新製品Thermo ScientificTM OrbitrapTM ID-XTM TribridTM

Mass Spectrometer のご紹介

INTRODUCTION

2018年米国質量分析学会（ASMS）でローンチされたOrbitrap ID-XT ib id M S t t は 低分子構造解析に有用な ドウ ア

武川 泰啓サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社 CMDアプリケーション部

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AcquireX従来 DDA(data dependent scan)にて微量な成分まで取こぼしなく

Novel Data Acquisition Advanced Data Processing

MSn による異性体の区別下図では 2種のフラボノイド異性体のMSnスペクトルを示していますTribrid Mass Spectrometerは、低分子構造解析に有用なハードウェア

の改良、微量成分まで取りこぼしなくMS/MSデータを自動取得可能な新しいデータ取得方法（AcquireX)、取得したデータを効率よく解析可能なソフトウェア（Thermo Scientific Compound DiscovererTM 3.0、Thermo Scientific Mass FrontierTM 8.0）により、これまでにない有用な情報をサンプルから引き出すことが可能になりました。

従来、DDA(data-dependent scan)にて微量な成分まで取こぼしなくMS/MSスペクトルを取得するためには、取得したデータをマニュアルまたはソフトウェアで解析した後、inclusionリスト／exclusionリストを次の分析メソッドにマニュアルで組み込む等の多大な労力と時間が必要でした。一方、AcquireXは自動でinclusionリスト／exclusionリストを作成し、それらを組み込んだ分析メソッドによって一連の測定を完了することができる新しいデータ取得方法です。マニュアル作業を必要としないAcquireXによる測定では、比較的サイクルタイムの長いMSnや複雑なメソッドを用いたとしても、繰り返し測定を行うことで取こぼしのないMS/MS測定が可能になるため、より詳細な構造情報を簡便に引き出すことが可能です。

Orbitrap ID-X MS

Improved Instrumentation

Inclusion List

下図では、2種のフラボノイド異性体のMSnスペクトルを示しています。MS2スペクトルではこれら異性体の明確な区別は困難ですが、MS3スペクトルを取得することで異性体の区別が明確に行えます。

Query LibraryMS2

MS3OptaMaxTM NG

Figure 2 AcquireXの概要

MSn Substructure Searchによる部分構造の同定Substructure Searchは、大元の構造が異なっていたとしても、共通する部分構造のMSnスペクトルは類似性の高いスペクトルとなる事を利用して部分構造を同定する方法です。Mass Frontier 8.0では、取得したデータからMSnイオンツリーを作成し、mzCloud MSnスペクト

ルライブラリに対して検索することが可能で、化合物の部分構造の同定が可能になります。

Novel Data Acquisition

AdvancedData Processing

Thermo Scientific Orbitrap ID-X Tribrid Mass Spectrometer System

Ultra High Field Orbitrap Mass AnalyzerAccurate mass measurement and resolves isobaric species

Dual Pressure Linear Ion TrapSensitive MSn mass analysis of HCD and CID fragments

Ion Routing MultipoleAllows parallel analysisHCD at any fragmentation level

Mass Selection Quadrupole

BlankFull MSBlank

Full MSSampleFull MS

Sampleiterative

DDA

Sampleiterative

DDA

Sampleiterative

DDA

Exclusion List automatically updates run-to-run inclusion/exclusion lists

未知物質の部分構造がmzCloudライブラリとマッチ

Performance CharacteristicsMax resolution 500,000 at m/z 200Mass range m/z 50 to 2,000Scan rate OTMS2 30 HzScan rate ITMS2 40 HzQuad Mass Selection Precursor isolation to 0.4 amuIon Trap MSn Up to MS10

OptaMax NG ion source

Figure 6 Mass Frontier 8.0によるmzCloud substructure search

Optional Easy-IC Ion SourceGenerates internal calibrant ion for real-time mass calibration

Mass Selection QuadrupoleEfficient and selective precursor ion isolation

Active Beam GuidePrevents neutrals and high velocity clusters from entering mass selecting quadrupole S Lens

Efficiently focuses ions into a tight beam minimizing in-source dissociation of fragile compounds

Figure 3 AcquireXがサポートする3種のモード

①ブランクサンプル（あるいはマトリｯクスサンプル）の測定により、exclusionリストを組み込んだメソッドが作成される②exclusionリストが組み込まれたメソッドで実サンプルを測定

Deep Scan AnalysisモードExclusion & Component inclusionモード

Background exclusionモード

①ブランクサンプル（あるいはマトリックスサンプル）の測定により、exclusionリストを作成②実サンプルの測定により、inclusionリストを作成③inclusion/exclusionリストが組み込まれたメソッドで実サンプルを1回測定

①ブランクサンプル（あるいはマトリックスサンプル）の測定により、exclusionリストを作成②実サンプルの測定により、inclusionリストを作成③inclusion/exclusionリストが組み込まれたメソッドで実サンプルを測定④③でMS/MSを取得済みのプレカーサーをexclusionリストに加えたメソッドがアップデートされ、実サンプルを測定（2回目）⑤inclusion/exclusionリストがアップデートされたメソッドで必要に応じて繰り返し測定

Compound Class Based Flavonoid MSn Based Structure Annotation

Figure 1 Orbitrap ID-X Tribrid Mass Spectrometerの装置構成と性能

Mass Accuracy* Internal: < 1 ppm RMS, External: < 3 ppm RMSDissociation CID, HCD*under defined conditions

New Calibration Routineキャリブレーション方法の変更により、低質量領域の質量精度・安定性が改善しました。

mzLogicTMを利用した候補化合物のランキング

Improved Instrumentation

各スキャンポイントにおける優れた質量精度低質量領域(< m/z 1,000)の優れた

質量精度と安定性

pm)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

1 2 3 4 5

マスリストへ

のエントリー数

サンプルのインジェクション数

Inclusion Exclusion

• メタボライトサンプル(NIST SRM 1950 plasma extract ) 2 μl をThermo Scientific Hypersil GoldTM カラム(2.1 X 150 mm)にインジェクション

• 4,000以上のexclusionリストが自動生成

• 5,000以上のinclusionリストが自動生成

• Inclusionリストのサイズは再インジェクションするたびに減少する一方、exclusionリストのサイズは増加

AcquireX (Deep Scan)

g q す 種 pIdentification and Annotation

MS2 results MSn (n=2-5) results

Num

ber o

f Stru

ctur

es

Con

fiden

tly A

ssig

ned

62

129

• 市販のケールジュースをLC-MS/MSn測定

• Mass Frontier 8.0によるMSn substructure search により、フラボノイド類の部分構造を同定

• さらに、Compound Discoverer 3.0のフラボノイドマスリストとFISh スコアリングによりアノテーション

• MS2までの測定と比較し、MSn（n=2～5）まで測定したデータでは2倍以上の数のフラボノイドの同定が可能

Figure 7 化合物同定におけるMSnの有用性

Figure 4 メタボロミクス測定におけるTraditional DDAとDDA with Acquire X

Assisted CEAssisted CEは、イオントラップを利用してリアルタイムでコリジョンエネルギーを最適化し、決定した最適なエネルギーでFT-MS2スペクトルを取得する機能です。MS2

においてAssisted CEを利用することで、より多くのフラグメント情報の取得が可能となり MS3スペクトルのS/Nも改善します

gmzLogicは、ChemSpiderTM（MS1検索）サーチでヒットした膨大な化合物群を、mzCloudのSimilarityサーチ（MS2、MS3検索）でヒットしたフラグメ

ントの部分構造と照合し、共通の部分構造を見つけ、スコアリング（ランキング ） を行 う ツールです 。 Mass Frontier 8.0 お よび CompoundDiscoverer 3.0に搭載されています。

Query Spectrum

LC-MS mass measurement accuracy for a mixture of 24 small molecule standards conducted over 72 hours

Sub-ppm mass measurement accuracy for Creatine (theoretical MH+ 132.0768 Da) detected over the LC-MS elution profile

Mas

s ac

cura

cy (p

p

MS/MSが取得されたプレカーサーイオン数の比較(traditional DDA vs. DDA with AcquireX)

mzCloudTMでヒットした化合物数(Score<50)

のデータ比較となり、MS3スペクトルのS/Nも改善します。

Figure 8 MassFrontier 8.0によるmzLogic解析結果例

ChemSpider(MS1)データベースサーチ

mzCloud Similarity Search

①FTMS Scanとパラレルにイオントラップを利用して化合物ごとに複数のコリジョンエネルギーでactivationを行い、プレカーサーイオンの減少をモニターします。

②最適なコリジョンエネルギーはプレカーサーイオンの減少具合（デフォルト 20%以下）により決定されます。

③最適なコリジョンエネルギーによりFT-MS2 Scanが実行されます。

FT-MS3 スペクトルのS/Nの改善

E M

S2

-FT-

MS

3 S/N

Assisted CE Determination

NCE 35

• アンプレナビル(5 μM) とヒト肝ミクロソーム(1 mg/mL)をGSH、UDPGA、alamethicin存在下、37℃、1時間インキュベーション

• マトリックスサンプルを測定し、AcquireXによりexclusionリストとメソッドを生成

• 従来のDDAではメタボライト8種が同定されたのに対し、AcquireXでは21種のメタボライトが同定

• 従来のDDAと比較し、AcquireXではより微量

AcquireX(Background Exclusion）

NCE 20%でのMS/MSスペクトル

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LC-MS/MSn測定においてMS2でAssisted CEまたはStepped CEを用いて、FT-MS3データを取得した際のスペクトルのS/N比較

Ass

iste

d C

E

Stepped CEMS2 - FT MS3 S/NFigure 5 MetIDにおけるAcquireXの効果

従来のDDAと比較し、AcquireXではより微量なメタボライトまで同定

Assisted CEにより

最適化されたエネルギー(NCE 60%)でのMS/MSスペクトル