etude de l’activite antioxydante - bu.univ … · iv-2-1 dosage des composés phénoliques totaux...

UNIVERSITE KASDI MARBAH OUARGLA

Faculté des Sciences et Technologie et Sciences de la matière

Département de Génie des Procédés

Mémoire

MASTER ACADEMIQUE

Domaine : Sciences et Techniques

Filière : Génie des Procédés

Spécialité : Analyse et contrôle de qualité

Présenté Par : BOURAS Fatima Zohra et HOUCHI Abdelbassset

Thème

Devant le jury :

Le 23/06/2013

CHAOUCH Noura MAA UKMO Présidente

RAHMANI Zehour MAA UKMO Examinatrice

KENDOUR Zaouia MAA UKMO Encadreur

Année Universitaire : 2012 /2013

ETUDE DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE

DE LA PLANTES Rumex Vesicarius L

En premier lieu, nous tenons à remercier notre DIEU, notre créateur

pour nous avoir donné la force pour accomplir ce travail.

Nous tenons à exprimer nos vifs remerciements à tous nos professeurs qui

ont contribués à notre formation

Nous désirons exprimer notre profonde et vive reconnaissance à notre

encadreur, Melle

Kendour Zaouia,

Qui a mis toute sa compétence à notre disposition, pour ces directives et

Conseils judicieux et pour son suivi régulier à l’élaboration de

Ce modeste travail.

Nous voudrons aussi exprimer toute notre gratitude et nos remerciements

à tous les enseignants

Existés pendant le travail en laboratoire VPRS

(Laboratoire de valorisation et promotion de ressources sahariennes)

Pour les orientations et les conseils ainsi que le support documentaire

Nous remercions les membres du jury : Mell e

:Rahmani Zehour et

Melle

:Chaouche Noura d’avoir accepté de juger notre modeste travail.

Nous remercions également tous les membres de laboratoire de VPRS

qui nous ont beaucoup aidés à réaliser ce travail dans des bonnes

conditions

Nos derniers remerciements et ce ne sont pas les moindres, vont

À tous ceux qui ont contribué de près ou de loin pour

l’aboutissement de ce travail.

Dédicace A Ceux qui sont les plus chères au monde, nos

parents que dieu protège :

En témoignage de nos profondes affectations. Qu’ils

sachent que ce travail est en partie

Le fruit de leurs soutien ; nous leurs sommes très

reconnaissants. Leurs fiertés à nos

égard aujourd’hui est pour nous la meilleure des

récompenses.

A tous nos frères et toutes nos

Sœurs

Qui sont très chère.

A tous nos amis et à tous ceux Qui nous ont témoigné

leur affectation et leur soutien durant Ces longues

années

Liste des abréviations

A : Absorption.

AEAC : Ascorbique acide équivalent antioxydant capacité.

BHA: Butyl hydroxyanizole.

BHT: Butylhydroxytoluène.

DPPH : 1 ,1-diphényle-2-picrylhydrazyl.

λ max : longueur d’onde.

TCA : Acide trichlorure acétique.

Tris :(hydroxymethyl) aminomethanehydrochloride.

TBHQ : tertiobutyl-hydroxyquinone.

mg/g : milligramme par gramme.

g: gramme.

ml: millilitre.

min : minute.

nm : nanomètre.

μl: microlitre.

UV: Ultra-violet.

l:litre.

FRAP: Ferric Reducing Antioxidant Power.

I%: pourcentage d’inhibition.

IC50 : concentration inhibitrice IC50.

VC : vitamine C ou acide ascorbique

D : nombre de dilution

C : concentration

φ : phase.

m : masse.

0C : degré.

R : rendement.

% : pourcentage.

M : molaire.

mg/ml : milligramme par millilitre.

g/l : gramme par litre.

Liste des tableaux

Tableau I-1 : Classification des composés phénoliques 07

Tableau I-2 : Quelques exemples de coumarines 08

Tableau III-1 : les produits chimiques et les réactifs 21

Tableau III-2 : appareils et instruments 22

Tableau IV-1 : tableau récapitulatif regroupant les rendements des différents extraits 29

Tableau IV-2 : Quantité des phénols totaux dans les extraits 30

Tableau IV-3 : Quantité des flavonoïdes dans les extraits 32

Tableau IV-4: Les valeurs d’AEAC des différents extraits étudiés 33

Tableau IV-5 : les valeurs d’IC50 de différents extraits étudié 36

Liste des figures

Figure I-1 : Structure de base des coumarines. 08

Figure I-2 : Squelette de base des flavonoïdes. 09

Figure I-3 : Structures de quelques classes de flavonoïdes. 10

Figure II-1 : Origine des différents radicaux libres oxygénés et espèces réactives de

l’oxygène impliqué en biologie. 14

FigureIII-1: La plante de Rumex vesicarius. 20

Figure III-2 : le protocole d’extraction de différentes phases. 23

Figure III-3 : structure de l'acide gallique. 24

Figure III-4 : Quercétine. 26

Figure IV-1 : histogramme rendement de l’extraction. 29

Figure IV-2 : Courbe d'étalonnage de l’acide gallique. 30

Figure IV-3 : Histogramme de dosage des phénols totaux dans les extraits. 31

Figure IV-4 : Courbe d’étalonnage du Quercétine. 31

Figure IV-5 : histogramme de dosage de flavonoïdes. 32

Figure IV-6 : Courbe d’étalonnage d’acide ascorbique. 34

Figure IV-7 : Courbes représentants le pouvoir réductrice des différents extraits. 34

Figure IV-8 : évaluation de l’activité antioxydant par la méthode de FRAP de différents

extraits. 35

Figure IV-9 : Réaction d’un antioxydant avec le DPPH. 35

Figure IV-10 : Courbes représentants le pouvoir d’inhibition des différents extraits. 37

Figure IV-11 : histogramme représente le pouvoir d’inhibition des différents extraits. 37

Sommaire

Remerciements

Liste des abréviations

Liste des tableaux

Liste des figures

Introduction générale

Partie I : Etude bibliographique

01

Chapitre I : Généralités sur les plantes médicinales

I-1 Historique des plantes médicinales 03

I-2 Domaines d’application des plantes médicinales 04

I-3 Les composés phénoliques 06

I-3-1 Définition 06

I-3-2 Classification 06

I-3-2-1 Les coumarines 07

I-3-2-2 Les flavonoïdes 09

I-3-2-2-1 Flavonoïdes hétérosides 10

I-3-2-2-2 Les flavonoïdes aglycones 10

I-3-2-3 les tanins 10

I-3-2-3-1 Les tanins hydrolysables 11

I-3-2-3-2 Les tanins non hydrolysables 11

I-3-3 Rôle et intérêt des composés 11

Chapitre II : L’activité Antioxydante

II- Les antioxydants 12

II-1 Radicaux libres 12

II-1-1 Définition 12

II-1-2 Origine des radicaux libres 12

II-1-3 Nature des radicaux libres 13

II-1-3-1 Espèces réactives dérivées de l’oxygène (ERO) 13

II-1-3-2 Espèces libres non oxygénées 14

II-2 Antioxydants 15

II-2-1Définition

II-2-2 Mécanisme d’action 15

II-2-3 Utilisation des antioxydants 15

II-2-4 Classification des antioxydants 16

II-2-4-1 Antioxydants synthétiques 16

II-2-4-2 Substances synergiques 16

II-2-4-3 Antioxydants d’origine végétale 16

Partie I : Etude Expérimentale

Chapitre III : Matériel et Méthode

III-1 Matériel végétale 19

III-1-1 Présentation de plante 19

III-1-1-2 Origine et répartition géographique 19

III-1-1-3 Usages 19

III-1-1-4 Botanique 19

III-1-1-5 Ecologie 20

III-1-1-6 Gestion 20

III-1-1-7 Ressources génétiques et sélection 20

III-1-1-8 Perspectives 20

III-2 études chimiques 21

III-2-1 Appareils et Produits 21

III-2-1-1 Produits 21

III-2-1-2 Appareils 22

III-2-2 Méthode d'extraction 22

III-2-3 Analyse quantitative des composés phénoliques 24

III-2-3-1 Dosage des composés phénoliques totaux 24

III-2-3-2 Dosage de flavonoïdes 25

III-3 Évaluation de pouvoir antioxydant 27

III-3-1 le pouvoir réducteur des composés phénoliques (Reducing Power Assay) 27

III-3-2 Effet scavenger du radical DPPH 28

Chapitre IV : Résultats et discussion

IV-1 Détermination de rendement d’extraction 29

IV-2 Quantification des composés phénoliques 30

IV-2-1 Dosage des composés phénoliques totaux 30

IV-2-2 Dosage des flavonoïdes 31

IV-3 L’étude du pouvoir antioxydant 33

IV-3-1 le pouvoir réducteur des composés phénoliques ( Reducing Power Assay) 33

IV-3-2 Effet scavenger du radical DPPH 35

Conclusion

Références bibliographiques

INTRODUCTION

GENERALE


1


A l’origine, la nature constituée d’êtres végétaux, servait d’alimentation aux animaux et aux

hommes peuplant la terre. Mais à côté de cette fonction nutritionnelle, l’homme découvrit

bien d’autres fonctions que pouvaient lui procurer les plantes, notamment le pouvoir de

guérison. En effet cette faculté de guérison des plantes fut connue longtemps de nos ancêtres

depuis les temps reculés. Elle deviendra plus tard la médecine traditionnelle avec toutes les

avancées notoires qu’on peut lui attribuer.

L’homme est toujours émerveillé par la beauté de leurs couleurs, la forme de leurs fleurs ou

de leurs fruits. Il les considère comme des compagnes fidèles vers lesquelles il se retourne en

raison des bienfaits qu’elles procurent et pour leur grande utilité, ce sont de vraies panacées et

de véritables pharmacies naturelles. [1]

On a longtemps employé des remèdes traditionnels à base de plantes sans savoir à quoi étaient

dues leurs actions bénéfiques, il est difficile de définir les molécules responsables de l’action

pharmacologique. [2]

Actuellement plus de 80 % de la population africaine ont recours aux drogues faites

Essentiellement de matières végétales qui poussent autour de leur ville. En plus dans le

monde, près de 25% des prescriptions sont à base de plantes et 60 à 70% des médicaments

antibactériens et anticancéreux sont des substances d’origine naturelle. [3]

Pour le besoin de la présente étude, nous avons choisi l’Rumex vesicarius.L parmi les plantes

médicinales qui est le moins fréquemment employé dans notre pays à cause de l’ignorance de

sa valeur nutritionnelle et médicale. Les extraits de cette plantemédicinale sont utilisés

traditionnellement comme anti abcès et l’acnée, anti constipation et anti-ictère.Notre travail

s’inscrit dans le cadre d’une contribution à une meilleure connaissance de cette plante

médicinale de la région de El-Goléa et de découvrir certains constituants chimiques et l’étude

l'activité antioxydante, les composes phénoliques totaux, les flavonoïdes et l’étude de

l'activité antioxydante des certaines extraits.

Dans ce présent travail, nous avons fixé les objectifs suivants :

Analyse quantitative et du contenu en polyphénols et en flavonoïdes des deux extraits

de la plante (fraction chloroformique et d'acétate d'éthyle).

Etude de l’activité antioxydante par la méthode réduction de fer.


2

Evaluation du pouvoir piégeur (scavenger) des extraits vis-à-vis d’un radical libre

relativement stable (DPPH).

PARTIE I

ETUDE

BIBLIOGRAPHIQUE

CHAPITRE-I :

GENERALITE SUR LES

PLANTES MEDECINALE

Chapitre I Généralités sur les plantes médicinales

3

I-1 Historique des plantes médicinales :

Des plantes médicinales ont été employées pendant des siècles comme remèdes pour les

maladies humaines parce qu'elles contiennent des composants de valeur

thérapeutique.Récemment, l'acceptation de la médecine traditionnelle comme forme

alternative de santé etle développement de la résistance microbienne aux antibiotiques

disponibles a mené des auteurs à étudier l'activité antimicrobienne des plantes médicinales et

en raison d'une conscience croissante des effets secondaires négatifs infligés par les

droguesmodernes, beaucoup cherchent les remèdes normaux sans effets secondaires et bien

sûr coût élevé de médecine conventionnelle.

Depuis toujours les plantes ont constitué la source majeure de médicaments grâce à la richesse

de ce qu'on appelle le métabolisme secondaire. Cependant, l'homme n’à découvert les vertus

bénéfiques des plantes que par une approche progressive, facilitée par l'organisation des

rapports sociaux, en particulier à partir du néolithique. L'observationliée à l'expérience et la

transmission des informations glanées au cours du temps font que certains hommes

deviennent capables de poser un diagnostic, de retrouver la plante qui soigneet finalement de

guérir le malade.

Dans les civilisations chinoise, indienne (médecine ayurvédique) ou aztèque, on trouve la

trace d'utilisations médicinales très anciennes. Le premier livre de matière médicale, le Shen

Nung Ben Caojing, futrédigé vers 2900 avant J.-C. 4000 ans avant J.-C., les populations

babyloniennes et sumériennes utilisaient les plantes pour se soigner : 600 tablettes d'argiles

mentionnent 1000plantes pour leurs vertus curatives et plus de 800 remèdes sont décrits par

les Egyptiens. Le soin de la peau a commencé 3.000 ans avant naissance du Christ,quand les

Egyptiens ont enregistré en forme hiéroglyphique le soin de la peau sur des peintures de mur

de temple.

Les grands médecins grecs, dont le plus célèbre est Hippocrate, utilisaient couramment les

narcotiques, les laxatifs ou des émétiques (vomitifs). Théophraste classe les plantes dans son

ouvrage Historia plantarum.

A l'apogée de l'empire arabe (dont les frontières allaient de l'Inde à l'Espagne), tous les

documents écrits furent réunis à Bagdad dans la plus grande bibliothèque de l'époque. Les

Arabes avaient aussi leurs spécialistes en médecine et en pharmacie : AbuBakr al-Razi ou

Rhazès (865-925), fut l'un des grands médecins de son temps et aussi le précurseur de la


4

psychothérapie. Il fut suivi par Ibn Sina ou Avicenne (980-1037) qui écrivit le "Canon de la

médecine". Ce livre servira de base à l'enseignement de la médecine dans les universités de

Louvain et de Montpellier jusqu'aux environs de 1650. Ibn al Baytar (1197-1248) rédigea le

très complet Somme des Simples : ce livre contenait une liste de 1400 préparations et plantes

médicinales dont un millier était connues des auteurs grecs. [4]

I-2 Domaines d’application des plantes médicinales :

Les substances naturelles issues des végétaux ont des intérêts multiples mis à profit dans

l’industrie : en alimentation, en cosmétologie et en pharmacie. Parmi ces composés on

retrouve dans une grande mesure les métabolites secondaires qui se sont surtout illustrés

enthérapeutique. La pharmacie utilise encore une forte proportion de médicaments d’origine

végétale et la recherche trouve chez les plantes des molécules actives nouvelles, ou des

matières premières pour la semi synthèse.

Il y a eu donc un réveil vers un intérêt progressif dans l'utilisation des plantes médicinales

dans les pays développés comme dans les pays en voie de développement, parceque les

herbes fines guérissent sans effet secondaire défavorable. Ainsi, une recherche de nouvelles

drogues est un choix normal. Utilisation

-en médecines en tant que médicament pour l’homme ; exemple :

*en urologie, dermatologie, gastrites aigues, toux, ulcères d’estomac, laxatifs,

*sommeil et désordres nerveux.

*systèmes cardiovasculaires, ex : Flavoce est un médicament constitué par la flavonenon

substitué en combinaison avec la rutine et isoquercetine est utile dans le traitement de

l’athérosclérose.

*drogues immunostimulantes,antispasmodiques et anti-inflammatoires (Melaleucaalternifolia,

Echinaceaangustifolia, Chrysantenumparthenium, Achilleamillefolium,...etc.).

*contre le diabète (Azadirachtaindica).


5

*les maladies du stress, des activités antioxydantes ; tels le thé noir, le thé vert et lecacao sont

riches en composé phénoliques, parmi lesquels theaflavine, le resveratrol, le gallate et

epigallocathechine procyanidine, très étudié en raison de leur rôle en tant qu’agent

chemopreventifs basés sur leurs capacités antioxydantes. D’excellentes capacités à inhiber les

réactions oxydatives ont été mises en évidence pour les huiles essentielles de romarin, sauge,

thym, origan, sarriette, clou de girofle, gingembre et curcuma.

*Activité antimicrobienne, antivirale, antiparasitaire: Les produits naturelsdes plantes depuis

des périodes très anciennes ont joué un rôle important dans la découverte de nouveaux agents

thérapeutiques ex: la quinine obtenue à partir du quinquina "Cinchona" a été avec succès

employée pour traiter le malaria , l’arbre de thé (Melaleucaalternifolia) est renommé pour ses

propriétés :antibactériennes, anti-infectieux, antifongiques, antivirales , aussi comme antiviral

(Azadirachtaindica,Aloevera,Andrographispaniculata, Withaniasomnifera,

Astragalusmembranaceus, Curcuma longa…etc.). mais aucune plante n’est aussi efficace que

les médicaments antirétroviraux pour arrêter la réplication du VIH, antibacterienne

(Azadirachtaindica), antifongiques (Adenocalymaalleaceum, Allium ampeloprasum, Allium

ramosum, Allium sativum,Tulbaghiaviolacea, Capsicumannuum, Capsicumchinense,

Capsicumfrutescens).

-En Agriculture exemple : l'arbre Azadirachtaindica, qui se développe dans tout le

subcontinent indien, est une des plantes médicinales les plus importantes au Bangladesh, de

12 à 18 mètres de hauteur avec un périmètre atteignant jusqu'à 1,8 à2,4 mètres. Les huiles de

cet arbre ont des utilisations dans l'agriculture dans le contrôle de divers insectes et nématodes

(vers parasites).

-En alimentation

Assaisonnements, des boissons, des colorants et des composés aromatiques. Les épices et les

herbesaromatiques utilisées dans l’alimentation sont pour une bonne part responsable des

plaisirs de la table, considérée comme condiments et aromates.La popularité des épices et

herbes aromatiques a été et reste très liée à leurs propriétés organoleptiques. La notion de

flaveur des épices et aromates recouvre l’ensemble des perceptions olfacto-gustatives. Ces

perceptions résultent de stimuligénérés par une multitude de composés organiques dont

certains sont volatils et constituent ce qu’on appelle en général l’huile essentielle, les autres

non volatils,sont plus particulièrement responsables de la saveur et de la couleur.


6

-En cosmétique

Des produits de beauté, parfums et articles de toilette, produits d’hygiène.

-Des suppléments diététiques. [4]

I-3 Les composés phénoliques :

I-3-1 Définition :

Les composants phénoliques sont des métabolites secondaires caractérisés par la présence

d’un cycle aromatique portant des groupements hydroxyles libres ou engagés avec des

glucides.

Ils sont présents dans toutes les parties des végétaux (racines, tiges, feuilles, fleurs, pollens,

fruits, graines et bois) ; et sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques comme

la croissance cellulaire, la rhizogénèse, la germination des graines et la maturation des fruits.

Les principales classes des composants phénoliques sont les acides phénoliques (acide

caféique, acide hydroxycinnamique, acide ferulique, acide chlorogenique…), les flavonoïdes,

les tanins, et les coumarines.

Les composants phénoliques sont des molécules biologiquement actives, ils sont largement

utilisés en thérapeutique comme vasoconstricteurs, anti-inflammatoires, inhibiteurs

enzymatiques, antioxydants et antiradicalaires, antimicrobiens. [5]

I-3-2 Classification :

Le terme de composés phénoliques couvre un groupe très vaste et diversifié de produits

chimiques. Ces composés peuvent être classés dans un certain nombre de façons.Harborne et

Simmonds (1964) ont classé ces composés dans les groupes en fonction du nombre d'atomes

de carbone dans la molécule.


7

Tableau I-1 : Classification des composés phénoliques

Structure Classe

C6 Phénols simple

C6-C1 Acides phénoliques et composés dérivés

C6-C2 Acétophénone et acides phénylacétiques

C6-C3 Acides cinnamiques, coumarines, isocoumarines,

chromones

C15 Flavanols, flavonones, anthocyanines et anthocyanidines

C30 Biflavonyles

C6– C1– C6,C6– C1– C6 Benzophénones, xanthones et stilbéne

C6, C10, C14 Quinones

C18 Bétacyanines

Lignanes ,neolignanes Dimères ou oligomères

Lignine Polymères

Tanins Condensé et hydrolysable

Une autre classification a été utilisée par Swain et Bate-Smith(1962). Ils ont regroupé les

phénols dans les catégories "commune" et "moins fréquent". Ribéreau-Gayon (1972) a

regroupé les phénols en trois familles comme suit:

1. Phénols largement distribués - omniprésente à toutes les plantes, ou de importance dans une

usine spécifique

2. Phénols qui sont moins largement distribués - nombre limité de composés connus

3. Constituants phénoliques présents dans les polymères. [6]

I-3-2-1 Les coumarines :

Elles sont issues du métabolisme de la phénylalanine via un acide cinnamique, l’acide

P-coumarique.

Les coumarines libres sont solubles dans les alcools et les solvants organiques tels que l’éther

ou les solvants chlorés dans lesquels ils sont extractibles. Les formes hétérosidiques sont plus

ou moins solubles dans l’eau. Elles ont un spectre UV caractéristique, fortement influencé par


8

la nature et la position des substituants. En lumière ultra-violette, les CCM présentent des

tâches dont la coloration varie du bleu au pourpre en passant par le jaune.

Les coumarines sont cytotoxiques, antivirales, immunostimulantes, tranquillisantes,

vasodilatatrices, anticoagulantes (au niveau du cœur), hypotensives ; elles sont également

bénéfiques en cas d’affections cutanées.

L'odeur de foin fraîchement coupé de la coumarine est très utilisée en parfumerie .Elles est

aussi utilisée dans les produits cosmétiques. [7]

Figure I-1 : Structure de base des coumarines

Tableau I-2 : Quelques exemples de coumarines

R1 R2 R3

Coumarine non phénolique H H H

Ombelliférone H OH H

Herniarine H OCH3 H

Esculétol OH OH H

Scopolétol OCH3 OH H

Scopanone OCH3 OCH3 H

Fraxétol OCH3 OCH3 OH

OO

R3

R2

R1


9

I-3-2-2 Les flavonoïdes :

Les flavonoïdes désignent une très large gamme de composés naturels appartenant à la famille

des polyphénols.

Ces molécules sont considérées comme des pigments quasiment universels des végétaux ;ils

sont responsables de la coloration des fleurs, des fruits et parfois des feuilles. Ils existent le

plus souvent à l’état naturel sous forme d’hétérosides.

Les flavonoïdes sont des dérivés benzo-γ-pyran. Leur structure de base est celle d’un

diphénylpropane à 15 atomes de carbone (C6-C3 -C6), constitué de deux noyaux aromatiques

(ou anneaux) que désignent les lettres A et B, reliés par un hétérocycle oxygénés, qui désigne

la lettre C.

La classe des flavonoïdes comporte à elle seule plus de 4000 substances qui ont été isolées et

identifiées à partir des milliers des plante (Forkmann et Martens, 2001), qu’endivise en

plusieurs catégories : Les flavones, les flavonols et les dihydroflavonols, les isoflavonoïdes,

les biflavonoides, les flavanones, les flavanols, les flavanediols(leucocyanidines), les

anthocyanidines, les chalcones et les dihydrochalcones, les aurones. [5]

Figure I-2 :Squelette de base des flavonoïdes.

Chalcone Aurone

O

O

O

O

O

2

3

45

7

6

8

4'

5'

6'

2'

3'

A

B

C


10

Isovlavonol Isoflavone

Figure I-3 :Structures de quelques classes de flavonoïdes.

I-3-2-2-1 Flavonoïdes hétérosides : la partie osidique peut être mono, di ou

trisaccharidique. En général, les hétérosides sont hydrosolubles et solubles dans les alcools,

bon nombre d’entre eux ont une hydrosolubilité plutôt faible (rutoside, hespéroside).

I-3-2-2-2 Les flavonoïdes aglycones : Les génines sont, pour la plupart, solubles dans les

solvants organiques apolaires.les lipophiles des tissus superficiels des feuilles (ou des frondes)

sont directement extraits par des solvants moyennement polaires (dichlorométhane) ; il faut

ensuite les séparer des cires et des graisses extraites simultanément (on peut certes laver

d’abord àl’hexane, mais la sélectivité de ce solvant n’est pas absolue) [6].

I-3-2-3 les tanins :

Les tanins sont très répandus dans le règne végétal, ils sont particulièrement abondants chez

les Conifères, les Fagacée, les Rosacée. Tous les organes végétaux peuvent en renfermer

(l’écorce, le bois, les feuilles, lesfruits, les racines, les graines). Les tanins sont présents dans

une variété de plantes utilisées dans l’alimentation notamment les céréales et les légumineuses

et les fruits [5] Ils ont la propriété de précipiter les protéines (fongiques ou virales) et les

métaux lourds. Ils favorisent la régénération des tissus et la régulation de la circulation

veineuse, tonifient la peau dans le cas des rides. Deux groupes de tanins différents aussi bien

par leur structure que par leur origine biogénétique sont distingués : les tanins hydrolysables

et les tanins vrais. [7]

O OH

O

O

O


11

I-3-2-3-1 Les tanins hydrolysables :

Les tanins hydrolysables sont des esters du glucose et d’acides phénols que sont l’acide

gallique (tanins galliques) et l’acide éllagique (tanins éllagiques). Leurs polymères sont

appelés des tannoïdes. Ils sont caractéristiques des Angiospermes dicotylédones.

I-3-2-3-2 Les tanins non hydrolysables :

Les tanins vrais, non hydrolysables sont des polymères de flavonols (catéchols) et de

proanthocyanidols qui donnent par ébullition avec les acides minéraux dilués des composés

insolubles amorphes et de couleurs rouges appelés phlobaphènes ou rouge de tanins. [7]

I-3-3 Rôle et intérêt des composés phénoliques :

Le rôle des composes phénoliques est maintenant reconnu dans différents aspects de la vie de

la plante et dans l'utilisation que fait l'homme des végétaux. Ils peuvent en effet intervenir:

Dans certains aspects de la physiologie de la plante (lignification. régulation de la

croissance, interactions moléculaires avec certains microorganismes symbiotiques ou

parasites...).

Dans les interactions des plantes avec leur environnement biologique et physique

(relations avec les bactéries, les champignons, les insectes, résistance aux UV), soit

directement dans la nature soit lors de la conservation après récolte de certains

végétaux.

Dans les critères de qualité (couleur, astringence, amertume, qualités nutritionnelles...)

qui orientent les choix de l'homme dans sa consommation des organes végétaux

(fruits, légumes, tubercules...) et des produits qui en dérivent par transformation.

Dans les variations de certaines caractéristiques des végétaux lors des traitements

technologiques (préparation des jus de fruits, des boissons fermentent...) pendant

lesquels apparaissent fréquemment des brunissements enzymatiques qui modifient la

qualité du produit fini.

Dans la protection de l'homme vis-à-vis de certaines maladies en raison de leur

interaction possible avec de nombreuses enzymes et de leurs propriétés antioxydantes.

[8]

CHAPITRE-II :

L’ACTIVITE

ANTIOXYDANTE

Chapitre II L’activité Antioxydante

12

II- Les antioxydants :

II-1 Radicaux libres :

II-1-1 Définition :

Un radical est une molécule ou un fragment moléculaire qui contient un électron (ou plus)

non apparié. De par sa structure particulière, il a tendance à attirer les électrons d’autres

atomes et molécules pour gagner sa stabilité. Plusieurs éléments peuvent être à l’origine de

radicaux libres. Les sources des radicaux libres sont nombreuses. [9]

II-1-2 Origine des radicaux libres :

Ils sont produits par divers mécanismes physiologiques (Figure II-1) afin de détruire des

bactéries au sein des cellules phagocytaires (macrophages, polynucléaires) ou pour réguler

des fonctions cellulaires létales telle la mort cellulaire programmée ou apoptose.

Toutefois, au contact entre l'oxygène et certaines protéines du système de la respiration, une

production d'anions superoxydes se produit lors du fonctionnement de la chaîne respiratoire

mitochondriale.

Des sources importantes de radicaux libres sont les mécanismes de cycles redox que produit

dans l’organisme l'oxydation de molécules comme les quinones. Ce cycle redox a lieu soit

spontanément, soit surtout lors de l'oxydation de ces composés au niveau du cytochrome

. Les rayonnements UV sont capables de générer des radicaux libres et les particules inhalées

(amiante, silice) sont aussi des sources de radicaux libres.

L'ingestion d'alcool est suivie de la formation de radicaux libres selon divers mécanismes,

également des antibiotiques, des anticancéreux L’infection au VIH a pour effet d’accroître la

production de radicaux libres dans l’organisme. [4]


13

II-1-3 Nature des radicaux libres :

II-1-3-1 Espèces réactives dérivées de l’oxygène (ERO) :

L’oxygène doit sa grande réactivité à sa structure particulière. En effet, il possède deux

électrons célibataires non appariés sur sa couche orbitale externe. Cette molécule est

essentielle au bon Fonctionnement de l’organisme. [4]

a- Ion superoxyde : -O2.

L’ion super oxyde -O2.est un dérivé très réactif de l’oxygène, relativement stable, il n’est

pas très toxique pour l’organisme, mais il est à l’origine de cascades de réactions

conduisant à la production de molécules très nocives. [9]

b- Radical libre hydroxyle : (OH.)

Le radical libre hydroxyle (OH.) est très réactif. Il peut réagir avec de nombreuses molécules

comme l’ADN, les glucides, les nucléotides, les protéines et être à l’origine de lésions de

nécrose. C’est un dérivé de l’ion super oxyde. [9]

c- Oxygène singulet: 1O2

Lorsque de l’énergie est apportée à l’oxygène, celui-ci passe à l’état singulet qui représente la

forme activée. C’est une forme très énergétique de grande réactivité qui peut oxyder de

nombreuses molécules. Il est formé à partir de l’ion superoxyde selon la réaction suivante :

.O-O

.

1O2 (sous l’action de la lumière). [9]


14

Figure II-1 : Origine des différents radicaux libres oxygénés et espèces réactives de

l’oxygène impliqué en biologie [4]

II-1-3-2 Espèces libres non oxygénées :

Les espèces libres non oxygénées sont les produits des réactions de certaines molécules avec

les espèces réactives dérivées de l’oxygène.

Ils peuvent à leur tour réagir avec d’autres molécules et être à l’origine de la multiplication

des réactions d’oxydation et de la propagation de dommages oxydatifs. Nous citerons, par

Exemple :

Les acides gras peroxydés, résultats de l’action des espèces oxygénées sur les membranes

biologiques.

Les fractions protéiques, les acides aminés et les acides nucléiques peuvent aussi réagir avec

les ERO générant des molécules réactives et nocives. [9]

1/2 O2 O2

Oxygène

NOO2

HOCl

Monoxyde d'azoteAnion super oxyde

peraxynitriteRadical hydroxyle

Nitration desproteines

Activationdes cascadesde kinases

Oxydationdes proteines

Peroxydationlipidique

Oxydation del' ADN

Arginine

Peroxyded'oxygène

Fe3+

Cycles redoxNADPH oxmitochoderie

Superoxydedismutases

myéloperoxidase

Fe2+

Cl-

OH

H2O2

Oxygène singulier

Lumière UV Oxydases

ONOO


15

II-2 Antioxydants :

II-2-1 Définition :

Les antioxydants sont des composés chimiques capables de minimiser efficacement les

rancissements, retarder la peroxydation lipidique, sans effet sur les propriétés sensorielle et

nutritionnelle du produit alimentaire. Ils permettent le maintien de la qualité et d’augmenter la

durée de conservation du produit

En outre, l’antioxydant alimentaire idéal, doit être soluble dans les graisses, efficace à faible

dose, et non toxique, n’entraine ni coloration, ni d’odeur, ni saveur indésirable, résistantaux

processus technologiques, il est stable dans le produit fin. [10]

II-2-2 Mécanisme d’action :

D’une manière générale, un antioxydant peut empêcher l’oxydation d’un autre substrat en

s’oxydant lui-même plus rapidement que celui-ci. Un tel effet résulte d’une structure de

donneurs d’atome d’hydrogène ou d’électrons souvent aromatiques cas de dérivés du phénol.

En plus leurs radicaux intermédiaires sont relativement stables du fait de la délocalisation par

résonance et par manque de positions appropriées pour être attaqué par l’oxygène

moléculaire.

Les antioxydants sont en fait des agents de prévention, ils bloquent l’initiation en complexant

les catalyseurs, en réagissant avec l’oxygène, ou des agents de terminaison capables de dévier

ou de piéger les radicaux libres, ils agissent en formant des produits finis non radicalaires.

D’autres en interrompant la réaction en chaine de peroxydation, en réagissant rapidement avec

un radical d’acide gras avant que celui-ci ne puissent réagir avec un nouvel acide gras. Tandis

que d’autres antioxydants absorbent l’énergie excédentaire de l’oxygène singulet pour la

transformer en chaleur. [10]

II-2-3 Utilisation des antioxydants :

Dans l'industrie chimique : pour éviter le durcissement du caoutchouc ou en

métallurgie pour protéger les métaux de l’oxydation.

Dans l'industrie agro-alimentaire : pour éviter le rancissement des corps gras.

Dans l'industrie teinturerie : pour éviter l'oxydation des colorants au soufre ou des

colorants de cuve lors de la teinture. [9]


16

II-2-4 Classification des antioxydants :

Les antioxygènes sont classés dans trois catégories différentes :

Les antioxydants synthétiques.

Les substances synergiques.

Les antioxydants d’origine végétale. [9]

II-2-4-1 Antioxydants synthétiques:

Parmi les antioxydants phénoliques de synthèse qui sont autorisés dans certains aliments : le

BHT 321 (3,5-ditertiobutyl-4-hydroxytoluéne), BHA 320 (3-tertiobutyl-4-hydroxyanisole),

sont l’un et l’autre soluble dans les lipides et résistent bien à la chaleur. Ils ont une action

synergique, ils présentent l’inconvénient d’avoir une odeur désagréable et s’évapore

rapidement. Le TBHQ (tertiobutyl-hydroxyquinone) est moins soluble dans les graisses et le

PG (gallate de propyle) à l’avantage d’être relativement soluble dans l’eau, mais

l’inconvénient d’être peu soluble dans les lipides, peu résistant à la chaleur et de donner avec

le fer des sels de couleur foncée. Le nitrite présent des propriétés anti oxydantes, il peut aussi

former des nitrosamines cancérigènes. Les chélateurs de métaux utilisés et plus efficaces sont

les polyphosphates et les dérivés d’acide citrique. [10]

II-2-4-2 Substances synergiques :

Ce sont des molécules qui améliorent l’action de certains antioxydants. Ce qui se traduit

souvent par un accroissement de la période de protection, parmi eux se trouvent : Les acides

lactique, tartrique et ortho phosphorique et leurs sels de sodium, potassium ou calcium. Leurs

propriétés peuvent s'expliquer par un effet chélatant de métaux comme le fer ou le cuivre,

dont on connaît bien l'effet pro-oxydant à faible dose. Cependant, ce n'est peut-être pas la

seule explication, car plusieurs de ces produits sont d'assez mauvais chélatants. [9]

II-2-4-3 Antioxydant d’origine végétale :

Les plantes constituent des sources très importantes d’antioxydants. Les antioxydants naturels

dont l’efficacité est la plus reconnue aussi bien dans l’industrie agroalimentaire que pour la

santé humaine sont : les tocophérols, les caroténoïdes et les polyphénols. [9]


17

a- Tocophérols :

La grande stabilité des huiles végétales, dans les conditions d’oxydation, est due à la présence

d’un taux élevé d’antioxydants naturels dont les plus importants sont les tocophérols qui se

présentent sous quatre formes isométriques : α, β, δ et γ. Les tocophérols protègent contre

l’oxydation naturelle des acides gras, en particulier les acides gras polyinsaturés (AGPI). Ont

signalé qu’une molécule de tocophérol peut protéger 103 à 106 molécules d’AGPI. [9]

Exemple de tocophérol :

La vitamine E :

.La vitamine E est un antioxydant majeur liposoluble. C’est un composé amphiphile, capable

de s’insérer dans les membranes cellulaires : globules rouges, cellules endothéliales, cellules

musculaires, neurones (c’est le seul antioxydant du système nerveux central).

Il existe dans la nature plusieurs dérivés de la vitamine E à activités différentes (α-, β-, γ -, δ-

tocophérol, tocotriénols, …). Ils sont différenciés par les substituants du noyau chromanol

(noyau benzyle associé à un hétérocycle à six carbones substitués par un hydroxyle et par une

chaine latérale ramifiée saturée s’il s’agit de tocophérol ou insaturée s’il s’agit de

tocotriénols).

b- Caroténoïdes :

Les caroténoïdes sont, avec la chlorophylle et les anthocyanes, les pigments les plus répandus

dans la nature. A ce jour, plus de 600 caroténoïdes ont été identifiés, mais seule une

quarantaine est retrouvée régulièrement dans l’alimentation humaine. Une trentaine de

caroténoïdes et de leurs métabolites a été identifiée dans le plasma et les tissus humains, mais

6 caroténoïdes sont majoritaires : le β-carotène, le lycopène, la lutéine, la β-cryptoxanthine,

l’α- Carotène, et la zéaxanthine. [9]

Le plus important et le plus connu des caroténoïdes est le β-carotène. Il a longtemps été étudié

pour son activité de provitamine A. Cependant, tous les caroténoïdes ne peuvent pas être

convertis en vitamine A. Ils intéressent de plus en plus les chercheurs pour leur pouvoir

antioxydant que n’a pas la vitamine A.

Les caroténoïdes peuvent agir en tant qu’antioxydants selon plusieurs mécanismes:


18

Ils sont capables de bloquer les chaînes de réactions radicalaires, selon les équations suivantes

:

BC + ROO.

BC.

BC. + O2

BC-OO

.

BC + ROO.

Produits inactifs BC : βcarotène

PARTIE II

ETUDE

EXPIREMENTALE

CHAPITRE-III:

MATERIEL ET METHODE

Chapitre III Matériel et Méthode

19

III-1 Matériel végétale :

III-1-1 Présentation de plante :

Rumex vesicarius L.

Règne : plantae

Division : Magnoliophyta

Classe : Magnoliopsida

Ordre : Caryophyllale

Famille : Polygonacée

Genre : Rumex

Espèce : Rumex vesicarius

Noms vernaculaires : Sorrel, Bladder dock, Rosy dock

III-1-1-2 Origine et répartition géographique

En Afrique, on trouve Rumex vesicarius dans les régions sèches Mauritanie et du

Mali jusqu'au Soudan, l'Ethiopie et la Somalie en, dehors de l’Afrique il est présent de la

méditerranée jusqu'en Inde. On a parfois essayé de le cultiver avec succès dans des zones

humides par ex : en Tanzanie. Dans d'autres régions, par ex. en Australie, il est devenu un

adventice difficile à éradiquer depuis son introduction. [11]

III-1-1-3 Usages

Dans plusieurs régions du Sahara et du Sahel, Rumex vesicarius est consommé

comme légume, par ex. en Mauritanie, au Maliet au Soudan, en Inde, il est considéré comme

aliment de famine et les feuilles sont d’abord, bouillies. Il est brouté par le bétail. En soude

d'Alger Les racines de Rumex permettent de fabriquer un extrait qui, non dilué, permettra de

traiter en pulvérisation les concombres, les pommiers et la mâche contre l'oïdium. [11]

III-1-1-4 Botanique

Plante herbacée annuelle ou vivace. Buissonnante, rhizomateuse, atteignant 50 cm de

haut fortement ramifiée à partir de la base, avec de jeunes tiges vertes herbacées de venant

brunes et ligneuses avec l'âge. Feuilles alternes, simples ; ochréa en entonnoir« atteignant 8

mm de long ; pétiole environ aussi long que le limbe ; limbe triangulaire à oblong-

triangulaire, atteignant 7 cm x 4 cm, cunéiforme à tronqué à la base, glabre mais avec de

petites verrues sur toute sa surface. Inflorescence : panicule dense axillaire ou terminale.

http://fr.wikipedia.org/wiki/Concombre

http://fr.wikipedia.org/wiki/Pommier

http://fr.wikipedia.org/wiki/M%C3%A2che

http://fr.wikipedia.org/wiki/O%C3%AFdium


20

Fleurs bi• sexuées ou mâles ; tépales 6, les 3 intérieurs cordés, d’environ 3 mm de long lors de

la floraison, s’élargissant ٠ 2 cm chez le fruit et montrant alors de spectaculaires veines

rouges en réseau. 2 des tépales de chaque fleur munis d'un tubercule (veine médiane enflée).

Fruit : nucule trigone de 3-5 mm de long, brune. [11]

Le genre Rumex comprend environ 200 espèces nombre d'entre elles étant originaires des

régions tempérées de l’hémisphère nord. [11]

III-1-1-5 Ecologie

Rumex vesicarius pousse dans des zones sèches parmi les pierrailles, sur des pentes

herbeuses ou caillouteuses, du niveau de la mer jusqu’à 1150 m d’altitude. [11]

III-1-1-6 Gestion

Rumex vesicarius est récolté dans la nature et n’

est pas cultivé. Parfois il est devenu un

adventice gênant. [11]

III-1-1-7 Ressources génétiques et sélection

Rumex vesicarius est répandu et n’est pas menacé d'érosion génétique. Une collection

importante de ressources génétiques est conservée à Gâtersleben (Allemagne). [11]

III-1-1-8 Perspectives

Rumex vesicarius restera un légume intéressant pour les régions sèches où d’autres aliments

sont rares. Il faut mener des recherches pour évaluer sa valeur nutritionnelle. [11]

Figure III-1:La plante de Rumex vesicarius


21

III-2 études chimiques :

III-2-1 Appareils et Produits :

III-2-1-1 Produits : Tableau III-1 : les produits chimiques et les réactifs

Produits Propriétés

Méthanol.(CH3-OH) M=32.04 g/mol, 99%

Ether de pétrole.(R-O-R) d=0.65, 65%

Acétate d'éthyle.(CH3COOCH2CH3) D=88.1, 99.8%

Chloroforme (CHCl3) M=119.4, 99%

TCA ou acide

trichloracétique(CCl3COOH)

M=163.39

Potassium ferricyannateK3Fe(CN)6 M=329g/mol

Acide gallique monohydrate (C7H6O5H2O) M=188.14

Carbonate de sodium(Na2CO3) M=105.99g/mol

chlorure ferrique FeCl3 M=162.21g/mol

NaHPO4 (2H2O) M=156g/mol

Na2H PO4 (12H2O) M=358.13

Sulfate de Sodium.Na2SO4 M=142.04g/mol

Eau distillée.(H2O) M=18g/mol

n-Butanol. M=76g/mol

acétate de sodium M=82.03g/mol

Chlorure d’aluminium(AlCl3) M=241.43 g/mol

Acide ascorbique M=152g/mol

Solution de Folin. d =1.22

BHA M=180.25g/mol

BHT M=220.35g/mol

DPPH. M = 394.3g/mol

Quercitrine. M=302 g/mol

TRIS M=121.14g/mol

HCl M=36 g/mol


22

III-2-1-2 Appareils et instruments :

Tableau III-2 : appareils et instruments

Appareils et matériels Caractéristiques

Rota vapeur R-210 Buchi

Ampoule à decanter. 250 ml

Ballons pour le rota-vapeur. (250ml→1000ml)

Etuve. LDO-080N, Tmax=320°C

Balance électronique. OHAUS,0.0001 g , m max=210g

Broyeur

Spectrophotomètre ultraviolet-visible Spectro Scan 80DV

Micropipette SL-plus 100

III-2-2 Méthode d'extraction :

Après séchage dans un endroit sec et aéré, à l’abri de la lumière du soleil, la plante est broyée

entièrement, puis pesée (M=10g). La matière végétale obtenue est mise à macération dans un

mélange hydroalcoolique (Méthanol / eau ; 80 / 20 ; V / V). Cette macération est répétée 2

fois avec renouvellement du solvant chaque 24 heure.

Après filtration, la solution a subi des extractions successives de type liquide-liquide en

utilisant des solvants de polarité croissante en commençant par le chloroforme puis l’acétate

d’éthyle.

Les deux phases organiques ainsi obtenues (faiblement polaire : chloroforme, moyennement

polaire : acétate d’éthyle) sont concentrées à sec sous pression réduite, pesées, puis les extraits

sont repris avec du méthanol.


23

Filtration

Figure III-2 : le protocole d’extraction de différentes phases

10 g de matière végétale

sèche

Macération pendant 24h

(2 fois) Méthanol 80%/ Eau20%

Filtrat obtenue

Evaporation sous pression réduite à 50°C de solvant

(MeOH)

Solution aqueuse

Extraction liq-liq par l’éther de pétrole

Solution aqueuse délipidée

Extraction liq-liq par chloroforme (x3)

Phase organique Phase aqueuse

Extraction par l’acétate d’éthyle (x1) Séchage par Na2SO4 + Filtration

Filtrat

Phase aqueuse Phase organique

Séchage par Na2SO4 + Filtration

Filtrat

Evaporation d’acétate d’éthyle sous

pression réduite à 50°C

Résidus

Solubilisation dans le méthanol

Extrait d’acétate d’éthyle brut

Résidus

Extrait brut

Chloroformique

Evaporation de chloroforme sous pression

réduite à 50°C

Solubilisation dans le méthanol


24

III-2-3 Analyse quantitative des composés phénoliques :

Cette analyse permet d’avoir une estimation sur la teneur en phénols totaux de l’échantillon

.Le dosage des phénols totaux a été effectué par une méthode adaptée de Singleton et Rossi en

utilisant le réactif de Folin-Siocalteu, tandis que les flavonoïdes ont été quantifiés par le

dosage direct par le trichlorure d’aluminium d’après une méthode adaptée de Lamaiosn et

Carnat. [6]

III-2-3-1 Dosage des composés phénoliques totaux :

Le dosage des composés phénoliques totaux a été effectué par une méthode adaptée de

singleton et Ross (en 1965) avec le réactif de folin-Ciocalteu.En milieu basique, le réactif de

folin-Ciocalteu qui est formé d’acide phosphotungstique H3PW12O40et l’acide

phosphomolybdique H3PMO12O4 oxyde les groupements oxydables des composés

polyphénoliques présents dans l’échantillon. Les produits de réduction (oxydes métalliques

W8O23/Mo8O23) de couleur bleue, présentent un maximum d’absorption dont l’intensité est

proportionnelle à la quantité des composés phénoliques présents dans l’échantillon. La

concentration massique des constituants utilisés dans la préparation des réactifs, a été

optimisée pour obtenir la réponse analytique la plus linéaire possible en respectant le rapport

réactifs/composés phénoliques totaux. Dans cette méthode on a utilisé l’acide gallique comme

étalon. [12]

Figure III-3 : structure de l'acide gallique

-Courbe d’étalonnage de l’acide gallique :

La courbe d’étalonnage standard a été obtenue à partir des solutions d’acide gallique de

différentes concentrations (0.01-0.3mg/ml). On prend 100μl de chaque solution ont été

introduit à l’aide d’une micropipette dans des tubes à essai, suivi de l’addition de 500μl du

réactif de folin-Ciocalteu (diluée 10 fois). Après incubation pendant 2 minutes, 2 ml de

COOH

OH

OH

HO


25

carbonates de sodium Na2CO3 à 20% ont été ajoutées, puis maintenues dans l’obscurité

pendant 30 minutes à température ambiante. L’absorbance de chaque solution a été

déterminée à 760 nm contre un blanc préparé de la même manière sauf qu’il ne contient pas

d’acide gallique (l’extrait phénolique).Les lectures de la densité optique à 760 nm, des

solutions ainsi préparées ont permis de tracer la courbe d’étalonnage de l’acide gallique.

L’analyse quantitative des phénols totaux des extraits phénoliques a été réalisée par la même

procédure. [13]

Les concentrations des polyphénols a été déterminé par la formule suivante :

C : concentration de polyphénols en mg/g.

A : l’absorbance à λ = 760 nm.

K : tangente de l’acide gallique. (nm*ml/mg)

D : nombre de dilution.

V : volume de récupération de l’extrait. (ml).

P : le poids d’initial de la plante (10 g).

III-2-3-2 Dosage de flavonoïdes :

Le chlorure d’aluminium (AlCl3) forme un complexe très stable avec les groupements

hydroxydes OH des phénols. Ce complexe jaune absorbe la lumière visible à une

longueurd’onde 415 nm.Les phénols sont estimés par une spectroscopie UV, dont la

Quercetine est utilisé comme un standard à une longueur d’onde λ =415 nm. [14]

- Courbe d’étalonnage :

Un standard de calibration a été préparé en utilisant des solutions de Quercetine des

différentes concentrations de 0.004 jusqu'à 0.04 g/l.0.5 ml de la solution diluée a été mélangé

avec 1.5 ml de méthanol 95%, est mis à réagir avec0.1 ml de chlorure aluminium 10%, suivie

de 0.1 ml d’acétate de sodium 1M et 2.8 ml d’eau distillé puis laissé 30 minutes dans

l’obscurité .L’absorbance de chaque solution a étédéterminée à 415 nm.

p

VD

K

AC ...


26

En utilisant les valeurs des absorbances obtenues pour les différentes solutions de

Quercetineainsi préparées nous avons tracé la courbe d’étalonnage.

FigureIII-4 : Quercétine

L’analyse quantitative des flavonoïdes totaux des extraits a été réalisée en adaptant la même

procédure utilisée pour l’établissement de la courbe d’étalonnage, en remplaçant l’acide

gallique par des délutions des extraits jusqu'à une appropriée concentration.La teneur en

flavonoïdes totaux de chaque extrait a été calculée et exprimé en équivalentQuercetine en

milligramme par 1g de la matière végétale (mg/g) [14]. par la formule suivante :

C : concentration de flavonoïdes en mg/g.

A : l’absorbance à λ = 415 nm.

K : tangente de Quercitine. (nm*ml/mg).

D : nombre de dilution.

V : volume de récupération de l’extrait. (ml)

P : le poids d’initial de la plante (10 g).

C

O

OH

OH

OH

OH

HO

O

p

VD

K

AC ...


27

III-3 Évaluation de pouvoir antioxydant

Des nombreuses méthodes sont utilisées pour l’évaluation de l’activité antioxydante des

composés phénoliques purs ou des extrais. La plupart de ces méthodes sont basées sur la

coloration ou décoloration d’un réactif dans le milieu réactionnel. Dans notre étude nous

avons utilisé deux différents tests chimiques à savoir : le test Feric Reducing/antioxydant

power assay qui mesure les pouvoir de réduction des ions de fer et l’effet (scavanger) sur le

radical 2,2diphényl1-1-picrylhydrazyl (DPPH).

III-3-1 le pouvoir réducteur des composés phénoliques (Reducing Power Assay) :

Ce test est découvre par Oyaizu 1896[15] .Ce test est considéré comme un test direct et rapide

dont est utilisé pour mesurer le pouvoir des antioxydants non enzymatiques, et utiliser pour

déterminer l’activité antioxydant des extraits étudies dans un milieu neutre .Ce test est basé

sur la réduction des ions [Fe (CN)6]3-

à des ions de [Fe (CN)6]4-

, qui peut être mesurer leur

absorbanceà une longueur d’onde λ= 700 nm.L’activité antioxydante est mesuré avec un

nouveau terme appelé AEAC : qui présente l’activité antioxydante en équivalant de l’acide

ascorbique des extraits étudiés (Ascorbic Acid Equivalent Antioxydant Capacity).L’évolution

de l’activité antioxydante de nos extraits est comparée par rapport à l’acideascorbique

(vitamine C) et cela en traçant une courbe d’étalonnage.

On prépare des solutions d’acide ascorbique (vitamine C) de concentration de 0.01 jusqu'à0.1

g/l. 1 ml de chaque solution ont été introduits à l’aide d’une pipette dans des tubes à essai,

suivis de l’addition de 2.5 ml d’une solution K3Fe(CN) 6 (1%), 2.5 ml de solution tampon

phosphaté (PH=6.6 C=0.2M). Les solutions ont été secouées immédiatement et bien

mélangées, puis ils sont maintenus dans un bain marie pendant 30 minutes à une température

de 50 °C. Ensuite, on ajoute 2.5 ml de l’acide trichloracétique (TCA 10%). On prend de

chaque tube 2.5 ml et on introduit dans un autre tube à essai et on ajoute 2.5 ml de l’eau

distillé, 0.5 ml de solution de FeCl3 (0.1 %).L’absorbance de chaque solution a été déterminée

à 700 nm contre un blanc. Les lectures de la densité optique à700 nm, des solutions ainsi

préparées ont permis de tracer la courbe d’étalonnage de l’acide ascorbique (Vitamine C).

[16]


28

III-3-2 Effet scavenger du radical DPPH :

Dans ce test, les antioxydants réduisent le diphényle picryl hydrazyl ayant une couleur

violette en un composé jaune, le diphényle picryl hydrazyl, dont l’intensité de la couleur est

inversement proportionnelle à la capacité des antioxydants présents dans le milieu à donner

des protons.

1ml de chaque extrait phénolique dilué (et les standards) acide ascorbique et le 3-tertiobutyl-

4-hydroxyanisole dans le tampon Tris HCl (100 mM, pH=7.4) est additionné à 1ml d’une

solution de DPPH• (500μM) préparé dans le méthanol. Le mélange réactionnel a été secoué

immédiatement, puis il est maintenu à l’obscurité pendant 30 minutes à une température

ambiante pour que la réaction accomplisse. L’absorbance du milieu réactionnel a été mesurée

à 517 nm .

L’activité antiradicalaire est estimée selon l’équation suivante :

Calcule des pourcentages d’inhibitions :

Nous calculons ainsi les pourcentages d’inhibition par la formule suivante :

I (%) : pouvoir d’inhibition en %.

A0: absorbance de la solution de DPPH en absence de l’extrait

A1: absorbance de la solution de DPPH en présence de l’extrait. [17]

Calcule des IC50:

IC50 est la concentration de l’échantillon testé nécessaire pour réduire 50 % de

radical DPPH , Les IC50 sont calculées graphiquement par les régressions linéaires des

graphes tracés ; pourcentages d’inhibition en fonction de différentes concentrations des

fractions testées et les standards

CHAPITRE-IV:

RESULTATS ET DISCUSSION

Chapitre IV Résultats et discussion

29

IV-1 Détermination de rendement d’extraction :

Le rendement d’extraction ont été déterminés par la formule suivants :

é

é é

Pour chaque échantillon, nous avons calculé le rendement de l’extraction, les résultats obtenus

sont présentes dans le tableau suivant :

Tableau IV-1 : tableau récapitulatif regroupant les rendements des différents extraits

Matériel végétale Extrait m (g) Rendement

Rumex vesicarius Chloroforme

Acétate d’éthyle

0.1128

0.2147

1.128

2.147

Figure IV-1 : histogramme rendement de l’extraction

Les résultats obtenus montrent que parmi les différentes fractions de l’extrait brut,

l’extrait d’acétate d’éthyle représente le rendement le plus élevé (2.147%), suivi par le

chloroforme (1.128%).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

acétate chloroforme

rendement

%


30

IV-2 Quantification des composés phénoliques :

IV-2-1 Dosage des composés phénoliques totaux :

La quantification des composés phénoliques a été faite en fonction d’une courbe d’étalonnage

linéaire (y=ax) réalisé par une solution étalon (l’acide gallique) à différents concentration.

Figure IV-2 : Courbe d'étalonnage de l’acide gallique

La teneur en composés phénoliques de chaque extrait a été alors calculée à partir de la courbe

d’étalonnage et exprimée en milligrammes équivalent en acide gallique par 100 gramme de la

matière sèche, la mesure de la densité optique a été effectuée à la longueur d'onde de 760 nm.

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau suivant :

Tableau IV-2 : Quantité des phénols totaux dans les extraits

Phase la quantité (mg/100g)

φ chloroformique 69.6 mg /100 g

φ acétate d’éthyle 452 mg /100 g

Total 521.6 mg/100 g

R² = 0,9996

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

concentration de l'acide gallique g/l

ab

sorb

an

ce à

y=

76

0 n

m


31

Figure IV-3 : Histogramme de dosage des phénols totaux dans les extraits

On remarque d’après les résultats du tableau ci-dessus que la quantité des composés

phénoliques varie entre 69.6 et 452 mg/100g de la matière sèche. Le taux des composés

phénolique le plus élevé ont été détecté dans l’extrait par l’acétate d’éthyle (452 mg/100g),

cependant il est 6 fois supérieur à celle rapportée par le chloroforme (69.6 mg/100g).

IV-2-2 Dosage des flavonoïdes :

La quantification de flavonoïdes a été faite en fonction d’une courbe d’étalonnage linéaire

(y=ax) réalisé par une solution étalon (Quercitine) à différents concentration.

Figure IV-4 : Courbe d’étalonnage du Quercitine

R² = 0,9983

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05

ab

sorb

an

ce à

ʎ=

41

5n

m

concentration de quercitine g/l

0

100

200

300

400

500


la quantité

des phénols mg/100g


32

La teneur en flavonoïdes de chaque extrait a été alors calculée à partir de la courbe

d’étalonnage et exprimée en milligrammes équivalent en Quercitine par 100 gramme de la

matière sèche, la mesure de la densité optique a été effectuée à la longueur d'onde de 415 nm.

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau suivant :

Tableau IV-3 : Quantité des flavonoïdes dans les extraits

Figure IV-5 : histogramme de dosage de flavonoïdes

On remarque d’après les résultats du tableau ci-dessus que la quantité de flavonoïdes varie

entre 4.28 et 25.2 mg/100g de la matière sèche. Le taux de flavonoïdes le plus élevé ont été

détecté dans l’extrait d’acétate d’éthyle (25.2 mg/100g), cependant il est 6 fois supérieur à

celle rapportée par le chloroforme (4.28 mg/100g).

Phase la quantité (mg/g)

φ chloroformique 4.28 mg/100g

φ acétate d’éthyle 25.2 mg/100g

Total 29.48

0

5

10

15

20

25

30


la

quantité

de

flavonoide

s mg/g


33

IV-3 L’étude du pouvoir antioxydant :

IV-3-1 le pouvoir réducteur des composés phénoliques ( Reducing Power Assay):

Les différents extraits sont traités de la même façon que ceux des solutions standards

del’acide ascorbique (V.C). Nous avons tracé les courbes représentants la variation du

pouvoirréducteur exprimée en absorbance en fonction de l’inverse du nombre de dilution

On résume les résultats des tests du pouvoir réductrice dans le tableau :

Tableau IV-4: Les valeurs d’AEAC des différents extraits étudiés

Phase AEAC mM

φ chloroformique 7.64

φ acétate d’éthyle 48.08

BHT 1.52

BHA 1.03

Les résultats d’activité réductrice exprimés en AEAC montrent clairement que l’extrait de

l’acétate d’éthyle présente le pouvoir de réduire l’ion Fe+3

le plus intéressant (le potentiel

antioxydant le plus fort), par contre l’extrait de chloroforme montre un pouvoir réducteur

moins fort.

Ces résultats pourront expliqués que l’extrait de l’acétate d’éthyle présentant un pouvoir

réducteur important renferme des molécules ayant un potentiel réducteur donneur d’électron

plus fort, tandis que l’extrait chloroformique qui est montré un pouvoir réducteur moins fort

peut renfermer des substances à potentiel réducteur donneur d’électron aussi moins fort.


34

Figure IV-6 : Courbe d’étalonnage d’acide ascorbique

Figure IV-7 : Courbes représentants le pouvoir réductrice des différents extraits


35

Figure IV-8 : évaluation de l’activité antioxydant par la méthode de FRAP de différents

extraits

IV-3-2 Effet scavenger du radical DPPH :

Pour détecter l’activité antiradicalire des différents extraits de rumex vesicarius, nous avons

utilisé le 2,2-diphényl-2-picrylhydrazyle(DPPH), un radical stable, violet en solution et

présentant un maximum d’absorption caractéristique à 517 nm. Le protocole appliqué en

routine en repose sur la disparition de ce maximum lorsque le DPPH est réduit par un

composé à propriété antiradicalaire , entrainant ainsi une décoloration selon la réaction

suivante :

Figure IV-9 : Réaction d’un antioxydant avec le DPPH

Les profils d’activité antiradicalaire obtenus révèlent que les extraits possèdent une activité

antiradicalaire dose dépendante, les IC50 de chacun des différents extraits ont été

déterminées.

DPPH + AH DPPH-H + A


36

Tableau IV-5 : les valeurs d’IC50 de différents extraits étudié

Phase IC50(mg/ml)

φ acétate d’éthyle 0.25

φ chloroformique 0.034

BHA 0.013

VC 0.01

A des fins comparatives, deux antioxydants standards sont utilisés, l’acide ascorbique et le

BHA, ils ont montré une activité antiradicalaire puissante avec des IC50 de l’ordre de

0.01mg/ml et 0,013 mg/ml et l’acide ascorbique respectivement dont le pouvoir antioxydant

de l’acide ascorbique est presque le même que celui de BHA.

Parmi les deux extraits de notre plante, l’extrait chloroformique représente l’extrait le plus

actif avec une IC50 de l’ordre de 0.034 mg /ml suivi par l’extrait d’acétate d’éthyle avec une

IC50 de 0.25 mg/ml. En comparaison avec les antioxydants standards, l’extrait d’acétate

d’éthyle est moins actif.


37

Figure IV-10 : Courbes représentants le pouvoir d’inhibition des différents extraits

Figure IV-11 : histogramme représente le pouvoir d’inhibition des différents extraits

CONCLUSION

Conclusion

38

Conclusion

Les plantes aromatiques et médicinales sont la source de la majorité des antioxydants naturels

et elles restent encore sous exploitées dans le domaine médicale. Dans l’industrie

pharmaceutique, sachant que les antioxydants sembleraient de manière significative à la

prévention des maladies, le développement de nouveaux médicaments à base d’antioxydants

d’origine naturelle doit être à l’ordre de jour.

Dans le cadre de notre travail, nous nous sommes intéressés à l’étude phytochimique et du

pouvoir antioxydant de différents extraits de Rumex vesicarius la famille Polygonacea de la

région d’El-Goléa.

La première étape qui consiste à l'extraction des composés phénoliques par le méthanol 80%

par la macération à froid et fractionnée par deux (faction chloroforme, fraction d'acétate

d'éthyle) nous a permis de calculer le rendement de chaque extrait ou chaque fraction.

La teneur des phénols totaux, adaptant par la méthode de Singleton et Ross. La teneur la plus

élevée des polyphénols est constatée dans la fraction d'acétate d'éthyle 452 mg GAE/100 g,

puis la fraction de chloroforme 69.60 mg GAE/g. la quantité totales est 521.60 mg

GAE/100g.

En parallèle, La quantification des flavonoïdes a été effectuée par la méthode du trichlorure

d'aluminium qui donne une couleur jaune avec les flavonoïdes.

Nous avons observé le même résultat qui nous remarquons par les polyphénols, la teneur la

plus élevée 25.2mg QE/g.

Concernant l’activité antioxydante, nous avons étudié le pouvoir antioxydant par la capacité

de piégeage de radical DPPH● et de réduction de fer, afin de localiser la fraction qui

représente l’activité la plus élevé. Nous avons constaté pour l’activité antioxydante par la

méthode réduction de fer, que tous les extraits de la plante étudiée ont la capacité de réduire le

fer qui augmente en fonction de la concentration. Comme nous avons remarqué que les

extraits présentent une capacité intéressante pour réduire le fer par rapport aux BHA et BHT.

L'activité antioxydante de la plante (les deux fractions) supérieures 55 fois l'activité de BHA

et BHT.

Conclusion

39

Cependant, pour le piégeage du radical libre DPPH●

et en comparant les IC50 des différents

extraits testés par rapport l’acide ascorbique et BHA, nous avons remarqué une activité

antioxydante très importante

Selon les résultats obtenus dans cette étude, nous pouvons dire que la Rumex vesicarius est

riche en Phénols Totaux et en Flavonoïdes. Les extraits donnes une bonne activité

antioxydante soit une capacité de piégeage de radicaux libres et la réduction de fer .Notre

perspective d’avenir est d’étudier chaque extrait séparément puis isoler et identifier les

différents composés qui existent.

Enfin, nous recommandons une culture des plantes médicinales et alimentaires pour permettre

à la population d’avoir des médicaments et des denrées alimentaires moins chers et d’éviter la

disparition de certaines espèces intéressantes.

REFERENCES

BIBLIOGRAPHIQUES


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مـلـخـص

تهدف دراستنا الى تثمين النباتات الطبية الموجودة في الجزائر وذلك بتقدير كمية المركبات الفينولية

والفاعلية المضادة لألكسدة وتمت الدراسة على عينة من الجنوب الجزائري تسمى نبتة الحميض

suisa isRm xemuR

الفينولية باستعمال مذيبين هما الكلوروفورم وأول خطوة في هذا العمل متمثلة في استخالص المركبات

والفالفونيدات بطريقة Folin قمنا بالتقدير الكمي للفينوالت الكلية بطريقة ذلك بعد, اإليثيلخالت و

AlCl3ذلك باستعمال المطيافية فوق البنفسجية وVU.تم تحديد فاعلية المضادة لألكسدة لهذه ثم

طريقة ارجاع الحديد الثالثي, DPPHطريقة تثبيط الجذور الحرة ةالمستخلصات بواسطة طرق كيميائي

.BHT , BHA, Vitamine Cومقارنتها بمركبات قياسية

ومقدار ارجاع الحديد الثالثي بطريقة AEACحيث تم تحديد نسب التثبيط بداللة التراكيز وحساب مقدار

IC50 بطريقةDPPH حيث تحصلنا على نتائج جيدة.

الفعالية المضادة ,المركبات الفينولية,الفالفونيدات ,الحميض ,إستخالص : تاحيةالكلمات المف

.DPPHطريقة ارجاع الحديد الثالثي طريقة تثبيط الجذور الحرة .لألكسدة

Résumé:

Notre étude a pour objectif de valorisation des plantes médicinales en Algérie et en évaluant

la quantité des composés phénoliques et de l'étude de l'efficacité antioxydante a un

échantillon de sud d'Algérie appelée moût oseille( Rumex vesicarius).Notre travail porte sur

l’étude de la phytochimie et des activités antioxydantes de la plante Rumex vesicarius.

La première étape de ce travail représentée dans l'extraction des composés phénoliques en

utilisant deux solvants : chloroforme et l'acétate d'éthyle et la quantification des composes

phénoliques par la méthode de folin et la quantification des flavonoïdes par la méthode de

AlCl3nous avons estimé ces composés par spectroscopie UV -VIS.

L’activité antioxydante des différents extraits a été évaluée par deux méthodes ; la réduction

du fer et le piégeage du radical libre DPPH et comparé avec des standards BHA-Vitamine C.

Mots-clés: Extraction, Oseille, flavonoïdes, composés phénoliques, activité antioxydante, le

piégeage du radical libre DPPH, la réduction du fer,

etude de l’activite antioxydante - bu.univ … · iv-2-1 dosage des composés phénoliques totaux...

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