, culminando em sua liberação, e ocasionando relevantes danos
patológicos pela reagudização da doença (KODYM, et al., 2015).
Pacientes portadores de HIV/Aids consistem em um importante grupo de risco
no que se refere à toxoplasmose. Nesses indivíduos, a toxoplasmose está diretamente
relacionada com os baixos níveis de células TCD4+, as quais são importantes
integrantes da resposta imune celular que, por sua vez, é o principal mecanismo de
defesa contra parasitos intracelulares (ALIBERTI, 2005). Níveis muito baixos de
linfócitos TCD4+ representam um risco elevado de reativação da infecção (em
pacientes soropositivos) ou primoinfecção (em pacientes soronegativos) em
indivíduos portadores de HIV/Aids (KODYM, et al., 2015).
A toxoplasmose consiste em uma das infecções oportunistas mais comuns que
acomete pacientes HIV - positivos, sendo a neurotoxoplasmose a lesão cerebral focal
mais presente nesses pacientes (WEISS, DUBEY, 2009), de modo que os distúrbios
neurológicos são particularmente mais graves naqueles que apresentam maior
imunossupressão (COLOMBO et al., 2005). Além disso, a retinocoroidite toxoplásmica
é uma importante inflamação ocular secundária manifestada nesses pacientes
(RODGERS; HARRIS, 1996).
A literatura mostra que as infecções oportunistas são um dos principais fatores
para o risco de morte em pacientes portadores de HIV/ Aids (GOMIDES et al., 2002).
Estudos mostram também que a toxoplasmose consiste em uma importante causa de
morbi-mortalidade neste grupo de indivíduos (XAVIER et al., 2013).
1.2.1 Neurotoxoplasmose em pacientes HIV/Aids
Os distúrbios neurológicos relacionados à Aids são responsáveis por um
impacto considerável na morbi-mortalidade, particularmente nos países em
desenvolvimento (SACKTOR, 2002). A neurotoxoplasmose ocorre em
aproximadamente 40% dos pacientes com Aids em todo o mundo, e destes pacientes,
10 a 30% morrem em consequência de complicações da doença (LUFT e
REMINGTON, 1992; TENTER et al. 2000). No Brasil, a toxoplasmose cerebral
consiste na lesão cerebral focal predominante nesses pacientes (VIDAL, PENALVA,
HERNANDEZ, 2003).
29
De acordo com a literatura, o sistema nervoso central (SNC) é o local mais
afetado pela infecção, no qual a encefalite é a mais importante manifestação da
doença, causando sérios danos ao paciente (FERREIRA, 2000; PEREIRA-
CHIOCCOLA et. al., 2009; DUBEY et. al., 2012). Cerca de 95% da encefalite causada
por T. gondii deve-se à reativação da infecção latente em consequência da perda
progressiva da imunidade celular (LUFT e REMINGTON, 1992). Sabe-se que o risco
da reativação da infecção está diretamente relacionado aos baixos níveis de células
TCD4+ que, por sua vez, tem seus valores de referência entre 508 – 2480 células/mm³
em indivíduos adultos imunocompetentes (GOMIDES et. al., 2002; PARDINI, 2002).
Nos pacientes imunossuprimidos, a encefalite toxoplásmica ocorre quando a
contagem de células TCD4+ está abaixo de 200 células/mm³ (WEISS, DUBEY, 2000).
A neurotoxoplasmose, classicamente, apresenta-se como um processo sub-
agudo ou agudo (HERNÁNDEZ-GONZÁLEZ et. al., 2002). As manifestações clínicas
dependem da localização e do número de lesões presentes. Os sintomas/sinais mais
frequentes incluem: déficits motores focais, hemiparesia, ataxia, distúrbios sensoriais,
alterações da fala, intensa cefaleia, crises convulsivas, confusão mental, letargia e
alterações visuais. Além disso, pode ocorrer disfunção cognitiva e aumento da
pressão intracraniana (VIDAL et. al., 2005; MOULIGNIER, 2006; PEREIRA-
CHIOCCOLA et. al., 2009). Em cerca de 5 a 10% dos casos, os pacientes apresentam
coriorretinite toxoplásmica associada à neurotoxoplasmose (HERNÁNDEZ-
GONZÁLEZ et. al., 2002).
1.2.2 Diagnóstico da neurotoxoplasmose em pacientes HIV/ Aids
O diagnóstico definitivo da neurotoxoplasmose requer a demonstração direta
do parasito no tecido cerebral. Desse modo, na prática clínica, o diagnóstico da
toxoplasmose cerebral é presuntivo e depende da associação dos achados
sorológicos, clínicos e radiológicos (PEREIRA-CHIOCCOLA et. al., 2009; VIDAL et.
al., 2011). Posteriormente, a confirmação é realizada mediante à resposta terapêutica
empiricamente instituída, que ocorre, geralmente, entre 7 a 14 dias (LUFT et. al.,
1993). Assim, em regiões com alta prevalência da toxoplasmose, alguns pacientes
30
podem ser expostos de forma desnecessária aos efeitos adversos do tratamento anti-
T. gondii, em até 40% dos casos (RAFFI et. al., 1997).
Os exames de imagem são de grande relevância para o diagnóstico presuntivo
da neurotoxoplasmose, e podem ser realizados através da Tomografia
computadorizada (TC) de crânio ou Ressonância Magnética (RM). O diagnóstico
radiológico pode ser classificado em achados típicos ou atípicos. Os padrões típicos
incluem lesões hipodensas, unifocais ou multifocais, que captam o contraste de forma
anelar ou nodular, além de apresentar um edema perilesional, além disso, as lesões
localizam-se preferencialmente em núcleos da base. Tais achados são encontrados
em 80% dos casos, sendo bastante sugestivos de neurotoxoplasmose, no entanto,
não são patognomônicos. Em 20% dos casos ocorrem padrões atípicos, de modo que
as lesões podem ser hipodensas sem captação do contraste e com efeito expansivo,
ou ainda, apresentar encefalite difusa sem lesões focais visíveis (PEREIRA-
CHIOCCOLA et. al., 2009; NISSAPATORN e SAWANGJAROEN, 2011).
As características demonstradas pelos métodos de imagem também podem ser
encontradas de forma semelhantes em tumores, linfomas, abscessos, ou em outras
infecções oportunistas do SNC em pacientes HIV positivos (FERREIRA, 2000).
Portanto, o diagnóstico não pode ser feito baseado somente em observações clínicas
e radiológicas (MONTOYA e LIESENFELD, 2004; MENTZER et. al., 2012).
Com relação ao diagnóstico sorológico, a literatura mostra que a soroevidência
da infecção é geralmente observada em pacientes HIV antes do desenvolvimento da
neurotoxoplasmose, onde a maioria dos casos apresenta altos níveis de anticorpos
anti-T. gondii IgG (COLOMBO et. al., 2005; MEIRA et. al., 2008; NISSAPATORN e
SAWANGJAROEN, 2011). Tais anticorpos apresentam alta avidez, enfatizando a
ideia de que a reativação da infecção latente ocorre na resposta imune secundária
(MECHAIN et. al., 2000; COLOMBO et. al., 2005; PEREIRA-CHIOCCOLA et. al.,
2009). Entretanto, esses anticorpos não são detectados em, aproximadamente, 5%
dos pacientes em consequência da imunossupressão (HELLERBRAND et. al., 1996;
VIDAL et. al., 2005). Além disso, anticorpos anti-T.gondii da classe IgM não são
habitualmente detectados em pacientes HIV com neurotoxoplasmose (BORGES e
FIGUEIREDO, 2004; BHASKAR, 2005).
Os métodos moleculares têm proporcionado um grande avanço para o
diagnóstico da toxoplasmose cerebral através da técnica de PCR, que por sua vez,
31
permite a detecção do DNA do T. gondii em diferentes amostras biológicas
(NISSAPATORN e SAWANGJAROEN, 2011). Os métodos moleculares são
particularmente apropriados para pacientes HIV/Aids, pois não são interferidos pelo
status imunológico do paciente (PEREIRA-CHIOCCOLA et. al., 2009).
Em amostras de líquido céfalorraquidiano (LCR) tem sido observada uma
grande variação na sensibilidade da PCR (11,5-100%), no entanto, com alta
especificidade (96-100%) (CINGOLANI et. al., 1996; CINQUE et. al., 1996; GIANOTTI
et. al., 1997; JOSEPH et. al., 2002; VIDAL et. al., 2004). É importante ressaltar que a
coleta de líquor pode ser inapropriada em alguns casos, principalmente nos pacientes
que apresentam lesões cerebrais expansivas (CINGOLANI et. a., 1998; COHEN et.
al., 1999; PEREIRA-CHIOCCOLA et. al., 2009). Em adição, amostras de sangue
também vem sendo avaliadas quanto à sua eficiência na técnica de PCR. Estudos
observaram variação na sensibilidade entre 16-86% (PRIYIA et. al., 2002; BASTIEN,
2002; COLOMBO et. al., 2005).
Essa variação quanto à sensibilidade da PCR se deve a diversos fatores
relevantes, tais como: escolha dos primers, processamento e armazenamento das
amostras, padronização da extração de DNA, além do tempo decorrido entre o início
do tratamento específico e a coleta da amostra clínica, a qual deve ser realizada antes
ou até os três primeiros dias após a introdução do tratamento anti-toxoplásmico
(CINGOLANE et. al., 1996; GIANOTTI et. al., 1997; BRETAGNE, 2003; VIDAL et. al.,
2004)
1.2.3 Epidemiologia da toxoplasmose em pacientes HIV
A prevalência da toxoplasmose cerebral nestes pacientes está diretamente
associada à prevalência da infecção por T. gondii na respectiva população. Na
Noruega, a sorologia para T. gondii foi estudada em 698 pacientes HIV positivos,
sendo encontrada positividade para 17,8% (DUNLOP et. al., 1996). Por outro lado, no
Uruguai, foi observada soroprevalência de 69,1% em 492 pacientes HIV (DURAN et.
al., 1997). No Japão, Naito et al. (2007) realizaram estudo com 56 pacientes HIV
positivos. A média da contagem dos linfócitos T CD4+ entre os pacientes foi de 371
céls/mm³; anticorpos específicos para T. gondii foram detectados em apenas três
32
pacientes (5,4%). Segundo os autores, a baixa prevalência encontrada poderia estar
relacionada a um menor risco de infecção pelo protozoário, em função dos hábitos
alimentares e das boas condições sanitárias do país (NAITO et. al., 2007).
Com relação à neurotoxoplasmose, na Índia, um estudo avaliou 89 portadores
de HIV/Aids (82 homens e 7 mulheres), dos quais 67,8% apresentaram anticorpos IgG
anti-T. gondii. Destes, 43,4% desenvolveram neurotoxoplamose. A média de linfócitos
TCD4+ encontrada foi de 283,6 céls/mm³. Segundo os autores, o risco de desenvolver
neurotoxoplasmose parece ainda ser elevado mesmo em moderada imunodeficiência
(MEISHERI; MEHTA; PATEL,1997). Por outro lado, na Noruega, 238 pacientes com
Aids foram avaliados, dos quais 19 (8%) desenvolveram toxoplasmose cerebral. No
momento do diagnóstico, a média de células TCD4+ era de 75 céls/mm³ (DUNLOP et.
al., 1996).
No Brasil, alguns estudos epidemiológicos observaram alta prevalência de
anticorpos anti-T.gondii em imunossuprimidos, onde destacam-se o Rio Grande do
Sul (80%) e Bahia (77,3%) (XAVIER et al., 2013; NUNES et al., 2004). Apesar dos
avanços obtidos em consequência do tratamento antirretroviral, a queda da incidência,
no Brasil, foi inferior aos países desenvolvidos, de modo que a toxoplasmose cerebral
consiste em uma doença indicadora de infecção por HIV em 35% dos pacientes e
definidora de Aids em 75% dos casos (VIDAL et. al., 2005).
No Rio Grande do Sul, dos 80% dos pacientes HIV com sorologia positiva para
toxoplasmose, 4,8% e 1,6% apresentaram toxoplasmose cerebral e ocular,
respectivamente (XAVIER et al. 2013). No estado da Bahia, foram avaliadas 82
mulheres atendidas no Serviço de Ambulatório Especializado do Hospital Couto Maia.
Destas pacientes, 48 (58,5%) eram portadoras do HIV e 34 (41,5%) tinham Aids. Das
82 mulheres, 46 (55,4%) apresentaram episódios de infecções oportunistas, onde a
neurotoxoplasmose afetou 12,2%, sendo a segunda infecção oportunista mais
frequente ao longo do acompanhamento, superada apenas por monilíase oral (37,8%)
(NUNES et al., 2004). No Rio de Janeiro, foram necropsiados 154 pacientes com Aids,
no Hospital Universitário Antônio Pedro, no período de 1984 a 1990. A
neurotoxoplasmose foi a manifestação neurológica mais frequente (38,9%) (CAMARA
et al., 2003).
33
2 JUSTIFICATIVA
As infecções oportunistas são as principais causas de morbidade e mortalidade
entre os pacientes acometidos pelo HIV. A literatura mostra que a toxoplasmose é
uma das principais infecções oportunistas que aflige os pacientes portadores de
HIV/Aids. Diante da importância da toxoplasmose, as organizações de saúde pública,
como a Organização Mundial de Saúde, recomendam o levantamento de dados
epidemiológicos referentes à infecção pelo Toxoplasma gondii, principalmente, em
relação ao impacto para a saúde humana como doença oportunista. No Brasil, alguns
estudos epidemiológicos observaram alta prevalência de anticorpos anti-T.gondii em
imunossuprimidos. Desse modo, é de grande importância a determinação sorológica
quanto à toxoplasmose em pacientes HIV/Aids, para que seja determinada a
população em risco para o desenvolvimento de neurotoxoplasmose, uma vez que
mais de 95% dos casos ocorrem devido à reativação da infecção latente. Além disso,
sabendo que a toxoplasmose cerebral consiste na lesão cerebral focal predominante
em pacientes soropositivos para HIV no Brasil, torna-se pertinente a avaliação deste
aspecto clínico no presente estudo, pois a investigação de complicações neurológicas
é crucial em indivíduos infectados pelo HIV, já que diagnóstico e tratamento eficazes
podem proporcionar uma melhor qualidade de vida ao paciente ou até mesmo maior
sobrevida. Portanto, considerando que dados referentes a esta abordagem são
escassos no Rio Grande do Norte, a realização deste estudo é bastante relevante,
visto que a triagem inicial dos fatores de risco, bem como da sororreatividade e perfil
clínico da toxoplasmose em pacientes vivendo com HIV/Aids pode contribuir na
implementação de estratégias em saúde pública, com a finalidade de prevenir a
morbidade associada a essa doença, nesses pacientes. Além disso, trata-se de um
estudo pioneiro em nosso estado, possibilitando o desenvolvimento de pesquisas
subsequentes.
34
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL.
Realizar diagnóstico, determinar fatores de risco e avaliar perfil clínico de pacientes
HIV/Aids co-infectados com Toxoplasma gondii em Natal, Rio Grande do Norte.
3.2 OBJETIVOS ESPECíFICOS.
Realizar diagnóstico para a toxoplasmose em pacientes HIV/Aids provenientes
do Serviço de Atendimento Especializado em DST/Aids (SAE) do Hospital
Giselda Trigueiro (HGT), bem como estimar a fase da infecção.
Verificar a associação entre fatores socioeconômicos e biológicos e a
toxoplasmose em pacientes HIV/Aids provenientes do HGT.
Caracterizar perfil clínico dos pacientes e sua relação com a sorologia para T.
gondii, além de investigar diagnóstico prévio para neurotoxoplasmose.
Avaliar prevalência anual da neurotoxoplasmose em pacientes HIV internados
no Hospital Giselda Trigueiro de 2011 a 2015.
Realizar estudo de validação do marcador GRA7 para diagnóstico molecular
da neurotoxoplasmose.
35
4 METODOLOGIA
4.1 DESENHO DO ESTUDO E POPULAÇÃO ALVO.
Foi realizado um estudo transversal, no qual a população avaliada consistiu em
179 pacientes portadores do vírus HIV provenientes do Serviço de Atendimento
Especializado em DST/Aids (SAE) do Hospital Giselda Trigueiro (HGT), que por sua
vez é o hospital de referência no tratamento de doenças infecciosas no estado do Rio
Grande do Norte. Além disso, 11 pacientes HIV/Aids internados nos mistos I e II do
HGT, com diagnóstico presuntivo ou confirmado de neurotoxoplasmose (NTX),
também foram inseridos na pesquisa. Os pacientes voluntários que aceitaram
participar do estudo assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido. Este
trabalho foi aprovado conforme o Comitê de Ética em Pesquisa com seres humanos
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte com o CAAE:
39633714.0.0000.5537 (anexo B).
4.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
FIGURA 2. Delineamento experimental para os pacientes HIV/Aids acompanhados no
ambulatório (SAE) do HGT, Natal, RN, 2015 – 2016.
36
FIGURA 3. Delineamento experimental para os pacientes HIV/Aids internados no HGT
com diagnóstico presuntivo ou confirmado de neurotoxoplasmose, Natal, RN, 2015 –
2016.
4.3 CÁLCULO AMOSTRAL
O número amostral foi calculado utilizando uma fórmula para Amostra aleatória
simples sem reposição, segundo LOHR (1999). Para isso, foi realizado um estudo
piloto por meio de 53 amostras, obtendo-se 0,87 (87%) referente à proporção de
indivíduos HIV acometidos pela toxoplasmose na amostra piloto. Além disso, o
tamanho da população avaliada consistiu em 3000 pacientes HIV/Aids acompanhados
no SAE do HGT, no momento em que foi realizada a pesquisa (abril de 2015 a janeiro
de 2016). Nível de confiança 95% e erro 5%.
n = z²α/2
S² = n0
e² + z²α/2
S² 1+ n0
N N
Em que:
N = Tamanho da população (3000)
S² = Variância, calculada a partir de p (1 – p), sendo p igual a 0,87
37
n0 = Tamanho da amostra piloto
e² = erro (0,05)
α = Nível de significância (0,05)
Para a aplicação desta fórmula, foi utilizada a versão que considera z²α/2
S²
N
negligenciável (igual a 0). Finalmente, verificou-se que o tamanho mínimo da amostra
necessária para esse estudo é de 165 pacientes.
4.4 COLETA DAS AMOSTRAS DE SANGUE
De cada paciente, foi coletado 5mL de sangue por meio de punção venosa,
usando um tubo do tipo vacutainer® sem anticoagulante e, em alguns casos, foi
coletado mais um tubo com anticoagulante (EDTA). Após a coleta, as amostras foram
encaminhadas para o Laboratório de Biologia da Malária e Toxoplasmose, onde foram
processadas para a obtenção do soro. Após centrifugação, o soro foi aliquotado e
armazenado em eppendorfs a -20°C até a realização do ensaio imunoenzimático.
Para as amostras coletadas com anticoagulante, após o processamento, o anel
leucocitário foi submetido à extração de DNA.
4.5 ANÁLISE SOROLÓGICA
Os soros foram testados através da técnica de ELISA (Ensaio
Imunoenzimático). Para todas as análises sorológicas, foi utilizado antígeno solúvel
total de Toxoplasma gondii (STAg), previamente preparados pelo Laboratório de
Toxoplasmose do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas
Gerais, conforme protocolo descrito por Buery e colaboradores (2014), e
encaminhados ao nosso laboratório.
38
4.5.1 ELISA para detecção de anticorpos IgG anti-T. gondii
A técnica ELISA para detecção de anticorpo IgG anti-T. gondii foi realizada in
house (BUERY et. al., 2014), e tinha a finalidade de realizar o diagnóstico da
toxoplasmose em pacientes HIV/Aids. Foram utilizadas placas de poliestireno de 96
poços com fundo chato, as quais foram sensibilizadas com 100μL do antígeno (STAg),
que por sua vez foi adicionado em cada poço na concentração de 5μg/ml diluído em
tampão carbonato/bicarbonato (pH 9,6). A placa foi incubada overnight a 4°C. No dia
seguinte, a solução contendo o antígeno foi desprezada, e posteriormente a placa foi
lavada duas vezes com solução salina contendo Tween 20 a 0,05% (SST). Após o
processo de secagem da placa (por inversão utilizando papel de filtro absorvente),
100 μL de uma solução contendo PBS/Caseína 2% foi adicionado em cada poço,
correspondendo à etapa de bloqueio do teste, em seguida a placa foi incubada durante
30 minutos a 37ºC. Após a incubação, a solução de bloqueio foi desprezada e a placa
foi lavada duas vezes com SST seguido do processo de secagem. Posteriormente, foi
adicionado em cada poço da placa 100 μL do soro, o qual foi previamente diluído em
PBS-T/Caseína 0,25% (Tween 20 a 0,05% em PBS pH 7,2) na proporção de 1:100,
no dia anterior. Os soros foram analisados em duplicada, de modo que em cada placa
foram utilizadas duas amostras como controles positivos, e seis amostras como
controles negativos. Após a distribuição das amostras na placa, esta foi novamente
incubada por 45 minutos a 37°C. Os soros foram desprezados e a placa foi lavada
quatro vezes com SST. Em cada poço foram adicionados 100μL do conjugado
humano anti-IgG marcado com a enzima peroxidase (Sigma – Aldrich: human anti IgG
– A6029), este foi previamente diluído em PBS / Caseína 0,25% / Tween 20 a 0,05%
na proporção 1:5000. Em seguida, a placa foi incubada por 45 minutos a 37°C. Após
a incubação, as placas foram lavadas quatro vezes com SST. Foi preparada uma
solução substrato composta por 3μg de σ-phenylinediamine (Sigma), 15 mL de
solução de ácido cítrico e 3μL de H2O2. Em seguida, 100μL dessa solução substrato
foi adicionada em cada poço da placa. Após 20 minutos, a reação foi interrompida
através da adição de 25μL de H2SO4 (4N) em cada poço. A leitura foi realizada em
espectrofotômetro com filtro de 490nm. Cada ensaio teve seu respectivo ponto de
corte (cut off), o qual é calculado pela média das absorbâncias das seis amostras de
soro negativo para T. gondii (controle negativo) mais três vezes o desvio-padrão. A
39
média da absorbância dos soros testados em duplicata foi dividida pelo valor do cut
off da placa para determinar o índice de reatividade (IR) de cada amostra testada. Os
soros que apresentaram os valores de IR > 1,1 foram considerados positivos. Aqueles
que apresentaram um valor indeterminado, ou seja, com o valor de IR entre 0,9 e 1,1
foram testados novamente para confirmação do resultado. E aqueles que
apresentaram um valor < 0,9 foram considerados negativos.
Para avaliar a reprodutibilidade do ELISA-IgG, 10% do total de amostras
analisadas neste estudo foram selecionadas aleatoriamente, e avaliadas em duplicata
para a determinação do índice de Kappa, sendo classificado segundo Landis e Koch
(1977), e admitindo-se intervalo de confiança de 0,95.
4.5.2 ELISA para avaliação da avidez de anticorpos IgG anti-T. gondii
A avaliação da avidez de anticorpos IgG anti-T. gondii foi realizada com a
finalidade de diferenciar as infecções recentes e crônicas. Este ensaio sorológico
considerou apenas as amostras IgG positivas, e seguiu o protocolo descrito por
Colombo (2005), utilizando a ureia (6M) como agente dissociante da ligação antígeno-
anticorpo.
Este ensaio foi realizado simultaneamente ao ELISA-IgG convencional
(descrito no item anterior), porém divergindo em algumas etapas. A primeira etapa
diferenciada consistiu na distribuição dos soros na placa, os quais foram organizados
em duas séries duplicadas, de modo que a metade da placa (colunas 1 a 6 para ELISA
convencional) foi uma réplica da outra metade (colunas 7 a 12 para ELISA avidez).
Além disso, outro processo adicionado consistiu nas quatro etapas seguintes à
incubação da placa (45 minutos a 37°C) contendo as amostras de soros. Os soros
foram desprezados e a placa foi submetida à quatro lavagens. A primeira lavagem foi
realizada em todos os poços utilizando SST. Na segunda lavagem foram utilizadas
duas soluções, uma composta por PBS-T/Caseína 0,25% que foi adicionada às
colunas de 1 a 6 (100μL/poço) para o ELISA convencional, e outra composta por uréia
6M (em PBS-T/Caseína 0,25%) que foi adicionada às colunas de 7 a 12 (100μL/poço)
para a avaliação de avidez. Nas últimas duas lavagens, em todos os poços foi
adicionada a solução PBST/ Caseína 0,25%. Todas as quatro lavagens dessa etapa
40
ocorreram sob agitação (300rpm) por 5 minutos. Após estes procedimentos, o
conjugado humano anti-IgG marcado com peroxidase foi adicionado, conforme
descrito no item anterior para o teste de ELISA convencional. Do mesmo modo
ocorreu para as etapas subsequentes.
A avidez do anticorpo IgG foi calculada como a razão entre a absorbância
média obtida para cada soro nos poços tratados com uréia (AU) pela absorbância
média dos poços não tratados (A) expressos em porcentagem: AU/A X 100 (COZON
et al. 1998). Segundo Buery e colaboradores (2014), valores de avidez ≥ 50% indicam
toxoplasmose crônica, enquanto valores < 50% indicam infecção recente. Outros
autores também têm utilizado este ponto de corte (50%) na interpretação da avidez
de anticorpos IgG (HOLLIMAN 1994; ROBERT-GANGNEUX 1998; MECHAIN et al.
2000; COLOMBO et al. 2005; MONTOYA 2002; MATTOS et al. 2011).
4.5.3 ELISA para detecção de anticorpos IgM anti-T. gondii
A técnica de ELISA para a pesquisa de anticorpos IgM anti-T. gondii foi
realizada com a finalidade de identificar a fase aguda da infecção. Para isso, foram
excluídas amostras que apresentaram resultado positivo para IgG anti-T.gondii
associado à alta avidez desses anticorpos (indicativo de fase crônica da infecção). A
técnica foi padronizada, anteriormente, por nosso grupo de pesquisa (ALOISE, 2016),
o qual se baseou no estudo de Vasconcelos-Santos e colaboradores (2009).
O ELISA-IgM foi realizado de forma semelhante ao ELISA-IgG (descrito no item
4.5.1), exceto pelo uso do conjugado anti-IgM humano marcado com peroxidase
(Sigma – Aldrich: human anti IgM – A6907), o qual foi diluído na proporção de 1:500
em PBS / Caseína 0,25% / Tween 20 a 0,05%. Outra modificação consistiu na diluição
das amostras de soro, que pro sua vez foram diluídas na proporção de 1:50. Foram
utilizadas duas amostras como controles positivos, e seis amostras como controles
negativos. De modo semelhante ao ELISA-IgG, o ponto de corte (cut off) foi calculado
pela média das absorbâncias das seis amostras de soro negativo para T. gondii
(controle negativo) mais três vezes o desvio-padrão. A média da absorbância dos
soros testados em duplicata foi dividida pelo valor do cut off da placa para determinar
o índice de reatividade (IR) de cada amostra testada. Os soros que apresentaram os
41
valores de IR > 1,1 foram considerados positivos. Aqueles que apresentaram um valor
indeterminado, ou seja, com o valor de IR entre 0,9 e 1,1 foram testados novamente
para confirmação do resultado. E aqueles que apresentaram um valor < 0,9 foram
considerados negativos.
4.6 ANÁLISE EPIDEMIOLÓGICA
Os pacientes foram submetidos a um questionário (anexo C) socioeconômico
e biológico (estruturado e validado). Este questionário abordou dados
socioeconômicos e gerais categorizados da seguinte forma: Gênero (feminino;
masculino); Idade (≥18 e <30; ≥30 e <45; ≥45 e ≥60); Grau de escolaridade
(analfabeto; até 4° sério ensino fundamental; até 8° série ensino fundamental; 2° grau
incompleto; 2° grau completo; 3° grau incompleto ou completo); Profissão
(agricultor/jardineiro; autônomo; cozinheiro/açougueiro; empregado de empresa
privada; profissional da saúde; pedreiro/serviços gerais; dona de casa;
doméstica/cuidador; aposentado ou pensionista; professor; estudante; funcionário
público; não tem; não respondeu) e renda familiar (abaixo de 1 salário mínimo; entre
1 e 2 salários; entre 2 e 3 salários; acima de 3 salários; não respondeu); Já ouviu
sobre toxoplasmose (sim; não; não lembra); Recebeu orientação sobre prevenção da
toxoplasmose (sim; não; não lembra).
As questões associadas aos fatores de risco relacionados à transmissão da
toxoplasmose foram categorizadas da seguinte maneira: Come salada crua (sim;
não); Come salada crua fora de casa (sim; não; não come salada crua); Lava as mãos
antes da refeição (sim; não ou as vezes); Manipula/Manipulou terra (não; sim); Água
que bebe (mineral; filtrada ou fervida; não tratada); Bebe/Bebeu água de poço (não;
sim; não sabe); Bebe/Bebeu água de rio (não; sim; não sabe); Bebe/Bebeu água de
caminhão pipa (não; sim; não sabe); Bebe/Bebeu água de açude (não; sim; não sabe);
Tem/Teve gato (não; sim); Onde o gato fica/ ficava (dentro de casa; dentro e fora de
casa; não lembra; não tem gato); O gato dorme/dormia na cama (não; sim; não tem
gato); O gato dorme/dormia na cadeira/sofá (não; sim; não tem gato); Você
brinca/brincava com o gato (não; sim; não tem gato); As fezes do gato eram/são
recolhidas (com luvas; sem luvas; não se aplica); Há gatos na vizinhança (não; sim);
42
Gatos da vizinhança entram na casa (não; sim; não se aplica); Tem cachorro (não;
sim); Costuma comer carne crua/mal passada (não; sim; não lembra); Costuma comer
carne bovina crua/mal passada (não; sim; não come carne crua/mal passada);
Costuma comer carne suína crua/mal passada (não; sim; não come carne crua/mal
passada); Costuma comer carne de bode crua/mal passada (não; sim; não come
carne crua/mal passada); Costuma comer carne de frango crua/mal passada (não;
sim; não come carne crua/mal passada).
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Inicialmente, foi utilizado o programa Epidata (versão 3.1) para gerar um banco
de dados com base nas informações obtidas nos questionários e nos resultados
sorológicos. Para análise estatística dos dados foi utilizado o programa STATA versão
10.0. A análise estatística ocorreu nas seguintes etapas:
Determinação da prevalência da infecção por T. gondii.
Análise descritiva das variáveis coletadas no questionário.
Análise univariada: comparações de frequências entre infectados e não
infectados, utilizando-se o teste do qui-quadrado. O efeito de covariáveis em relação
à infecção por T. gondii foi realizada através de regressão logística. A medida de
associação utilizada foi a Odds Relativa (OR) e intervalo de confiança 95%. A
regressão logística foi realizada utilizando-se a função “xtmelogit” do STATA.
Análise multivariada: as variáveis cuja análise univariada apresentaram
nível de significância p < 0,25 foram selecionadas para regressão logística
multivariada. Partiu-se do modelo completo, com descarte sucessivo das variáveis
não significativas, até obtenção do modelo final. Permaneceram no modelo final
somente as variáveis com nível de significância p < 0,05
43
4.8 AVALIAÇÃO DE PRONTUÁRIOS MÉDICOS
Para a avaliação do perfil clínico dos pacientes HIV/Aids, foi realizada a busca
de dados clínicos desses pacientes, conforme orientações da médica Mônica Bay,
infectologista no HGT. Esta busca se deu através do acesso ao prontuário médico de
cada paciente. A partir desta análise, foram observados os seguintes parâmetros:
contagem mais recente de linfócitos TCD4 + e TCD8+, relação CD4/CD8, carga viral
do HIV, uso de terapia antirretroviral, diagnóstico prévio quanto à sorologia para
toxoplasmose. Além disso, foi observado a ocorrência de neurotoxoplasmose e
toxoplasmose ocular na população alvo do estudo. Para os pacientes HIV/Aids
internados com suspeita ou confirmação de toxoplasmose cerebral, foram observadas
informações referentes à lesão cerebral presentes em exames de imagem.
Além disso, a partir da análise dos livros de internamentos, disponibilizados
pelo HGT, foi realizada busca retrospectiva para prevalência anual da
neurotoxoplasmose em pacientes HIV internados no Hospital Giselda Trigueiro de
2011 a 2015.
4.9 ANÁLISE MOLECULAR
A análise molecular foi realizada nas 11 amostras de pacientes HIV/Aids
internados com suspeita ou confirmação de neurotoxoplasmose, com a finalidade de
desenvolver um diagnóstico molecular para a toxoplasmose cerebral, utilizando
sangue periférico.
4.9.1 Extração de DNA
O DNA foi extraído a partir de amostras de sangue periférico, especificamente
do anel leucocitário, utilizando o Kit Qiagen®, QIAamp DNA Mini Kit 250 (Cat. Nº.
44
51306) e seguindo as instruções do fabricante. A extração foi realizada no mesmo dia
da coleta e o DNA foi armazenado a -20ºC até o momento da análise molecular. Foram
extraídos DNA a partir das 11 amostras de pacientes HIV/Aids internados no HGT
com suspeita ou confirmação de neurotoxoplasmose.
4.9.2 Nested-PCR
O gene GRA7 foi utilizado como marcador nesse estudo, este foi descrito
recentemente como excelente marcador, principalmente em regiões onde há uma
grande diversidade de genótipos para T. gondii (COSTA et. al., 2016). O DNA de T.
gondii foi detectado por meio da amplificação de um fragmento de 322pb e 222pb na
primeira e segunda etapa do Nested-PCR, respectivamente. Para isso, foram
utilizados os primers GRA7FE e GRA7RE na primeira etapa, e os primers GRA7FI e
GRA7RI na segunda etapa, conforme descrito por Costa e colaboradores (2016). As
duas etapas do Nested-PCR foram realizadas em reações de 20µL contendo 0,25µM
de cada primer, 1,5 mM de MgCl2, 0,01U Taq DNA pol (Ludwig), 0,2mM de cada dNTP
e 1,5µL da amostra de DNA. Para controle negativo foi utilizado DNA extraído a partir
de sangue humano cujo resultado sorológico foi negativo para IgG e IgM. Para
controle positivo foi utilizado DNA extraído da cepa CK3 do T. gondii, que por sua vez
foi obtida diretamente de macerado cerebral de camundongos Swiss previamente
infectados, tendo sido isolada em estudo realizado anteriormente por nosso grupo de
pesquisa (CLEMENTINO-ANDRADE et. al., 2013).
A primeira e segunda etapa do Nested-PCR ocorreram em termociclador
(TECHNE TC-512), nas mesmas condições, as quais consistiram em 30 ciclos
repetitivos com os seguintes parâmetros: desnaturação inicial (94°C por 2 minutos),
desnaturação (94°C por 40 segundos), anelamento (59°C por 40 segundos), extensão
(63°C por 40 segundos) e extensão final (63°C por 3 minutos).
45
4.9.3 Eletroforese em gel de agarose
O gel de agarose foi preparado a 2%, utilizando 2 g de agarose diluído em 100
mL de TAE 1x, que posteriormente foi aquecido em microondas durante dois minutos.
Após a polimerização do gel, 8 µL do amplicon foi misturado a 2 µL de solução tampão
(6X DNA Loading Dye - Thermo Scientific) e 2 µL de gel red (Invitrogen), este último
usado como corante. Foi utilizado como padrão, 5 µL do marcador de peso molecular
(1kb ladder - Ludwig), o qual foi acrescido de 2 µL de gel red. Finalmente, as amostras
foram pipetadas nas canaletas do gel em cuba eletroforética (APELEX PS 305) e
submetidas à uma diferença de potencial elétrico.
.
46
5 RESULTADOS
5.1 ANÁLISE EPIDEMIOLÓGICA DOS PACIENTES HIV/Aids DO SAE.
5.1.1 Características dos pacientes
A amostra do presente estudo constituiu 179 pacientes portadores de HIV/Aids
acompanhados no Serviço de Atendimento Especializado (SAE) do Hospital Giselda
Trigueiro (HGT). Por ser um hospital de referência em doenças infecciosas no estado
do Rio Grande do Norte, este estudo abrangeu pacientes provenientes de diversas
cidades do estado, mas principalmente da capital, Natal, e das cidades litorâneas
(Figura 2).
Em relação aos 179 pacientes acompanhados no SAE, observou-se que 46,4%
eram do sexo feminino, e 53,6% eram do sexo masculino. Os voluntários
apresentaram idade entre 18 e 71 anos. O grau de escolaridade foi dividido em
categorias, das quais na categoria “analfabeto” foi observada maior frequência
(27,9%). As atividades profissionais dos pacientes foram diversificadas, com maior
frequência para as categorias “autônomo” (19,6%), “dona de casa” (12,8%) e
“empregado de empresa privada” (12,8%). Apenas 3,3% trabalhavam diretamente
com manipulação de solo (Tabela 1). A renda familiar dos pacientes concentrou-se na
categoria “abaixo de 1 salário mínimo” (30,2%) seguida da categoria “entre 1 e 2
salários mínimos” (24,6%), além disso, 25,7% dos entrevistados não souberam ou não
responderam sobre sua renda familiar. Além disso, 49,2% dos pacientes nunca
ouviram informações sobre a toxoplasmose, e 87,2% declararam nunca ter recebido
orientações a respeito da prevenção para esta doença.
47
FIGURA 4. Distribuição geográfica dos 179 pacientes HIV/Aids participantes da
pesquisa, Natal, RN, 2015-2016.
48
TABELA 1 – Características gerais dos pacientes HIV/Aids do Hospital Giselda
Trigueiro, Natal, RN, 2015-2016.
Características dos Pacientes N = 179 %
Gênero Feminino 83 46,4 Masculino 96 53,6 Idade (anos) ≥ 18 e < 30 ≥30 e < 45 ≥45 e < 60
21 74 74
11,8 41,3 41,3
≥60 Grau de escolaridade
10 5,6
Analfabeto Até a 4° série Fundamental Até a 8° série Fundamental 2° grau incompleto 2° grau completo 3° grau (incompleto ou completo) Profissão Agricultor/ Jardineiro Autônomo Cozinheiro/ Açougueiro Empregado de empresa privada Profissional da saúde Pedreiro/ Serviços gerais Dona de casa Doméstica/ Cuidador Aposentado ou pensionista Professor Estudante Funcionário Público Não tem Não respondeu Renda familiar Abaixo de 1 salário Entre 1 e 2 salários Entre 2 e 3 salários Acima de 3 salários Não sabe/ Não respondeu Já ouviu sobre toxoplasmose Sim Não Não lembra Recebeu orientação sobre prevenção da toxoplasmose Sim Não Não lembra
50 39 18 11 45 16
6
35 7
23 5 8
23 15 13 6 2 6
27 3
54 44 16 19 46
89 88 2
18 156
5
27,9 21,8 10,1 6,2
25,1 8,9
3,3
19,6 4,0
12,8 2,8 4,5
12,8 8,4 7,3 3,3 1,1 3,3
15,1 1,7
30,2 24,6 8,9
10,6 25,7
49,7 49,2 1,1
10,0 87,2 2,8
49
5.1. 2 Variáveis relacionadas à infecção por oocistos.
A ingestão de salada crua foi relatada por 93,8% dos pacientes, dos quais
69,8% comiam salada crua fora de casa. Foi observado que 82,1% relataram lavar as
mãos antes das refeições (Tabela 2). Em relação à manipulação do solo, 65,4%
relataram ter realizado esta atividade em algum momento de sua vida, onde a maioria
(61,5%) não utilizava luvas para manipular a terra (Tabela 2). Considerando a fonte
de água para o consumo, foi observado maior frequência (63,7%) entre os pacientes
que consumiam água mineral. Por outro lado, no passado, 79,3% haviam consumido
água de poço, 43,0% água de rio, 31,3% água de caminhão pipa e 47,0% água de
açude (Tabela 2).
A maioria dos pacientes (64,2%) tem ou já tiveram gatos em sua residência
(Tabela 3). Destes, 49,7% relataram que os gatos ficavam dentro e fora da casa, e
41,3% dormiam em cadeiras ou sofás. Além disso, foi observado que a maioria dos
gatos defecava na rua (38,0%), e daqueles que defecavam em áreas da residência,
apenas 5,6% dos pacientes declararam utilizar luvas para a limpeza. Sobre a
observação de gatos em região peridomiciliar, a maior parte dos pacientes relataram
a presença de gatos na vizinhança (84,9%), dos quais 52,0% informaram que esses
animais entravam em suas casas (Tabela 3).
50
TABELA 2- Aspectos comportamentais relacionados à ingestão de oocisto pelos
pacientes HIV/Aids do Hospital Giselda Trigueiro, Natal, RN, 2015 – 2016.
Características dos Pacientes N = 179 %
Come salada crua Não 11 6,2 Sim 168 93,8 Come salada crua fora de casa Não Sim Não come salada crua
43 125 11
24,0 69,8 6,2
Lava as mãos antes da refeição Sim Não ou as vezes Manipula/Manipulou terra Não Sim Como manipula/manipulava a terra Com luvas Sem luvas Não se aplica Água que bebe Mineral Filtrada ou fervida Não tratada (Torneira) Bebe/Bebeu água de poço Não Sim Não sabe Bebe/bebeu água de rio Não Sim Não sabe Bebe/Bebeu água de caminhão pipa Não Sim Não sabe Bebe/Bebeu água de açude Não Sim Não sabe
147 32
62
117
7 110 62
114 21 44
37
142 0
100 77 2
117 56 6
94 84 1
82,1 17,9
34,6 65,4
3,9
61,5 34,6
63,7 11,7 24,6
20,7 79,3
0
55,9 43,0 1,1
65,4 31,3 3,3
52,5 47,0 0,5
51
TABELA 3- Aspectos comportamentais de pacientes HIV/Aids do Hospital Giselda
Trigueiro em relação a gatos, Natal, RN, 2015 – 2016.
Características dos Pacientes N = 179 %
Tem/Teve gato Não 64 35,8 Sim 115 64,2 Onde o gato fica/ficava Dentro de casa Dentro e fora de casa Não lembra Não tem gato
24 89 2
64
13,4 49,7 1,1
35,8 O gato dorme/dormia na cama
Não Sim Não tem gato O gato dorme/dormia na cadeira/sofá Não Sim Não tem gato Você brinca/brincava com o gato Não Sim Não tem gato As fezes do gato são/eram recolhidas Com luvas Sem luvas Não se aplica O gato defeca/defecava na rua Não Sim Não se aplica Há gatos na vizinhança Não Sim Gatos da vizinhança entram na casa Não Sim Não se aplica Tem cachorro Não Sim
86 29 64
41 74 64
36 79 64
10 38
131
47 68 64
27
152
60 92 27
87 92
48,0 16,2 35,8
22,9 41,3 35,8
20,1 44,1 35,8
5,6
21,2 73,2
26,2 38,0 35,8
15,1 84,9
33,5 52,0 14,5
48,6 51,4
52
5.1.3 Variáveis relacionadas à infecção por cistos.
A ingestão de carne crua ou malcozida foi declarada por 33,5% dos pacientes,
de modo que o consumo de carne bovina malcozida foi relatado por todos os pacientes
que possuíam esse hábito alimentar, sendo o mais frequente (33,9%), seguido da
carne de frangos (13,6%), caprinos (9,6%) e suínos (6,8%), respectivamente. (Tabela
4).
TABELA 4 – Aspectos comportamentais com relação à ingestão de cistos de T.
gondii pelos pacientes HIV/Aids do Hospital Giselda Trigueiro, 2015-2016.
Características dos Pacientes N = 179 %
Costuma comer carne crua/mal passada Não 117 65,4 Sim Não lembra
60 2
33,5 1,1
Costuma comer carne bovina crua/mal passada
Não Sim Não come carne crua/mal passada
0 60
117
0 33,9 66,1
Costuma comer carne suína crua/mal passada
Não Sim Não come carne crua/mal passada Costuma comer carne de bode ou carneiro crua/mal passada Não Sim Não come carne crua/mal passada Costuma comer carne de frango crua/mal passada Não Sim Não come carne crua/mal passada
48 12
117
43 17
117
36 24
117
27,1 6,8
66,1
24,3 9,6
66,1
20,3 13,6 66,1
5.1.4 Sorologia da toxoplasmose em pacientes HIV/Aids do SAE
A partir da análise de 179 amostras de soro por ELISA-IgG, foi observada
soroprevalência da infecção por T. gondii em 83,8% (150/179) dos pacientes HIV/Aids
acompanhados no SAE do HGT. Os índices de reatividade (IR) para o ELISA-IgG
53
variaram entre 0,36 – 11,71. A reprodutibilidade do ELISA-IgG foi avaliada em ensaio
mascarado utilizando 10% do total de amostras por meio da determinação do índice
de kappa que, por sua vez, foi igual a 1, correspondendo a 100% de concordância e,
portanto, indicando ótima reprodutibilidade. Dentre as amostras positivas para IgG
anti-T.gondii, todas apresentaram avidez superior a 50% (entre 60,8% e 100%),
sugerindo que esses pacientes se encontram na fase crônica da infecção por T. gondii.
As amostras negativas (29/179) para anticorpos IgG foram avaliadas quanto à
presença de anticorpos IgM anti-T. gondii. Os valores do IR variaram entre 0,38 e
2,07. Verificou-se positividade (IR > 1,1) em apenas 3 amostras, e resultado
inconclusivo (IR entre 0,9 e 1,1) em 4 amostras mesmo após repetição do teste.
5.1.5 Análise Univariada
5.1.5.1 Características dos pacientes.
Considerando as características gerais dos indivíduos, na análise univariada,
não foi observada diferença estatisticamente significativa em nenhuma das variáveis
avaliadas. As prevalências no sexo feminino e masculino foram semelhantes entre si,
sendo 84,34% e 83,33%, respectivamente (Tabela 5). Em relação ao grau de
escolaridade, a maior prevalência foi observada entre os pacientes que possuíam até
a 8° Série Fundamental (94,44%). Aqueles pacientes com renda entre 1 e 2 salários
mínimos apresentaram maiores proporções de positivos para toxoplasmose (93,18%)
(Tabela 5). Além disso, maior prevalência foi observada entre os indivíduos que nunca
ouviram informações sobre a toxoplasmose (86,36%) (Tabela 5).
54
TABELA 5 – Análise univariada das características dos pacientes HIV/Aids do
Hospital Giselda Trigueiro, Natal, RN, 2015-2016.
Características dos Pacientes (N=179) ELISA Positivo(%) Negativo(%)
Univariada OR (IC95%)
P
Gênero Feminino 70 (84,34) 13 (15,66) 1 Masculino 80 (83,33) 16 (16,67) 0,92 (0,4 – 2,0) 0,86 Idade (anos) ≥ 18 e < 30 ≥ 30 e < 45 ≥ 45 e < 60
20 (95,24) 01 (04,76) 61 (82,43) 13 (17,57) 60 (81,08) 14 (18,92)
1 0,2 (0,0 – 1,9) 0,2 (0,0 – 1,7)
0,18 0,15
≥ 60 Grau de escolaridade
09 (90,00) 01 (10,00) 0,5 (0,0 – 8,0) 0,59
Analfabeto Até a 4° série Fundamental Até a 8° série Fundamental 2° grau incompleto 2° grau completo 3° grau Profissão Agricultor/ Jardineiro Autônomo Cozinheiro/ Açougueiro Empregado de empresa privada Profissional da saúde Pedreiro/ Serviços gerais Dona de casa Doméstica/ Cuidador Aposentado ou pensionista Professor Estudante Funcionário Público Não tem Renda familiar Abaixo de 1 salário Entre 1 e 2 salários Entre 2 e 3 salários Acima de 3 salários Já ouviu sobre toxoplasmose Sim Não Recebeu orientação sobre prevenção da toxoplasmose Sim Não
43 (86,00) 07 (14,00) 30 (76,92) 09 (23,08) 17 (94,44) 01 (05,56) 09 (81,82) 02 (18,18) 38 (84,44) 07 (15,56) 13 (81,25) 03 (18,75) 05 (83,33) 01 (16,67) 29 (82,86) 06 (17,14) 05 (71,43) 02 (28,57) 19 (82,61) 04 (17,39) 04 (80,00) 01 (20,00) 06 (75,00) 02 (25,00) 21 (91,30) 02 (08,70) 14 (93,33) 01 (06,67) 11 (84,62) 02 (15,38) 04 (66,67) 02 (33,33) 02 (100,0) 0 (0,00) 06 (100,0) 0 (0,00) 21 (77,78) 06 (22,22) 41 (75,93) 13 (24,07) 41 (93,18) 03 (06,82) 14 (87,50) 02 (12,50) 15 (78,95) 04 (21,05) 72 (80,90) 17 (19,10) 76 (86,36) 12 (13,64) 15 (83,33) 03 (16,67) 130 (83,33) 26 (16,67)
1,4 (0,3 – 6,3) 0,8 (0,2 – 3,3)
3,9 (0,4 – 42,0) 1,0 (0,1 – 7,5) 1,3 (0,3 – 5,6)
1
1 1,0 (0,1 – 9,8) 0,5 (0,0 – 7,4)
1,0 (0,0 – 10,5) 0,8 (0,0 – 17,2) 0,6 (0,0 – 8,7)
2,1 (0,2 – 28,0) 2,8 (0,1 – 53,7) 1,1 (0,0 – 15,2) 0,4 (0,0 – 6,2)
- -
0,7 (0,0 – 7,2)
0,8 (0,2 – 3,0) 3,6 (0,7 – 18,2) 1,8 (0,3 – 11,8)
1
1 1,5 (0,6 – 3,3)
1 1 (0,3 – 3,7)
0,77 0,97 0,26 0,73 0,65
0,98 0,62 0,97 0,89 0,71 0,58 0,50 0,94 0,51
- -
0,76
0,78 0,11 0,5
0,33
1,00
55
5.1.5.2 Aspectos relacionados a oocistos de T. gondii.
Considerando os aspectos comportamentais relacionados à ingestão de
oocisto pelos pacientes, observou-se maior prevalência entre os pacientes que
relataram comer salada crua (84,52%). Além disso, foi constatado que os indivíduos
que comem salada crua fora de casa possuem maior risco de adquirir a infecção,
apresentando prevalência de 88,0%, e sendo estatisticamente significativa na análise
univariada (Tabela 6). Verificou-se ainda que os pacientes que não possuem o hábito
de lavar as mãos antes das refeições apresentaram maior soropositividade para
toxoplasmose (90,60%), apesar desses dados não serem significativos nesta análise.
56
TABELA 6 – Análise univariada dos aspectos comportamentais relacionados à
ingestão de oocisto pelos pacientes HIV/Aids do Hospital Giselda Trigueiro, 2015 –
2016.
Características dos Pacientes (N=179) ELISA Positivo(%) Negativo(%)
Univariada OR (IC95%)
P
Come salada crua Não 08 (72,73) 03 (27,27) 1 Sim 142 (84,52) 26 (15,48) 2,0 (0,5 – 8,2) 0,31 Come salada crua fora de casa Não Sim
32 (74,42) 11 (25,58) 110 (88,00) 15 (12,00)
1 2,5 (1,1 – 6,0)
0,04
Lava as mãos antes da refeição Sim Não ou as vezes Manipula/Manipulou terra Não Sim Como manipula/manipulava a terra Com luvas Sem luvas Água que bebe Mineral Filtrada ou fervida Não tratada (Torneira) Bebe/Bebeu água de poço Não Sim Bebe/bebeu água de rio Não Sim Bebe/Bebeu água de caminhão pipa Não Sim Bebe/Bebeu água de açude Não Sim
121 (82,31) 26 (17,69) 29 (90,60) 03 (09,40)
54 (87,10) 08 (12,90) 96 (82,05) 21 (17,95)
06 (85,71) 01 (14,29) 90 (81,82) 20 (18,18) 96 (84,21) 18 (15,79) 17 (80,95) 04 (19,05) 37 (84,09) 07 (15,91) 34 (91,89) 03 (08,11) 116 (81,69) 26 (18,31) 86 (86,00) 14 (14,00) 62 (80,52) 15 (19,48) 100 (85,47) 17 (14,53) 45 (80,36) 11 (19,64) 80 (85,11) 14 (14,89) 69 (82,14) 15 (17,86)
1
2,1 (0,6 – 7,3)
1 0,7 (0,3 - 1,6)
1
0,8 (0,3 – 2,6)
1 0,8 (0,2 – 2,6) 1,0 (0,4 – 2,6)
1
0,4 (0,1 – 1,4)
1 0,7 (0,3 – 1,5)
1
0,7 (0,3 – 1,6)
1 0,8 (0,4 – 1,8)
0,26
0,39
0,80
0,71 0,98
0,15
0,33
0,40
0,59
Sobre os aspectos comportamentais em relação a gatos, foi observada maior
prevalência entre os pacientes que relataram ter gatos (84,35%), e entre aqueles cujo
gato possuía o hábito de dormir nas camas (93,10%). Contudo, esses valores não
foram significativos nesta análise (Tabela 7). Os pacientes que relataram que os gatos
da vizinhança entram em suas casas apresentaram maior risco de adquirir a infecção
(89,13%), de modo que esta variável foi estatisticamente significativa na análise
univariada (Tabela 7). Além disso, observou-se maior prevalência entre os indivíduos
que possuíam cachorro (88,04%) que, por sua vez, foi inserido como possível
57
bioindicador da infecção por T. gondii, porém essa variável não foi significativa nesta
análise.
TABELA 7 – Análise univariada dos aspectos comportamentais de pacientes HIV/Aids
do Hospital Giselda Trigueiro em relação a gatos, Natal, RN, 2015 - 2016.
Características dos Pacientes (N=179)
ELISA Positivo(%) Negativo(%)
Univariada OR (IC95%)
P
Tem/Teve gato Não 53 (82,81) 11 (17,19) 1 Sim 97 (84,35) 18 (15,65) 1,1 (0,5 – 2,5) 0,79 Onde o gato fica/ficava Dentro de casa Dentro e fora de casa Não tem gato
22 (91,67) 02 (08,33) 73 (82,02) 16 (17,98) 53 (82,81) 11 (17,19)
2,3 (0,5 – 11,2) 0,9 (0,4 – 2,2)
1
0,31 0,90
O gato dorme/dormia na cama
Não Sim Não tem gato O gato dorme/dormia na cadeira/sofá Não Sim Não tem gato Você brinca/brincava com o gato Não Sim Não tem gato As fezes do gato são/eram recolhidas Com luvas Sem luvas O gato defeca/defecava na rua Não Sim Há gatos na vizinhança Não Sim Gatos da vizinhança entram na casa Não Sim Tem cachorro Não Sim
70 (81,40) 16 (18,60) 27 (93,10) 02 (06,90) 53 (82,81) 11 (17,19) 34 (82,93) 07 (17,07) 63 (85,14) 11 (14,86) 53 (82,81) 11 (17,19) 29 (80,56) 07 (19,44) 68 (86,08) 11 (13,92) 53 (82,81) 11 (17,19) 10 (100,00) 0 (0,00) 35 (92,11) 03 (07,89) 36 (76,60) 11 (23,40) 61 (89,71) 07 (10,29) 23 (85,19) 04 (14,81) 127 (83,55) 25 (16,45)
45 (75,00) 15 (25,00) 82 (89,13) 10 (10,87) 69 (79,31) 18 (20,69) 81 (88,04) 11 (11,96)
0,9 (0,4 – 2,0) 2,8 (0,6 – 13,5)
1
1,0 (0,4 – 2,9) 1,2 (0,5 – 3,0)
1
0,8 (0,3 – 2,5) 1,3 (0,5 – 3,2)
1
1 -
0,4 (0,1 – 1,1) 1
1 0,9 (0,3 – 2,8)
1 2,7 (1,1 – 6,6)
1
1,9 (0,9 – 4,3)
0,82 0,20
1,00 0,71
0,78 0,60
0,36
0,06
0,83
0,03
0,12
58
5.1.5.3 Aspectos relacionados a cistos de T. gondii
Sobre os aspectos comportamentais relacionados à ingestão de cistos de T.
gondii, não foram observados dados estatisticamente significativos. No entanto,
observa-se uma tendência à maior prevalência entre os pacientes que comem carne
crua ou malcozida (86,67%) (Tabela 8). Além disso, todos os pacientes que relataram
comer carne suína mal passada apresentaram positividade para toxoplasmose.
Verificou-se ainda altas prevalências entre os indivíduos consumidores de carne mal
passada de frango (91,67%), de bode ou carneiro (88,24%) e carne bovina (86,67%)
(Tabela 8).
TABELA 8 – Análise univariada dos aspectos comportamentais com relação à
ingestão de cistos de T. gondii pelos pacientes HIV/Aids do Hospital Giselda Trigueiro,
Natal, RN, 2015-2016.
Características dos Pacientes (N=179) ELISA Positivo(%) Negativo(%)
Univariada OR (IC95%)
P
Costuma comer carne crua/mal passada
Não 96 (82,05) 21 (17,95) 1 Sim 52 (86,67) 08 (13,33) 1,4 (0,6 – 3,4) 0,43 Costuma comer carne bovina crua/mal passada
Não Sim Não come carne crua/mal passada
0 (0,00) 0 (0,00) 52 (86,67) 08 (13,33) 96 (82,05) 21 (17,95)
- 1,4 (0,6 – 3,4)
1
- 0,43
Costuma comer carne suína crua/mal passada
Não Sim Não come carne crua/mal passada Costuma comer carne de bode ou carneiro crua/mal passada Não Sim Não come carne crua/mal passada Costuma comer carne de frango crua/mal passada Não Sim Não come carne crua/mal passada
40 (83,33) 08 (16,67) 12 (100,00) 0 (0,00) 96 (82,05) 21 (17,95) 37 (86,05) 06 (13,95) 15 (88,24) 02 (11,76) 96 (82,05) 21 (17,95) 30 (83,33) 06 (16,67) 22 (91,67) 02 (08,33) 96 (82,05) 21 (17,95)
1,1 (0,4 – 2,7) - 1
1,3 (0,5 – 3,6) 1,6 (0,3 – 7,7)
1
1,1 (0,4 – 3,0) 2,4 (0,5 – 11,0)
1
0,84
0,55 0,53
0,86 0,26
59
5.1.6 Análise multivariada
Foram incluídas todas as variáveis com p < 0,25 para a realização da análise
logística multivariada. No modelo final, permaneceram dois fatores de risco
diretamente associados à infecção por T. gondii em pacientes HIV/Aids
acompanhados no HGT (Tabela 9).
Para a variável “come salada crua fora de casa” foi observado que os pacientes
que possuem esse hábito têm 3,6 vezes mais chances de adquirir a infecção por T.
gondii quando comparados àqueles que não se expõem a esse fator de risco.
Considerando a categoria “gatos da vizinhança entram na casa”, os indivíduos que
relataram esse comportamento dos animais possuem 2,8 vezes mais chances de
adquirir a toxoplasmose (Tabela 9).
TABELA 9 – Análise multivariada dos aspectos relacionados à infecção por
T. gondii em pacientes HIV/Aids do Hospital Giselda Trigueiro, Natal, RN, 2015-2016.
Variável
Multivariada OR (IC95%)
P
Gatos da vizinhança entram na casa Não 1 Sim 2,8 (1,1 – 7,2) 0,04 Come salada crua fora de casa Não Sim
1 3,6 (1,4 – 9,4)
0,00
60
5.2 AVALIAÇÕES CLÍNICAS
5.2.1 Dados de CD4, CD4/CD8 e carga viral dos pacientes HIV/Aids do SAE.
Dos 179 pacientes participantes da pesquisa, 167 tiveram seus prontuários
médicos analisados, visto que 12 (6,7%) deles não foram encontrados nos arquivos
do HGT. Verificou-se que os níveis de linfócitos TCD4 dos pacientes analisados
apresentaram variação entre 25 e 1478 céls/mm³, com média de 580,2 céls/mm³. Foi
observado que 10,6% (19/179) possuíam CD4 < 200 no momento em que foi realizado
a pesquisa, dos quais 84,2% (16/19) apresentaram resultado positivo para IgG anti-T.
gondii (Tabela 10). Entre os pacientes com sorologia positiva para T. gondii, a variação
dos níveis de linfócitos T CD4 foi entre 25 – 1478 céls/mm³ com média de 573,44
céls/mm³.
No presente estudo, a relação CD4/CD8 variou entre 0,01 e 3,32, de modo que
79,3% apresentavam CD4/CD8 < 1, e apenas 14,0% apresentavam CD4/CD8 > 1
(Tabela 10). Em relação à carga viral, 67,0% dos pacientes possuíam níveis
indetectáveis (<40 cópias/mm³), sendo o valor máximo de 3.557.646 cópias/mm³. O
tratamento antirretroviral foi avaliado com base no questionário e confirmados através
de prontuários, apesar da informação não estar descrita em alguns casos. Foi
observado que 70,9% dos pacientes relataram o uso regular de TARV (Tabela 10).
5.2.2 Dados clínicos dos pacientes HIV/SIDA do SAE
De acordo com os prontuários, constatou-se que 11,7% (21/179) dos pacientes
desenvolveram neurotoxoplasmose em determinado momento da vida, dos quais
1,7% (3/179) também apresentaram toxoplasmose ocular de forma associada à
toxoplasmose cerebral. Além disso, foi observado que 3,35% (6/179) apresentaram
histórico clínico para toxoplasmose ocular, e duas (1,11%) pacientes relataram
infecção primária durante a gestação. A partir da análise dos prontuários, também foi
possível observar que em 44,7% (80/179) dos pacientes não havia relato quanto ao
resultado de sorologia para toxoplasmose.
61
TABELA 10- Frequência de 179 pacientes HIV-positivos atendidos no SAE do HGT
com diagnósticos soronegativos e soropositivos para Toxoplasma gondii,
relacionados aos níveis de CD4+, CD4/CD8, uso da terapia antirretroviral e carga viral,
em Natal, RN, 2015 – 2016.
Variável clínica
Frequência n %
Soropositivo Toxoplasmose n %
Soronegativo Toxoplasmose n %
CD4 < 200 19 10,6 16 8,9 3 1,7 CD4 >200 Não conhecido
148 82,7 12 6,7
122 68,2 12 6,7
26 14,5 - -
CD4/CD8 < 1 142 79,3 117 65,4 25 13,9 CD4/CD8 > 1 Não conhecido Carga viral detectável ( > 40) Sim
25 14,0 12 6,7
47 26,3
21 11,7 12 6,7
39 21,8
4 2,3 - - 8 4,5
Não Não conhecido
120 67,0 12 6,7
99 55,3 12 6,7
21 11,7 - -
Tratamento antirretroviral regular Sim Não
127 70,9 52 29,1
107 59,7 43 24,1
20 11,2 9 5,0
5.2.3 Avaliações sorológicas e clínicas dos pacientes HIV/Aids internados.
No presente estudo, 11 pacientes HIV/Aids internados no HGT (com
diagnóstico presuntivo ou confirmado para neurotoxoplasmose) aceitaram participar
da pesquisa. Conforme as análises sorológicas, foi observado que 10 pacientes
apresentavam anticorpos IgG anti-T. gondii, cuja avidez foi superior a 50% em todos
os casos (Tabela 11), sugerindo fase crônica da infecção. O intervalo para o IR no
ELISA-IgG variou entre 0,52 – 9,07. Em relação à avaliação de anticorpos IgM anti-T.
gondii, 2 pacientes apresentaram resultado positivo, e 3 tiveram seus resultados
inconclusivos, mesmo após repetição. O intervalo para o IR no ELISA-IgM variou
entre 0,36 – 1,33. Além disso, um paciente não foi reagente para nenhuma das duas
classes de anticorpos anti-T.gondii avaliadas nesse estudo (Tabela 11).
Após a análise dos prontuários, foi observado que os níveis de linfócitos TCD4
apresentaram intervalo entre 2 – 507 céls/mm³, com média de 163 céls/mm³. Foi visto
62
que 63,6% estavam com níveis de CD4< 200. Além disso, observou-se quanto à carga
viral que 72,7% dos pacientes possuíam níveis detectáveis, de modo que o valor
máximo consistiu em 692.943 cópias/mm³, e apenas um paciente apresentava carga
viral indetectável (<40 cópias/mm³) (Tabela 11).
TABELA 11 – Características clínicas e sorológicas dos pacientes HIV/Aids
internados no HGT com suspeita ou confirmação de Neurotoxoplasme, em Natal,
RN, 2015 – 2016.
CD4
(céls/mm³)
Sorologia IgM/IgG
anti-T. gondii
Avidez
IgG anti-T. gondii
Carga viral
(cópias/mm³)
Terapia
antirretroviral
Paciente 01 56 IgM indt/ IgG+ > 50% 692.943 Uso irregular
Paciente 02
Paciente 03
2
49
IgM-/ IgG-
IgM-/ IgG+
-
> 50%
4.098
7.889
Uso irregular
Uso irregular
Paciente 04 507 IgM indt/ IgG+ > 50% 84 Sem uso
Paciente 05
Paciente 06
Paciente 07
Paciente 08
132
44
25
327
IgM-/ IgG+
IgM-/ IgG+
IgM+/ IgG+
IgM-/ IgG+
> 50%
> 50%
> 50%
> 50%
18.178
640
475.819
206.372
Uso irregular
Uso regular
Uso irregular
Uso irregular
Paciente 09 428 IgM indt/ IgG+ > 50% < 40 Uso irregular
Paciente 10
Paciente 11
63
-
IgM-/ IgG+
IgM+/ IgG+
> 50%
> 50%
-
-
Uso irregular
Sem uso
Conforme os prontuários, a maioria dos pacientes fazia uso irregular da terapia
antirretroviral (72,7%), além disso, 2 pacientes (18,2%) não faziam uso da mesma.
Portanto, 90,9% dos pacientes internados participantes da pesquisa não realizavam
tratamento adequado para o controle da carga viral.
5.2.4 Análise clínica de pacientes HIV/Aids com diagnóstico presuntivo ou confirmado
para neurotoxoplasmose.
63
Foi realizada análise de alguns fatores clínicos a partir dos pacientes internados
(11), bem como pacientes acompanhados no SAE cujo prontuário demonstrou
diagnóstico para neurotoxoplasmose (21). Com relação às manifestações clínicas
mais comuns apresentadas por estes pacientes (n=32), observou-se maior
prevalência de Paresia/Hemiparesia (65,62%), seguida de cefaleia (37,50%) e
alterações da consciência (28,12%) (Tabela 12).
O tratamento específico para toxoplasmose utilizado por esses pacientes
consistiu, em sua maioria, no tratamento convencional sulfadiazina + pirimetamina +
ácido folínico (65,63%) (Tabela 12). No entanto, em alguns casos, foi utilizado
clindamicina + pirimetamina + ácido folínico (18,75%).
O exame de Tomografia Computadorizada de crânio foi realizado somente em
43,74% dos pacientes, de modo que esse exame não foi realizado, ou não foi relatado,
na maioria dos casos (56,26%) (Tabela 12). Entre os pacientes cujo prontuário relatou
este exame de imagem, apenas a metade (21,87%) apresentou achados típicos de
neurotoxoplasmose (Tabela 12). Não foi possível classificar os tipos de lesões
presentes, uma vez que os prontuários descreviam informações incompletas.
TABELA 12 – Características clínicas de todos os pacientes HIV/Aids participantes
da pesquisa que possuem diagnóstico confirmado ou presuntivo para
neurotoxoplasmose, Natal, RN 2015 – 2016.
Variável clínica (n = 32)
Frequência
n %
Manifestações clínicas: Paresia/Hemiparesia Cefaleia Alterações da consciência Alterações visuais Parestesia Convulsão Alterações do equilíbrio Não relatado Alterações da fala
21 65,62 12 37,50 09 28,12 07 21,87 06 18,75 06 18,75 05 15,62 05 15,62 04 12,50
Outros Tipo de Tratamento para neurotoxoplasmose Sulfadiazina + Pirimetamina + Ácido folínico
04 12,50 21 65,63
Clindamicina + Pirimetamina + Ácido folínico 06 18,75
64
Não relatado 05 15,62
Tomografia Computadorizada de Crânio Realizada Lesão típica de neurotoxoplasmose Sim Não Não realizada/ Não relatada
14 43,74 07 21,87 07 21,87 18 56,26
5.3 ESTUDO RETROSPECTIVO DE INTERNAMENTOS POR
NEUROTOXOPLASMOSE NO HGT.
Os documentos referentes aos internamentos do HGT foram avaliados entre os
anos 2011 e 2015. Foram observados dados constantes no que se refere à
prevalência de internamentos por neurotoxoplasmose em pacientes com Aids ao
longo desses anos. Tais prevalências variaram entre 13,7 e 18,9%. Além disso, foi
observado valores crescentes quanto ao número de internamentos por Aids no HGT
nos anos avaliados.
TABELA 13 – Estudo retrospectivo: número de internamentos de pacientes HIV/Aids
internados por neurotoxoplasmose no Hospital Giselda Trigueiro entre 2011 e 2015,
Natal, RN.
Ano
Total de internamentos
n
Internamentos por Aids
n
Internamentos por NTX/Aids
n % *
% **
2011 2.253 406 77 18,9 3,4 2012 2013 2014 2015
2.012 1.968 1.877 1.879
414 493 515 517
57 13,7 78 15,8 75 14,5 78 15,1
2,8 3,9 4,0 4,1
*Porcentagem dos internamentos por NTX em relação aos internamentos por Aids
** Porcentagem dos internamentos por NTX em relação a todos os casos de internamentos
no HGT.
65
5.4 ANÁLISES MOLECULARES.
Foram avaliadas 11 amostras de sangue periférico de pacientes HIV/Aids
internados com diagnóstico presuntivo ou confirmado de neurotoxoplasmose. Para
esta análise, utilizou-se o marcador GRA7 na técnica de Nested-PCR. Não foi
observado amplificação do DNA do Toxoplasma gondii em nenhuma das amostras
avaliadas, tanto para o step 1 como para o step 2 (Figura 5).
Figura 5. Resultado molecular a partir de 11 amostras de sangue periférico de
pacientes HIV/Aids internados no HGT, Natal, RN, 2015 – 2016. Eletroforese em gel
de agarose a 2%. PM: marcador de peso molecular de 1Kb (Ludwig); C+: (controle
positivo); C-: (controle negativo).
66
6 DISCUSSÃO
Pacientes portadores de HIV/Aids consistem em um importante grupo de risco
no que se refere à toxoplasmose. Nesses indivíduos, a toxoplasmose está diretamente
relacionada com os baixos níveis de células TCD4+, as quais são importantes
integrantes da resposta imune celular que, por sua vez, é o principal mecanismo de
defesa contra parasitos intracelulares (ALIBERTI, 2005). Níveis muito baixos de
linfócitos TCD4+ representam um risco elevado de reativação da infecção (em
pacientes soropositivos) ou primoinfecção (em pacientes soronegativos) em
indivíduos portadores de HIV/Aids (KODYM, et al., 2015). A importância das células
TCD4 + durante a infecção é explicada pelos mecanismos efetores induzidos por IFN-
y. Sabe-se que o INF-y produzido é necessário para que os macrófagos produzam
respostam antimicrobianas potentes, uma vez que o INF-y regula a expressão do
óxido nítrico sintase induzível (iNOS), que é extremamente necessário para a inibição
da replicação do Toxoplasma gondii (COHEN et. al., 2013). Nesse sentido, devido ao
comprometimento desse mecanismo imunológico, importante para o controle desse
parasito, a neurotoxoplasmose consiste na lesão cerebral focal mais presente em
pacientes HIV/Aids (WEISS, DUBEY, 2009).
Diante da importância da toxoplasmose, as organizações de saúde pública,
como a Organização Mundial de Saúde, recomendam o levantamento de dados
epidemiológicos referentes à toxoplasmose, em função do seu considerável impacto
para as gestantes, consistindo em uma das infecções oportunistas mais comuns que
acomete imunossuprimidos.
No presente estudo, verificou-se que a soroprevalência da infecção por T.
gondii ocorreu em 83,8% dos pacientes HIV/Aids acompanhados no SAE do HGT,
sendo superior à observada em pacientes imunocompetentes da mesma região
(66,3%) (BARBOSA; HOLANDA; ANDRADE-NETO, 2009). A alta prevalência em
imunossuprimidos também foi relatada em outros estados brasileiros, como Bahia
(77,3%) e Rio Grande do Sul (80%) (NUNES et. al., 2004; XAVIER et. al., 2013). Em
relação a outros países, dados semelhantes foram encontrados na Venezuela (85%),
Uruguai (69,11%), India (67,8%) e Etiópoa (87,4%) (DURAN; MIRAZO; COMBOL,
1997; MEISHERI; MEHTA; PATEL, 1997; MARTINEZ et. al., 2002; WALLE et. al.,
2013). Por outro lado, a prevalência encontrada no presente estudo foi superior à
67
observada em países como Malásia (44,8%), Noruega (17,8%) e Japão (5,4%)
(DUNLOP et. al., 1996; NISSAPATORN et. al., 2004; NAITO et. al., 2007). Sabe-se
que a divergência quanto à prevalência da toxoplasmose deve-se a diferentes hábitos
culturais e alimentares em populações. Além disso, as condições
ambientais/climáticas influenciam consideravelmente na prevalência elevada em
países tropicais da América do Sul e na África, por exemplo (DUBEY et. al., 2012).
Foi observado que 29 amostras não apresentaram anticorpos IgG anti-T.gondii.
Tais pacientes soronegativos encontram-se em risco para a primo-infecção e,
portanto, devem ser orientados quanto à não exposição aos diversos fatores de risco
envolvidos na transmissão da toxoplasmose (ROBERT-GANGNEUX; DARDÉ, 2012).
Contudo, nesse estudo, 87,2% dos pacientes acompanhados no SAE do HGT
relataram não ter recebido orientações sobre como prevenir a infecção por T. gondii.
Sobre a detecção de anticorpos IgM, apenas três amostras foram reativas. Não foi
possível acompanhar esses pacientes quanto à soroconversão, porém, tais amostras
podem ter sofrido interferência pela presença de autoanticorpos, como fator
reumatoide, os quais são capazes de alterar ensaios sorológicos, levando à resultados
falso-positivo (LAURENT, et. al., 2015).
Para a toxoplasmose, a determinação de uma fonte de infecção é tecnicamente
difícil devido ao tempo em que a infecção por T. gondii é diagnosticada, de modo que
a fonte original da infecção pode não ser demonstrada (DUBEY et. al., 2012). De
acordo com pesquisas epidemiológicas, os fatores de risco para a infecção
permaneceram conflitantes e/ou indeterminados em 14 a 49% dos casos (ROBERT-
GANGNEUX, DARDÉ, 2012). No Brasil, muitas áreas apresentam um ambiente
altamente prevalente para oocistos, dificultando ainda mais a identificação da fonte de
infecção (DUBEY et. al., 2012). No presente trabalho, verificou-se dois fatores de risco
associados à infecção por T. gondii, ambos relacionados à transmissão por oocistos.
Nas Américas, os surtos recentes de toxoplasmose em humanos têm sido associados
à contaminação do ambiente ou alimentos por oocistos que, por sua vez, devem ser
considerados como potencial fonte de infecção para os humanos (TENTER et. al.,
2000; DUBEY 2012).
No presente estudo, foi observado que o consumo de salada crua fora de casa
consistiu em um importante fator de risco para a infecção por T. gondii. Possivelmente,
esses alimentos estariam contaminados com oocistos liberados nas fezes de gatos, e
68
não foram higienizados de forma adequada. Conforme a literatura, a ingestão de
oocistos presentes no ambiente, água ou em alimentos está entre os mais importantes
mecanismos de transmissão da toxoplasmose (TENTER et. al., 2000; DUBEY et. al.,
2012). Na Noruega, um estudo caso-controle observou que comer frutas e vegetais
crus não lavados estava associado a um aumento no risco de infecção primária
durante a gravidez (KAPPERUD et. al., 1996). O mesmo foi observado em trabalho
desenvolvido na China (LIU et. al., 2009).
Outro fator de risco identificado no presente estudo consistiu em gatos da
vizinhança que entram nas casas. Sabe-se que o gato, hospedeiro definitivo, pode
excretar milhões de oocistos, os quais sobrevivem no ambiente até dois anos
dependendo da humidade e temperatura (DUBEY et. al., 2010a). De acordo com a
literatura, a incidência da toxoplasmose em áreas urbanas pode estar relacionada com
a contaminação ambiental com oocistos. Em São Paulo, Meireles e colaboradores
(2004) observaram prevalência de 40% em gatos andarilhos. No presente estudo,
pacientes que relataram que os gatos presentes na região peridomiciliar entravam em
suas casas possuíam maior risco de adquirir toxoplasmose do que aqueles que não
relataram tal comportamento. Isto se deve, possivelmente, à contaminação do
ambiente domiciliar por oocistos eliminados através das fezes desses animais, de
modo que esses pacientes se encontram mais expostos ao parasito. No Rio Grande
do Norte, outros estudos realizados também observaram relação entre o gato e um
maior risco para infecção por T. gondii em humanos (BARBOSA; HOLANDA;
ANDRADE-NETO, 2009; ALOISE, 2016).
Apesar de não ter sido observada nenhuma relação estatisticamente
significativa entre cistos teciduais presentes em carne malcozida, sabe-se que esse é
um importante fator de risco demonstrado por vários estudos epidemiológicos (BARIL
et. al., 1999; COOK et. al., 2000; TENTER et. al., 2000). Verificou-se que 100% dos
indivíduos que relataram comer carne suína malcozida apresentaram positividade
para toxoplasmose. De acordo com a literatura, entre os alimentos provenientes de
animais de produção, porcos são a fonte de carne mais provável de infecção por T.
gondii em muitos países, incluindo o Brasil (SPALDING et. al., 2005; SILVA et. al.,
2010). A alta produção e grande consumo de carne suína, no Brasil, associados ao
fato de que cistos podem permanecer viáveis na musculatura de suínos por até 875
dias, não sendo detectáveis no abate, torna este alimento uma importante via de
69
transmissão ao homem (KOSKI, 1990). De um modo geral, em animais produtores de
carne, os cistos teciduais de T. gondii são mais frequentemente observados em
suínos, ovinos e caprinos (TENTER et. al., 2000).
A população avaliada no presente trabalho, em sua maior parte, consistiu em
indivíduos apresentando baixo nível sócio-econômico, uma vez que foi observado que
54,8% possuíam renda familiar até dois salários mínimos, e 49,7% apresentavam
baixo grau de escolaridade. Isto pode ser explicado pelo fato de que pacientes com
maior poder aquisitivo optam por clínicas particulares. Essas características podem
estar associadas com a alta prevalência verificada no presente estudo. Contudo, não
foram encontrados dados estatisticamente significativos em relação às características
sócio-econômicas, apesar de que outros estudos, no Brasil, observaram tal relação
(BAHIA-OLIVEIRA et. al., 2003; BARBOSA; HOLANDA; ANDRADE-NETO, 2009).
Esse fato pode estar relacionado não apenas ao poder aquisitivo propriamente dito,
mas aos desdobramentos disso, no que se refere ao acesso à informação.
O conhecimento sobre as fontes de infecção mais prováveis em determinada
população consiste em um importante subsídio para o desenvolvimento de estratégias
eficazes na prevenção da toxoplasmose em grupos de risco, principalmente, os
pacientes portadores do vírus HIV e gestantes.
Entre os pacientes do SAE analisados, verificou-se uma frequência de 11,7%
para neurotoxoplasmose, sendo similar aos estudos realizados no Rio de Janeiro
(10,4%) (Thuler et. al., 1998) e na Bahia (12,2%) (NUNES et. al. 2004). Por outro lado,
a prevalência de neurotoxoplasmose encontrada no presente estudo foi superior à
observada em alguns países como o México (5,1%), Estados Unidos (2,2%) e
República Checa (1,7%) (DEL RIO-CHIRIBOGA; ORZECHWSKI-RALLO; SANCHEZ-
MEJORADA, 1997; DJAWE et. al., 2015; KODIM et. al., 2015).
Possivelmente, isto se deve a fatores intrínsecos ao parasito, como a
diversidade genotípica dos isolados de T. gondii que, por sua vez, é decorrente da
grande variedade geográfica e diversidade de hospedeiros que esse parasito é capaz
de infectar (BOOTHROYD e GRIGG 2002). Hoje, sabe-se que isolados de regiões
como América Central e, principalmente, América do Sul apresentam alta
porcentagem de genótipos atípicos ou recombinantes que diferem das três linhagens
clonais (tipos I, II e III) comumente encontradas na América do Norte e Europa
70
(FERREIRA et. al., 2006; DARDÉ, 2008). Em relação ao Brasil, acredita-se que a
amplitude geográfica e a alta biodiversidade da fauna contribuem para essa grande
variabilidade genética dos isolados regionais de T. gondii (FERREIRA et. al., 2006).
Os vários genótipos diferentes deste parasito estão associados com a infecção grave
em seres humanos na América do Sul. Algumas cepas de T. gondii, geneticamente
distintas, já foram isoladas a partir de pacientes HIV/Aids, no Brasil (FERREIRA et.
al., 2008).
Quanto ao desenvolvimento clínico, pesquisas demonstraram uma maior
gravidade da toxoplasmose na América do Sul quando comparada à Europa e
América do Norte (SIBLEY et. al., 2009; GILBERT, 2008), de modo que o polimorfismo
presente em cepas brasileiras de T.gondii, possivelmente, estaria relacionado com as
diferenças observadas na apresentação clínica da doença (CRISTINA et. al., 1995).
Estudos recentes, a partir de isolados da África, sugeriram uma possível correlação
entre genótipos específicos e o curso clínico da toxoplasmose em imunossuprimidos
(LINDSTROM; SUNDAR; LINDH, 2008; VELMURUGAN; DUBEY; SU, 2008).
Contudo, outros autores acreditam que para esses indivíduos, aspectos
inerentes ao hospedeiro como imunidade e genética, estariam mais relacionados com
a susceptibilidade ou resistência à infecção pelo T. gondii, do que as características
genéticas do parasito (AJZENBERG et. al., 2009). Recentemente, pesquisas
apresentaram forte correlação entre o desenvolvimento da neurotoxoplasmose em
pacientes HIV/Aids e genes do HLA (Human leukocyte antigens) (SORRENTINO e.
tal., 2005; CINTRA et. al., 2009; RODRIGUES et. al., 2016). Além disso, outros fatores
podem estar envolvidos, tais como: inóculo, estágio evolutivo do parasito e,
principalmente, a infecção concomitante com outros agentes patogênicos (WENDTE
et. al., 2011).
No Brasil, apesar dos avanços obtidos nos últimos anos, a queda da incidência
da neurotoxoplasmose foi inferior à observada em países como a França, por exemplo
(ABGRALL et. al, 2001). Atualmente, essa forma clínica representa a primeira causa
de doença no sistema nervoso central (BAHIA-OLIVEIRA et. al., 2003; VIDAL et. al.,
2005; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006; OLIVEIRA et al., 2006; PEREIRA-
CHIOCCOLA, 2009), sendo uma doença indicadora de infecção por HIV em 35% dos
pacientes e definidora de Aids em 75% dos casos (VIDAL et al., 2005).
71
A toxoplasmose ocular foi relatada em 3,35% dos pacientes, no presente
estudo, além de 1,7% que estava associada à toxoplasmose cerebral. Tal prevalência
foi semelhante à observada em pacientes HIV/Aids de Pernambuco (5,7%)(ALVES;
MAGALHÃES; MATOS, 2010). Sabe-se que a toxoplasmose ocular é uma das mais
importantes infecções oportunistas secundárias em pacientes com Aids (SILVEIRA,
2001), além disso, a retinocoroidite toxoplásmica é reconhecida como a causa mais
comum de uveíte posterior, deixando sequelas graves, incluindo a perda completa da
visão (BONFIOLI; ORÉFICE, 2005). Segundo alguns autores, embora a incidência de
infecções oportunistas tenha reduzido desde a introdução da terapia antirretroviral, a
toxoplasmose ocular continua sendo frequente em pacientes HIV com
neurotoxoplasmose (ZAJDENWEBER; MUCCIOLI; BELFORT, 2005).
Em relação aos níveis de células T CD4+ dos pacientes do SAE, foi constatado
que 84,2% dos pacientes com CD4<200 encontram-se em risco considerável para o
desenvolvimento de neurotoxoplasmose, uma vez que possuem CD4 inferior a 200
céls/mm³ associado à positividade para IgG anti-T.gondii. Além disso, entre os
pacientes que já apresentam histórico clínico para a toxoplasmose cerebral, 19,04%
estão em risco de reincidiva, pois apresentam CD4<200 (média 76,75 céls/mm³),
carga viral detectável, e CD4/CD8<1. De acordo com os respectivos prontuários,
apenas um deles relatou profilaxia secundária para neurotoxoplasmose.
A média de linfócitos T CD4+ observada entre todos os pacientes HIV/Aids do
SAE foi de 580,2 céls/mm³, semelhante a estudo realizado em São Paulo que
encontrou média de 405,1 céls/mm³ (XAVIER et. al. 2013). Apesar do status
imunológico satisfatório observado no presente estudo, deve-se ressaltar que 44,7%
dos pacientes não haviam realizado exame sorológico para toxoplasmose
anteriormente à esta pesquisa, o que implica em um relevante fato, já que é de grande
importância a avaliação sorológica quanto à toxoplasmose em pacientes HIV/Aids,
para que seja determinado aqueles que estão em risco para o desenvolvimento de
neurotoxoplasmose (NISSAPATORN et.al., 2004), e consequentemente, para que
seja introduzido o tratamento profilático, conforme recomendado pelo Ministério da
Saúde (2015).
Este fato é agravado considerando que 29,1% dos pacientes do SAE avaliados
nesse estudo realizavam o tratamento antirretroviral com alguma irregularidade. Em
pesquisa realizada por BRITO e colaboradores (2006), observou-se que apenas
72
64,1% dos pacientes HIV/Aids do Rio Grande do Norte não interromperam TARV, e
10,4% não iniciaram o tratamento após primeira prescrição médica, de modo que a
interrupção da terapia estava significativamente relacionada ao uso de drogas, história
de tratamento psiquiátrico, internamento hospitalar, baixo nível de escolaridade, e ter
entre 25 e 34 anos de idade. Além disso, estes autores verificaram que 67% dos casos
com indicação para TARV apresentavam linfócitos TCD4+ abaixo de 200 céls/mm³, o
que sugere diagnóstico e introdução de TARV tardios na população avaliada.
No presente estudo, 79,3% dos pacientes do SAE apresentavam CD4/CD8 <
1. A relação CD4/CD8, normalmente, é apresentada na proporção 2:1, a qual diminui
gradativamente na infecção por HIV, inicialmente pelo aumento de linfócitos T CD8+,
e posteriormente pela redução intensa de linfócitos T CD4+, ocasionando uma
inversão nos valores dessa relação (XAVIER et. al., 2013). Além disso, foi observado
que 26,3% desses pacientes possuíam carga viral detectável, a qual evidencia o risco
de alteração subseqüente nas contagens dos linfócitos, de modo que a elevada
presença de vírus circulantes pode prever uma futura redução no número de células
T CD4+ (BRASIL, 2007c).
Em relação aos pacientes HIV/Aids internados com diagnóstico presuntivo ou
confirmado de neurotoxoplasmose, verificou-se nesse estudo que 90,9% apresentou
sorologia positiva para IgG anti-T. gondii, corroborando com dados da literatura que,
por sua vez, mostram que a maioria desses pacientes apresentam evidência
sorológica da infecção por T. gondii (COLOMBO et. al., 2005; MEIRA et. al., 2008;
NISSAPATORN e SAWANGJAROEN, 2011). Além disso, pesquisas relataram que
em diversos casos, altos níveis desses anticorpos podem ser preditivos para a
ocorrência da toxoplasmose cerebral quando CD4<200, no entanto, o tempo
decorrente entre a elevação dos títulos de anticorpos e o desenvolvimento da
neurotoxoplasmose não está bem definido, uma vez que isto está diretamente
relacionado com aspectos da resposta imune inerentes à cada indivíduo (DEROUIN
et. al.,1996).
Constatou-se também que todos os pacientes HIV/Aids internados por
neurotoxoplasmose e com sorologia positiva (IgG anti-T. gondii) apresentaram
anticorpos com avidez superior a 50%. Isto significa que os casos de toxoplasmose
cerebral avaliados no presente estudo foram, provavelmente, decorrentes de
reativação da infecção latente. Este dado é corroborado com relatos da literatura, que
73
mostra que cerca de 95% da encefalite causada por T. gondii deve-se à reativação da
infecção latente em consequência da redução progressiva da imunidade celular,
ocasionando relevantes danos patológicos pela reagudização da doença, na qual
ocorre a ruptura de cistos teciduais e subsequente interconversão de bradizoítos em
taquizoítos (ROBERT-GANGNEUX et. al., 2012; KODYM, et al., 2015).
Além disso, foi observado que apenas 2/11 pacientes internados apresentaram
IgM anti-T. gondii. Contudo, esse resultado não é indicativo de infecção recente, uma
vez que foram observados anticorpos IgG com alta avidez nesses mesmos pacientes.
Pesquisas mostram que anticorpos anti-T.gondii da classe IgM não são habitualmente
detectados em pacientes HIV com neurotoxoplasmose (BORGES e FIGUEIREDO,
2004; BHASKAR, 2005). No entanto, a detecção desses anticorpos em dois pacientes
deve-se, possivelmente, à persistência de IgM que pode ocorrer em alguns casos,
mesmo na fase crônica da infecção (MONTOYA, 2002; KODYM et. al., 2015).
Adicionalmente, constatou-se que um paciente HIV/Aids internado (com
histórico clínico de neurotoxoplasmose) não apresentou positividade para as
avaliações de anticorpos anti-T.gondii das classes IgM e IgG. Este resultado pode ser
explicado pelo alto grau de imunossupressão desse paciente (CD4 = 2 céls/mm³).
Devido à redução gradual da resposta mediada por célula e da resposta humoral,
decorrentes da progressão da infecção por HIV, a produção de anticorpos anti-T.
gondii pode ser baixa em pacientes severamente imunossupridos. Isso explica porque
em diversos estudos, incluindo o presente trabalho, 2-6% dos pacientes com
reativação da infecção por T. gondii são soronegativos (HAPPE et. al., 2002; VIDAL
et. al., 2005; KODYM et. al., 2015). Portanto, esses resultados enfatizam a
necessidade de novas metodologias para o diagnóstico da toxoplasmose em
pacientes HIV/Aids.
Quanto aos linfócitos T CD4+, os pacientes HIV/Aids internados por
neurotoxoplasmose apresentaram média de 163 céls/mm³. Porém, outros estudos
verificaram maior nível de imunossupressão com média igual a 78 céls/mm³ no México
(DEL RIO-CHIRIBOGA et. al., 1997), 75 céls/mm³ na Noruega (DUNLOP et. al., 1996),
e 25 céls/mm³ na Malásia (NISSAPATORN et. al., 2004). Diversas pesquisas
relataram significativa associação entre o desenvolvimento da toxoplasmose cerebral
e níveis de CD4 inferiores a 100 céls/mm³ (NASCIMENTO et. al., 2001;
NISSAPATORN et. al., 2004; ROBERT-GANGNEUX; DARDÉ, 2012). Por outro lado,
74
na Índia, um estudo observou média de 283,6 céls/mm³ entre os pacientes com
toxoplasmose cerebral, de modo que os autores acreditam que o risco do
desenvolvimento da neurotoxoplasmose ainda é considerável, mesmo em moderada
imunodeficiência (MEISHERI; MEHTA; PATEL, 1997).
Foi observado que 90,9% dos pacientes internados por neurotoxoplasmose não
realizavam terapia antirretroviral de modo regular, e 72,7% possuíam níveis
detectáveis quanto à carga viral. Sabe-se que o uso de TARV tem sido associado a
benefícios clínicos duráveis e a uma grande redução de doenças oportunistas,
indicando que as defesas do hospedeiro, mais especificamente a resposta imune
mediada por células, aumenta após os primeiros meses de terapia (POWERLY;
LANDAY; LEDERMAN, 1998). Por outro lado, a má adesão pelos pacientes gera
falências na terapêutica, possibilitando a emergência de cepas resistentes do vírus
HIV, além de comprometer o prognóstico do indivíduo que, por sua vez, torna-se mais
suscetível à infecções oportunistas, dentre elas, a toxoplasmose cerebral (RACHID;
SCHECHTER, 2008).
A avaliação de prontuários de todos os pacientes com histórico clínico de
neurotoxoplasmose (11 internados e 21 do SAE) permitiu a observação das
manifestações clínicas mais frequentes: Paresia/Hemiparesia (65,62%), seguida de
cefaleia (37,50%) e alterações da consciência (28,12%). Tais achados corroboram
com outros estudos que observaram semelhante quadro clínico entre os pacientes
acometidos por neurotoxoplasmose (RAGNAUD et. al., 1993; FERRER et. al., 1996;
BOURÉE et. al., 1997). De acordo com a literatura, os déficits motores focais e cefaleia
estão entre os principais sinais clínicos apresentados (PEREIRA-CHIOCCOLA;
VIDAL; SU, 2009).
Não foi possível classificar os tipos de lesões presentes nesses pacientes, uma
vez que os prontuários descreviam informações incompletas a respeito da Tomografia
Computadorizada de crânio. Além disso, este exame não foi realizado, ou não foi
relatado, na maioria dos casos. Portanto, observa-se uma deficiência no que se refere
à realização deste exame no HGT, evidenciando condições precárias quanto ao
serviço de saúde deste hospital. Um estudo realizado recentemente na mesma
unidade de saúde relatou que as neuroinfecções são doenças relevantes no HGT,
responsáveis por importante morbidade. Apesar disso, a falta de estrutura, baixos
recursos financeiros do hospital, bem como o déficit de exames confirmatórios no HGT
75
contribuíram para que a maior parte dos casos de neuroinfecções tivessem
diagnóstico etiológico presumido pelos sinais e sintomas clínicos (BAY et. al., 2016).
Nesses casos, a confirmação do diagnóstico ocorre mediante à resposta terapêutica
empiricamente instituída (LUFT et. al., 1993).
Em relação ao tratamento específico para T. gondii realizado pelos 32
pacientes acometidos pela toxoplasmose cerebral, foi observado que 65,63%
realizaram o tratamento convencional, o qual é constituído por sulfadiazina +
pirimetamina + ácido folínico. Estudo recente mostrou que isolados de T. gondii
obtidos de animais de criação utilizados para consumo humano, no Rio Grande do
Norte, apresentaram resistência ao tratamento com sulfadiazina (OLIVEIRA et. al.,
2016). Esses dados são de grande importância, uma vez que a sulfadiazina é o
fármaco de referência no tratamento da toxoplasmose (KAYE, 2011). Desse modo,
estas cepas podem estar envolvidas em complicações clínicas e falhas terapêuticas
observadas no Rio Grande do Norte (MENDES et. al., 2014; OLIVEIRA et. al., 2016).
Outros autores relataram a possível relação entre parasitos resistentes e falhas
terapêuticas em 10% dos casos de toxoplasmose cerebral em pacientes tratados com
sulfadiazina (ASPINALL et. al., 2002).
Além disso, foi observado que 18,75% dos pacientes acometidos por
neurotoxoplasmose utilizaram clindamicina + pirimetamina + ácido folínico como
tratamento para infecção por T. gondii. Esses casos apresentaram farmacodermia em
consequência do tratamento com sulfadiazina. De acordo com a literatura, o
tratamento a longo prazo da neurotoxoplasmose é frequentemente limitado pela não
adesão dos pacientes e, principalmente, pelas reações adversas. Esses fatores,
possivelmente, estão relacionados com os casos de reincidência da toxoplasmose
cerebral (NISSAPATORN et. al., 2004). Outros estudos também relataram significativa
frequência quanto ao desenvolvimento de reações adversas decorrentes do
tratamento com sulfadiazina em pacientes HIV/Aids com neurotoxoplasmose
(FERRER et. al., 1996; BOURÉE et. al., 1997; NISSAPATORN et. al., 2004). Os
fatores mencionados quanto ao tratamento atualmente disponível para a
toxoplasmose, enfatizam a necessidade de novas alternativas terapêuticas.
No presente trabalho, foi realizado um estudo retrospectivo, no qual observou-
se que o número de internamentos de pacientes HIV/Aids internados por
neurotoxoplasmose no HGT, entre 2011 e 2015, manteve-se relativamente constante
76
(13,7 – 18,9%). Essas frequências representam um impacto relevante. Recentemente,
um estudo avaliou a frequência de neuroinfecções no HGT, e constatou que a
neurotoxoplasmose foi a mais frequente (50,9%), representando 75% das
neuroinfecções em pacientes HIV/Aids (BAY et. al., 2016). Desse modo, o estudo
retrospectivo no presente trabalho mostra a ausência de intervenções e vigilâncias
que viabilizem um controle eficaz dessa doença em pacientes HIV/Aids do Rio Grande
do Norte.
Em relação às análises moleculares, foram avaliadas 11 amostras de sangue
de pacientes HIV/Aids internados com diagnóstico presuntivo ou confirmado de
neurotoxoplasmose. Não foi observado amplificação de DNA do T. gondii nas
referidas amostras, fato relativamente esperado, pois acredita-se que na maioria dos
casos, a neurotoxoplasmose é resultante de uma reativação de cistos cerebrais
latentes, havendo pouca ou nenhuma disseminação do parasito por via hematogênica
(FRANZEN et. al., 1997; AJZENBERG et. al., 2010). Alguns estudos, utilizando
amostras de sangue, observaram baixa sensibilidade da PCR, variando entre 1,5 e
30% (FRANZEN et. al., 1997; BASTIEN, 2002; CORREIA; MELO; COSTA et. al.,
2010). Esses autores acreditam que o teste de PCR, no sangue, possui valor limitado
quanto ao diagnóstico da neurotoxoplasmose em pacientes HIV/Aids. Contudo, alguns
estudos relataram sensibilidade mais alta para o mesmo teste (PRIYA et. al., 2002;
COLOMBO et. al., 2005; MESQUITA et. al., 2010).
A ausência de padronização quanto aos protocolos de PCR para a
toxoplasmose contribuem para resultados divergentes entre os laboratórios. Diversos
fatores podem explicar essas divergências (BRETAGNE, 2003; VIDAL et. al., 2004).
Porém, um aspecto de grande relevância consiste no tempo decorrente entre a coleta
da amostra e o início do tratamento anti-toxoplásmico. No presente trabalho, todas as
amostras foram coletadas após a introdução do tratamento anti-parasitário, em virtude
da logística da pesquisa no HGT. Acredita-se que este fator influenciou negativamente
nos resultados obtidos para essa avaliação molecular. Outros estudos também
relataram interferência significativa desse aspecto (FRANZEN et. al., 1997; BASTIEN,
2002), de modo que Khalifa e colaboradores (1994) também não observaram
amplificação em nenhuma das amostras de sangue coletadas após tratamento anti-
toxoplásmico.
77
De acordo com a literatura, a realização da PCR em amostras de líquor é algo
promissor quanto ao diagnóstico da neurotoxoplasmose em pacientes HIV/Aids
(JOSEPH et. al., 2002; VIDAL et. al., 2004; ALFONSO et. al., 2009;). No entanto, a
punção lombar pode oferecer riscos, principalmente, em pacientes com lesões
expansivas e pressão intracraniana, sendo uma importante limitação relatada por
algumas pesquisas (KODYM et. al., 2015). Este motivo impossibilitou a análise
molecular de líquor no presente estudo, pois a punção lombar é pouco realizada
nesses pacientes no HGT, conforme explicado pelos próprios médicos. Apesar disso,
a avaliação da PCR com o marcador GRA7 é bastante pertinente, uma vez que já foi
demonstrada maior eficácia deste marcador comparado a outros marcadores mais
utilizados na literatura, principalmente, considerando que no Rio Grande do Norte há
circulação de cepas atípicas do T. gondii (COSTA et. al., 2016). Portanto, um novo
desenho experimental torna esta análise molecular uma perspectiva promissora.
Desse modo, a realização deste trabalho permitiu uma caracterização inicial do
perfil da toxoplasmose em pacientes HIV/Aids do Rio Grande do Norte, tratando-se
de um estudo pioneiro na região. Os resultados obtidos contribuem consideravelmente
para a saúde pública a nível municipal e estadual, proporcionando a elaboração de
dados que incentivem a implementação de medidas eficazes para o controle da morbi-
mortalidade associada a essa doença na população avaliada.
78
7 CONCLUSÃO
Os resultados obtidos nesse estudo indicam alta taxa de infecção por T. gondii em
pacientes portadores de HIV/Aids (83,8%), sendo detectadas a neurotoxoplasmose e
a toxoplasmose ocular. Além disso, a presença de gatos e a ingestão de salada crua
foram fatores de risco identificados para a infecção.
79
8 PERSPECTIVAS
Realização de palestras no HGT para orientação e atualização dos
profissionais de saúde quanto à toxoplasmose em pacientes HIV/Aids no Rio
Grande do Norte.
Elaboração de medidas de intervenção que viabilizem o conhecimento sobre
os fatores de risco associados à toxoplasmose, tendo como alvo pacientes
vivendo com HIV/Aids no nosso estado.
Novo desenho experimental para avaliação molecular da técnica de PCR
utilizando o marcador GRA7. Tal estudo deverá apresentar maior número de
amostras, bem como, controle eficaz em relação à coleta da amostra no
período de pré-tratamento anti-toxoplásmico. Isso será possível através de uma
maior interação com os médicos do HGT. Além disso, poderão ser avaliadas
amostras de sangue e líquor, de acordo com a rotina do referido hospital.
80
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96
ANEXO A – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Este é um convite para você participar da pesquisa: “Pesquisa de anticorpos anti-
Toxoplasma gondii em pacientes HIV atendidos no Hospital Giselda Trigueiro em Natal, Rio
Grande do Norte”, que tem como pesquisador responsável a aluna Marianne Garcia de Oliveira
devidamente assistida pelo seu orientador Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto.
Esta pesquisa pretende avaliar a frequência da toxoplasmose em pacientes HIV positivos
atendidos no Hospital Giselda Trigueiro.
O motivo que nos leva a fazer este estudo está relacionado com o fato da toxoplasmose
ser uma das doenças oportunistas mais comuns em pacientes portadores do HIV, causando
sérios danos ao organismo, dentre eles lesões neurológicas. Caso você decida participar, você
deverá responder a um questionário (com duração de 5 minutos) que apresentará questões
gerais e alguns fatores de riscos relacionados à transmissão da toxoplasmose. Além disso, você
será submetido a uma coleta de sangue (5 – 10 mL). Haverá casos específicos em que a médica
Dra. Mônica Bay solicitará coleta de líquor se o paciente apresentar sinais clínicos neurológicos.
Somente se este for o seu caso, você será submetido também a uma punção lombar.
Durante a realização da coleta de sangue a previsão de riscos é mínima, ou seja, o risco que
você corre é semelhante àquele sentido em um exame de rotina. Pode acontecer um desconforto
durante a punção lombar que será minimizado por meio de anestesia e você terá como benefício
uma avaliação para o diagnóstico da Toxoplasmose Cerebral, recebendo posteriormente o
tratamento específico de acordo com o resultado.
Em caso de algum problema que você possa ter, relacionado com a pesquisa, você terá direito
a assistência gratuita que será prestada no Hospital Giselda Trigueiro com assistência da Dra.
Mônica Bay.
Durante todo o período da pesquisa você poderá tirar suas dúvidas ligando para Marianne
Garcia de Oliveira – (084) 88146570.
Você tem o direito de se recusar a participar ou retirar seu consentimento, em qualquer fase da
pesquisa, sem nenhum prejuízo para você.
Os dados que você irá nos fornecer serão confidenciais e serão divulgados apenas em
congressos ou publicações científicas, não havendo divulgação de nenhum dado que possa lhe
identificar.
Esses dados serão guardados pelo pesquisador responsável por essa pesquisa em local
seguro e por um período de 5 anos.
Se você tiver algum gasto pela sua participação nessa pesquisa, ele será assumido pelo
pesquisador e reembolsado para você.
Se você sofrer algum dano comprovadamente decorrente desta pesquisa, você será
indenizado.
Qualquer dúvida sobre a ética dessa pesquisa você deverá ligar para o Comitê de Ética em
Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, telefone 3215-3135.
97
Este documento foi impresso em duas vias. Uma ficará com você e a outra com o pesquisador
responsável Marianne Garcia de Oliveira.
Consentimento Livre e Esclarecido
Após ter sido esclarecido sobre os objetivos, importância e o modo como os dados serão
coletados nessa pesquisa, além de conhecer os riscos, desconfortos e benefícios que ela trará para
mim e ter ficado ciente de todos os meus direitos, concordo em participar da pesquisa “Pesquisa de
anticorpos anti-Toxoplasma gondii em pacientes HIV atendidos no Hospital Giselda Trigueiro
em Natal, Rio Grande do Norte”, e autorizo a divulgação das informações por mim fornecidas em
congressos e/ou publicações científicas desde que nenhum dado possa me identificar.
Natal, / / .
Assinatura do participante da pesquisa
Declaração do pesquisador responsável
Como pesquisador responsável pelo estudo “Pesquisa de anticorpos anti-Toxoplasma
gondii em pacientes HIV atendidos no Hospital Giselda Trigueiro em Natal, Rio Grande do Norte”,
declaro que assumo a inteira responsabilidade de cumprir fielmente os procedimentos
metodologicamente e direitos que foram esclarecidos e assegurados ao participante desse estudo,
assim como manter sigilo e confidencialidade sobre a identidade do mesmo.
Declaro ainda estar ciente que na inobservância do compromisso ora assumido estarei
infringindo as normas e diretrizes propostas pela Resolução 466/12 do Conselho Nacional de Saúde –
CNS, que regulamenta as pesquisas envolvendo o ser humano.
Natal, / / .
Assinatura do pesquisador responsável
Impressão datiloscópica do
participante
98
ANEXO B – PARECER DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA
99
100
101
ANEXO C – QUESTIONÁRIO SOCIOECONÔMICO E BIOLÓGICO
QUESTIONÁRIO N°________________________________________
IDENTIFICAÇÃO
1. Nome: ________________________________________________________________
2. Idade:_________________________________________________________________
3. Sexo: 1 Feminino ( ) 2 Masculino ( )
4. Cidade:________________________________________________________________
5. Endereço:_____________________________________________________ N°_______
6. Complemento:__________________________________________________________
7. Contato para retorno do resultado do exame:
Telefone:_______________________________________________________________
DADOS SÓCIO-ECONÔMICOS
8. Grau de escolaridade:
1. ( ) Sem escolaridade/Até 3ᵃ série Fundamental/ até 3ᵃ série do 1° grau (primário
incompleto)
2. ( ) Até 4ᵃ série Fundamental/ até 4ᵃ série do 1° grau (primário completo)
3. ( ) Fundamental completo/ 8ᵃ série completa (1° grau completo)
4. ( ) Médio incompleto/ 2° grau incompleto (3° ano científico incompleto)
5. ( ) Médio completo/ 2° grau completo (3° ano científico completo)
6. ( ) Superior completo ou incompleto
9. Qual a profissão/ocupação?
0. ( ) Agricultor/ Jardineiro
1. ( ) Autônomo
2. ( ) Cozinheiro/ Açougueiro
3. ( ) Empregado de empresa privada
4. ( ) Profissional da saúde
5. ( ) Pedreiro/ Serviços gerais
6. ( ) Do lar (dona de casa)
7. ( ) Doméstica/ Cuidador
8. ( ) Aposentado ou pensionista
9. ( ) Professor
10. ( ) Estudante
11. ( ) Funcionário público
12. ( ) Não tem
99. ( ) Não respondeu
12. Renda familiar por mês:
1. ( ) Até 1 salário mínimo
2. ( ) Entre 1 e 2 salários mínimos
3. ( ) Entre 2 e 3 salários mínimos
4. ( ) Acima de 3 salários mínimos
5. ( ) Não sabe/ Não respondeu
102
FATORES DE RISCO
13. Costuma comer saladas cruas/ verduras e legumes crus?
1.( ) Sim 2. ( ) Não
14. Costuma comer saladas cruas fora de casa?
1. ( ) Sim 2.( ) Não 99. ( ) Não se aplica
15. Costuma lavar as mãos antes das refeições?
1.( ) Sim 2. ( ) Não ou as vezes
16. Mexe ou já mexeu com terra de jardim, vaso de flores ou horta?
1.( ) Sim 2. ( ) Não 0.( ) Não lembra
17. Como você mexe/mexia com a terra?
1.( ) Sempre com luvas 99.( ) Não se aplica
2.( ) Sempre sem luvas 0.( ) Não lembra
18. De onde vem a água que consome?
0. ( ) Não lembra/ Não sabe
1. ( ) Não tratada (Torneira)
2. ( ) Água filtrada ou fervida
3. ( ) Água mineral
Você bebeu alguma vez na vida água de:
19. Poço: 1. ( ) Sim 2. ( ) Não 0. ( ) Não sabe
20. Lago, rio ou riacho: 1.( ) Sim 2. ( ) Não 0. ( ) Não sabe
21. Caminhão Pipa: 1. ( ) Sim 2. ( ) Não 0. ( ) Não sabe
22. Açude: 1. ( ) Sim 2. ( ) Não 0. ( ) Não sabe
23. Costuma comer carne crua ou mal passada?
1.( ) Sim 2.( ) Não 0.( ) Não lembra
Preencher o quadro abaixo com o tipo de carne consumida crua ou mal passada:
24. Boi 1. ( ) Sim 2. ( ) Não 0 ( ) Não lembra 99( ) Não aplica
25. Porco 1. ( ) Sim 2. ( ) Não 0 ( ) Não lembra 99( ) Não aplica
26. Bode/ Carneiro 1. ( ) Sim 2. ( ) Não 0 ( ) Não lembra 99( ) Não aplica
27. Galinha 1. ( ) Sim 2. ( ) Não 0 ( ) Não lembra 99( ) Não aplica
28. Já ouviu falar sobre a doença toxoplasmose?
1.( ) Sim 2. ( ) Não 0. ( ) Não lembra
29. Apresentou que tipo de manifestação clínica?
1.( ) Toxoplasmose ocular 2. ( ) Neurotoxoplasmose 3. ( ) Linfoadenopatia
0.( ) Não lembra 99.( ) Não se aplica 4. ( ) Toxo Congênita
5. ( ) Toxo ocular + Toxo Congênita 6. ( ) Toxo ocular + Neurotoxoplasmose
30. Você já recebeu orientações para prevenção da toxoplasmose?
1.( ) Sim 2.( ) Não 0. ( ) Não lembra
31. Tem ou já teve gato?
1.( ) Sim 2.( ) Não 0. ( ) Não lembra
32. Onde o gato fica/ficava?
1.( ) Dentro de casa
2.( ) Dentro e fora de casa 0.( ) Não lembra 99.( ) Não se aplica
103
Que tipo de contato teve com o gato?
33. Dormia na cama: 1. ( ) Sim 2. ( ) Não 0. ( ) Não lembra 99.( ) NA
34. Dormia no sofá/cadeira: 1. ( ) Sim 2. ( ) Não 0. ( ) Não lembra 99.( ) NA
35. Brincava com ele: 1. ( ) Sim 2. ( ) Não 0. ( ) Não lembra 99.( ) NA
36. Recolhia as fezes com luvas: 1. ( ) Sim 2.( ) Não 0. ( ) Não lembra 99.( ) NA
37. O gato defecava na rua? 1. ( ) Sim 2.( ) Não 0. ( ) Não lembra 99.( )NA
38. Costuma ver gatos na vizinhança?
1.( ) Sim 2. ( ) Não 0. ( ) Não lembra
39. Os gatos da vizinhança entram na sua casa?
1.( ) Não 2.( ) Sim 0. ( ) Não lembra 99. ( ) Não se aplica
40. Tem cachorro?
1.( ) Sim 2.( ) Não
41. Faz uso regular do tratamento antirretroviral?
1.( ) Sim 2. ( ) Não 99.( ) Não se aplica
Resultado do Teste ELISA: 1. ( ) Positivo 2. ( ) Negativo