estudos citogenéticos nas leucemias do lactente · lma- m3= leucemia promielocítica aguda...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUC0 CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE GENTICA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM GENTICA
Estudos Citogenticos nas Leucemias do Lactente
Terezinha de Jesus Marques Salles
Recife, 2010
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE GENTICA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM GENTICA
Estudos Citogenticos nas Leucemias do Lactente
Terezinha de Jesus Marques Salles
Tese apresentada ao Programa de Ps-
Graduao em Gentica da Universidade
Federal de Pernambuco, como parte dos
requisitos necessrios para a obteno do
grau de Doutor em Gentica.
Orientadora: Profa Dra Neide Santos
Co-orientadora: Dra Maria Luiza Macedo Silva
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Salles, Terezinha de Jesus Marques Estudos citogenticos nas leucemias do lactente/ Terezinha de Jesus Marques Salles. Recife: O Autor, 2010. 126 folhas : il., fig., tab.
Orientadora: Neide Santos. Co-orientadora: Maria Luiza Macedo Silva Tese (doutorado) Universidade Federal de Pernambuco.
Centro de Cincias Biolgicas. Gentica, 2010. Inclui bibliografia e anexos.
1. Citogentica 2. Leucemia em crianas 3. Hospitais
universitrios I. Ttulo. 572.8 CDD (22.ed.) UFPE/CCB-2011-035
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AGRADECIMENTOS
Aos meus amados filhos, Vivian e Leonardo como estmulo para que eles sempre
tenham fora de vontade para atingir seus objetivos.
A meu querido marido, companheiro que sempre teve muita tolerncia e
compreenso em todas as decises da minha vida.
Aos meus queridos pais por toda educao e discernimento pelo lado correto da
vida.
Este trabalho no poderia ter sido realizado sem a colaborao de diversas
pessoas amigas a quem expresso os meus profundos agradecimentos:
Dra Neide Santos, minha orientadora, pela amizade e maneira gentil com que
aceitou tal incumbncia.
minha co-orientadora Dra. Maria Luiza Macedo Silva que desde o mestrado vem
ajudando na minha formao como citogeneticista, sem sua participao este
trabalho no teria tanto valor.
Ao intercmbio cientfico Brasil-Alemanha. Brasil - Laboratrio de Citogentica
Centro de Transplante de Medula ssea (CEMO), Instituto Nacional de Cancer
(INCA) coordenado pela Dra. Maria Luiza Macedo Silva / CAPES 3017089 e
Alemanha - Molekulare Zytogenetik Institt fr Humangenetik, Universitts
klinikum Jena coordenado pelo Dr. Thomas Liehr / DAAD XXXX9
Ao Dr Thomas Liehr orientador na Alemanha pelo projeto CAPES/ DAAD, pela
reviso dos trabalhos publicados e por todas as anlises realizadas em seu
laboratrio em Jena / Alemanha
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querida Eliane pela ajuda nos diagnsticos citogenticos, reviso dos FISH, pela
amizade e carinho durante todo esse tempo que temos trabalhado juntas.
Edinalva e Mariluze, mdicas hematologistas, que dividiram comigo os
diagnsticos, assim como, os sucessos e insucessos no tratamento das crianas
com leucemia.
Dra. Hasmik Mkrtchyan pela orientao na realizao das tcnicas de
citogentica molecular, e pelo incio de uma grande amizade.
Betnia pela ajuda nos exames e na confeco dos grficos da tese.
Elizngela pela amizade e pelos diagnsticos imunofenotpicos.
minha querida irm Olga pela ajuda na confeco da tese.
Dra Tereza Cartaxo, chefe dos laboratorios do CEONHPE, pela amizade e pela
sua dedicaco no desenvolvimento do laboratrio de citogentica desta Instituico.
A todas as mdicas do CEONHPE, Vera, Karina, Raquel, Silvania, Adriana,
Laurice, Leda e Marina que participaram conjuntamente no tratamento das crianas
com leucemia.
Teresa Marquim, Jemima e Amlia, pela ajuda na preparao das tcnicas
citogenticas.
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Dedico esta tese a todas as crianas portadoras de leucemia, na
esperana, de que no futuro breve, possamos ver uma mudana na
tragetria desta grave doena.
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SUMRIO
AGRADECIMENTOS .................................................................................................. V
LISTA DE ABREVIATURAS ...................................................................................... IX
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ XIII
LISTA DE QUADROS ...............................................................................................XV
LISTA DE TABELAS ...............................................................................................XVI
RESUMO.................................................................................................................XVII
ABSTRACT ............................................................................................................XVIII
1 INTRODUO .................................................................................................XVIII
2 REVISO DA LITERATURA ................................................................................ 3
2.1 AS LEUCEMIAS AGUDAS NOS LACTENTES ........................................................... 3 2.1.1 Mecanismos Hipotticos da Etiopatogenia das Leucemias Agudas dos Lactentes (LAL) ..................................................................................................... 4 2.1.2 Fisiologia da protena MLL ........................................................................ 8 2.1.3 Patogenia do gene MLL na leucemia do lactente .................................... 12 2.1.4 Mecanismo molecular na leucemia aguda do lactente MLL+ .................. 17
2.2 SNDROME MIELODISPLSICA (SMD) NA INFNCIA ............................................ 19 2.3 DIAGNSTICO DAS LEUCEMIAS NO LACTENTE .................................................... 24
2.3.1 Morfologia ................................................................................................ 25 2.3.2 Imunofenotipagem ................................................................................... 26 2.3.3 Citogentica Convencional ...................................................................... 27 2.3.4 Citogentica Molecular: FISH, M-FISH, MCB, mMCB ............................. 31
3 OBJETIVOS ........................................................................................................ 38
3.1 OBJETIVOS GERAIS ......................................................................................... 38 3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ................................................................................ 38
4. MATERIAL E MTODOS ................................................................................ 39
4.1 PACIENTES ..................................................................................................... 39 4.2 MTODOS ...................................................................................................... 39
4.2.1 Amostras ................................................................................................. 39 4.2.2 Citogentica Convencional ...................................................................... 39 4.2.3 Bandeamento G ...................................................................................... 40 4.2.4 Citogentica Molecular ............................................................................ 41
4.2.4.1 Hibridizao in situ Fluorescente (FISH) .......................................................................... 41 4.2.4.2 Multicolor FISH (M-FISH) e multitude multicolor banding (mMCB) ............................... 42 4.2.4.3 Bandeamento multicolorido (MCB)..................................................................................... 43
5. ASPECTOS TICOS ....................................................................................... 44
6. RESULTADOS ................................................................................................. 45
7. DISCUSSO .................................................................................................... 89
8. CONCLUSES .............................................................................................. 106
9. REFERNCIA BIBLIOGRFICA ................................................................... 108
10. ANEXOS ........................................................................................................ 119
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LISTA DE ABREVIATURAS
AcMo = anticorpo monoclonal
ALL1 gene (acute lymphoblastic leukemia 1 gene) = Gene da leukemia
linfoblstica aguda
AF6 = Gene do cromossomo 6 humano
AF9 = Gene do cromossomo 9 humano
AF1P = Gene do cromossomo 1 humano
AFX= Gene do cromossomo X humano
LMA-K= Leucemia megacarioblstica aguda
AnaE= Alfa-naftil acetato esterase
AnbE = Alfa-naftil butirato esterase
AREB-T= Anemia refratria em transformao
ASH2L gene (absent, small, or homeotic, Drosophila, homolog-like gene)= gene
ausente, pequeno ou hometico com homologia a Drosfila
BCR (Break Cluster Region) = Regio de pontos de quebra
CALLA = Antgeno comum da leukemia linfoblastica aguda (CD10)
CBP= Protena de ligao CREB
CCK ( Color changing karyotyping) = Caritipo de mudana de cor
CTD= (Cytolethal distending toxin) = Toxina de citoesqueleto distendinda
CEP = Sonda centromrica
COT1-DNAR= DNA bloqueador com um valor cot de 1
del = deleo cromossmica
der = cromossomo derivativo
dic = cromossomo dicntrico
domnio AT = domnio adenina transferase
dominio MT= domnio metil trasferase
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EBV= Vrus Epstein Barr
FAB = Grupo cooperativo Franco-Americano-Britnico
FISH = Fluorescente in situ Hibrydization = Hibridizao in situ Fluorescente
FYRc e FYRN= Sequncias motivo pouco caracterizadas com regies ricas em fenilalanina/ tirosina, ao redor dos aminoacidos 50 e 100.
Gene EEN = Gene de fuso da leucemia extra onze dezenove
Gene ENL = Gene da leukemia onze dezenove
GBG = Badeamento G
HLA-DR = Antigeno de histocompatibilidade leucocitrio HLA-DR humano HRX gene = Gene humano Trithorax
HOX gene = Gene Homeoboxe
HTLV-1= Vrus humano tipo lymphotrop T Hb-F= Hemoglobina Fetal HDAC = histona deacetilase IgH = Imunoglobulina de cadeia pesada
Inv = inverso cromossmica
ISCN (International System Cytogenetic Nomenclature (Nomenclatura do sistema Internacional)
K-Ras (Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)= oncogene homlogo de
sarcoma viral de rato Kirsten) LL= Leucemia do lactente
LAL = Leucemia aguda do lactente
LS = Sndrome Lentigene
LIF (leukemia inhibitory factor) = Fator inibitrio de leucemia
LLA= Leucemia linfoblstica aguda
LLA- Pr B = Leucemia Linfoblstica Pr-B
LMA = Leucemia mieloblstica aguda
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LMA-MO= Leucemia mielide aguda sem diferenciao
LMA- M1= Leucemia aguda sem maturao
LMA- M2= Leucemia mielide aguda com maturao
LMA- M3= Leucemia promieloctica aguda
LMA-M3v= Leucemia promielocitica variante
LMA- M4= Leucemia mielomonoctica aguda
LMA-M4 eo= Leucemia mielonocitica aguda eosinoflica.
LMA- M5= Leucemia monoblstica
LMA - M6= Eritroleucemia
LMMJ= Leucemia mielomonoctica juvenil
MAT = Mielopoese anormal transitria
MCB( Multicolor banding)= bandeamento multicolorido
mMCB(Multitude multicolor chromosome banding) = Todos cromossomos com bandeamento multicolorido
M-FISH( Multicolor FISH) = FISH multicolorido
MLL(myeloid/lymphoid or mixed lineage leukemia) = leucemia mista/linfide ou leucemia mista
MO = Medula ssea
MOF gene (mammalian ortholog of the Drosophila gene) - Gene de Drosfila ortologo mamfero)
MPO = Mieloperoxidase NF1= Neurofibromatose 1
OMS= Organizao Mundial Sade
P53 = Protena 53
P300 = Transcrio coactivator PAS (Periodic acid Shiff) cido Peridico de Schiff
PCP= Cromossomo Pintura Parcial
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PHD domain= Homedominio de Planta
Protena Rb= Protena do Retinoblastoma
Proteina WDR = protena com motivo triptofano cido asprtico repetido
PTPN11 ( protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 1) = Protena tirosina fosfatase, no receptora tipo 1
RBPB5 (RNA-binding protein splice variant b5) = Protena de quebra variante b5 ligante do RNA)
SBB= Sudan Black B
SC (Stem cells)= Clula Pluripotente
SD= Sndrome de Down
SEPT 2 = Protena septina 2
SEPT 5 = Protena septina 5
SEPT 6= Protena septina 6
SET domain = Domnio SET
SH = Sistema hematopotico
SHP-2(SH2 domain-containing tyrosine phosphatases) = Tirosina fosfatases contendo o domnio SH2
SMD= Sndrome Mielodisplsica
SmIg (Surface membrane imunoglobulin)= Antgeno de membrana de superfcie SMP= Sndrome Mieloproliferativa
SNC= Sistema Nervoso Central
SNL1= Sinal de localizao nuclear 1
SNL2= Sinal de localizao nuclear 2
SN= Sndrome de Nooam
SP= Sangue perifrico
t= translocao
WCP ( Whole chromosomic painting)= Cromossomo todo pintado
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representao esquemtica das regies do gene MLL e regies de quebras e translocaes.............................................................................7
Figura 2 -. Representao esquemtica das funes biolgicas da protena MLL
com os principais stios de transcrio....................................................10 Figura 3 - Adaptada. Modelo esquemtico do complexo MLL na regulao da
transcrio...............................................................................................11
Figura 4 - Metilao e transcrio do gene MLL.....................................................15
Figura 5 - Genes parceiros do gene MLL. ........................................................... 16
Figura 6 - Esquema das mltiplas funes das protenas normais e aberrantes MLL no programa desenvolvimento hematopotico......................................18
Figura 7- Distribuio da frequncia dos parceiros do MLL na infncia.............30
Figura 8 - Marcao da regio 11q23 com a sonda MLL LSI espectro .............. 33
Figura 9 - Metfase e ncleo interfsico com rerranjo do gene MLL.. ................. 34
Figura 10. Combinao de fluorocromos para identificao dos cromossomos no M-FISH.. .............................................................................................. 35
Figura 11- MCB (Bandeamento Multicolorido)..................................................... 36
Figura 12 - Portadores de Leucemia de novo (83 casos) .................................... 45
Figura 13 - Faixa etria dos lactentes com leucemia aguda e SMD .................... 46
Figura 14 - Anormalidades da regio 11q23 na LLA do lactente (N=13) ............. 54
Figura 15 - Bandeamento G no caso 6 (LLA),46,XX,t(4;11)(q21;q23) ................. 54
Figura 16 - Anormalidades citogenticas no relacionadas a regio 11q23 ....... 55
Figura 17- Frequncia das alteraes da regio 11q23 na LLA (n=17). ............. 56
Figura 18 - MCB no caso 31 (LLA) mostrando a trissomia 14 ............................. 58
Figura 19 - Dados citogenticos do caso 35 com LLA. ....................................... 59
Figura 20 - Dados citogenticos do caso 38 com LLA. ....................................... 60
Figura 21- Dados citogenticos do caso 45 com LLA ......................................... 61
Figura 22 - Dados citogenticos do caso 41 com LLA. ....................................... 62
../../../../../../../Users/Terezinha/Documents/Tese%20doutorado%20final/tese%20%20teca%2007.11.10correes%20pos%20pretese.doc#_Toc277895022
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Figura 23 - Classificao FAB na LMA dos lactentes (N=23) .............................. 63
Figura 24 - Alteraes citogenticas na LMA dos lactentes (n=21). .................... 67
Figura 25 - Caritipo no caso 6(LMA-M4), 46,XY,t(1;11)(p32;q23) ..................... 68
Figura 26- Estudo do rearranjo do gene MLL na LMA do lactente (n=23) ........... 68
Figura 27- Dados citogenticos do caso 17 com LMA-M5. ................................. 70
Figura 28 - Dados citogenticos do caso 18 com LMA-M7. ................................ 71
Figura 29- Dados citogenticos do caso 20 com LMA-M5. ................................. 72
Figura 30- Dados citogenticos do caso 23 com LMA-M4eo. ............................. 73
Figura 31- Dados citogenticos do caso 1 com L bifenotpica............................. 76
Figura 32- Dados citogenticos do caso 2 com L bifenotpica............................. 77
Figura 33- Frequncia do rearranjo do gene MLL nas LAL ................................. 78
Figura 34- Achados citogenticos na SMD do lactente. ...................................... 79
Figura 35- Dados citogenticos do caso 2 com SMD. ......................................... 83
Figura 36- Dados citogenticos do caso 4 com SMD. ......................................... 84
Figura 37- Dados citogenticos do caso 6 com LMA/SMD ................................. 85
Figura 38- Dados citogenticos do caso 8 com LMA/SMD. ................................ 86
Figura 39- Dados citogenticos do caso 9 com LMA-M7 e Neurofibromatose. ... 87
Figura 40 - Dados citogenticos do caso 10 com SMD/LMA............................... 88
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LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Critrios mnimos para o diagnstico da SMD na infncia .................... 19
Quadro 2. Classificao da Sndrome Mielodisplsica na infncia de acordo com a
OMS ..................................................................................................... 20
Quadro 3. Fluxograma para o diagnstico das leucemias no lactente ................... 24
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Adaptada. Frequncia dos principais parceiros do gene MLL, e do grupo
das diversas protenas geradas. ....................................................... 14
Tabela 2. Diferentes classes de sondas comumente usadas para anlise de FISH em laboratrios clnicos ..................................................................... 32
Tabela 3. Dados Clnicos e Citogenticos Clssico e Molecular dos lactentes com
LLA ...................................................................................................... 48
Tabela 4. Dados Clnicos e Citogenticos Clssico e Molecular dos lactentes com LMA ..................................................................................................... 64
Tabela 5. Dados Clnicos e Citogenticos Clssico e Molecular dos lactentes com leucemia de linhagem ambgua ........................................................... 77
Tabela 6. Dados Clnicos e Citogenticos Clssico e Molecular dos lactentes com SMD .................................................................................................... 83
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xvii
RESUMO
A anlise citogentica convencional e molecular nas leucemias do lactente (LL) de fundamental importncia para estabelecer alteraes cromossmicas e que definem grupos e subgrupos de risco. Este estudo caracterizou alteraes cromossmicas em 83 lactentes, oriundos do Centro de Oncohematologia do Hospital Universitrio Oswaldo Cruz e Centro de Transplante de Medula ssea do Instituto Nacional do Cancer (CEMO/INCA) no perodo de julho/2000 a agosto/2010, sendo 73 casos de leucemias agudas (LA) e 10 de sndrome mielodisplsica (SMD). As Leucemias agudas foram classificadas como leucemia linfoblstica aguda (LLA) (47 casos), leucemia mielide aguda (LMA) (23 casos) e leucemias ambguas (3 casos). A idade dos pacientes com leucemia linfoblstica aguda variou de 5 dias a 22 meses, com proporo entre os sexos de 1:1. A idade dos casos de leucemia mielide aguda variou de 2 a 21 meses, sendo 15 masculinos e 7 femininos. Os subtipos morfolgicos foram leucemia mielide com diferenciao (M2), leucemia mielomonoctica (M4), leucemia mielomonoctica eosinoflica (M4eo), leucemia monoblstica (M5) e leucemia megacarioblstica (M7). O bandeamento G (GBG) revelou anormalidades da regio 11q23 em 38% dos casos de leucemia linfoblstica e em 50% dos casos de leucemia mieloblstica. O rearranjo do gene MLL por hibiridizao in situ foi observado em 65% e 39% das leucemias linfoblsticas e leucemia mielide, respectivamente. Nos casos com sndrome mielodisplsicas, a idade variou entre 20 dias a 20 meses, sendo seis do sexo masculino e quatro do feminino. Sete casos foram leucemia mieloblstica em portadores de S.Down, destes seis eram leucemias megacarioblsticas (LMA-K/LMA-M7) e uma leucemia mielide sem diferenciao (LMA-MO). Todas as leucemias megacarioblsticas tiveram caritipos complexos com translocaes envolvendo o cromossomo 1. Os mtodos de Hibridizao in situ (FISH), multicolor FISH (M-FISH) e bandeamento cromossmico multicolorido (MCB), foram essenciais nos casos duvidosos pelo GBG, nos caritipos complexos e nos casos de cromossomos marcadores.
Palavras Chaves: Gene MLL, citogentica molecular, leucemia do lactente.
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xviii
ABSTRACT
Cytogenetic and molecular analysis in infant leukemia has extremely importance for establishing chromosomes alterations to defining groups and sub-groups of risk. This study has pointed chromosomes alterations in 83 infants originating from Cytogenetic Laboratory of Pediatric Oncohematology Center of University Hospital Oswaldo Cruz of Pernambuco and Cytogenetic Department of Nacional Center for Bone Marrow Transplant of National Cancer Institute from July/2000 until august/2010. Seventy three cases were acute leukemia (AL) and 10 of them, mielodysplasic syndrome (MDS). The acute leukemias were classified as acute lymphoblastic leukemia (47 cases), acute myeloid leukemia (23 cases) and ambiguous leukemias (3 cases). The acute lymphoblastic leukemia age has varied between 5 days to 22 months with gender proportion of 1:1. The acute myeloide leukemia ages have varied from 2 to 21 months, being 15 males and 7 females. The morphologic subtypes were acute myeloid leukemia without maturation (M2), myelomonocytic leukemia (M4), eosionophilic myelomonocytic leukemia (M4eo), acute monoblastic leukemia (M5) and acute megakaryoblastic leukemia (M7). G-banding has revealed abnormalities 11q23 in 38% of the acute lymphoblastic leukemia and 50% of the acute myeloid cases. The MLL gene rearrangement by in situ hibridization was observed in 65% and 39% of the acute lymphoblastic and acute myeloid leukemia, respectively. The myelodysplastic syndrome age has varied between 20 days to 20 months, being six males and 4 females. Seven cases were acute myeloid leukemia in Down syndrome carriers, being six acute megakaryoblastic leukemia (AMLK) and one undifferentiad acute myeloid (MO). All acute megakaryoblastic leukemia had complex kariotypes with translocation dealing with chromosome 1. The methods in situ hybridization (FISH), Multicolor FISH (M-FISH) and multicolor chromosomic banding (MCB) were essential in the doubtfully cases by G-banding, in complex kariotypes or mark chromosome cases.
Keys words: MLL Gene, molecular cytogenetic, infant leukemia.
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Ma Marques-Salles , TJ Estudos Citogenticos na Leucemia do Lactente
1
1 INTRODUO
As leucemias no lactente (LL) so doenas graves da criana menor de dois
anos de idade. Tm ocorrncia em torno de 3% dos casos e caractersticas
especficas que diferem das leucemias em outras faixas etrias. Evidncias
sugerem origem intratero, devido ntima relao entre embriognese e
carcinognese. As LL podem ser leucemias agudas (LAL), leucemia linfide aguda
(LLA), leucemia mielide aguda (LMA), leucemias de linhagem ambgua (leucemias
bifenotpica e bilineal) ou sndrome mielodisplsica (SMD), mielopoese anormal
transitria (MAT), LMA em portadores de sndrome de Down (LMA/SD) e leucemia
mielomonoctica juvenil (LMMJ).
No lactente, a LLA ocorre em 60% dos casos tendo como prottipo o subtipo
pr-B. uma doena agressiva, com hiperleucocitose, visceromegalias e infiltrao
do sistema nervoso central (SNC). Em cerca de 80% dos casos existe o rearranjo
do gene MLL (leucemia mista mielide linfide), sendo as principais anormalidades
a t(4;11) e t(11;19). Estes rearranjos exercem um papel primordial na
leucemognese, pois a protena quimrica produzida atua como fator de
transcrio, estimulando continuamente a hematopoese.
A LMA ocorre em 40% dos lactentes e os subtipos mais freqentes so
leucemias mielomonoctica e monoblstica aguda (LMA-M4 e M5). As
translocaes mais freqentes so: t(9;11), t(6;11), t(10;11). Apesar da alta
frequncia do rearranjo envolvendo o gene MLL, diferentemente da LLA, na LMA o
prognstico no difere das outras faixas etrias. Nos recm-nascidos, h uma
maior ocorrncia da LMA em relao a LLA e a leucemia megacarioblstica aguda,
LMA-K(LMA-M7) que est associada t(1;22) o principal subtipo, cujo
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Ma Marques-Salles , TJ Estudos Citogenticos na Leucemia do Lactente
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prognstico desfavorvel. Entretanto, nos neonatos com SD h uma maior
frequncia do subtipo LMA-K, sem a t(1;22), e a doena cursa com bom
prognstico. Estes pacientes so classificados como SMD pela OMS que pertence
especificamente ao grupo LMA em portadores de SD. Cerca de 20-30% dos
neonatos com SD podem apresentar a mielopoese anormal transitrios (MAT) ou
achados de mielodisplasia antes do surgimento de LMA definitiva. Assim como os
portadores de MAT, os portadores de LMMJ so diagnsticados como SMD e
classificados no grupo de doenas mieloproliferativas/mielodisplsicas (SMD/SMP).
A LMMJ representa 3% das leucemias da infncia, ocorre em torno de 1,2 por
milho entre 0 a 14 anos. Atinge principalmente lactentes e crianas jovens,
menores de 5 anos. A doena indolente com prognstico ruim. Apesar de 80%
dos portadores de LMMJ apresentarem caritipo normal, a monossomia do
cromossomo 7 est frequentemente correlacionada doena.
No Brasil, os estudos citogenticos em lactentes so raros e no se conhece
as principais alteraes cromossmicas. Como a LAL uma doena com alto risco
de recidiva, relacionada ao rearranjo do gene MLL, presente em cerca de 70% dos
casos estudados, os protocolos atuais sugerem realizar estudos citogenticos para
indicao do tratamento incluindo quimioterapia e transplante de medula ssea.
Nas LMA, apesar da presena do rearranjo do gene MLL, decorrente
principalmente da t(9;11), existe boa resposta a poliquimioterapia, sem a
necessidade de transplante de medula ssea. Desta forma, os estudos pelas
tcnicas de citogentica convencional e molecular na LAL so de fundamental
importncia para estabelecer as alteraes cromossmicas, assim como, para
definir grupos e subgrupos de risco que se beneficiem com um tratamento
direcionado, o que de extrema relevncia epidemiolgica.
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Ma Marques-Salles , TJ Estudos Citogenticos na Leucemia do Lactente
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2 REVISO DA LITERATURA
2.1 As Leucemias Agudas nos Lactentes
As leucemias agudas que acometem os lactentes (LAL) so neoplasias
malignas raras do sistema hematopotico e o primeiro caso clnico foi descrito em
1921 por Smith (apud Pierce, 1959). Em 1936, Goldhamer e Barnney descreveram
o acometimento cutneo na LMA e, em 1951, Bernhard e cols descreveram que os
fatores que causam leucemia poderiam ocorrer intrautero. Zussman et al. (1967)
descreveram um caso de leucemia congnita com anomalias cromossmicas
restrita ao clone leucmico e, revisaram as caractersticas clnicas de 50 outros
lactentes. Naquela poca, a correlao entre leucemias congnitas e sndromes
constitucionais (sndrome de Down, sndrome de Bloom e mais raramente,
sndrome de Patau e de Turner) levou especulao que as anomalias
cromossmicas adquiridas, que levam a transformao maligna, seriam
secundrias a leses decorrentes de instabilidade cromossmica ou leses em
stios frgeis dos cromossomos. Estas alteraes produziriam um clone anormal
oriundo, provavelmente, da leso na hematopoese embrionria (Quesnel e Malkin,
1997).
Em 1986, Pombo-de-Oliveira et al. publicaram um estudo mostrando as
alteraes moleculares na leucemia congnita de gmeos univitelinos. A reviso da
literatura, neste estudo mostrou que a maioria destas leucemias ocorria em
crianas menores de 1 ano. A partir desse perodo, os estudos sobre leucemias do
lactente ganharam grande impulso, principalmente, com a descoberta do gene MLL
no cromossomo 11, banda q23, como o marcador mais importante para este tipo
de leucemia (Ziermin van der Poel, 1991). Nos lactentes, com rearranjo do gene
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Ma Marques-Salles , TJ Estudos Citogenticos na Leucemia do Lactente
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MLL, as leucemias apresentam infidelidade celular podendo ser LLA pr-B, LMA
M4/M5 e L ambguas (Cimino et al.,1998). Nos lactentes, a LLA geralmente tem
comportamento clnico agressivo, cursa com leucometria elevada, visceromegalias
e infiltrao SNC, enquanto as infiltraes em pele, tecidos subcutneos, regio
retro-orbitria e gengiva ocorrem mais frequentemente na LMA (Pui et al.,1995,
Isoyama et al., 2002). A LMA-K ocorre em 10% das LMA da infncia, predomina
nos neonatos e em geral cursa com prognstico reservado, exceo dos
portadores de SD (Ribeiro et al, 1993).
2.1.1 Mecanismos Hipotticos da Etiopatogenia das Leucemias Agudas dos Lactentes (LAL)
As pesquisas realizadas in vitro e in vivo nas LAL so bastante promissoras
no que se refere etiopatogenia da doena, devido s caractersticas biolgicas
das clulas leucmicas e do curto perodo do surgimento das manifestaes
clnicas na doena. Apesar da dificuldade na identificao dos possveis fatores
predisponentes, a baixa idade, nestes casos, indica que mutaes recorrentes,
durante a gravidez ou durante a embriognese esto associadas ao processo
leucmico (Hartley e Sainsbury, 1981; Greaves, 1993). Os estudos moleculares em
gmeos univitelinos e siameses com leucemias agudas, atualmente, confirmam
que a mutao ocorre intratero. Um fato interessante, nestes casos, que apenas
um dos gmeos inicialmente afetado, posteriormente a doena passa para o
segundo gmeo por metstases, via anastomose intraplacentria ou atravs da
circulao materna (Pombo-de-Oliveira et al.,1986; Mahmound, et al.,1995
Greaves, 2003).
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Apesar de no se saber quais fatores levam a leucemia, existem diversos
estudos elaborados que avaliam os fatores de risco no desenvolvimento da
doena. Uma hiptese muito cogitada que, durante a gestao as mulheres
sofram exposio a substncias inibidoras da topoisomerase II ou, a enzimas com
funes similares destes inibidores. Existem inibidores naturais da topoisomerase II
em frutas, vegetais, gro de soja (substncias flavonides tipo quercetina e a
genistena), chs preto e verde, cacau, vinhos (catechis) e quinolonas (Ross, 1995;
Alexander et al., 2001, Hengstler et al., 2002). A possibilidade de substncias
inibidoras de topoisomerase causarem leucemias advm da semelhana nos
achados citogenticos com a leucemia secundria ao tratamento quimioterpico
(Prieto et al., 1990). Dados da literatura mostram que drogas inibidoras de
topoisomerase produzem leso no cromossomo 11, no mesmo ponto de quebra
das LAL, na regio 11q23 (Hunger, 1998). Outros fatores sugeridos como indutores
de leucemias so: exposio materna a raios-X, agentes qumicos, como os
derivados de petrleo e alguns pesticidas (Lowengart, 1987; Rinski, 1987).
Durante a transformao leucmica, nvel molecular, ocorre ativao de
proto-oncogenes ou a formao do gene de fuso com propriedades de oncogene
(Hogge, 1994). Na maioria das vezes, um oncogene ativado por uma
translocao cromossmica, mas pode tambm resultar de uma mutao pontual,
amplificao e insero viral. Quando h translocao, um proto-oncogene se
fusiona a outro gene celular resultando num produto protico, que pode ser um
fator de transcrio e, assim codificar protenas envolvidas no crescimento e
diferenciao celular. Os genes, como o MLL, tm grande importncia na
leucemognese, pois atuam como Master genes, ou seja, genes regulatrios que
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esto envolvidos na regulao da hematopoese e controlam a expresso de
diversos genes (Green, 1996).
Nas LAL as anormalidades cromossmicas mais frequentes envolvem o
gene MLL. Este gene est localizado no cromossomo 11q23, tambm conhecido
como gene leucemia linfide 1 (ALL1) ou gene Trithorax(HRX)(Fig.1) (Marschalek,
1997). Este gene codifica uma histona-lisina N-metiltransferase HRX, com
homologia epigentica protena reguladora transcricional Trithorax da Drosophila
melanogaster, um efetor transcricional dos genes HOX. A protena MLL
essencial, tanto no desenvolvimento do embrio, como na regulao dos genes
HOX. Dessa forma, o gene MLL conjuntamente com alguns genes HOX, atuam na
especificao e/ou expanso de clulas hematopoticas progenitoras (Stem Cells)
(Magli et al., 1997; Ernst et al., 2004). Aps a vida embrionria, a protena MLL
necessria para manuteno da transcrio dos genes HOX. Ento, a ligao entre
a protena MLL, a regulao de gene HOX e a hematopoese so de particular
importncia na fisiopatogenia das leucemias (Li et al., 2005).
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Figura 1-Representao esquemtica das regies do gene MLL e regies de quebras e translocaes. Vrios domnios funcionais so mostrados: AT em gancho; sinais de localizao nuclear, SN1 e SN2; CxxC (MT), motivo rico em cistena homolga metiltransferase DNA eMDB1; PHD1-3 em dedo de zinco; regies CS1 e CS2, TAD, domnio de transativao; SET domnio SET. TRX regies estruturalmente conservadas com a Tritorax da Drosophila Melanogaster (TRX). Vrios ativadores transcrionais esto tambm representados. Fonte: Krivsov e Armstrong 2007.
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2.1.2 Funes da Protena MLL
O entendimento do funcionamento da protena MLL de importncia
primordial para leucemognese. A MLL uma protena complexa com diversos
domnios funcionais, atua na regulao de genes de transcrio atravs dos seus
domnios AT e MT que se ligam diretamente ao DNA. A regio em gancho AT se
liga nas regies ricas em AT da pequena curvatura do DNA e o domnio MT, a uma
regio rica em cistena (CXXC) (Birke et al., 2002). A regio AT tem funo de
desmetilao e a MT de metilao nas sequncias CpG. A protena MLL atravs de
sua regio RD1 e RD2 tambm atuam como repressora da transcrio, atravs do
recrutamento de complexos HDAC ou protenas do grupo polycomb (Xia et
al.,2003). O domnio em dedo de zinco (PHD), semelhante a outras protenas PHD,
atua na remodelao da cromatina, alm da atividade na regulao transcrional
(Slany, 2005). Por conter motivos de auto associao na regio em dedos de zinco
e na regio do domnio SET (motivo tambm responsvel pela metilao de H3K4)
(fig 1), acredita-se que a protena MLL funciona como um dmero ou um
oligomrico (Rozovskaia et al., 2000). Ao lado destes domnios, esta protena, tem
dois sinais de localizao nuclear, na regio N terminal (SNL1 e SNL2), o qual
determina um padro pontilhado de localizao nuclear (Fig.1) (Daser e Rabbitts,
2004; Krivtsov e Amstrong, 2007).
A protena MLL aps ser completamente formada, ps transcricionalmente
clivada por uma protease, a taspase 1, em dois fragmentos: um fragmento N-
terminal de 320 kDa, com atividade de represso da transcrio, composto pelos
motivos em gancho AT e com suas regies SNL1 e SNL2 (localizao nuclear
salpicado 1 e 2), alm do domnio MT e o em dedo de zinco (MLLH) e num
fragmento C-terminal com 180kD, com forte atividade transcricional que contm o
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domnio SET e o TAD (MLLC) (Hsieh et al., 2003). H uma interao entre os
domnios FYRN da MLL, localizado na regio terminal N-320, com FYRC e o
domnio SET, localizados na regio C180 (Fig. 2). Desta forma, estes dois
complexos peptdeos MLL (MLLH e MLLC) constroem a estrutura bsica,
necessria para o supercomplexo multiprotena MLL (MLL-MPSC). Os peptdeos
MLL conferem estabilidade e localizao subnuclear de pelo menos 27 protenas
adicionais. Este grande complexo nuclear inclui diversas protenas, com variadas
funes, como as WDR5, RBPB5 e ASH2L (Fig. 3) (Couture et al., 2006; Sterward
et al., 2006).
Estudos mais recentes mostram que a protena MLL tambm se liga ao DNA
atravs de protenas de ligao. Um exemplo a protena de ligao supressora de
tumor, conhecida como menin (codificada pelo gene MEN 1), ambas (MLL e menin)
atuam na regulao da expresso do gene HOX9 (Yokoyama et al., 2005). Alm do
HOX, existem outros genes alvos do gene MLL. Estudos atuais em clulas de
linhagem sugerem, na realidade, que o gene MLL exerce um papel global na
regulao da transcrio (Milne et al., 2005).
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Figura 2- Representao esquemtica das funes biolgicas da protena MLL com os principais stios de transcrio.Trs stios AT em gancho que se ligam a pequena curvatura do DNA; SNL: 2 sinais salpicados de localizao nuclear; RD: domnios de represso; PHD + bromo envolvido na interao protena-protena; FYRN e o FYRC domnios associados a p300/p320 N-terminal, chamada MLLH e a protena C- terminal chamada de MLLc. Uma vez que a protena MLL clivada pela taspase em duas protenas antes de ir pro ncleo, formam um complexo multiprotena com o TFIID. TAD: domnio de transativao e liga o CBP que pode metilar as histonas H3 e H4 na rea HOX; SET: domnio SET metiltransferase, metilase H3, incluindo histonas na rea HOX para abertura da cromatina e transcrio. Fonte adaptada: Huret JL URL. http://AtlasGeneticsGenes/Oncology.org/mll.htlm
.
http://atlasgeneticsgenes/Oncology.org/mll.htlm
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Figura 3- Modelo esquemtico do complexo MLL na regulao da transcrio. Uma
sequncia especfica do fator de transcrio se liga ao promotor e recruta o complexo MLL durante a fase de iniciao da transcrio. O domnio SET da MLL metila a lisina 4 da histona H3. Concomitantemente, a lisine 16 da histona H4 acetilada por MOF. Na fase de alongamento, o complexo MLL se acopla com a RNA pol II pela associao como CTD da RNA PoL II com o MLLH, MLLC, e a menin. Alm disso, o componente WDR5 specificamente reconhece e metila a lisina 4 da H3. Desta maneira, o modelo de modificao se espalha ao longo de uma regio de transcrio ativa. Fonte adaptada: Slany, 2005.
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2.1.3 Patogenia do gene MLL na leucemia do lactente
As translocaes que envolvem o gene MLL levam a uma falha no
repareamento do DNA nas clulas hematopoticas em desenvolvimento
(Richardson e Jasin, 2000). A regio do ponto de quebra (BCR) entre os xons 8 e
13 o alvo para maioria do rearranjos, existindo ao longo desta regio stios de
clivagem para topoisomerase II. Esta uma regio na qual a protena se liga a
matriz nuclear e provavelmente contribui para o mecanismo pelo qual ocorrem as
traslocaes. Desta forma, a desregulao deste processo leva as translocaes
encontradas nas leucemias (Strissel et al., 1998).
Quando um determinado agente mutagnico penetra no organismo rompe a
estrutura do gene MLL entre as regies em dedos de zinco e de metilao,
ocasionando a perda da regio em dedo de zinco, stio de ligao ao DNA,
resultando num segmento truncado. Como os domnios de metilao (MT) e
gancho AT so mantidos, esta regio fica susceptvel a ligaes inespecficas com
alterao na metilao, levando a leucemognese. Por outro lado, a fuso com
genes parceiros resulta na codificao de protenas ricas em serina e prolina. Pelo
menos 52 protenas tm sido descritas, mas apenas algumas so classificadas
dentro de 5 grupos (Tabela 1) (Krivtson et al., 2007). No primeiro grupo esto as
protenas ligantes do DNA que se distribuem no citoplasma, na membrana nuclear,
no retculo endoplasmtico, no golgiossomo e nos ribossomos. Alguns exemplos de
protenas de fuso so AF4 da t(4,11), AF6 da t(6;11), AF9 da t(9;11), ENL da
t(11;19)(Meyer et al., 2009). O segundo grupo formado por protenas
citoplasmticas do tipo coiled coil, tais como: GAS 7, EEN, AF1P, AF6 e AFX (So
and Cleary, 2003; So et al., 2003). O terceiro grupo compreende um pequeno
grupo de protenas que inclui as septinas (SEPT2, SEPT5, SEPT6 9 e 11). As
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septinas so protenas citoplasmticas que parecem estar envolvidas em diversos
processos como controle de ciclo celular, trfego de vesculas e
compartimentalizao da membrana plasmtica, embora o significado especfico,
ainda permanea desconhecido. No quarto grupo esto as histonas
acetiltransferases p300 e CBP (Rowley et al., 1997; Ida et al., 1997), e ao quinto
grupo pertence a MLL-PTD (duplicao parcial in tandem), que so resultantes da
duplicao interna in tandem de xons especficos (Schichman, 1994).
O achados comuns a todas as fuses do gene MLL, exceo da MLL-PTD,
so reteno do domnio AT em gancho e motivo em dedo de zinco CxxC (ambos
so essenciais para as fuses do gene MLL) assim como, a perda do domnio C-
terminal SET, o qual media a metilao da H3K4. Independente da fuso, o gene
MLL mantm a capacidade de regular positivamente a transcrio dos grupos de
genes HOX A e diversos outros genes. Na LAL, ainda no est esclarecido, qual
dos eventos o mais importante na induo leucmica, se a fuso de genes
produzindo novos transcritos como a formao de protenas quimricas que
contm o motivo em gancho AT ou, se a dimerizao do gene MLL (Cherif. 1992;
Tkachuk, 1992).
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Tabela 1- Frequncia dos principais parceiros do gene MLL e do grupo das diversas protenas geradas.
Fonte adaptada: Krivtsov et al.,2007
Evidncias atuais sugerem que muitos parceiros de fuso do gene MLL
pertencem a uma rede envolvida na regulao da transcrio, atravs da
remodelao da cromatina e alongamento da transcrio (Slany, 2005). O gene
ELL, um parceiro do gene MLL um fator de alongamento que se associa a RNA
Pol II e a diversas protenas (Simone et al., 2001). Uma protena conhecida como
DOT1L, uma histona metiltransferase que metila o resduo de lisina 79 na histona
H3 (H3K79), medeia a fuso do rearranjo MLL/AF10 (Fig 4) (Okada et al., 2005).
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Figura 4- Metilao e transcrio do gene MLL, como membro de um complexo
multiprotico, a protena MLL media a metilao de H3K4, nas regies promotoras dos genes ocupadas pela RNA Pol II. Fonte adaptada: Kritsov et al.,2007
Uma funo hipottica das fuses proticas mostrada na figura 4. A
protena MLL sem a regio SET, que tem atividade H3K4 metiltransferase, pode
recrutar a Dotilmetilferase H3K79. As fuses do gene MLL recrutam a protena
Dotil, nos stios que so normalmente ocupados pelos promotores do gene MLL
(como o gene HOXA), o que permite a metilao H3K79 dos Hoxes A, resultando
em expresses aberrantes (Okada et.al, 2005, Couture et al., 2006).
Atualmente, o gene MLL reconhecidamente o gene mais envolvido em
translocaes, mais de 54 genes de fuses foram identificados por clonagem
molecular, pela sequncia genmica do ponto de quebra ou pelo transcrito
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quimrico (Fig.5) (Huret, 2005). A ocorrncia de duplicao parcial do gene MLL
observada em sangue perifrico e em medula ssea de adultos e lactentes normais
e em fgados fetais, demonstram que devem existir alteraes genticas adicionais
para completa transformao maligna na leucemia do lactente. Mutaes nos
genes codificadores das protenas Ras, p53 ou p16 so encontradas em alguns
casos, mas so inconsistentes. A protena karos que faz ligao com o DNA
necessria para o desenvolvimento linfide normal. Isoformas anormais desta
protena foram identificadas em sete lactentes com LLA com t(4;11) ou t(11;19).
Dessa forma, a ruptura do gene IKAROS hoje em dia considerada uma alterao
adicional na LLA do lactente (Sun, 1999; Felix e Lange, 2006).
Figura 5- Genes parceiros do MLL. Fonte: Atlas Genet Cytogenet Oncol
Haematol. Atualizado em 2009. Huret JL URL. http://AtlasGenetics Oncology.org/Genes/MLL.html
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2.1.4 Mecanismo molecular na leucemia aguda do lactente MLL+
Provavelmente existem diferentes mecanismos envolvidos na leucemognese
do LAL, devido existncia de diferentes protenas MLL aberrantes e certamente
ocorre alguma conexo entre estes mecanismos (Fig. 6). Uma protena aberrante
resultante de translocaes ou duplicao parcial in tanden ocasiona um programa
gnico aberrante por diversos mecanismos: (1) por dimerizao (ou
oligomerizao), um mecanismo comum na leucemognese de diversas protenas
aberrantes (protenas de fuses parceiras citoplasmticas, MLL-PTD ou
amplificao gnica) (Martin et al., 2003); (2) as aberrantes MPSC-MLL,
recrutadoras de complexos remodeladores de cromatina levam a alteraes na
cromatina produzindo perfis gnicos aberrantes; (3) algumas protenas de fuses
so derivadas da fuso do gene MLL com parceiros citoplasmticos podem agir
como reguladores da transcrio via dimerizao (ex.MLL-EE); (4) alguns parceiros
de fuso podem ligar a molcula sinalizadora para o MPSC-MLL resultando em
extensa alterao do perfil gnico. Desta forma, uma protena MLL aberrante
presumidamente afeta o controle celular normal incluindo transduo de sinal e
ciclo celular e, possivelmente, tem uma ao direta na expresso gnica, a nvel de
cromatina de genes alvos, como nos genes HOX (Li et al., 2005).
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Figura 6- Esquema das mltiplas funes das protenas normais e aberrantes MLL no programa desenvolvimento hematopotico. A protena normal necessria para manter o perfil gnico durante o programa de desenvolvimento hematopotico normal. A protena aberrante derivada de translocaes, duplicao parcial in tanden ou amplificao leva a expresso gnica e programa de desenvolvimento aberrante, que eventualmente resultar em leucemia. Diferentes mecanismos esto envolvidos na leucemognese por protenas MLL aberrantes e existem conexes entre estes mecanismos. Fonte adaptada: Li-Z-Y et al.,2005.
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2.2 Sndrome Mielodisplsica (SMD) na Infncia
O termo sndrome mielodisplsica (SMD) refere-se a um grupo de
malignidades com displasia dos precursores hematopoticos que ocasionam
citopenia no sangue perifrico, a despeito da medula normal ou hipercelular. O
diagnstico das SMD se baseia em uma tabela de critrios mnimos (Quadro 1) e
segue a classificao da Organizao Mundial de Sade (OMS) (Quadro 2) que
normalmente usada em pediatria (Hasle et al.,2003).
Quadro 1. Critrios mnimos para o diagnstico da SMD na infncia
Pelo menos dois dos critrios abaixo:
Citopenia sem explicao
Morfologia com displasia de duas linhagens
Anormalidade citogentica clonal adquirida em clulas
hematopoticas
Blastos 5% na medula ssea
Fonte: Hasle et al.,2003
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Quadro 2. Classificao da SMD (Sndrome Mielodisplsica) na infncia de acordo com a OMS (Organizao Mundial da Sade).
Fonte: Hasle et al.,2003.
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Na infncia, algumas formas de SMD so iguais as do adulto, como a
anemia refratria (AR) e a anemia refratria com excesso de blastos (AREB-t), mas
algumas, ainda no foram diagnosticadas, como a anemia sideroblstica em anel e
a leucemia mielomonoctica crnica, entidade bem definida com caractersticas
prprias do adulto. Independente do grupo em que esteja definido o diagnstico,
cerca de 1/3 dos pacientes com SMD evoluem para LMA (Hasle et al., 1995; Lopes
e Lorand-Metze,1999).
Uma entidade muito discutida pela difcil classificao morfolgica na
infncia a leucemia mielomonocitica juvenil (LMMJ), que ora se apresenta com
achados de SMD e ora de sndrome mieloproliferativa (SMP). H dificuldades de
diagnstico devido heterogeneidade da doena. Como malignidade rara,
representa menos de 2% das leucemias da infncia e na maioria das vezes ocorre
na infncia precoce (em lactentes) e, principalmente, no sexo masculino. Os
pacientes apresentam episdios de infeces recorrentes, anemia, rash cutneo,
hepatoesplenomegalia e linfoadenomegalia generalizada. Os achados laboratoriais
mostram leucocitose (
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pacientes com SN apresentam mutao na linhagem germinativa, no proto-
oncogene PTPN11. Este gene codifica a protena fosfatase 2 tirosina (SHP-2) que
exerce importante papel na via de transduo de sinal da hematopoese, liberando
sinais de ativao para receptores de fatores de crescimento ligadora para o gene
Ras. Mutaes dos genes PTPN11, KRAS2, NRAS e NF1 so encontradas em
conjunto nos pacientes com LMMJ. Estes dados apiam a hiptese de que a
hiperativao da via de sinalizao Ras exerce um papel central na LMMJ (Hess et
al., 1996; Kratz et al., 2005). A monossomia do cromossomo 7 a anomalia
citogentica mais encontrada, principalmente, em crianas com desordem mielide
e, desta forma, pode ser identificada em todos os subtipos de SMD, assim como na
LMA, sendo tambm um achado freqente na LMMJ (Kelleher et al., 1991; Yeilipek
et al., 1994).
As crianas portadoras de sindrome de Down (SD) apresentam
frequentemente, na primeira infncia, displasia hematopotica, antes de
apresentarem franca leucemia (Zipursky et al.,1994). Cerca de 10% das crianas
com SD nascem com a mielopoese anormal transitria (MAT) que na maioria dos
casos regride espontaneamente, ao redor dos 3 meses de vida e, raramente
evoluem com quadro fatal de fibrose medular e insuficincia renal (Zipursky et
al.,1994,2003; Zwaan et al., 2010). Estudos citolgicos, imunolgicos,
ultraestrutural e molecular das clulas blsticas dos portadores de MAT mostram
que as clulas precursoras dos megacaricitos apresentam achados comuns dos
progenitores eritride e megacarioctico. Mas, quando a leucemia desenvolve
predominantemente uma proliferao megacarioblstica aguda (Xavier et al.,
2009). Cerca de 30% dos portadores de MAT apresentam leucemia aguda nos
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quatro primeiros anos de vida e provvel que alteraes adicionais ocorram para
transformao da MAT em LMAK (Taub, 2004).
Atualmente, existe considervel interesse em relatos da mutao somtica
adquirida no xon 2 do gene de transcrio eritride/megacaricito, o GATA-1. A
mutao deste gene em crianas com SD est diretamente relacionada com LMA-
K e MAT, indicando que a primeira doena derivada da segunda (Li et al., 2005;
Emerenciano et al.,2006). Malkin et al. (2000) mostraram que a protena p53
fundamental para diferenciao megacarioctica e que mutao do gene TP53
pode levar ao desenvolvimento de LMA-K em portadores de SD.
Tm sido observadas alteraes cromossmicas nos portadores de SD com
trissomia 21 ou mosaisismo, assim como, nos portadores de MAT (Zubizarreta et
al.,1995). Estas alteraes cromossmicas no diferem das encontradas nos
pacientes com SD e leucemias agudas, o que demonstra que h algo em comum
entre as duas entidades. A principal alteraco cromossmica descrita na SD (+21
constitucional) com SMD/LMA a trissomia 8, a qual parece participar do processo
mieloproliferativo (Zipursky et al., 1994; Creutzig et al., 1996). Outras alteraes
descritas nestes pacientes so duplicaes 1q ou, mais comumente, trissomia
parcial desta regio que pode ter um importante papel na patognese da doena
(Fong e Brodeur 1987; Blann et al., 2000).
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2.3 Diagnstico das leucemias no lactente
Para um diagnstico preciso das leucemias no lactente necessrio um
algoritmo de exames sequenciados, como mostra o fluxograma no Quadro 3.
Quadro 3. Fluxograma para o diagnstico das leucemias no lactente.
Confeccionada pelo autor, de acordo em Bain, 2001 e Hasle et al.,2003.
LLA: Leucemia linfide aguda de linhagem T ou B
MO: Leucemia mielide aguda sem diferenciao
M1: Leucemia aguda sem maturao
M2: Leucemia mielide aguda com maturao
M3: Leucemia promieloctica aguda e a variante M3v
M4: Leucemia mielomonoctica aguda e a variante M4eo
M5: Leucemia monoblstica
M6: Eritroleucemia
M7: Leucemia megacarioctica aguda
SMD/LMMJ-Sndrome mielodisplsica/Leucemia mielomonoctica Juvenil MAT Mielopoese Anormal Transitria
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2.3.1 Morfologia
At meados da dcada de 70, os diversos tipos de leucemias eram
classificados pelos seus aspectos morfolgicos, no havia um consenso para
distinguir corretamente as leucemias linfoblsticas e mieloblsticas. Entretanto, em
1976, aps a uniformizao das leucemias agudas pelo grupo Franco-Americano-
Britnico (FAB) e com a introduo das reaes citoqumicas, muitos diagnsticos
foram definidos (Bennett et al, 1976). Mas, o diagnstico da leucemia linfoblstica
continuava sendo feito por excluso, pois os estudos das reaes citoqumicas,
no eram suficientes para diferenciar as leucemias de linhagem mielide.
Atualmente, a classificao FAB continua com importncia no diagnstico,
mas tem valor limitado no prognstico. Na classificao FAB, a LLA apresenta dois
principais subtipos, L1 e L2, que so baseados no tamanho celular, basofilia
citoplasmtica, tamanho do ncleo, padro de cromatina nuclear e presena de
nuclolos. Enquanto na LMA so descritos oito subtipos, de MO-M7, com algumas
variantes, baseadas no tamanho celular, presena ou ausncia de granulaes
citoplasmticas, forma e tamanho do ncleo, padro de cromatina e presena de
nuclolos (Bennett et al.,1976,1991). Nos lactentes, os subtipos mais freqentes
so M4, M5 e M7, h poucos casos descritos de M1 e M2 e raros os casos com
M4eo e M3 (Biondi, 1994; Pui, 1995; Silva et al., 2008).
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2.3.2 Imunofenotipagem
Com o progresso das tcnicas imunolgicas, surgiu a imunofenotipagem, cujo
princpio utiliza um anticorpo monoclonal dirigido para o antgeno presente na
clula leucmica. Este mtodo revela com preciso a natureza das clulas
blsticas e a fase celular na qual ocorreu a parada do processo de maturao
celular que originou o clone leucmico. Uma das mais importantes contribuies
desta metodologia foi a deteco precoce da mieloperoxidase em clulas com
morfologia indiferenciada, cujas reaes citoqumicas eram negativas. Assim,
muitos casos de leucemias agudas, antes consideradas indiferenciadas, puderam
ser classificados como leucemia mielide com diferenciao mnima (LMA-M0) ou
como leucemias de clulas pluripotentes. A imunofenotipagem tambm permitiu o
diagnstico da leucemia megacarioblstica e dos casos de leucemias com
expresso de marcadores de mais de uma linhagem, conhecida como leucemias
ambguas que so as leucemias bilneas e bifenotpicas (Foon e Todd, 1986;
Bennett et al., 1991).
A citometria de fluxo na LLA permite classificar de linhagem B em pr-B,
CALLA e pr-B (presena da imunoglobulina de superfcie intracitoplasmtica) e a
LLA de linhagem T em pr T, Pr-T e T madura (Jennings e Foon, 1997). Nos
lactentes menores que 12 meses, o subtipo pr- B o mais encontrado, aps esta
faixa etria comeam a surgir os casos de LLA- CALLA. So raros os lactentes
com LLA pr-B, assim como, de linhagem T (Emerenciano et al., 2007). A
incorporao da imunofenotipagem, citogentica e biologia molecular
classificao morfolgica, originou a classificao MIC-M para leucemias agudas,
que agrupa as leucemias com a finalidade de reconhecer entidades especficas
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Ma Marques-Salles , TJ Estudos Citogenticos na Leucemia do Lactente
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que diferem em suas etiologias, mecanismos de leucemognese, achados clnicos
e hematolgicos, prognstico, assim como, a otimizao do tratamento (Bain,
2001).
2.3.3 Citogentica Convencional
Nos anos 70 a introduo de tcnicas de identificao cromossmica foi de
grande importncia para a etiologia clonal das leucemias agudas. Os estudos feitos
nas dcadas de 60 e 70 demonstraram que clulas tumorais apresentavam
marcadores cromossmicos recorrentes com importncia diagnstica e prognstica
(Chaganti et al., 1979). Secker-Walker et al. (1997) foram os primeiros a
demonstrar que o nmero de cromossomos estava relacionado com a evoluo
clnica e o prognstico nas crianas portadoras de LLA.
O estudo citogentico classifica a LLA de acordo com o nmero modal de
cromossomos em cinco grupos. Grupo hiperdiplide, dividido em: hiperdiplide I
(47 a 50 cromossomos) e hiperdiplide II (mais de 50 cromossomos); Grupo
hipodiplide (menor de 46 cromossomos); Grupo com caritipo normal (46
cromossomos sem alteraes estruturais evidentes) e grupo pseudodiplide (46
cromossomos, com alteraes estruturais e/ou numricas) (Raimondi, 1993; Heim
e Mitelman, 1995).
O grupo hiperdiplide I representa de 10 a 15% da LLA da infncia. Neste
grupo o ganho de alguns cromossomos, como +8, +10, +21 e +X so observados,
sendo a trissomia do cromossomo 21, a mais frequente, seguida dos cromossomos
X, 8 e 10. As alteraes estruturais mais frequentemente encontradas, em 6% dos
casos, foram anomalias do 1q, 6q, 12p e 19p (Raimond et al.,1992).
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O grupo hiperdiplide II se divide em hiperdiploidia com 51 a 68
cromossomos, casos com near-triploidia (69 a 81 cromossomos) e casos com near
tetraploidia (82 a 94 cromossomos). O primeiro subgrupo observado em 25% a
30% das LLA da infncia, e tem como caracterstica um bom prognstico, ou seja,
melhor resposta ao tratamento. A hiperdiploidia encontrada em crianas entre 2 e
10 anos com leucometria no muito elevada, fentipo CALLA (CD10) e tem como
caractersticas comuns cpias extras dos cromossomos 4, 6, 10, 14, 17, 18, 20, 21
e X, duplicao do 1q e isocromossomo 17q, em alguns casos. O ganho isolado do
cromossomo 21 uma anormalidade comum na LLA, ocorrendo em 20% dos
casos com alterao citogentica e mais de 90% dos casos com hiperdiploidia com
mais de 50 cromossomos (Raimondi et al.,1992; Paulsson et al., 2005).
O grupo pseudodiplide ocorre em 40% dos casos, enquanto o grupo com
caritipo normal (sem alterao cromossmica detectvel pela citogentica
convencional) compreende de 10 a 15%. O grupo hipodiplide observado em 7 a
8% das LLA da infncia. Na maioria destes casos, h perda do cromossomo inteiro,
translocaes no balanceadas e formao de cromossomos dicntricos
(Raimondi, 1993).
O estudo citogentico, alm de ajudar no entendimento da fisiopatologia, tem
sido muito importante para estabelecer fatores de risco no tratamento das
leucemias. Enquanto os caritipos com hiperdiplidia II esto associados a um
prognstico favorvel e devem ser tratados apenas com quimioterapia para baixo
risco, os pacientes com caritipos hipodiplide ou com translocaes
cromossmicas como t(1;19), devem ser tratados com quimioterapia para alto risco
e os portadores de t(4;11) e t(9;22), alm de quimioterapia, devem realizar
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transplante de medula ssea em primeira remisso (Ribeiro e Pui, 1993; Heerema
et al., 1999, Isoyama et al., 2002).
Na LMA, as alteraes cromossmicas especficas podem ser de dois tipos,
rearranjos cromossmicos balanceados, como translocaes e inverses. Estas
alteraes causam fuso de genes que esto envolvidos na regulao e na
diferenciao celular. Os rearranjos cromossmicos no balanceados envolvem
perda ou deleo de genes contribuindo para a transformao maligna por perda
da funo de genes supressores de tumor (Pedersen-Bjergaard e Rowley, 1994).
O estudo citogentico na LAL bastante peculiar, os fatores prognsticos
encontrados em outras leucemias agudas, como t(9;22) e a hiperdiploidia sem
alteraes estruturais, so raros (Lampert et al.,1992). As anormalidades
citogenticas basicamente envolvem a regio 11q23, onde encontrado o gene
MLL. Este gene atua em translocaes com diversos parceiros, atualmente j
foram descritas mais de 54 translocaes (Johansson et al.,1998; Heerema et
al.,1999). As translocaes envolvendo a regio 11q23 ocorrem em 80% das LLA e
em 50% das LMA, sendo as mais frequentes: a t(4;11) na LLA e a t(9;11) na LMA,
enquanto a translocao t(11;19) ocorre em ambos tipos de leucemias.
Praticamente todos os casos de leucemia ambgua apresentam algum tipo de
rearranjo do gene MLL (Fig.7). Alguns casos com caritipo hiperdiplide esto
associados translocao t(1;22), especfica da LMA-M7 do neonato (Carroll et al.,
1991; Lion et al., 1992).
O valor de mau prognstico do rearranjo do gene MLL para maioria dos
subtipos de leucemia do lactente estabelecido. Entretanto, outras anormalidades
da regio 11q23 tais como, deleo e inverso, nas quais o MLL no est
rearranjado, apresentam melhor evoluo clnica, exceo so os casos de LMA-
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Ma Marques-Salles , TJ Estudos Citogenticos na Leucemia do Lactente
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t(9;11), na qual existe o rearranjo do MLL, mas no apresentam impacto negativo
no prognstico (Raimondi et al., 1995; Behm et al., 1996, Secker-Walker, 1998).
Uma translocao especfica e bem estabelecida em lactente com LLA que no
envolve o gene MLL e associada a bom prognstico a t(5;15)(Heerema et
al.,1994; Silva et al.,2001).
Figura 7-- Distribuio da frequncia dos genes parceiros do MLL na infncia. Os principais genes de fuso so: AF4, nas LLA; AF9 na LMA e o ENL em ambas. A fuso do MLL encontrada em praticamente todos os casos de leucemia bifenotpica. Fonte: Krivtsov e Armstrong, 2007.
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2.3.4 Citogentica Molecular: FISH, M-FISH, MCB, mMCB
Um grande nmero de alteraes cromossmicas humanas tem sido
definidas por tcnicas citogenticas convencionais. Contudo, muitos pacientes
apresentam pequenas delees ou alteraes interstciais que no podem ser
detectadas atravs do bandeamento G. Em adio, cromossomos marcadores ou
alguns rearranjos cromossmicos podem ser difceis, ou mesmo, impossveis de
ser definidos por tcnica convencional. A tcnica de hibridizao in situ
fluorescente (FISH) e suas variantes (caritipo espectral-SKY, FISH-multicolor,
bandeamento multicolorido - MCB) tm ajudado nestes casos e atualmente tem
grande importncia metodolgica na deteco e confirmao de anormalidades
cromossmicas humanas (Schrock et al., 1996; Speicher et al., 1996; Liehr et
al.,2009).
Na tcnica de FISH as sondas so preparadas apartir de nucleotdeos,
fragmentos ou seqncia de DNA especficos, que so ligadas a uma cadeia de
DNA complementar (DNA alvo) no cromossomo a ser estudado. Para localizao
do DNA alvo, aplicado um anticorpo marcado com corante fluorescente. A anlise
feita em microscopia de fluorescncia. Desta forma, a FISH permite a localizao
precisa de genes ou seqncias de DNA diretamente nos cromossomos. Existem
diversos tipos de sondas cromossmicas (tabela 2); a CEP (marca o centrmero do
cromossomo), WCP (sonda de cromossomo inteiro), sonda especfica do telmero
e as que so especficas de determinadas regies ou genes especficos, entre
outras (Liehr e Pellestor, 2009)
A tcnica de FISH pode ser realizada em metfases ou ncleos interfsicos
de material como sangue perifrico, medula ssea, alm de peas tumorais. Essa
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tcnica tem produzido um considervel impacto na anlise citogentica por permitir
uma anlise rpida de um grande nmero de clulas, ao mesmo tempo em que
favorece o diagnstico de diversas neoplasias. Alm disso, a utilizao de sondas
do cromossomo inteiro e regies especficas tm permitido caracterizar diferentes
rearranjos cromossmicos.
Tabela 2. Diferentes classes de sondas comumente usadas para anlise de
FISH em laboratrios clnicos
Fonte: Liehr e Pellestor, 2009.
Tipo
Intensidade da
Fluorescncia
Aplicao
Sondas para
regies especficas
Sonda Centromrica
Forte Identifica alteraes numricas; monossomias; trissomias.
Sonda Telomrica Moderada a fraca Identifica rearranjos envolvendo o telmero
Sondas para cromossomos inteiros ou de partes dos cromossomos
Sonda WCP e PCP Forte a moderada
Identifica pequenos marcadores ou alteraes quando o bandeamento G for inconclusivo.
Sondas
locus especfica
para translocao e sondas gnicas
Moderada Detecta translocaes em metfases ou ncleos interfsicos
Microdeleo Moderada Detecta microdelees em metfases
Amplificao Gnica Forte Detecta aumento no nmero de copias gnicas em metfases e/ou em ncleos interfsicos
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No estudo das leucemias, a tcnica de FISH pode ser realizada em clulas
em metfase ou em ncleos interfsicos de sangue perifrico e/ou medula
ssea, contribuindo para preciso no diagnstico cromossmico das diversas
leucemias. Como o rearranjo do gene MLL freqente na LAL, a aplicao
desta tcnica fundamental para o diagnstico e prognstico da doena, (Huret,
2005). A figura 8 mostra as regies onde a sonda hibridizada no cromossomo
11, com sua regio 3 marcada em vermelho e 5 em verde. Qualquer ruptura
desta regio com consequente translocao produzir a separao dos sinais de
fluorocromos verdes e vermelhos como exemplicado na figura 9.
Figura 8. Marcao da regio 11q23 com a sonda MLL LSI espectro veremlho e verde. Fonte: http://www.abbottmolecular.com/ LSIMLLDualColorBreak ApartRearrangementProbe_5318.aspx
http://www.abbottmolecular.com/%20LSIMLLDualColorBreak%20%20Aparthttp://www.abbottmolecular.com/%20LSIMLLDualColorBreak%20%20Apart
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Figura 9. Metfase e ncleo interfsico com rerranjo do gene MLL. H trs sinais, um que corresponde a fuso dos fluorocromos verde
e vermelho, dando cor amareladado encontrada no gene normal e outros dois, verde e vermelho, separados que corresponde a translocao do referido gene. Fonte: http://www.abbottmolecular/ LSIMLLDualColorBreakAparRearrangmentProbe_5318.aspx
As tcnicas SKY e M-FISH so variantes da tcnica de FISH e permitem
visualizar simultneamente todos os cromossomos humanos, em diferentes cores.
Estas tcnicas tm a finalidade de elucidar a ocorrncia de rearranjos
cromossmicos tais como translocaes, inseres e alteraes estruturais
complexas, facilitando consideravelmente a anlise do caritipo. Em ambas as
tcnicas, as sondas so originadas da marcao e amplificao de cada um dos 24
cromossomos, por DOP-PCR, degenerate oligonucleotide-primed PCR. Esta
tcnica permite a amplificao aleatria do DNA e utiliza sequncias degeneradas
de nucleotdeos. Ambas, SKY e M-FISH usam um esquema combinatrio ligado a
fluorocromos distinguveis espectralmente, mas os mtodos diferem aps a
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hibridizao in situ, na deteco e discriminao de diferentes combinaes de
fluorescncia (Schrock et al.,1996; Speicher et al.,1996).
Na tcnica de SKY a imagem adquirida na combinao de microscopia
epifluorescente, imagem CCD (charge-coupled device) e um espectofotmetro de
Fourier. Este aparelho mede a emisso inteira de uma nica exposio, em todos
os pontos da imagem. Na tcnica de M-FISH imagens separadas so capturadas
de cada um dos cinco fluorocromos usando filtros de microscpios, estas imagens
so ento, combinadas em um software. Ambas as tcnicas usam pseudocores
para os cromossomos baseados em seus fluorocromos especficos (Speicher et
al.,1996; Trask, 2002). A figura 10 ilustra os fluorocromos usados para obter cores
especficas para os 24 cromossomos.
Figura 10- Fluorocromos usados na identificao dos cromossomos no M-FISH. Uma coluna de 5 cores corresponde aos 5 fluorocromos indicados. A combinao destas cores compe os 24 cromossomos humanos. Fonte: Liehr et al.,2009.
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Como as tcnicas de M-FISH e a de SKY, outras tcnicas tem sido descritas
com a mesma finalidade, entre outras: o FISH 24 cores, FISH COBRA (FISH de
ligao de taxa de combinao binria), CCK (cariotipagem de mudana de cor).
Apesar de todos esses mtodos permitirem reduzir o tempo de anlise e facilitar a
deteco de rearranjos cromossmicos (translocaes, inseres) e identificao
de cromossomos marcadores, ainda tm sido descritas limitaes quanto a exata
localizao do ponto de quebra das translocaes, assim como identificao de
delees, duplicaes e inverses (Trask, 2002, Liehr et al., 2009).
A tcnica de bandeamento multicolorido (MCB) (Fig.11) foi inicialmente
desenvolvida e testada no cromossomo 5 por Chudoba et al.(1999), posteriormente
est tcnica foi desenvolvida por Liehr et al. (2002) para os 24 cromossomos
humanos.
Figura 11. MCB (Bandeamento Multicolorido). As bandas e sub-bandas so
marcadas com os fluorocromos especficos de cada regio. Facilita a determinao do ponto de quebra em casos de translocaes, delees e inverses dos cromossomos. Fonte: Liehr et al, 2009.
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A tcnica de MCB foi introduzida com o intuito de determinar a exata
localizao do ponto de quebra nos cromossomos. Esta tcnica pode ser alinhada
com o bandeamento G, mas independente do comprimento do cromossomo
analisado apresentando uma maior resoluo, quando comparado ao
bandeamento G. O MCB permite a diferenciao de reas de regies
cromossmicas em bandas e sub-bandas. Est tcnica permitiu a realizao de
uma biblioteca com 138 regies cromossmicas, atravs da tcnica de
microdisseco ao nvel de 450-550 bandas especficas do genoma humano e,
analisa atravs de um sistema com pseudocores diferentes, nas regies
cromossmicas especficas. Esta metodologia tem sido extremamente til no
esclarecimento dos rearranjos mascarados em caritipos complexos (Liehr et al.,
2009).
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3 OBJETIVOS
3.1 Objetivos Gerais
Este trabalho teve como objetivo realizar um estudo do tipo srie de casos
(retrospectivo e prospectivo), para identificar e caracterizar as alteraes
cromossmicas em crianas entre 0- 22 meses com leucemia, nos laboratrio de
Citogentica do Centro de Oncohematologia Peditrica (CEONHPE)/Recife e do
laboratrio do Centro de Tansplante de Medula ssea do Instituto Nacional do
Cancer (CEMO-INCA)/RJ, no perodo de julho 2000 a agosto 2010.
3.2 Objetivos Especficos
1. Definir os achados citogenticos divididos por faixa etria (< de 6 meses, de 6
meses at 12 meses; >12 meses at 22 meses);
2. Relacionar a classificao morfolgica (subtipo FAB) com os achados
citogenticos;
3. Descrever as alteraes cromossmicas constitucionais associadas leucemia
do lactente;
4. Verificar a frequncia do rearranjo do gene MLL nos portadores de LA do
lactente at a idade de 22 meses;
5. Caracterizar molecularmente o rearranjo do gene MLL e quando indicado outros
rearranjos, em ncleos interfsicos atravs do FISH nos pacientes sem
metfases;
6. Caracterizar molecularmente caritipos complexos e alteraes cromossmicas
crpticas atravs do FISH, M-FISH e MCB.
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4. Material e Mtodos
4.1 Pacientes
Foram estudadas as caractersticas clnicas e citogenticas de 83 crianas
portadoras de leucemia de novo, com idade inferior a 22 meses, que deram
entrada nos laboratrios de citogentica do CEONHPE e do CEMO/INCA-RJ no
perodo de julho 2000 a agosto 2010.
4.2 Mtodos
4.2.1 AAmostras
As amostras de medula ssea (MO) dos pacientes foram colhidas nos
referidos centros de diagnstico e tratamento. Para o diagnstico da doena foi
realizada uma puno diagnstica da medula ssea e 5 lminas para
citomorfologia e reaes de citoqumica. Nesta ocasio foram retirados entre 5 a 10
mL de sangue da medula ssea, em seringas estreis e heparinizadas, que foram
enviadas para os laboratrios de citogentica e de marcadores celulares, dos
respectivos centros. Os estudos citogenticos moleculares pelas tcnicas M-FISH e
MCB, entre outras tcnicas, foram realizados no laboratrio de gentica do Instituto
de Antropologia e Genetica Humana da Universidade de Jena/Alemanha.
4.2.2 Citogentica Convencional
As preparaes cromossmicas foram realizadas a partir de cultura de
medula ssea (MO) e/ou sangue perifrico (SP) utilizando tcnicas de obteno e
identificao cromossmica, de acordo com Testa et al. (1985). As clulas da MO
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e/ou SP de cada paciente foram cultivadas em meio de cultura composto de RPMI
1640 (SIGMA) e soro bovino fetal (20%) em tubos Falcon. As clulas foram
incubadas durante 24 horas em estufa a 37 C. Aps 22hs foi adicionada colchicina
(SIGMA) na concentrao de 0,05g/mL. No fim da incubao as culturas foram
retiradas e as lminas testes foram confeccionadas. Para anlise cromossmica
convencional as lminas foram coradas com Giemsa a 2% (Merck) diludo em
tampo fosfato (pH 6,8) por 6 minutos, para verificao do ndice mittico e
qualidade das metfases.
4.2.3 Bandeamento G
O bandeamento G foi realizado segundo Seabright (1971), com
modificaes. Os cromossomos foram identificados e classificados de acordo com
o ISCN (2009). A anlise cromossmica foi realizada em microscpia ptica e a
documentao realizada com o sistema de captura de imagens Cytovision da
Applied Imaging. Para cada paciente foram analisadas 20 clulas. Um caso foi
considerado anormal quando mais de trs metfases apresentaram a mesma
alterao cromossmica. A presena de clulas normais, concomitantes com as
clulas anormais, foi usada como parmetro para afastar a possibilidade de uma
alterao cromossmica constitucional. A excluso de alteraes constitucionais foi
realizada nos pacientes com 100% de alteraes cromossmicas no recorrentes
e, naqueles com anomalia dos cromossomos X e Y, atravs da anlise cariotpica
do sangue perifrico, estimulado por fitohemaglutinina.
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4.2.4 Citogentica Molecular
4.2.4.1 Hibridizao in situ Fluorescente (FISH)
A sonda LSI MLL Dual Color break apart (Abbott Molecular/Vysis) foi usada
na anlise do rearranjo do gene MLL nos lactentes estudados. Os casos com
rearranjos cromossmicos complexos e/ou suspeitos de outras anormalidades,
para confirmao da citogentica clssica, foram estudados tambm com sondas
comerciais para outros genes alvos especficos tais como: LSI BCR/ABL (Abbott
Molecular/Vysis), para a translocao t(9;22); LSI TEL/AML1(Abbott
Molecular/Vysis), para a translocao t(12;21), WCP7(Abbott Molecular/Vysis), de
acordo com a metodologia do fabricante. Foram utilizadas tambm em alguns
casos sondas centromricas e subcentromricas, assim como as tcnicas de M-
FISH, MCB e mMCB (sondas de fabricao prpria cedidas pelo laboratrio de
citogentica molecular do Instituto de Gentica Humana e Antropologia da
Universidade de Jena, Alemanha).
1. Pr-tratamento das lminas as lminas foram preparadas com o
material a ser estudado um dia anterior ao procedimento, em seguida foram
colocadas em uma soluo crescente de etanol 75%, 95% e 100% por 3 minutos
cada. Posteriormente, as lminas foram colocadas em uma soluo 10 mM HCL e
500uL de pepsina (20mg/mL) a 37 C por 5min. Em seguida em PBS1X por 5
minutos, e ento numa fixao com a soluo de formaldedo com cloreto de
magnsio por 10min. Aps este perodo foram lavadas em PBS por 5 minutos e em
seguida novamente desidratadas na srie crescente de etanol, 70%, 90% e 100%
(3 minutos para cada concentrao).
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2. Desnaturao do DNA Cromossmico e das Sondas a desnaturao foi
realizada simultaneamente numa placa aquecedora a 73 C por 3 minutos e em
seguida as lminas foram colocadas para hibridizao em camara mida a 37C
por 24h para o FISH e MCB e 72h para o M-FISH
3. Lavagem ps-hibridizao - Foi realizada com 1XSSC a 62-65 C por 5
minutos. Em seguida as lminas foram lavadas numa soluo de 0,4x SSC:
IGEPAL a TA (temperatura ambiente) por 5 minutos sob agitao. Em seguida,
foram colocadas no PBS1X por 5 minutos e ento lavadas com gua deonizada.
Aps este perodo as lminas foram desidratas em soluo crescente de etanol,
70%, 90% e 100% (3 minutos cada). Aps a secagem das lminas foi aplicado o
corante DAPI (Vysis).
4. Anlise As anlises citogenticas foram realizadas em microscpio de
fluorescncia Olympus BX 51 e a documentao atravs do sistema da captura de
imagens Cytovision (Applied imaging).
4.2.4.2 FISH multicolorido (M-FISH) e bandeamento multicolorido de todos os cromossomos (mMCB)
Para a realizao do M-FISH e mMCB foram aplicadas 24 sondas de
cromossomos inteiros humanos contendo cinco fluorocromos Rodamina, Vermelho-
Texas, FITC (fluorescein isothiocyanate), DEAC (diethylaminocoumarin), Cyanine
5, fornecendo um padro diverso de pseudocores para cada cromossomo. As
imagens foram capturadas processadas e analisadas utilizando um microscpio de
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fluorescncia equipado com Sistema de captura digital para FISH e programas
para anlise de imagem, ISIS (MetaSystem) Heidelberg/Alemanha.
4.2.4.3 Bandeamento cromossmico multicolorido (MCB)
Para o MCB foram aplicadas sondas marcadas com cinco fluorocromos
diferentes para regies (bandas) especficas de cada cromossomo, seguindo a
tcnica introduzida por Liehr et al.(2009). Tanto para a tcnica M-FISH como para a
tcnica MCB os procedimentos foram os mesmos usados para a tcnica de FISH
com a diferena que as sondas estavam com marcao indireta e sofreram
procedimentos especficos como descrito a seguir.
As sondas foram diludas em tampo de hibridizao (dextran sulfato) com o
COT1 (Roche, cat no. 158074), sendo 10 mg para o MCB e 25 mg para o M-FISH,
a seguir desnaturadas no termociclador por 5 min a 75 C, posteriormente a 4 C
por 2 minutos e logo a seguir a 37 C por 30 minutos. A desnaturao do material
biolgico foi feita com formamida 70% em uma placa aquecedora 73-74 C por 3
minutos, em seguida colocadas em soluo de etanol 70% a -20 C,
posteriormente a 95% e 100%, 3 minutos cada. Aps as lminas estarem secas
foram aplicadas as sondas e vedadas com uma lamnula com uma cola especfica
para hibridizao, e colocadas em uma cmara mida por 24 horas para as sondas
WCP e MCB e 72 h para o M-FISH e mMCB.
Aps esta etapa, as lminas sofreram lavagens rpidas semelhante ao
FISH, sendo feita outra etapa com uma soluo (Marvel 0,2g e 2 mL do 0,4SSC-
Tween) prpria para lavagens de lminas que foram hibridizadas com sondas
biotinizadas e/ou digoxigenadas. De acordo com a sonda a ser utilizada, foram
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Ma Marques-Salles , TJ Estudos Citogenticos na Leucemia do Lactente
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aplicados anticorpos especficos. Em caso de sondas marcadas com biotina o
anticorpo usado foi a Streptavidina marcada com FITC (1:250) ou Cy5 (1,5:50) e,
para digoxigenina, a antidigoxigenina, marcada com Rodamina ou Fluorescena (1-
8:10). Aps aplicao dos anticorpos, as lminas foram levadas para cmara mida
a 37 C por 40 minutos. A seguir foram lavadas por duas vezes no 4x SSCTw e
uma vez na gua deionizada e ento desidratadas em soluo crescente de etanol
70-95-100%. Em seguida as lminas foram coradas com o DAPI e mantidas a 25
C podendo ser analisadas em at 30 dias. As anlises foram feitas no microscpio
Zeiss, programa Isis MetaSystem, seguindo o ISCN (2009).
5. ASPECTOS TICOS
O projeto foi submetido ao Comit de tica do Hospital Universitrio
Oswaldo Cruz (HUOC/UPE) e do Instituto Nacional do Cncer (INCA/RJ) (Anexo
1). Os pais ou responsveis pelos pacientes foram orientados sobre a proposta de
estudo e foram informados de todos os critrios para a incluso no projeto e
assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 2).
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6. RESULTADOS
No perodo de julho de 2000 a agosto de 2010 foram estudados 83 lactentes
(0 - 22 meses), portadores de leucemias de novo. Os diagnsticos foram assim
especificados: 73 pacientes com LAL, sendo 47 LLA, 23 LMA e trs leucemias com
linhagem ambgua. Dez casos foram classificados como SMD, sete como doena
em portadores de SD, seis eram portadores de LMA e um caso de MAT, uma
paciente neurofibromatose foi includa neste grupo. Um paciente foi classificado no
grupo SMP/SMD e um com AREB-t no grupo de SMD (figura 12). Dos 83 lactentes,
24% eram
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Ma Marques-Salles , TJ