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Etude ultrastructurale des spermatozoïdes

Dr Florence BOITRELLEService Histologie Embryologie Biologie de la Reproduction

CHI Poissy St Germain (78)EA 2493 Université Versailles-Saint Quentin (78)

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NORMES WHO 1999 2009Volume: 2 ml 1.5 ml

Concentration : 20 millions/ml 15M/mlNombre total : 40 millions 39M

Vitalité : 60% 58%Mobilité a+b : 50% ou a >25% 32% (a+b)

40 %(a+b+c)

F. typiques : 30% 4% (critères stricts)

Qu’est-ce qu’un sperme « normal »?

Mais encore… qu’attend t-on d’un spermatozoïde ?

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Fonctions attendues du spermatozoïde…

Aptitude migratoire et fécondante

un flagelle et une tête…

Etapes que doit effectuer lespermatozoïde fécondant:

• 1. Migration dans le mucus cervical

• 2. Progression dans la cavité utérine et la trompe

• 3. Capacitation

• 4. Progression dans le cumulus oophorus (A)

• 5. Reconnaissance et liaison à la zone pellucide (B)

• 6. Induction de la réaction acrosomique par la ZP

• 7. Hyperactivation et pénétration de la ZP

• 8. Liaison et fusion avec la membrane ovocytaire (C)

• 9. Activation de l’ovocyte et blocage de la polyspermie

10. Déplacement dans le cytoplasme ovocytaire (D)

• 11. Décondensation et formation d’un pronucléus

• 12. zygote et clivage

4Représentation schématique d’un spermatozoïde humain. D’après Holstein et Roosen-Runge 1981.

Structure du spermatozoïde…

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De quels outils dispose t-on pour l’étudier ?

Boitrelle et al. 2011

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De quels outils dispose t-on pour l’étudier ?

Spermogramme et spermocytogramme CASA Migration dans le mucus cervical (M) seul test in vivo++++

Réaction acrosomique (F) Fixation à la zone pellucide (F + M) Test de fécondance hétérospécifique (F) Etude des qualités nucléaires (fragmentation ADN, FISH, Bleu d’aniline)

LE MATCH Etude ultrastructurale en Microscopie électronique Etude (ultra)structurale en MSOME

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Intérêts de l’étude ultrastructurale en ME

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Le % de formes typiques est abaissé du fait d’une anomalie récurrente très fréquente = tératospermie monomorphe

impact très probable sur l’aptitude migratoire et/ou fécondante

nécessité de compléter avec investigations utiles pour aider à la décision

bilan génétique et consanguinité ?

intérêt de l’étude ultrastructurale +++

Quand le spermogramme révèle une tératospermie monomorphe...

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Fawcett DW 1958: Structure of the mammalian spermatozoon, Int Rev Cytol

David G & Bisson JP 1975: Le spermatozoïde, système de classification et ultrastructure, Gynec Obstet et BDR, suppl

AF Holstein & EC Roosen-Runge 1981 Atlas of Human spermatogenesis (Verlag Ed)

Escalier D, « LA » spécialiste en France (et au-delà) de l’ultrastructure du spermatozoïde: retraitée

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Méthodologie de l’étude ultrastructurale en ME

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DIFFICULTES Technique longue et coûteuse

(matériel et temps) Sections de spermatozoïdes

pas de vue globale Beaucoup de sections

ininterprétables

LIMITES Nombre de cellules examinées (analysables)Vitalité suffisante

AVANTAGES Analyse fine

Quantification

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1ère difficulté: Méthodologie METechnique longue et coûteuse (matériel et temps de

technicien et de biologiste)

Sperme entier et /ou fraction migrée

Fixation des cellules en suspension Lavage en tampon sucré Réalisation d’un culot cellulaire Post fixation à l’acide osmique Inclusion en araldite ou épone Réalisation des coupes à l’ultramicrotome (60-90 nm) Coloration des grilles à l’acétate d’uranyle et citrate de

plomb Lecture des grilles au microscope électronique:

Identification et quantification des anomalies Saisie de documents photos Analyse fine des anomalies

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2ème difficulté Sections de Spermatozoïdes pas de vue globale nombreuses sections ininterprétables

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Exemple de plan oblique

Plan sagittal

Ultrastructure de la tête spermatique

Plan frontal

Reconstitution 3DBisson et al,,J Gyn Obst Biol Reorod, 1975,4:37-86

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Coupe longitudinale (sagittale)

Sections obliques

Nécrose

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Pièces intermédiaire et principaleReconstitution en 3D d’après JP Bisson, 1975

Pièce Intermédiaire

Pièce Principale

Exemple de plan oblique

Structures axonémales et péri-axonémales

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Sections transversales analysables

Sections ininterprétables

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Grille de lecture

Identification et quantification des anomalies céphaliques

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Nom Aliquot Date Numéro

Nombre sections flagelles

Normaux

Tubules t.centraux -

t. périph. -

t. 4 à 7 -

t. périph. +h

désorganise.

autres

F denses

Colonnes col -

col +

malpo 1 col.

malpo 2 col.

Gaine fibreuse Irréguliere

hypertrophié

Mito Irrégulieres

Sections long Normale

Grille de lecture

Identification et quantification des anomalies flagellaires

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Intérêt de l’étude ultrastructurale céphalique

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Plan sagittal

Ultrastructure de la tête spermatique

Plan frontal

Reconstitution 3DBisson et al,,J Gyn Obst Biol Reorod, 1975,4:37-86

Vacuole

Zone de l’anneau

Segment principal

Segment équatorial

Cape post acrosomique

Espace nucléaire postérieur

Plaque basale

Membrane nucléaire

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Anomalies de l’acrosome ++

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Globozoospermie (+)

Défaut d’élongation du noyau, de formation et mise en place de l’acrosome + défaut condensation de la chromatine

Dam et al., Am J Hum Genet 2007

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Globozoospermie et MSOME X6300-X10000

Intérêt dans le choix du spermatozoïde à injecter?

Spermatozoïdes vivants, mobiles Spermatozoïde vu dans sa globalité

Image Boitrelle et al.

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Conduite à tenir / globozoospermie…

Conseil génétique préalable Etude de la fragmentation de l’ADN et du taux

d’aneuploïdie? Augmentée* Marqueurs de matériel acrosomique? échec ICSI si

totalement absent** Condensation de la chromatine (correl° inverse Guthauser et al. 2011)

ICSI avec ou sans activation de l’ovocyte*** IMSI****Taux de fécondation abaissés mais G+ et BB…!

•Dam et al. 2007 ** Check et al.2007 *** Guthauser et al. 2011 **** Dirican et al. 2008***** Sermondade et al. 2012

Macrocéphalies

Guthauser et al.2011

Défaut de condensation de la chromatine entre autres

Aisément repérable en MO

Formes syndromiques ou partielles tableau hétérogène

FISH INDISPENSABLEMême si sélection des formes

normales en ICSI27

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Prise en charge macrocéphalie?fonction du taux d’aneuploïdie / FISH

Le plus souvent: contrindication formelletaux d’aneuploïdie élevé, même si taille de la tête compatible avec calibre de la pipette d’injection, parfois même si peu de macrocéphales….

Sélection de "top" spermatozoïdes en IMSItop spzdes sélectionnés chez des patients macrocéphales: persistance de l’aneuploïdie: pas d’intérêt

Guthauser et al. 2006 et 2013

Chelli et al. 2008 et 2010Guthauser et al. 2012

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La chromatine en ME

Trous nucléaires en ME

Nombreux Impact ?

Qu’est ce que tu vois?

Des gros trous !!!

La chromatine en MSOME

Bleu d’aniline 2008

TUNEL 2008

FISH X,Y,18 2008

La chromatine du spermatozoïde est plus fréquemment non condensée et donc immature s’il est porteur d’une large vacuole que s’il n’en porte pas

Il n’existe pas de différence significative du taux de fragmentation de l’ADN spermatique

Il n’existe pas de différence significative du taux d’aneuploïdies spermatiques

9/15 spermatozoïdes aneuploïdes ont une chromatine non condensée

Triple marquage sur le même spermatozoïde

Boitrelle et al. 2011

Microscopie à force atomique 2008

2008

Microscopie à sectionnement optique et déconvolution 2008

Boitrelle et al. 2011

Qu’est ce que tu vois?

Des petits trous !!!

La chromatine en MSOME

2008

Microscopie à sectionnement optique et déconvolution Boitrelle et al. 2013

Microscopie à sectionnement optique et déconvolution Boitrelle et al. 2013

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Prise en charge des vacuoles ?

Sélection de "top" spermatozoïdes en IMSI IMSI=ICSI en première intention

Intéressante en cas d’échecs d’implantation en ICSI: indication principale

Boitrelle et al. 2013

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La MATCH ME vs MSOMEpour les anomalies céphaliques

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Intérêt de l’étude ultrastructurale flagellaire

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L’étude ultrastructurale… sur quels signes d’appel (autres que la morphologie) ?

Spermocytogramme Tératospermies monomorphes

Spermogramme Altérations de la mobilité Quantitative Qualitative

• Tests fonctionnels dans le mucus cervical Défaut de migration

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L’axonème:

- 9 doublets de tubules périphériques (microtubules A et B) reliés par des ponts de nexine

-1 doublet central entouré d’une gaine relié par des fibres radiaires aux doublets périphériques

- Bras interne et externe de dynéine associés au microtubule A

-Fibres denses autour de l’axonème sauf dans la pièce terminale

-Manchon mitochondrial en plus entourant axonème-fibres denses dans PI uniquement

-Gaine fibreuse entourant axonème-fibres denses dans pièce principale seulement

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Ultrastructure du flagelle +++ Structures axonémales et périaxonémales

Avec l’aimable autorisation de Denise Escalier 1984 et 1985

Longueur moyenne totale du flagelle # 60µm, diamètre #0.17µm; pièce intermédiaire # 3.4µm

Serres et al. 1983

DF Fibres denses

FS Gaine fibreuse

LC colonnes longitudinales

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Anomalies flagellaires axonémalescoupes transversales +++

Liaisons centrales Complexe central Doublets 4 à 7

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Anomalies pièce intermédiairecoupes longitudinales

Allosilla et al. 2002

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Anomalies Périaxonémalescoupes longitudinales

Avec l’aimable autorisation de Denise Escalier

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Anomalies flagellaires

Multiples Angulation

Court (+++)

Enroulé

Olmedo et al. 1997Chems et al. 2003

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Quels signes d’appel à l’interrogatoire?

Durée d’infertilité Iaire sans cause féminine décelée Consanguinité des parents Infertilité de la fratrie Échecs inexpliqués d’IIU ou échecs de tentatives

de FIV/ICSI Pathologie somatique associée (anosmie, DDB, etc…)

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Mobilité et anomalies flagellaires: parfois trompeuse

Absence des bras externes de dynéine

Absence des paires de tubules 4 à 7

Quel(s) moyen(s) diagnostiques(s)? (pfs non repérables au spermocytogramme…): CASA et spz glissant (atteinte périaxonémale)

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Test négatif, mais pénétration normale de spermatozoïdes témoins in vitro…

==> cause spermatique Infection (spermoculture)

Survie déficiente des spermatozoïdes (TMS)

Présence d’anticorps anti-spermatozoïdes dans le sperme

Dyskinésie flagellaire

Anomalies flagellaires: test de Hühner+++

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Chances d ’obtention d ’une grossesse en reproduction naturelle, IIU ou FIV quasi nulles

==> ICSI

Risque de transmission?

==> conseil génétique

Anomalies flagellaires: grossesse

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Systématique avant toute ICSI Réalisation d’un arbre généalogique Caryotype

informer sur…. Réserves sur le risque génétique encouru? Réserves sur le risque de transmission infertilité?

Si anomalie ultrastructurale caractérisée identifiée… Quels résultats en ICSI? Risque majoré de FCS? Possibilité de risque surajouté?

Viville et al. Human Reprod 2000; Olmedo et al. Asian J Androl 2000; Peerear Reprod Biomed Online 2004; Mobberley et al. Br J Biomed Sc 2010

Anomalies flagellaires: conseil génétique

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Série de 21 patients asthenozoospermie majeureet/ou dyskinésie flagellaire caractérisées, après ME et conseil génétique

Taux de fécondation: 61.8%

Survenue d’une grossesse clinique chez 12 couples/21

Accouchement BB normal à terme pour 9 couples

Mitchell et al.2006Francavilla et al.2007

Anomalies flagellaires: ICSI

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Série de 20 patients asthenozoospermie majeureet/ou dyskinésie flagellaire caractérisées, après bilan et conseil génétique

anomalie des structures axonémales centrales cinétique embryonnaire ralentie

14 grossesses cliniques / 53 tentatives d’ICSI (26.4%) 3 FCS

12 enfants nés, soit taux de grossesse de 7.2% par embryon transféré

Pronostic … absence bras internes dynéine > anomalie structures centrales > désorganisation axo et péri axonème > absence bras externes de dynéine

Fauque et al. 2009

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ME et MSOME complémentaires car apports d’informations différentes

Spermatozoïde fixé vs vivant Section vs cellule entière Constitution fine vs « aspect extérieur » MSOME apporte peu d’infos sur l’aptitude migratoire et

sur le flagelle Intérêt du MSOME pour PI et centriole ?? Ugajin et al. 2010

MAIS… nécessité de bien connaître l’ultrastructure pour comprendre ce que l’on voit au fort Gt…

La MATCH ME vs MSOMEpour les anomalies flagellaires

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CONCLUSION

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Au total, concernant l’étude ultrastructurale en ME...

(et au-delà des facteurs limitants précités…)

L’intérêt est de préciser un phénotype et quantifier les anomalies de structure impliquées dans l’aptitude migratoire et fécondante des spermatozoïdes

Cadre diagnostic, sur indications validées afin de:

Préciser un éventuel risque génétique associé (ex: absence bras de dynéine)

Définir le statut précis de certaines pathologies syndromiques

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Au total, concernant l’étude « ultrastructurale » en MSOME...

L’intérêt est de quantifier les anomalies de structure impliquées dans l’aptitude migratoire et fécondante (implantatoire) des spermatozoïdes ou des embryons issus de ces spermatozoïdes

Cadre diagnostique et thérapeutique:

MSOME dans les échecs d’ICSI, à relier à la nature des vacuoles

Essayer de corréler certains phénotypes avec l’AMP à choisir: ICSI ou IMSI ? Notion des seuil de spz typiques ? A déterminer s’il existe (étude en cours)

Pr Jacqueline SELVA