evaluaciÓn de la reactividad de las fracciones …
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EVALUACIÓN DE LA REACTIVIDAD DE LAS FRACCIONES
ANTIGENICAS DE 24 kDa Y 10 kDa DE Mycobacterium tuberculosis
MEDIANTE UNA TÉCNICA INMUNOENZMATICA.
MARGARITA GOMEZ SARMIENTO
TESIS DE GRADO PARA OPTAR AL TITULO DE
BIOLOGA
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES.
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
BOGOTÁ. ENERO DE 2003.
A mi papá...A mi papá...
AGRADECIMIENTOS
§ A mi directora Myriam Navarrete J. por toda su ayuda, comprensión
paciencia y amabilidad durante la realización de este proyecto.
§ A mi codirector Orlando Martínez W. por su colaboración y preocupación.
§ A todo el personal del departamento de Microbiología de la Facultad de
Medicina en la Universidad Nacional de Colombia por su valiosa
participación en todos los aspectos de la elaboración de este trabajo.
§ A la bacterióloga Claudia Rocío Sierra por enseñarme todo acerca de las
micobacterias y por colaborarme especialmente con el trabajo de
laboratorio.
§ Al Doctor Jorge E. Ángel, director del Laboratorio de Diagnóstico Molecular
Vegetal del ICA por su ayuda incondicional, sin la cual hubiese sido
imposible realizar este proyecto.
§ A todo el personal del Laboratorio de Diagnóstico Molecular Vegetal del ICA
por su paciencia y colaboración durante mi estancia allá.
§ A Julio Cesar Giraldo de la Universidad INCCA de Colombia, por su ayuda
en la purificación y cuantificación de los antígenos.
§ A mi mamá, a mi hermana y a Javier por estar siempre ahí cuando los
necesité y a mi papá por hacer posible todo este proceso.
TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCIÓN
1. JUSTIFICACIÓN............................................................................................1
2. TUBERCULOSIS...........................................................................................3
2.1 DEFINICIÓN.................................................................................................3
2.2 HISTORIA.....................................................................................................3
2.3 BACTERIOLOGIA........................................................................................4
2.3.1 POSICIÓN TAXONÓMICA.......................................................................5
2.4 FACTORES DE VIRULENCIA......................................................................6
2.5 DESCRIPCIÓN DE LA ENFERMEDAD........................................................7
2.6 INMUNOPATOLOGIA...................................................................................8
2.7 INMUNOLOGIA.............................................................................................9
2.8 TRATAMIENTO..........................................................................................11
2.9 DIAGNÓSTICO............................................................................................12
2.9.1 PRUEBA DE LA TUBERCULINA............................................................13
2.9.2 BACILOSCOPIA.....................................................................................15
2.9.3 CULTIVO................................................................................................16
2.9.4 OTROS ESTUDIOS DIAGNÓSTICOS...................................................16
2.9.5 REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA...................................17
2.9.6 ESTUDIOS PRELIMINARES PARA EL DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO
DE LA TUBERCULOSIS........................................................................17
2.9.7 ANTÍGENOS DE BAJO PESO MOLECULAR.......................................19
2.10 EPIDEMIOLOGÍA...................................................................................20
2.11 TUBERCULOSIS EN COLOMBIA.........................................................22
3. OBJETIVOS.................................................................................................23
3.1 OBJETIVO GENERAL.................................................................................23
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................23
4. MATERIALES. .............................................................................................24
4.1 EQUIPOS.....................................................................................................24
4.2 MATERIAL BIOLÓGICO..............................................................................25
4.3 MATERIAL DE LABORATORIO..................................................................25
4.4 REACTIVOS................................................................................................25
5. METODOS...................................................................................................27
5.1 MANTENIMIENTO DE LA CEPA Y OBTENCIÓN DEL ANTIGENO CRUDO
DE Mycobacterium tuberculosis CEPA H37RV...........................................27
5.2 ELECTROFORESIS DE PROTEINAS Y OBTENCIÓN DE LAS
FRACCIONES ANTIGÉNICAS DE Mycobacterium tuberculosis
H37RV..........................................................................................................28
5.3 RECOLECCION DE SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y
SANOS.........................................................................................................29
5.4 REABSORCIÓN DE LOS SUEROS CON LISADOS DE Escherichia
coli...............................................................................................................30
5.5 ENSAYO INMUNOENZIMATICO ELISA....................................................31
5.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO...........................................................................32
6. RESULTADOS.............................................................................................33
6.1 OBTENCIÓN DEL ANTÍGENO CRUDO DE Mycobacterium tuberculosis
H37RV Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE SDS-
PAGE...........................................................................................................33
6.2 TITULACIONES EN BLOQUE....................................................................34
6.3 REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 24 kDa CON LOS
SUEROS DE LOS PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS...................35
6.4 REACTIVIDAD DE LAFRACCIÓN ANTIGENICA DE 10 kDa CON LOS
SUEROS DE LOS PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS...................36
6.5 REACTIVIDAD DE LA MEZCLA DE ANTÍGENOS DE 24 kDa Y 10 kDa
CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS..........37
6.6 REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 10 kDa CON LOS
SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS ABSORBIDOS
CON LISADOS DE Escherichia coli............................................................38
6.6.1 CONDICIONES ESTANDARIZADAS PARA LOS SUEROS SIN
ABSORBER............................................................................................38
6.6.2 CONDICIONES ESTANDARIZADAS INDEPENDIENTE DE LO
ENCONTRADO PARA LOS SUEROS SIN ABSORBER.......................39
6.7 REACTIVIDAD DEL ANTIGENO DE 24 kDa CON LOS SUEROS DE
PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS ABSORBIDOS CON LISADOS
DE Escherichia coli......................................................................................40
6.7.1 CONDICIONES ESTANDARIZADAS PARA LOS SUEROS SIN
ABSORBER............................................................................................40
6.7.2 CONDICIONES ESTANDARIZADAS INDEPENDIENTEMENTE POR
TITULACIONES EN BLOQUE................................................................41
6.8 REACTIVIDAD DE LA MEZCLA DE LOS ANTIGÉNOS DE 10 Y 24 kDa
CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS
ABSORBIDOS CON LISADOS DE Escherichia coli..................................42.
6.8.1 CONDICIONES ESTANDARIZADAS PARA LOS SUEROS SIN
ABSORBER............................................................................................42
6.8.2 CONDICIONES ESTANDARIZADAS INDEPENDIENTEMENTE..........43
6.9 DETERMINACIÓN DE LOS VALORES DE RENDIMIENTO OPERATIVO
PARA CADA UNA DE LAS PRUEBAS........................................................44
7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS..................................................................46
7.1 REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 24 kDa CON LOS
SUEROS DE LOS PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS...................46
7.2 REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 10 kDa CON LOS
SUEROS DE LOS PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS...................47
7.3 REACTIVIDAD DE LA MEZCLA DE ANTÍGENOS DE 24 kDa Y 10 kDa
CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS..........48
7.4 REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 10 kDa CON LOS
SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS ABSORBIDOS
CON LISADOS DE Escherichia coli.............................................................49
7.5 REACTIVIDAD DE LA MEZCLA DE LOS ANTIGÉNOS DE 10 Y 24 kDa
CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS
ABSORBIDOS CON LISADOS DE Escherichia coli ...................................50
7.6 REACTIVIDAD DEL ANTIGENO DE 24 kDa CON LOS SUEROS DE
PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS ABSORBIDOS CON LISADOS
DE Escherichia coli......................................................................................51
7.7 EVALUACIÓN DE LA REACTIVIDAD DE LAS FRACCIONES
ANTIGENICAS DE 24 kDa Y 10 kDa DE Mycobacterium tuberculosis....52
8. CONCLUSIONES.........................................................................................56
9. RECOMENDACIONES................................................................................57
10. REFERENCIAS...........................................................................................58
INDICE DE ANEXOS.
Anexo 1. Medio de cultivo Ogagwa Kudoh para el mantenimiento de
Mycobacterium tuberculosis.
Anexo 2. Determinación de la concentración proteíca mediante el método
de Bradford (dye binding).
Anexo 3. Electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida.
Anexo 4. Marcadores de peso molecular.
Anexo 5. Resumen de los pacientes incluidos en el estudio.
Anexo 6. Soluciones usadas para los ensayos inmunoenzimaticos ( ELISA
indirecta).
Anexo 7. Análisis de tablas tetracóricas (4 x 4) para la determinación de los
valores de rendimiento operativo de una prueba diagnóstica.
INDICE DE FIGURAS.
Figura 1. Microfotografía electrónica de bacilos de Mycobacterium
tuberculosis
Figura 2. Aplicación de la prueba de la tuberculina
Figura 3. Algoritmo diagnóstico e interpretación del PPD
Figura 4. Baciloscopia de esputo positiva para bacilos ácido- alcohol
resistentes.
Figura 5. Incidencia de tuberculosis en el mundo según la Organización
Mundial de la Salud.
Figura 6. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 13%.
INDICE DE TABLAS.
Tabla 1. Principales fármacos usados en el tratamiento de la tuberculosis.
Tabla 2. Condiciones de trabajo para ELISA estandarizadas mediante
titulaciones en bloque.
Tabla 3. Valores de los rendimientos operativos para las distintas pruebas
INDICE DE GRÁFICOS.
Gráfico 1. Número de casos reportados en Colombia según un reporte de la
Organización Mundial de la Salud. OMS 2000
Gráfico 2. Regresión semi logarítmica de los Marcadores de Peso molecular
en función de su tasa de migración RF.
Gráfico 3. Reactividad de la fracción antigénica de 24 kDa con los sueros de
los pacientes tuberculosos y sanos.
Gráfico 4. Reactividad de la fracción antigénica de 10 kDa con los sueros de
los pacientes tuberculosos y sanos.
Gráfico 5. Reactividad de la mezcla de fracciones antigénicas de 24 kDa y
10 kDa con los sueros de los pacientes tuberculosos y sanos.
Grafico 6. Reactividad de la fracción antigénica de 10 kDa con los sueros de
pacientes tuberculosos y sanos absorbidos con lisados de
Escherichia coli. (condiciones estandarizadas para los sueros sin
absorber)
Gráfico 7. Reactividad de la fracción antigénica de 10 kDa con los sueros de
pacientes tuberculosos y sanos absorbidos con lisados de
Escherichia coli. (estandarización independiente)
Gráfico 8. Reactividad del antígeno de 24 kDa con los sueros de pacientes
tuberculosos y sanos absorbidos con lisados de Escherichia coli.
(condiciones estandarizadas para los sueros sin absorber)
Grafico 9. Reactividad del antígeno de 24 kDa con los sueros de pacientes
tuberculosos y sanos absorbidos con lisados de Escherichia coli.
(estandarización independiente)
Gráfico 10. Reactividad de la mezcla de los antigénos de 10 y 24 kDa con los
sueros de pacientes tuberculosos y sanos absorbidos con lisados
de Escherichia coli. (condiciones estandarizadas para los sueros
sin absorber)
Gráfico 11. Reactividad de la mezcla de los antigénos de 10 y 24 kDa con los
sueros de pacientes tuberculosos y sanos absorbidos con lisados
de Escherichia coli. (estandarización independiente)
INTRODUCCIÓN.
La tuberculosis es la causa de muerte de millones de personas y
actualmente se considera una de las endemias mas severas en el mundo.
Cada año aparecen 8 millones de nuevos enfermos y 2 millones de muertos
incluidos varios niños y enfermos de SIDA y las condiciones socioeconómicas
de países en desarrollo contribuyen a la diseminación de la enfermedad (OMS,
2000).
Descrita por primera vez a finales del siglo XIX por el científico Robert Koch
(Koch, 1884) el agente etiológico de esta enfermedad es una bacteria del
complejo Mycobacterium tuberculosis que se disemina fácilmente a partir de
gotas de saliva y que a través de la sangre puede abarcar cualquier órgano o
sistema (Volk et al. 1988).
El diagnóstico temprano es adecuado para el oportuno tratamiento de
pacientes con tuberculosis y de esta forma se previene la alta diseminación de
bacilos típica de las formas mas avanzadas de la infección. La historia clínica
y la radiología son la base para sospechar de esta enfermedad pero sólo la
comprobación bacteriológica de la existencia de M. tuberculosis en cualquier
muestra o tejido asegura el diagnóstico. Para esto se realizan cultivos y
exámenes directos a las muestras en un método conocido como baciloscopia
(Gutierrez et al. 1998). Este tipo de diagnóstico tarda mucho tiempo, un
cultivo puede demorar hasta 5 semanas y suele hacerse sólo en ciertos
laboratorios especializados. Es por eso que se hacen necesarios métodos
diagnósticos mas rápidos, eficientes y precisos.
Las pruebas serológicas no han tenido mucho éxito y no han llegado a
sustituir a los métodos tradicionales. Los resultados usando antígeno crudo son
poco concluyentes por lo que se han probado diversos antígenos proteicos y
lipídicos, (Garcia, David y Papa. 1988), (Barnes et al. 1992), (Tortola,
Laneelle y Martín-Casabona. 1996), (Diagbouga et al 1997), (Laal et al.
1997), (Samanich et al. 2000), (Laurens et al. 2000) , pero hasta el momento
los resultados son muy variables y parecen diferir entre grupos de estudio. Al
usar antígenos de menor peso molecular se espera obtener mejores resultados
en el diagnóstico serológico y de esta manera evaluar algunos candidatos para
ser usados como ligandos en pruebas serodiagnósticas de rutina como ELISA.
1
1. JUSTIFICACIÓN.
Se calculó que para finales del siglo pasado aparecieron cerca de 90
millones de nuevos casos de tuberculosis, 30 millones de muertes, 30 más de
nuevos infectados y un tercio de la población total mundial tuvo algún contacto
con el bacilo.
Su alta incidencia en la población la ha convertido en la principal causa
de muerte en adultos dentro del grupo de enfermedades infecciosas y se
asume que más de 50 millones de personas están infectadas con cepas
resistentes a por lo menos una de las drogas antituberculosas (Estrada, 2000).
En Colombia, esta enfermedad no es menos importante y sumado a las
condiciones de pobreza y hacinamiento se convierte en un serio problema de
salud pública.
Teniendo en cuenta que muchos de los casos ocurren en áreas rurales
donde los servicios de salud son deficientes, un método diagnóstico rápido,
simple y barato es una prioridad para el control de esta enfermedad en el país.
Si bien la serología no ha sido capaz de sustituir a la bacteriología como
patrón de oro en el diagnóstico de la TBC, esta puede llegar a convertirse en
una herramienta de ayuda diagnóstica importante para casos especiales como
TB extrapulmonar, o pacientes con VHI o menores de 6 años, en los cuales la
baciloscopia tiene un bajo rendimiento y la clínica y la radiología pueden llegar
a ser muy inespecíficas.
2
Por otra parte, la búsqueda activa de casos y el registro epidemiológico
también se ve afectado por la complicidad de los métodos diagnósticos
tradicionales lo cual resulta en un importante subregistro de nuevos casos.
Se han realizado diversos estudios para estandarizar y validar técnicas
serológicas de diagnóstico en tuberculosis, pero los resultados pueden diferir
enormemente entre los grupos de investigación y la aplicación de estas
pruebas depende directamente de las características de las poblaciones
estudiadas, es así como en Colombia, se hace necesario el estudio de
antígenos que sean lo suficientemente específicos para detectar a los
enfermos exitosamente teniendo en cuenta que la mayoría de la población
adulta fue vacunada con BCG y que la alta prevalencia de la enfermedad
implica una gran cantidad de personas infectadas no enfermas, de modo que
existe un nivel de anticuerpos circulantes que podrían producir muchos
resultados falsos positivos.
Es por eso que es importante estudiar otros ligandos para las pruebas
inmunoenzimáticas como los antígenos de bajo peso molecular que puedan
detectar con mayor especificidad la enfermedad.
3
2. TUBERCULOSIS.
2.2. DEFINICIÓN.
El término Tuberculosis (TBC) define una amplia gama de
manifestaciones clínicas causadas por Mycobacterium tuberculosis y menos
frecuentemente por Mycobacterium bovis o Mycobacterium africanum. Es la
causa de muerte mas frecuente en el mundo por un único agente infeccioso y
se ha declarado como una emergencia global de salud pública. La tuberculosis
puede afectar prácticamente cualquier órgano, sobre todo los pulmones y
típicamente se asocia con la formación de granulomas (Mendell, Bennet y
Dolin, 2002).
2.2. HISTORIA.
La tuberculosis es una enfermedad muy antigua, se han encontrado
lesiones raquídeas características de tuberculosis en restos humanos del
periodo neolítico. Aproximadamente en el año 380 A.C. Hipócrates efectuó una
descripción de un trastorno pulmonar llamado tisis (fundirse, derretirse) y
sugirió que era causado por alguna sustancia en el aire exhalado por los
pacientes enfermos, solo casi 2000 años después el médico Robert Koch
describió el agente causal de la enfermedad y comprobó la teoría de
Hipócrates (Rossman, MacGregor, 1995).
4
En el siglo XVII el anatomista holandés Francisco Silvio describió
pequeños nódulos en los pulmones de los pacientes que tenían tisis a los que
llamó tubérculos, también en este siglo la enfermedad empezó a considerarse
como un problema de salud pública y se catalogó entre las tres principales
causas de muerte en el mundo (Rossman, MacGregor, 1995).
Durante el siglo XIX se acuñaron los términos de Tuberculosis (1893) y
de Peste Blanca (1861) y además el nacimiento de la Bacteriología como
ciencia permitió a Robert Koch describir detalladamente a M. tuberculosis y
confirmar su postulados respecto a la infección (Rossman, MacGregor, 1995).
A mediados del siglo XX en 1940, se iniciaron pruebas clínicas de los
dos primeros fármacos eficientes contra M. tuberculosis y durante el resto del
siglo los esfuerzos se han centrado en la producción y búsqueda de nuevos y
mejores agentes terapéuticos para el tratamiento de esta enfermedad, y en
especial con el advenimiento de la tuberculosis multirresistente y la pandemia
de VIH (Rossman, MacGregor, 1995).
2.3. BACTERIOLOGIA
El género Mycobacterium consiste en organismos con forma de bacilo
( Figura 1), los cuales en algún estadio de su ciclo de vida son ácido alcohol
resistentes. Esta propiedad tintatorial se debe a la presencia en la superficie
celular de componentes lipídicos específicos llamados ácidos micólicos y
5
puede evidenciarse mediante la coloración de Ziehl Neelsen (Madigan ,
Martinko y Parker , 1997).
Figura 1. Microfotografía electrónica de bacilos de Mycobacterium tuberculosis.BBC.News en http://news.bbc.co.uk/1/hi/health/986406.stm
Mycobacterium tuberculosis es un anaerobio obligado que puede cultivarse
en un medio sencillo hecho de sales inorgánicas, asparagina y glicerol. En
virtud del elevado contenido de lípido de la bacteria, forma colonias muy
densas o una película superficial en medio líquido. El ritmo de proliferación de
M. tuberculosis es mucho más lento que el de otras bacterias, e incluso en
circunstancias óptimas, la división requiere 12 a 20 horas, por lo que puede ser
necesario el transcurso de seis semanas para que sea visible el crecimiento a
partir de una pequeño inóculo (Volk et al.1988).
2.3.1. POSICIÓN TAXONÓMICA.
ORDEN: Actynomycetales
FAMILIA: Mycobacteriaceae
GENERO: Mycobacterium
ESPECIE: tuberculosis, bovis, africanum, microti y ulcerans
(Complejo M. tuberculosis)
6
2.4. FACTORES DE VIRULENCIA.
Si bien no se ha aclarado del todo la base de la virulencia y los modelos
actuales son insuficientes para determinar los mecanismos moleculares de la
virulencia en tuberculosis se conocen algunos factores que pueden estar
involucrados con la capacidad infecciosa del bacilo tuberculoso.
Se conocen algunos constituyentes de las capas exteriores de la pared de
M. tuberculosis que pueden desempeñar un papel como factores en la
virulencia.
♦ Factor de cordón: conocido ahora como dimicolato de trehalosa. Tiene
actividad tóxica. Su función como factor de virulencia es dudosa debido a
que se encuentra también en micobacterias no patógenas.
♦ Sulfolípidos: intensifican la toxicidad del factor de cordón.
♦ Micósidos: específicos de especie, conforman una zona transparente a los
electrones y les confieren protección contra el ambiente hostil intracelular.
♦ Lipoarabinomanán (LAM): polisacárido de pared que puede actuar
como factor de virulencia debido a sus múltiples interacciones con el
sistema inmune del hospedero: intensifica la producción de TNF alfa y a
su vez inhibe la producción de INF gamma y es además un depredador
de radicales libres (Rossman, MaC Gregor, 1996).
7
2.5. DESCRIPCIÓN DE LA ENFERMEDAD
La infección inicial de la tuberculosis suele ser asintomática. Las
lesiones, por lo general, curan y no dejan alteraciones residuales, excepto
calcificación ocasional de los ganglios linfáticos pulmonares o traqueo-
bronquiales. La gran mayoría de las personas infectadas entran en esta fase de
latencia, a partir de la cual existe el peligro permanente de reactivación. En
algunos casos, la infección inicial puede evolucionar de manera directa hasta
culminar en tuberculosis pulmonar o, por la diseminación linfohematógena del
bacilo, causar afección pulmonar, miliar, meníngea o de localización
extrapulmonar. En los lactantes, los adolescentes y los adultos jóvenes es más
frecuente que la infección inicial tenga consecuencias y pronóstico graves. La
tuberculosis extrapulmonar es menos común que la pulmonar. Puede afectar
cualquier órgano o tejido, incluye meningitis tuberculosa, y tuberculosis
hematógena aguda (miliar), y afecta los ganglios linfáticos, la pleura, el
pericardio, los riñones, los huesos y las articulaciones, la laringe, la piel, los
intestinos, el peritoneo y los ojos. La tuberculosis pulmonar progresiva surge
por reinfección exógena o por reactivación endógena del foco latente que
persistía desde la infección inicial. Sin tratamiento, aproximadamente la mitad
de los enfermos mueren en el lapso de dos años. La quimioterapia apropiada
casi siempre cura la enfermedad. El estado clínico depende más bien de la
presencia o ausencia de bacilos tuberculosos en el esputo, como también de la
naturaleza de los cambios en las radiografías de tórax (Netsalud, 2002).
8
2.6. INMUNOPATOLOGIA.
Los bacilos que son inhalados profundamente en los pulmones son
fagocitadas por los macrófagos alveolares y allí son eliminados inmediatamente
o sobreviven para iniciar una infección. Si no hay suficientes macrófagos
activados para eliminar los bacilos se pueden formar lesiones caseosas que
crecen localmente o pueden licuarse para liberar mas bacilos y sus derivados
al tronco bronquial. La activación de los macrófagos alveolares está
acompañada de una reacción mediada por células que habilita a los
macrófagos para matar y digerir los bacilos. Esta respuesta celular tiene dos
funciones aparentemente contradictorias, una es destruir los macrófagos
incapaces de destruir las bacterias intracelulares y la otra es activar los
macrófagos infectados para destruir a su invasor, lo anterior requiere un
balance entre los diferentes mecanismos efectores de los linfocitos que
muestran actividad citolítica a la vez que secretan citoquinas
inmunoprotectivas. Tanto la lisis de los macrófagos como su activación pueden
detener el crecimiento del tubérculo ya que los bacilos no se multiplican
apreciablemente en tejido necrótico caseoso no licuado. La destrucción de los
macrófagos no activados, resulta inevitablemente en daño tisular, y puede
causar patologías características como necrosis caseosa y cavitaciones. Más
tarde en la infección se pueden reclutar otras células circulantes como
monocitos, linfocitos y neutrófilos, pero ninguno de estos tipos celulares es muy
eficiente en la destrucción de las bacterias. La destrucción y activación de los
macrófagos alveolares puede ser evidenciada a nivel macro por la presencia de
9
granulomas, éstos presentan una reacción típica de hipersensibilidad retardada
mediada por células T dentro del tejido parenquimatoso. Las lesiones focales
granulomatosas compuestas de células epiteloides gigantes y de linfocitos T
antígeno-específicos empiezan a formar una pared alrededor del patógeno y
así previene su diseminación, por lo tanto, el daño pulmonar característico de
esta enfermedad se debe casi exclusivamente a la respuesta de daño celular
del hospedero. Los granulomas o tubérculos previenen la multiplicación de las
micobacterias gracias al pH interior ácido y a la falta de nutrientes esenciales,
pero algunos bacilos pueden permanecer dormantes por décadas. En
conclusión, el proceso de formación de granulomas es eficiente para contener
los patógenos, pero la formación de cavitaciones puede permitir la
diseminación del bacilo a otros hospederos por vía aérea (Kaufmann, Sher y
Ahmed, 2002).
2.7. INMUNOLOGIA.
La tuberculosis es el prototipo de infecciones que requieren una
respuesta inmune de tipo celular para su control. Aunque se producen
abundantes anticuerpos durante la infección, estos no parecen desempeñar
ningún papel en la defensa del hospedero. Durante las primeras semanas
después de la exposición, el huésped casi no tiene ninguna defensa contra la
infección por el bacilo tuberculoso, de modo que las bacterias se replican
libremente en los alvéolos pulmonares o en los macrófagos alveolares. Esta
10
replicación sin restricciones prosigue durante semanas hasta que sobreviene el
desarrollo de la hipersensibilidad tisular e inmunidad celular (Mendell, Bennet
y Dolin, 2002).
Los linfocitos T �� activados por el reconocimiento de los antígenos
micobacteriales presentados dentro de un contexto de histocompatibilidad
mayor clase II proliferan y producen proteínas secretorias que atraen, retienen
y activan los macrófagos en el sitio del antígeno potenciando su actividad
micobactericida. Los macrófagos también secretan sustancias reguladoras
(TNF �, Factor de crecimiento plaquetario, Factor transformante � y Factor de
crecimiento fibroblástico) que en conjunto con las proteínas secretorias de los
linfocitos (INF gamma, factor inhibitorio de la migración MIF) determinan el
carácter de la respuesta (Mendell, Bennet y Dolin, 2002).
La última fase de la respuesta inmune en tuberculosis será la aparición
de una resistencia adquirida. No todos los linfocitos T permanecen en el foco
de infección, algunos retornan a la circulación sanguínea o linfática, entre estos
están los que median las reacciones de hipersensibilidad retardada, estos
linfocitos se diferencian a formas de larga vida y cuando se vuelven a encontrar
con los antígenos micobacteriales secretan citocinas nuevamente para
desencadenar la respuesta granulomatosa, contrarrestando de alguna manera
las infecciones secundarias (Sánchez y Toro, 2001).
11
2.8. TRATAMIENTO.
El tratamiento para las formas pulmonar y extra pulmonar es el mismo y
debe iniciarse presuntivamente antes del diagnóstico. Los pacientes se tratan
inicialmente con un esquema tetra conjugado mientras se realizan pruebas de
resistencia (solo en algunos casos). El tratamiento de la tuberculosis se basa
en tres principios básicos: el uso de múltiples medicamentos, la toma regular
de los mismos y el tratamiento prolongado. Sólo así se asegura un éxito en la
recuperación del paciente y una menor probabilidad de generar resistencia a
los fármacos (Wilson 2002).
La Tabla 1 muestra los fármacos de elección mas comunes en el
tratamiento de la tuberculosis.
12
Tabla 1. Principales fármacos usados en el tratamiento de latuberculosis ( Wilson, 2002).
FARMACOS EFECTOS ADVERSOS Isoniacida Hepatitis, Neuropatia periférica Rifampicina Síndrome similar al resfriadoPRIMERA ELECCIÓN Coloración de los fluidos corporales Pirazinamida Atralgia, Hiperuricemia. Estreptomicina Ototoxicidad Etambutol Neuritis óptica Etionamida Kanamicina Cicloserina Amikacina SEGUNDA ELECCIÓN Ciprofoxacina Clofazimina
Cicloserina Ofloxacina Rifabutina
2.9. DIAGNÓSTICO.
A partir de la historia clínica y el examen radiológico se puede sospechar de
tuberculosis, pero éstos nunca deben considerarse probatorios del diagnóstico,
el cual se confirma mediante la comprobación de la existencia de M.
tuberculosis en cualquier material proveniente del sospechoso de tener la
enfermedad. La presencia de granulomas con necrosis de caseificación en
muestras de tejido se considera altamente sugestiva de la enfermedad.
2.9.1. PRUEBA DE LA TUBERCULINA
13
Las personas que muestran infección por Mycobacterium tuberculosis, M.
africanum y M. bovis casi siempre reaccionan a las pruebas cutáneas con dosis
pequeñas de tuberculina (Figura 2), es decir, el bioequivalente de 5 unidades
internacionales (UI) del Patrón Internacional del Derivado Proteínico Purificado
(PPD). La reacción a veces no aparece en las personas gravemente enfermas
de tuberculosis, durante algunas enfermedades infecciosas agudas y en las
personas que han sufrido inmunosupresión. Las reacciones causadas por otras
bacterias, inclusive BCG, tienden a ser menores; su frecuencia relativa varía
con la prevalencia de esas otras micobacterias en el medio ambiente. Suele
definirse una reacción positiva como aquella que tiene un diámetro de 10 mm o
más de induración, esta cifra constituye un límite arbitrario y no es adecuada
para todas las situaciones y grupos de edad. Entre contactos familiares de
enfermos tuberculosos infectantes y personas con infección por VIH hay que
considerar como signo de infección tuberculosa, incluso una induración de 5
mm de diámetro (Netsalud 2002). La Figura 3 muestra la sinapsis diagnóstica
y la interpretación de la prueba de tuberculina.
figura 2. Aplicación de la prueba de la tuberculina.http://www.med.sc.edu:85/fox/mycobacteria.htm
14
Figura 3. Algoritmo diagnóstico e interpretación del PPD.Según Louro J. 2000
2.9.2. BACILOSCOPIA
15
Es el examen directo de cualquier material orgánico en busca de
micobacterias, en el caso de la tuberculosis respiratoria se hace la búsqueda
en esputo, espontáneo o inducido, o en las secreciones broncopulmonares
obtenidas por lavado bronquial o broncoalveolar. El examen se basa en la
propiedad de ácido-alcohol resistencia de las micobacterias; en la coloración
de Ziehl Neelsen, la más empleada, las micobacterias conservan el color rojo
dado por la fucsina, después de ser expuestas al alcohol ácido. La
sensibilidad de la baciloscopia del esputo no es alta y varia entre 40 y 60 %
dependiendo de la concentración de la bacteria en la muestra. En países con
condiciones sanitarias deficientes como el nuestro, en los cuales la prevalencia
de la tuberculosis en alta y la consulta suele ser tardía, la baciloscopia tiene un
mayor rendimiento. La especificidad de la baciloscopia es buena, aunque
micobacterias no tuberculosas y nocardias pueden dar falsos positivos. El
bajo costo y la accesibilidad del examen hacen de la baciloscopia el estudio
fundamental, obligatorio e insustituible para el diagnóstico de esta enfermedad
(Gutierrez et al. 1998) (Figura 4).
figura 4. Baciloscopia de esputo positiva para bacilos ácido- alcohol resistentes (rojos)http://www.nationaljewish.org/faculty/iseman.html
2.9.3. CULTIVO
16
La sensibilidad del cultivo de esputo para el diagnóstico de la tuberculosis
respiratoria es superior al 80%, por lo cual permite captar un mayor número de
pacientes (Gutierrez et al. 1998). Tiene los inconvenientes de tener un
costo mayor, menor accesibilidad y especialmente, mayor tiempo requerido
para obtener el resultado. El cultivo toma en promedio entre 4 y 8 semanas
para ser informado (INS 2000).
2.9.4 OTROS ESTUDIOS DIAGNÓSTICOS.
La baja sensibilidad de la baciloscopia, el retardo del resultado del
cultivo y la necesidad de invasión para los estudios histopatológicos han
justificado la investigación de otros métodos diagnósticos en tuberculosis. Las
pruebas serológicas no diferencian infección de enfermedad y tienen
sensibilidad y especificidad variables en diferentes estudios por lo que no han
llegado a sustituir a los métodos tradicionales. En casos particulares pueden
orientar un diagnóstico. La detección de antígenos específicos mediante
anticuerpos monoclonales y sondas de DNA tiene buena sensibilidad y
especificidad para la identificación de micobacterias en cultivo y en muestras
de tejido, no obstante en otras muestras clínicas rutinarias no se ha confirmado
el mismo rendimiento (Gutierrez et al. 1998).
2.9.5. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
17
Ha demostrado excelente sensibilidad y especificidad, las cuales, no
obstante, no han sido fáciles de reproducir en condiciones de la práctica clínica
diaria. La estandarización cuidadosa de la técnica y la validación local son
necesarias antes de depositar toda la confianza en los resultados de la prueba.
Su uso rutinario y masivo aún no está justificado y no han sustituido a los
métodos tradicionales debido a la ausencia de controles internos para la
detección de inhibidores de la reacción, también las comparaciones inter.-
laboratorios son insatisfactorias, por lo cual se necesita mucho trabajo adicional
en investigación (Ieven y Goossens, 1997). Actualmente se han mejorado
muchos las técnicas de PCR y su sensibilidad y especificidad han aumentado
pero aún siguen siendo pruebas especializadas y costosas para ser aplicadas
como método diagnóstico en países en desarrollo.
2.9.6. ESTUDIOS PRELIMINARES PARA EL SERODIAGNÓSTICO DE LA
TUBERCULOSIS.
Se han probado muchos antígenos proteicos de M. tuberculosis para ser
usados ya sea en diagnóstico o en el diseño de nuevas vacunas que ofrezcan
una mayor protección contra la infección. Un antígeno importante es el
complejo 85, que comprende algunas de las proteínas mas frecuentemente
encontradas en las suspensiones de cultivos de M. tuberculosis. Las proteínas
de este complejo difieren en peso molecular entre 30 y 31 kDa y todas son
proteínas de unión a la fibronectina, aunque la relación de esta actividad con la
fisiología bacteriana no es muy clara. Las proteínas del complejo 85 son
18
altamente inmunogénicas en infecciones naturales y experimentales en
términos de tanto producción de anticuerpos como de activación de reacciones
mediadas por linfocitos T (Wiker y Harboe 1992). Otros antígenos identificados
como el de 10 kDa que tiene actividad efectora de linfocitos T reportada pero
su acción no difiere significativamente de la exhibida por el antígeno crudo de
la bacteria completa (Barnes et al. 1992). En el caso del antígeno de 38 kDa
se encontró una buena especificidad al reaccionar con sueros hiperinmunes
contra M. tuberculosis y M. bovis (Cadival, Chaparras y Hudssong 1987). Lo
que lo hace un buen candidato para el diseño de vacunas y la inmunización
contra TBC pero debido a su reacción cruzada con M. bovis no es un péptido
útil para diagnóstico serológico ya que la mayoría de la población ha sido
vacunada con BCG y por lo tanto pueden darse falsos positivos. Otros
antígenos como Dna K y las proteínas de choque térmico (65 kDa y 12 kDa)
son altamente conservadas entre distintos miembros del género e incluso
entre dominios por lo que su uso potencial para el diagnóstico es limitado.
(Thole, Janssen y Young, 1999) Recientemente los estudios se han enfocado
en antígenos de alto peso molecular como el de 88 kDa que ha demostrado ser
inmunodominante en la respuesta humoral durante infecciones de tuberculosis
pulmonar (Laal et al. 1997) y parece ser el candidato mas importante para el
diagnóstico de esta enfermedad en pacientes VIH positivos (Samanich et al.
2000). Dentro de los antígenos de menor peso molecular la proteína MPT64
de 24 kDa parece ser idónea para aumentar la especificidad de las pruebas
diagnósticas ya que se ha encontrado en el complejo M. tuberculosis pero no
en M. bovis BCG (Oettinger y Andersen. 1994).
19
Debido a las limitaciones de los péptidos analizados se estudian a veces
cocteles de diferentes péptidos sobre todo en pruebas cutáneas que puedan
reemplazar al PPD para un mejor diagnóstico (Konstanti et al.1998).
2.9.7. ANTIGÉNOS DE BAJO PESO MOLECULAR.
El uso de antígenos de bajo peso molecular para diseñar pruebas
diagnósticas presenta algunas ventajas, en especial en tuberculosis se requiere
de una proteína o fracción antígénica que sea capaz de diferenciar entre la
vacunación con BCG y la infección con alguna especie del complejo M.
tuberculosis; el caso del antígeno de 24 kDa es adecuado ya que está ausente
en las 4 cepas mas comúnmente usadas para fabricar la vacuna BCG. (Thole,
Janssen y Young, 1999).
Por otra parte, es importante disminuir la reactividad cruzada en especial
con otras micobacterias no tuberculosas, por ejemplo, las especies del
complejo Mycobacterium avium intracellulare (MAC o MAI) y se ha demostrado
que son las proteínas de menor peso molecular ( <15 kDa ) las que menor
reactividad cruzada exhiben en pruebas serológicas usando sueros policlonales
de conejo (Olsen, Reytan y Wiker, 2000).
Debido a esto se escogieron las fracciones correspondientes a 24 kDa y
a 10 kDa para determinar su reactividad con sueros de pacientes
diagnosticados con tuberculosis y clínicamente sanos.
20
2.10. EPIDEMIOLOGIA.
M. tuberculosis infecta a un tercio de la población mundial y en 1996
produjo mas de 6 millones de casos en todo el mundo, los factores esenciales
para su propagación son las condiciones de hacinamiento y la poca resistencia
natural a la infección.
Durante un tiempo se creyó que la enfermedad tendería a desaparecer
ya que sólo el 10% de las infecciones desarrolla enfermedad activa y de éstos
aproximadamente el 50% produce cavitaciones pulmonares, es decir, se tornan
contagiosos, así que cada caso debería infectar a cerca de 20 personas para
mantener las tasas. Sin embargo, las últimas décadas han demostrado lo
contrario y la tuberculosis ha reemergido con incidencias importantes en todo el
mundo en especial en Asia y África (Mendel, Bennett y Dolin, 2002). Se
estima que durante la decada de 1990 a 1999 cerca de 90 millones de nuevos
casos de tuberculosis ocurrieron en el mundo y de éstos alrededor de dos
tercios fueron en Asia. En los países en vías de desarrollo, la tuberculosis a
emergido como la enfermedad oportunista mas común asociada a la infección
por VIH (Raviglione, Zinder y Kochi , 1995).
La Figura 5 muestra la incidencia de tuberculosis alrededor del mundo
según un informe de la Organización Mundial de la Salud del 2002. En
América Latina, Colombia es uno de los países con menos incidencia, sin
21
embargo, es muy posible que las cifras sean mayores debido al sub-registro de
casos y la falta de búsqueda activa.
Figura 5. Incidencia de tuberculosis en el mundo según la Organización Mundialde la Salud. (OMS, 2002)
2.11. TUBERCULOSIS EN COLOMBIA
22
En Colombia se diagnostican anualmente un promedio de 10.000 nuevos
casos de tuberculosis, pero el número real puede ser mayor debido a que
existe disminución en la búsqueda de potenciales enfermos. Los casos de
tuberculosis en el país tienen predominio de la forma infecciosa de la
enfermedad, conocida como tuberculosis pulmonar y la proporción de casos en
los menores de 15 años es de un 7,2% del total. El gráfico 1 muestra el
registro de casos reportados en el país en los últimos años según la
Organización Mundial de la Salud (OMS, 2000).
0
1.000
2.000
3.000
4.000
5.000
6.000
7.000
8.000
9.000
1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999
Gráfico 1. Número de casos reportados en Colombia según un reporte de laOrganización Mundial de la Salud. OMS 2000
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL.
23
• Diseñar una técnica serológica rápida como ayuda en el diagnóstico
de la tuberculosis en Colombia.
3.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS.
• Obtener antígenos proteicos de bajo peso molecular de
Mycobacterium tuberculosis H37RV mediante la separación por
Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS- PAGE).
• Evaluar la reactividad de las fracciones antigénicas de 24 y 10 kDa
de Mycobacterium tuberculosis en sueros de pacientes sanos y
tuberculosos
• Evaluar la sensibilidad y especificidad de ELISA usando las
fracciones de 24 y 10 kDa frente a sueros previamente absorbidos
con lisados de Escherichia coli.
• Estandarizar la prueba de ELISA indirecta como serodiagnóstico de
la tuberculosis, usando como ligandos antígenos de bajo peso
molecular.
4. MATERIALES.
4.1. EQUIPOS.
24
§ Agitador mecánico Biodancer.
§ Agitador mecánico Indulab.
§ Autoclave.
§ Balanza digital OHAUS.
§ Baño serológico Memert.
§ Cámara de flujo laminar LABCONCO Purifier Class II Total Exhaust.
§ Centrífuga refigerada Eppendorf 580R.
§ Congelador –20 ºC Framec.
§ Dispensador volumen ajustable Nichryco.
§ Espectrofotómetro digital Spectronic II.
§ Incubadora 37ºC.
§ Lavador manual de placas SIGMA.
§ Lector de ELISA Labsystems Uniskan II.
§ Micropipetas ajustables Eppendorf.
§ Nevera Industrial Indifrial.
§ Potenciometro digital Orion.
§ Pipeta multicanal Labsystems.
§ Revco ScienTemp.
§ Sonicador Sonics Vibracell.
§ Sistema de electroforesis vertical Penguin water coged –gel.
§ Vortex Fisher Scientific.
4.2. MATERIAL BIOLÓGICO.
§ Cepa de Escherichia coli ATCC.
25
§ Cepa de Mycobacterium tuberculosis H37Rv.
§ Sueros TBC negativos.
§ Sueros TBC positivos.
4.3. MATERIAL DE LABORATORIO.
§ Criotubos.
§ Espátulas de madera estériles.
§ Frascos de vidrio con tapón de caucho.
§ Perlas de vidrio.
§ Pipetas de vidrio 1. 5 y 10 ml.
§ Placas de ELISA Dynatech.
§ Puntas para micropipeta (volumen según requerimientos).
§ Tubos para centrífuga FALCON de 15 mL.
§ Tubos de vidrio tapa rosca para cultivo microbiológico
§ Viales de 1.5 ml Eppendorf.
4.4. REACTIVOS.
§ B—mercaptoetanol SIGMA.
§ Ácido acético Merck.
§ Ácido etilen dinitrilo tetra acético (EDTA) Merck
§ Acrilamida SIGMA.
§ Azul brillante de Coomasie R 250 Merck
§ Azul de bromofenol SIGMA.
§ Carbonato ácido de sodio Merck.
26
§ Carbonato de sodio Merck.
§ Cloruro de magnesio Merck.
§ Cloruro de sodio Merck.
§ Conjugado anti-IgG humana ligado a peroxidasa (Fc Specific) SIGMA.
§ Fosfato dibásico de sodio Merck.
§ Fosfato monobásico de sodio Merck.
§ Glicerol.
§ Glicina SIGMA.
§ Huevos.
§ L-Asparagina Merck.
§ Lauril sulfato de sodio SDS SIGMA.
§ Marcadores de peso molecular Bench Mark.
§ Metanol.
§ N.N Metilen bisacrilamida SIGMA.
§ Peroxido de hidrógeno Merk.
§ Persulfato de amonio SIGMA.
§ Sulfato de magnesio.
§ TEMED( N,N,N´,N´;-tetrametilen-etilendiamida) SIGMA.
§ Tris –HCL SIGMA.
§ Trizma base SIGMA.
§ Tween 20 SIGMA.
§ Verde de Malaquita MercK
5. METODOS.
27
5.1. MANTENIMIENTO DE LA CEPA Y OBTENCIÓN DEL ANTIGENO
CRUDO DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS CEPA H37RV.
La cepa pura se sembró en medio sólido Ogawa Kudoh (OK) (Anexo 1)
y se incubó a 37ºC durante aproximadamente 4 semanas al cabo de las cuales
se cosechó el antígeno de la siguiente manera: a los tubos crecidos se les
adicionaron aproximadamente 2 ml de solución salina estéril 0.85% y se hizo
un raspado superficial para desprender las colonias. Esta suspensión se llevó
a agitación en Vórtex por 2 ó 3 minutos y posteriormente se centrifugó a 8000
r.p.m. a 4ºC durante 30 minutos. Se descartó el sobrenadante y se agregó de
nuevo solución salina estéril 0.85% (4 a 5 ml). El anterior procedimiento se
repitió 5 veces para eliminar los restos de medio que puedan haber quedado en
la suspensión. Por último, se resuspendió el precipitado en aproximadamente
3 ml de solución salina estéril.
La suspensión de bacterias se llevó posteriormente a choque térmico y
sonicación. Para el choque térmico alícuotas de aproximadamente 1.5 ml se
calentaron hasta 70ºC en baño serológico durante 90 segundos y se
sumergieron en nitrógeno líquido por un minuto y medio o en congelador a
-60ºC durante 6 minutos. Esto se repitió 6 veces. Para la sonicación, el
volumen total de la suspensión celular se sometió a nueve ciclos de sonicación
de 1 minuto aproximadamente con descanso en baño de hielo de un minuto
usándose de 60Hz en cada ciclo.
28
El porcentaje de ruptura celular se evaluó mediante coloración de Ziehl
Neelsen, una ruptura aproximada al 70% fue suficiente para continuar con la
obtención del antígeno crudo; para esto, se centrifugó durante media hora a
13.000 r.p.m a 4 ºC y se tomó el sobrenadante, al cual se le determinó la
concentración de proteínas mediante el método de Bradford. (Anexo 2).
5.2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS Y OBTENCIÓN DE LAS
FRACCIONES ANTIGÉNICAS DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
H37RV
El procedimiento ha sido descrito previamente (Cangrejo 2000), de
manera general, se usaron tres tipos de soluciones de poliacrilamida,
inicialmente se sirvió 1 ml de del de sellamiento (solución de poliacrilamida
10% y 5 �l de TEMED) que se solidifica rápidamente. Posteriormente se
agregaron 4,5 ml de gel separador (solución acrilamida 13%) que se dejaron
polimerizar por al menos 20 minutos y por último se agregaron 2,5 ml de gel
concentrador (5% poliacrilamida) (Anexo 3). Se usó un peine de 10 pozos para
la mayoría de las electroforesis y uno con un dos pozos uno pequeño y otro
grande para la electroforesis preparativa.
El gel se coloreó con solución colorante (Anexo 3) durante 2-3 horas y
se decoloró (Anexo 3) hasta que se observaron las bandas, para la
electroforesis preparativa, el gel no se coloreó y se cortaron con bisturí
fracciones de 1 a 1,5 mm en frente del marcador de peso molecular deseado
29
(Anexo 4), estas fracciones se alicuotaron con 300 �l de buffer de elusión o
PBS pH 7.4, se maceraron con tubo de vidrio o pistilos y se llevaron a agitación
fuerte en Vórtex por 5 minutos. Posteriormente se centrifugaron a 13000 r.p.m
durante 10 minutos y luego se les determinó la concentración proteica por el
método de Bradford. Se almacenaron a 4 ºC para ser usados en las pruebas
serológicas.
5.3. RECOLECCION DE SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y
SANOS.
Los sueros de pacientes diagnosticados con Tuberculosis, proceden de
diferentes centros de atención médica y pertenecen al banco de sueros del
Laboratorio de Investigación en Micobacterias de la Universidad Nacional de
Colombia. Los sueros negativos para Tuberculosis pertenecen a estudiantes de
la Universidad Nacional de Colombia, clínicamente sanos que aceptaron
voluntariamente participar en los estudios del laboratorio.
No se usó un patrón de oro específico para el estudio ya que los sueros
de la seroteca tenían diferentes tipos de diagnóstico. Por eso se consideró el
patrón de oro como un constructo diagnóstico que incluía el criterio clínico
epidemiológico, la baciloscopia, el cultivo y los hallazgos radiológicos. Se
incluyeron en el estudio aquellos pacientes negativos o positivos para al menos
dos de los cuatro criterios.
30
La población de sueros en la seroteca consistía de 71 sueros negativos
y 25 positivos para TBC diagnosticados por alguno de las técnicas
tradicionales.
Se conocían algunos antecedentes de los pacientes tanto positivos
como negativos (Anexo 5).
5.4. PREABSORCIÓN DE LOS SUEROS CON LISADOS DE Escherichia
Coli.
Se usó el método descrito previamente (Samanich et al. 1997) de
manera general se cubrieron placas de ELISA con 200 µl de lisado celular de
E-coli en una concentración de aproximadamente 180 µg por mL que se
incubaron durante la noche en solución de cobertura a 4ºC. Posteriormente se
lavaron 3 veces con una solución de buffer salino fosfato –Tween 20 PBS-T20
y se secaron muy bien. Luego se incubaron con una solución bloqueadora de
leche descremada en PBS-T20 durante 30 minutos a 37ºC. posteriormente se
lavo la placa muy bien. Un volumen de 150 �L de los sueros diluidos 1:10 en
PBS-T20 se sometieron a 8 ciclos de absorción frente a estos lisados celulares.
5.5. ENSAYO INMUNOENZIMATICO ELISA.
31
Mediante titulaciones en bloque se determinaron las diluciones de
trabajo y los tiempos de incubación.
Las placas se sensibilizaron con 100 �L por pozo de antígeno diluido en
buffer carbonato de cobertura durante toda la noche en cámara húmeda a 4ºC.
Posteriormente se hicieron 3 lavados con PBS-T20 y se dejaron secar. se
bloqueo con una solución de leche descremada al 5% en PBS-T20 durante 45
minutos a 37ºC, se hicieron tres lavados con PBS-T20 y se dejó secar. Los
sueros se diluyeron en PBS-T20 a la dilución establecida y se incubaron
durante 30 minutos en cámara húmeda a 37ºC, nuevamente se hicieron 5
lavados y se secó la placa totalmente. Se adicionaron 100 �l por pozo de
conjugado diluido en PBS-T20 y se incubó a 37ºC en cámara húmeda durante
30 minutos y se repitió el procedimiento de lavado. Se agregaron 100 �l de
sustrato por pozo, se dejó reaccionar y por último se detuvo la reacción con 50
�l solución frenadora (2M ácido sulfúrico). Para determinar el titulo de
anticuerpos se leyó la absorbancia en un lector de ELISA a 450 nm. (Anexo 6).
5.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO.
32
El punto de corte se determinó por medio del método del análisis
discriminante (Gerardino y Martínez, 1996 ) y los valores de rendimiento
operativo para cada prueba se obtuvieron por medio del análisis de tabla
tetracórica ( Ardila, Sánchez y Echeverri, 2001) (Anexo 7).
6. RESULTADOS
6.1. OBTENCIÓN DEL ANTÍGENO CRUDO DE Mycobacterium tuberculosis
H37Rv Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTE SDS-PAGE.
33
El método de obtención de antígeno crudo fue adecuado, observándose un
buen bandeo durante la electroforesis (Figura 6), además la concentración
proteica del extracto determinada por el método de Bradford fue superior a 3
mg/mL, ideal para la realización de una electroforesis preparativa. Se
observaron alrededor de 40 bandas en el gel , lo cual coincide con lo reportado
previamente (Millership y Want, 1992). Se escogieron dos fracciones que
correspondían al peso molecular de interés, para esto se usaron marcadores
de peso molecular (Benchmark) y se determinó el peso molecular aproximado
de las bandas interpolando su tasa de migración (RF) en una regresión semi
logarítmica del peso molecular de los marcadores en función de su RF. El
Gráfico 2 muestra esta regresión y el Anexo 4 muestra detalles de los
marcadores de peso molecular.
Figura 6. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 13%. Carril 1. Marcadores de pesomolecular. Carriles 2 y 3. Antígeno crudo de M. tuberculosis puro y dilución 1:2 .Carriles
4 y 5. como en 1 pero dilución 1:5 y 1:10. En rojo las fracciones seleccionadas paraestudio.
Gráfico 2. Regresión semi logarítmica de los Marcadores de Peso
Molecular en función de su tasa de migración RF.
24kDa
10kDa
241147996957
43
29
23
19
kDa1 2 3 4 5
34
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
RF
Lo
g 1
0 P
M
Ecuación: Y= 2.286 –1.26X
RF fracción 24 kDa : 0.716 àà Y= 1.3838 àà 24.19 kDa
RF Fracción <10 kDa: 0.9811 àà Y= 1.049 àà 11.1 kDa
6.2. TITULACIONES EN BLOQUE.
Se probaron diferentes concentraciones de suero, antígeno y conjugado y
se determinó la mejor combinación siendo ésta en la cual había mayor
alejamiento entre las absorbancias de los sueros positivos y negativos. La
Tabla 2 muestra las distintas condiciones de trabajo estandarizadas para cada
caso.
Tabla 2. Condiciones de trabajo para ELISA estandarizadas mediantetitulaciones en bloque.
Concentración Dilución Dilución TiempoPrueba Antígeno Suero Conjugado Revelado
35
ELISA antígeno24 kDa ( suerossin absorber) 1 �g / ml 1:5 1:40.000 8 minutos
** 3�g/ ml **1:80 **1:40.000 **12 minutosELISA antígeno24 kDa ( suerosabsorbidos conE.coli) 1 �g / ml 1:5 1:40.000 8 minutosELISA antígeno10 kDa ( suerossin absorber) 1�g/ ml 1:40 1:40.000 8 minutos.
**3�g/ ml **1:80 **1:40.000 **10 minutos.ELISAantígeno10 kDa( suerosabsorbidos conE.coli) 1�g/ml 1:40 1:40.000 8 minutosELISA Mezcla deantígenos 10 y24 kDa ( suerossin absorber) 0.5 �g/ ml c/u 1:80 1:40.000 10 minutos
**1.5 �g/ ml c/u **1:80 **1:40.000 **10 minutosELISA Mezcla deantígenos 10 y24 kDa ( suerosabsorbidos conE.coli). 0.5 �g/ml c/u 1:80 1:40.000 10 minutos
** Según titulación realizadas ignorando los resultados para los sueros sin absorber
6.3. REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 24 kDa CON LOS
SUEROS DE LOS PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS.
La prueba detectó el 62.5% (15) de los pacientes diagnosticados como
positivos para tuberculosis con el patrón de oro y el 62.9%(39) de los pacientes
clínicamente sanos. Se determinó un punto de corte de 0.109 y se obtuvo una
tasa de falsos negativos de 37.5% (9) y una tasa de falsos positivos de 37.1%
(23). El gráfico 3 muestra la distribución de los valores de absorbancia para
cada suero.
Gráfico 3. Reactividad de la fracción antigénica de 24 kDa con lossueros de los pacientes tuberculosos y sanos.
36
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
No. muestra
Abs
rorb
anci
a
TBC (-) TBC(+) PC
6.4. REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 10 kDa CON LOS
SUEROS DE LOS PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS.
El ensayo inmuno enzimático detecto solo el 50% (11) de los verdaderos
positivos y el 71.42 % (50) de los sueros negativos. Es decir que su tasa de
falsos positivos fue 50 % (11) y la de falsos negativos fue tan solo 28.5% (20).
El gráfico 4 muestra la distribución de los sueros estudiados con respecto al
punto de corte determinado por el análisis discriminante (0.204).
Gráfico 4. Reactividad de la fracción antigénica de 10 kDa con lossueros de los pacientes tuberculosos y sanos.
37
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
No. muestra
Abs
orba
ncia
TBC (-) TBC(+) PC
6.5. REACTIVIDAD DE LA MEZCLA DE ANTÍGENOS DE 24 kDa Y 10 kDa
CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS.
El antígeno mostró reactividad suficiente para un diagnóstico positivo solo
en el 36.8% (7) de los pacientes tuberculosos, el resto de pacientes
correspondientes al 63.2% (12) fueron catalogados como falsos negativos. Por
otra parte la prueba inmuno enzimática detectó el 67% (46) de los pacientes
clínicamente sanos, se presentó una tasa de falsos positivos del 33% (23). La
gráfica 5 muestra la distribución de las absorbancias de los diferentes sueros
con respecto al valor de punto de corte (0.176).
38
Gráfico 5. Reactividad de la mezcla de fracciones antigénicas de 24kDa y 10 kDa con los sueros de los pacientes tuberculosos y sanos.
-0,2
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
No. Muestra
Abs
orba
ncia
TBC (-) TBC (+) PC
6.6. REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 10 kDa CON LOS
SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS ABSORBIDOS CON
LISADOS DE Escherichia coli.
6.6.1. Condiciones estandarizadas para los sueros sin absorber.
De 90 sueros estudiados, el 70% (14) de los catalogados como
positivos por el patrón de oro reaccionaron con el antígeno y se detectaron
como verdaderos positivos mediante la prueba de ELISA; por otra parte, el
66.7% (66) de los sueros pertenecientes a los pacientes clínicamente sanos
fue catalogado adecuadamente como verdaderos negativos para esta prueba.
39
Usándose como punto de corte 0.28 se presentó una tasa de falsos positivos
y una de falsos negativos de 34.3% y 30% respectivamente. El grafico 6
muestra la distribución de los sueros con respecto al punto de corte
determinado por análisis discriminante.
Grafico 6. Reactividad de la fracción antigénica de 10 kDa con los suerosde pacientes tuberculosos y sanos absorbidos con lisados de
Escherichia coli.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
No. Muestra
Abs
orba
ncia
TBC (-) TBC (+) PC
6.6.2. Condiciones estandarizadas independiente de lo encontrado
para los sueros sin absorber.
Al usar las condiciones estandarizadas independientemente no se
encontró mucha diferencia entre los resultados obtenidos con respecto a lo
observado para la prueba realizada bajo las condiciones estandarizadas para
los sueros sin absorber; excepto porque aumentó el porcentaje de falsos
negativos al 35% (7) y la consecuente disminución de la sensibilidad. Para los
40
sueros de pacientes clínicamente sanos los resultados fueron iguales,
detectándose el 65.7% (46). El gráfico 7 muestra la distribución de los sueros
estudiados con respecto a un punto de corte de 0.18.
Gráfico 7. Reactividad de la fracción antigénica de 10 kDa con los suerosde pacientes tuberculosos y sanos absorbidos con lisados de
Escherichia coli.
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
No. muestra
Abs
orba
ncia
TBC (-) TBC (+) PC
6.7. REACTIVIDAD DEL ANTIGENO DE 24 kDa CON LOS SUEROS DE
PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS ABSORBIDOS CON LISADOS DE
Escherichia coli.
6.7.1. Condiciones estandarizadas para los sueros sin absorber.
El antígeno detectó el 45% (9) y el 55% (33) de los sueros positivos y
negativos respectivamente. El gráfico 8 muestra el comportamiento de los
41
diferentes sueros con respecto al punto de corte 0.216 y se observa una tasa
de falsos positivos del 45% y una de falsos negativos del 55%.
Gráfico 8. Reactividad del antígeno de 24 kDa con los sueros depacientes tuberculosos y sanos absorbidos con lisados de Escherichia
coli.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 10 20 30 40 50 60 70 80
No. muestra
Abs
orba
ncia
TBC(-) TBC(+) PC
6.7.2. Condiciones estandarizadas independientemente por
titulaciones en bloque.
La prueba de ELISA indirecta determinó como positivos solo el 40% (10)
de los pacientes verdaderos positivos y el 76.8% (53) de los pacientes
verdaderamente negativos. En el gráfico 9 se observa la distribución de las
absorbancias de cada suero a 450 nm y su comportamiento con respecto al
punto de corte 0.186.
42
Grafico 9. Reactividad del antigeno de 24 kDa con los sueros de pacientestuberculosos y sanos absorbidos con lisados de Escherichia coli.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
No. muestra
abso
rban
cia
TBC (-) TBC(+) PC
6.8. REACTIVIDAD DE LA MEZCLA DE LOS ANTIGENOS DE 10 Y 24 kDa
CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS
ABSORBIDOS CON LISADOS DE Escherichia coli.
6.8.1 Condiciones estandarizadas para los sueros sin absorber.
De los sueros catalogados como verdaderos positivos por el patrón de
oro (clínica, baciloscopia, cultivo o Rayos x), el 65% (13) reaccionó con la
mezcla de antígenos y de los sueros verdaderos negativos lo hizo el 35.2%
(25). Usándose como punto de corte 0.1705 se obtuvo un tasa de falsos
43
negativos del 35%. En el gráfico 10 se observa el comportamiento de los
sueros analizados por ELISA.
Gráfico 10. Reactividad de la mezcla de los antigénos de 10 y 24 kDa conlos sueros de pacientes tuberculoos y sanos absorbidos con lisados de
Escherichia coli.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
No. muestra
Abs
orba
ncia
TBC (-) TBC (+) PC
6.8.2. Condiciones estandarizadas independientemente.
Se determinó un punto de corte de 0.255 el cual logró discriminar como
positivos al 65% (13) de los sueros pertenecientes a pacientes
tuberculosos y como negativos al 74.28% (52) de los sueros de pacientes
clínicamente sanos. El gráfico 11 muestra el comportamiento de los sueros
44
estudiados, se observa una tasa de falsos positivos del 25.7% y una de
falsos negativos del 35%.
Gráfico 11. Reactividad de la mezcla de los antigénos de 10 y 24 kDa conlos sueros de pacientes tuberculosos y sanos absorbidos con lisados de
Escherichia coli.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
TBC (-) TBC (+) PC
6.9. DETERMINACIÓN DE LOS VALORES DE RENDIMIENTO OPERATIVO
PARA CADA UNA DE LAS PRUEBAS.
Por medio del análisis de tablas tetracóricas (4x4) se determinaron los
valores de Sensibilidad, Especificidad, Valor Predictivo Positivo y Valor
Predictivo Negativo para cada una de las pruebas realizadas. La Tabla 3
muestra estos valores.
45
Tabla 3. Valores de los rendimientos operativos para las distintaspruebas
Sensibilidad Especificidad VPP VPN NFP NFN n24 kDa sueros sinabsorber 62,5 % 62.9% 81.3% 39.5% 23 9 8610 kDa sueros sinabsorber 50% 71.42% 33.3% 81.97% 20 11 92mezcla 24 y 10 kDasin absorber 36.8% 67% 23% 79.3% 23 12 88
**40% **76.8% **38.5% **77.9% **16 **15 **9424 kDa suerosAbsorbidos con E.coli 45% 55% 25% 75% 27 11 80
**65% **65.7% **31.1% **86.79% **24 **7 **9010 kDa suerosAbsorbidos con E.coli 70% 65.7% 36.8% 88.46% 24 6 90
**65% **74.28% **41.9% **88.1% **18 **7 90mezcla 24 y 10 kDaAbsorbidos con E.coli 65% 64.2% 34.2% 86.5% 25 7 90
** Según titulación realizadas ignorando los resultados para los sueros sin absorberVPP: valor predicitivo positivo, VPN: Valor predicitivo negativo, NFP: Número de falsospositivos, NFN: Número de falsos negativos. n: número total de muestras analizadas.
7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
46
7.1. REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 24 kDa CON
LOS SUEROS DE LOS PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS.
La prueba serológica con el antígeno de 24 kDa mostró sensibilidad y
especificidad de aproximadamente 62%, esto lo hace útil como herramienta
diagnóstica de la tuberculosis, su alto valor predictivo positivo (81.3%)
demuestra que esta fracción antigénica detecta exitosamente los pacientes
positivos lo cual es ventajoso para la confirmación de la enfermedad en casos
complicados donde los métodos tradicionales de diagnóstico (baciloscopia,
radiología) son inconcluyentes. Por otro lado, los valores de sensibilidad y
especificidad sin ser muy altos son aceptables para la aplicación de una prueba
de tamizaje en campo que permita determinar con cierta precisión la
prevalencia de la enfermedad en lugares donde no se hace búsqueda activa de
nuevos casos debido a la complicación que conlleva el diagnóstico tradicional.
No se encontró correlación entre la reacción a PPD y la falsa positividad de
algunos de los pacientes estudiados, es poco probable la presencia de
reactividad cruzada con anticuerpos producidos por inmunización con BCG,
debido a la alta especificidad de la fracción antigénica de 24 kDa (Oettinger y
Andersen, 1994), sin embargo, en un país como el nuestro donde la TBC es
endémica es altamente probable que muchos de los pacientes clínicamente
sanos hayan tenido una primoinfección que no generó enfermedad activa pero
que produjo algunos anticuerpos detectables por la prueba serológica.
Además, aunque la pureza de la fracción se comprobó mediante electroforesis
SDS –PAGE, está fracción puede contener otros péptidos que si pueden estar
47
involucrados en reacciones cruzadas con la vacunación o incluso con otras
infecciones bacterianas (ver discusión reactividad de la fracción antigénica de
24 kDa con los sueros absorbidos con E.coli). En el caso de los falsos
negativos se observa que aproximadamente el 50% de estos se encontraban
en tratamiento, aunque iniciándolo, es posible que el efecto de los
medicamentos antituberculosos haya disminuido notablemente la carga bacilar
y por ende la cantidad de antígenos micobacterianos en estos pacientes,
resultando en una baja producción de anticuerpos.
Estos resultados son prometedores, en especial porque contrario a lo
reportado previamente para antígenos de pesos moleculares similares (MPT64,
MPT70) (Colangeli et al. 1999) los cuales presentan poca o ninguna
reactividad con los sueros de pacientes TBC (+) / VIH (+), en nuestra prueba
esta fracción antigénica reaccionó con un buen número de pacientes positivos
con diagnóstico de VIH.
7.2. REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 10 kDa CON LOS
SUEROS DE LOS PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS.
Como era de esperarse los antígenos de menor peso molecular
evaluados con la fracción de 10 kDa son más específicos de la enfermedad
tuberculosa por M. tuberculosis y por lo tanto en la técnica serológica sólo se
presentó una tasa de falsos positivos de 28.5%, esta técnica altamente
específica, al igual que la ELISA indirecta con la fracción antigénica de 24 kDa
48
es útil para la confirmación de casos complicados con patrones de oro
inconcluyentes o para pacientes que no pueden ser diagnosticados por los
métodos tradicionales, por ejemplo, niños o pacientes con SIDA que no
esputan o son por naturaleza paucibacilares. Sin embargo, en este caso la
sensibilidad apenas alcanzó el 50% (11) de los casos positivos por lo cual no
es adecuada para usarse como una técnica de tamizaje en campo, para un
sondeo epidemiológico ya que en términos generales se estaría escapando el
50% de los casos positivos y se estimaría con un grado de error muy alto la
prevalencia de la enfermedad en el país.
7.3. REACTIVIDAD DE LA MEZCLA DE ANTÍGENOS DE 24 kDa Y 10 kDa
CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS.
Contrario a lo que se esperaría al usar mezclas de antígenos, la
sensibilidad de la prueba no mejoró con respecto a lo encontrado para las
fracciones individuales y en algunos casos pacientes con resultados positivos
para alguno de los dos antígenos resultaron negativos al analizarlos con la
mezcla, esto puede deberse a que la estructura espacial de los epítopes
cambia cuando éstos se encuentran en presencia de otros epítopes antigénicos
y de esta forma no se detectan una cantidad suficiente de anticuerpos, además
puede existir competencia ente los diversos epítopes por la carga inmunológica
del paciente resultando en bajos títulos de anticuerpos para las fracciones
analizadas. La especificidad se mantuvo y en la mayoría de los casos los
49
falsos positivos para alguna de las dos fracciones resultaron de nuevo positivos
para la mezcla de las fracciones.
Con base en estos resultados no parece útil usar la mezcla de estos dos
antígenos para confirmar o descartar casos de tuberculosis, ya que no
representa ninguna ventaja con relación a las pruebas individuales, de hecho
es posible que sea de mayor utilidad realizar las pruebas individuales de
manera simultanea con cada una de las fracciones para tener una mayor
probabilidad de obtener un diagnóstico adecuado.
Es posible que una mezcla de más fracciones antigénicas de diferentes
pesos moleculares, permita una prueba más sensible, sin embargo, es
importante usar antígenos altamente específicos, ya que se conoce la alta
reactividad cruzada con otras entidades bacterianas e incluso con infecciones
micobacterianas no tuberculosas (Grange. 1984).
7.4. REACTIVIDAD DE LA FRACCIÓN ANTIGENICA DE 10 kDa CON LOS
SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS ABSORBIDOS
CON LISADOS DE Escherichia coli.
No se encontró ningún aumento en la especificidad de la prueba al
absorber los sueros con lisados de E. coli previamente, esto indica que los
pacientes detectados como falsos positivos para esta fracción antigénica no
presentaban en general reactividad cruzada por infecciones bacterianas de otro
origen, esto no es sorprendente ya que los antígenos secretados de bajo peso
50
molecular (10 kDa ) son altamente específicos y es poco probable que sean
compartidos con tros organismos. El aumento de la sensibilidad puede ser
explicado por la ausencia de diferentes anticuerpos inespecíficos en los sueros
de pacientes positivos que son removidos durante el proceso de absorción, lo
cual se hace evidente en la disminución en el valor de sueros falsos negativos.
No se encontraron diferencias significativas entre los resultados
obtenidos mediante la técnica estandarizada independientemente y los
obtenidos según la estandarización para la fracción antigénica de 10 kDa,
siendo sus valores de rendimiento operativo : sensibilidad, especificidad y
valores predictivos muy similares para las dos pruebas.
7.5. REACTIVIDAD DEL ANTIGENO DE 24 kDa CON LOS SUEROS DE
PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS ABSORBIDOS CON
LISADOS DE Escherichia coli.
La especificidad de la prueba aumentó considerablemente al absorber
los sueros con lisados bacterianos, ya que se limitó la cantidad de anticuerpos
inespecíficos presentes en los sueros de muchos de los pacientes clínicamente
sanos, este aumento fue evidente solamente al realizar la prueba bajo las
condiciones estandarizadas independientemente ya que usando la mismas
condiciones descritas para los sueros sin absorber no se encontró ningún
cambio considerable en los valores de rendimiento operativo, con la salvedad
de los valores predictivos que son incomparables ya que la prevalencia
51
(Probabilidad pre- prueba) de la enfermedad en la población de estudio fue
diferente en los dos casos.
El hecho de que la especificidad aumente es una evidencia más para la
demostración de que uno de los principales problemas del diagnóstico
serológico de la tuberculosis es la reactividad cruzada con otras entidades
bacterianas o con otras micobacterias atípicas o pertenecientes al complejo M.
tuberculosis.
7.6. REACTIVIDAD DE LA MEZCLA DE LOS ANTIGÉNOS DE 10 Y 24
kDa CON LOS SUEROS DE PACIENTES TUBERCULOSOS Y SANOS
ABSORBIDOS CON LISADOS DE Escherichia coli.
Para la mezcla de las fracciones antigénicas de 24 y 10 kDa, la
absorción de los sueros resultó en una aumento de la sensibilidad y
especificidad considerables, tanto en el caso de las condiciones estandarizadas
independientemente como en el de las establecidas para los sueros sin
absorber, con valores de rendimiento operativo de alrededor de 60 –70%, el
uso de esta mezcla antigénica con los sueros absorbidos podría usarse como
herramienta diagnóstica útil para la confirmación de casos o para la
investigación epidemiológica.
52
7.7. EVALUACIÓN DE LA REACTIVIDAD DE LAS FRACCIONES
ANTIGENICAS DE 24 kDa Y 10 kDa DE Mycobacterium
tuberculosis
Las fracciones polipeptídicas de 24 kDa y 10 kDa resultaron ser buenos
antígenos y se constituyen en posibles candidatos para el diseño de pruebas
serológicas que permitan una ayuda en el diagnóstico adecuado de la
tuberculosis. Aunque la sensibilidad y especificidad de las pruebas fue
aceptable, aún falta perfeccionar el diseño para obtener una prueba diagnóstica
útil que sea usada ampliamente. Se comprobó que para algunos casos la
especificidad puede ser mejorada al absorber los sueros en estudio con lisados
de Escherichia coli , sin embargo, esto no es suficiente, ya que las fracciones
estudiadas, ( 24 y 10 kDa) son de por si altamente específicas, es probable
entonces, que los falsos positivos se deban a la detección de anticuerpos
circulantes producidos por la vacunación con BGC, o por contacto previo con
micobacterias ambientales, por lo que se recomienda probar los sueros en
estudio después de ser absorbidos con lisados de Mycobacterium bovis BCG.
Otra posible explicación para la presencia de falsos positivos es una aumento
en el nivel general de anticuerpos debido a una estimulación policlonal de
producción de anticuerpos ( Grange 1984). Además, es importante recalcar
que el principal criterio de inclusión en el grupo de pacientes sanos fue la
clínica pero que realmente no se realizó una prueba de oro para todos los
pacientes (enfermos y sanos) que nos informara con mayor precisión la
condición de los individuos participantes en el estudio. Asimismo, es claro que
53
en países en desarrollo como el nuestro, que son altamente tuberculínicos, la
probabilidad de tener una primo-infección sin desarrollar enfermedad es alta y
probablemente la prevalencia de infección sea muy alta, lo cual plantea un reto
para las técnicas serológicas ya que es importante que sean capaces de
distinguir entre infección y enfermedad de modo que el diagnóstico sea
realmente específico.
En el caso de los pacientes positivos para TBC por el patrón de oro
previamente realizado, que resultaron negativos para alguna o todas las
pruebas, al hacer el análisis individual, algunos sueros no reaccionaron con
ninguna de las fracciones mientras que algunos lo hicieron en todas las
pruebas y la mayoría sólo reaccionaron en algunas de las nueve pruebas
realizadas, esto demuestra la naturaleza individual (genética, ambiental) de la
respuesta inmune que cada persona monta frente a un agente infeccioso
específico.
Muchos sueros positivos resultaron negativos en todas las pruebas,
algunos tenían tratamiento lo que concuerda probablemente con el cambio en
el perfil inmunológico de la enfermedad a medida que el tratamiento avanza, es
notable además, el hecho de que los antígenos se hayan obtenido in vitro,
éstos no necesariamente se expresan o son importantes durante la infección in
vivo lo que explicaría la relativamente baja sensibilidad de todas las pruebas
realizadas. Asimismo, es posible que los pacientes TBC positivos que no
mostraron niveles de anticuerpos detectables por ELISA presentaran el
54
fenómeno de competencia antigénica debido a la vacunación con BGC o a una
infección tuberculosa previa que produjo otro tipo de anticuerpos contra
antígenos diferentes (Grange, 1984). En las pruebas realizadas se pudo
observar que algunos sueros positivos tenían un nivel de anticuerpos bajo de
modo que no alcanzaban a ser clasificados como verdaderos positivos, existen
varias posibles razones para este fenómeno: inmunosupresión, ya sea por
medicamentos o por condiciones como la infección por VIH, inhibición
especifica de los linfocitos, actividad degradativa muy eficiente de los
macrófagos, estimulo antigénico mínimo... etc (Grange, 1984).
La ELISA indirecta es una herramienta adecuada para la detección de
anticuerpos contra antígenos específicos de Mycobacterium tuberculosis ya
que los reactivos son relativamente económicos y estables por bastante tiempo
y no se requieren equipos muy complejos y la búsqueda de Inmunoglobulina G,
permite una cierta diferenciación entre las condiciones de infección y
enfermedad, sin embargo, sería útil probar los antígenos estudiados en
pruebas aún mas sencillas como el Dot-Blot o ELISA en papel, ya que las
condiciones de los países con mayor prevalencia de tuberculosis requieren la
estandarización de una técnica extremadamente simple y económica para la
ayuda diagnóstica de esta enfermedad.
Es claro que falta mucho para que la serología reemplace a los método
diagnósticos tradicionales y aún hay un gran camino por recorre antes de la
implemetación de ELISA u otra prueba serológica de rutina como ayuda
55
diagnóstica de la TBC, sin embargo, la sencillez y economía de estas pruebas,
sumado a la fácil obtención de las muestras las hacen una buena ayuda en
casos donde la bacteriología y la radiología son inaplicables o inconcluyentes.
56
8. CONCLUSIONES.
§ El método de obtención del antígeno crudo fue adecuado y permitió la
separación y recuperación de las fracciones antigénicas de 24 y < 10 kDa.
§ Las fracciones peptídicas de24 y 10 kDa son útiles en el diseño de pruebas
de ayuda en el diagnóstico serológico de la tuberculosis.
§ Los dos antígenos evaluados son en general altamente específicos y son
adecuados para pruebas diagnósticas que intenten confirmar casos, por
ejemplo pacientes VIH (+), TB extrapulmonar, pacientes paucibcilares y
niños menores de 6 años.
§ La sensibilidad en todas las pruebas fue aceptable pero no se recomiendan
estos antígenos para el uso de técnicas de tamizaje debido a la falta de
reactividad con muchos pacientes positivos.
§ El uso de un cóctel antigénico no mejoró los valores de rendimiento
operativo de las pruebas con relación a lo observado para los antígenos
individuales cuando se analizaron sueros sin absorber, la absorción con
E.coli aumentó considerablemente estos valores.
§ La absorción con lisados de Escherichia coli solo mejoró la especificidad en
el caso del antígeno de 24 kDa y muy ligeramente para la mezcla de los
antígenos, lo que implicaría otra causa diferente para explicar los falsos
positivos.
§ Los resultados obtenidos para este grupo de pacientes pueden ser
evaluados con técnicas mas sencillas como Dot-Blot, de modo que puedan
ser validados y usados ampliamente para la búsqueda activa de casos.
57
9. RECOMENDACIONES.
§ Si bien la SDS-PAGE es adecuada para la obtención de los antígenos
purificados, se recomienda buscar un método más eficiente para obtener
proteínas a gran escala sí se pretende que los métodos serológicos sean
usados ampliamente.
§ Se recomienda el uso de más antígenos para diseñar cocteles que detecten
mejor los pacientes positivos.
§ Se recomienda ensayar los sueros absorbidos con lisados de
Mycobacterium bovis BCG o incluso con lisados de M. avium complex para
descartar la reactividad cruzada con antígenos género –específicos.
§ Se recomienda evaluar pacientes sintomáticos respiratorios a quienes se
les haya descartado la enfermedad por baciloscopia o cultivo.
58
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63
ANEXO 1. MEDIO DE CULTIVO OGAGWA KUDOH (OK) PARA EL
MANTENIMIENTO DE Mycobacterium tuberculosis.
Solución de Sales.
Agua destilada 1000 mL
Fosfato monobásico anhidro. 2.0 g
Citrato de magnesio. 1.0 g
Glutamato de sodio. 5.0 g
Glicerol 40 mL
Citrato férrico (opcional) 5.0 g
§ pH final: 5.1
Adicionar las sales una a una en el orden descrito, ajustar el pH y esterilizar en
autoclave.
Homogenizado de huevos.
Usar huevos frescos. Lavarlos uno a uno con gasa, sumergirlos en alcohol al
70% por 15 minutos. Romper uno a uno los huevos observando la calidad de
la yema. Licuar a baja velocidad y filtrar en gasa estéril.
Verde de Malaquita
Pesar 2.0 g de verde de malaquita oxalato para microbiología, adicionar 100 ml
de agua destilada y autoclavar.
64
Preparación del medio.
Solución de sales. 500 ml
Homogenizado de huevos. 1000 ml
Verde de Malaquita 2% 20 ml
pH final. 6.4
§ No autoclavar.
65
ANEXO 2. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN PROTEÍCA
MEDIANTE EL MÉTODO DE BRADFORD (DYE BINDING).
Se basa en la desprotonización del colorante Azul de Coomasie G-250 en
presencia de proteínas cargadas.
Reactivo
Azul de Coomasie G-250 20 mg
Etanol absoluto. 10 ml
Acido ortofosfórico 85% 20 ml
Agua destilada. 200 ml
§ Filtrar dos veces para eliminar el colorante no disuelto.
Método.
Agregar 40 �l de muestra a 2.0 ml de reactivo. Esperar 10 minutos y leer
absorbancia a 595 nm. Interpolar en una curva realizada con patrones de
albúmina sérica bovina de concentración conocida.
66
Curva patrón 0 – 5 mg/ml
Concentraciónmg/ml
Absorbancia 595nm
0 0
1 0.377
2 1.007
3 1.063
4 1.172
5 1.432
Curva patrón 20 –100 �g/mL
67
Concentración�g/ml
Absorbancia 595nm
0 0
20 0.003
30 0.007
40 0.017
50 0.017
60 0.025
70 0.032
80 0.034
90 0.039
100 0.04
ANEXO 3. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS EN GEL DE
POLIACRILAMIDA
68
Preparación de un gel de PA al 13%
SELLAMIENTO SEPARADOR APILAMIENTO
Solución 30% Acrilamida,
8% Bisacrilamida.
527 �l 2.16 ml 335 �l
Solución Tris 1M pH 8.8 572 �l 1.3 ml ---
Solución Tris pH 6.8 --- --- 625 �l
Agua tridestilada deionizada 331 �l 1.44 ml 1.5 mL
Solución SDS 10 % 18 �l 50 �l 25 �l
Solución persulfato de
amonio
18 �l 50 �l 25 �l
TEMED 5 �l 3 �l 3 �l
Solución buffer de electroforesis.
Trizma base 1.5125 g
Glicina 7.2 g
SDS 0.5 g
Agua tridestilada desionizada Ajustar a 500 ml
Solución buffer de tratamiento de la muestra.
Solución Tris 1M pH 6.8 0.6 ml
Glicerol 50% 5.0 ml
Solución SDS 10 % 2.0 ml
�-mercapto-etanol 0.5 ml
Solución Azul de Bromofenol 1% 1.0 ml
Agua tridestilada desionizada 0.9 ml
§ Almacenar a 4 ºC protegido de la luz.
69
Solución colorante.
Azul de Coomasie R-250 0.25 g
Metanol 400 ml
Ácido acético 70 ml
Agua tridestilada desionizada Completar a 1 L
§ Almacenar protegido de la luz.
Solución decolorante.
Metanol 400 mL
Acido acético 70 mL
Agua tridestilada desionizada Completar a 1 L
ANEXO 4. MARCADORES DE PESO MOLECULAR
BenchMark prestained protein ladder.
70
Banda Peso molecular kDa
1 241
2 147
3 99
4 (Rosada) 69
5 57
6 43
7 29
8 23
9 18
70
ANEXO 5. RESUMEN DE LOS PACIENTES INCLUIDOS EN EL ESTUDIO
o TBC por GS. PPD BCG VIH Contacto Infección previa Origen Comentarios confirmado 1 (-) (-) NS ND (-) (-) UNAL 2 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 3 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 4 (-) (+) NS ND (-) (-) UNAL 5 (-) (-) NS ND (-) (-) UNAL 6 (-) (-) NS ND (-) (-) UNAL 7 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 8 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 9 (-) (-) NS ND (-) (-) UNAL 10 (-) 7mm (+) ND (-) (-) UNAL 11 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL Transfusión sanguínea12 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 13 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 14 (-) (-) (-) ND (-) (-) UNAL 15 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 16 (-) (-) NS ND (-) (-) UNAL 17 (-) 5-10mm (+) ND (-) (-) UNAL 18 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 19 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 20 (-) (-) (-) ND (-) (-) UNAL 21 (-) (-) NS ND (-) (-) UNAL 22 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL
23 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 24 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 25 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 26 (-) (-) (-) ND (-) (-) UNAL
71
27 (-) (-) (-) ND (+) (-) UNAL 28 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 29 (-) (-) NS ND (-) (-) UNAL 30 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 31 (-) ND NS ND (-) (-) UNAL 32 (-) (-) NS ND (-) (-) UNAL 33 (-) (-) NS ND (-) (-) UNAL 34 (-) <5mm (+) ND (-) (-) UNAL 35 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 36 (-) (+) (+) ND (-) (-) UNAL 37 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 38 (-) ND (+) ND (-) (-) UNAL 39 (-) ND NS ND (-) (-) UNAL 40 (-) ND (-) ND (-) (-) UNAL 41 (-) ND NS ND (-) (-) UNAL 42 (-) (-) (-) ND (-) (-) UNAL 43 (-) ND (-) ND (-) (-) UNAL 44 (-) ND (+) ND (-) (-) UNAL 45 (-) ND (+) ND (-) (+) UNAL Transfusión sanguínea46 (-) (-) (+) ND (+) (-) UNAL Transfusión sanguínea47 (-) (-) (+) ND (+) (-) UNAL 48 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 49 (-) ND (+) ND (-) (-) UNAL 50 (-) ND (+) ND (-) (-) UNAL 51 (-) ND (+) ND (-) (-) UNAL 52 (-) (+) NS ND (-) (-) UNAL 53 (-) (-) (+) ND (+) (-) UNAL 54 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 55 (-) 2mm (+) ND (+) (-) UNAL 56 (-) (-) (-) ND (-) (-) UNAL Transfusión sanguínea57 (-) (+) NS ND (+) (-) UNAL Transfusión sanguínea58 (-) (+) NS ND (-) (-) UNAL
72
59 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 60 (-) (-) NS ND (-) (-) UNAL 61 (-) (-) NS ND (-) (-) UNAL 62 (-) ND NS ND (-) (-) UNAL 63 (-) ND NS ND (-) (-) UNAL 64 (-) (+) NS ND (-) (-) UNAL 65 (-) ND (+) ND (-) (-) UNAL 66 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 67 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 68 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 69 (-) (-) (+) ND (-) (-) UNAL 70 (-) (-) (-) ND (-) (-) UNAL
0,01 (+) ND (-) (+) (-) ND H.S.B. TB pulmonar, varios tipos de tratamiento0,02 (+) (+) (+) (+) (+) ND H.S.B 2do día tratamiento0,03 (+) ND (+) (+) (-) ND H.S.B. TB pulmonar, 8 días de tratamiento0,04 (+) ND (-) (-) (-) ND H.S.B. TB pulmonar0,05 (+) ND (+) (+) (+) ND H.S.B. TB pulmonar sin tratamiento0,06 (+) ND (-) ND (-) ND C.C. Paciente embarazada 0,07 (+) ND NS ND (-) ND H.S.B. TB pulmonar sin tratamiento 0,08 (+) ND (+) (+) (-) ND H.S.B. TB pulmonar sin tratamiento 15+ (+) ND (+) ND (-) ND L.A.T.C
752 (-) ND ND (+) ND (-) C.C.LL.R. P. carinii , VIH hace 15 días
766 (+) ND ND (+) ND (-) C.C.LL.R. 774 (+) ND ND (+) ND (-) C.C.LL.R.
753 (+) ND ND (+) ND TBC pulmonar C.C.LL.R.
Histoplasmosis cutánea, neumonía porP. carinii, candidiosis oral. En tratamientoTBC
755 (+) ND ND ND ND (-) C.C.LL.R. 703 (+) ND ND (-) ND (-) C.C.LL.R.
81 (+) ND ND (+) ND TBC miliar H.S.B. Demencia por VIH, NeumoinfecciónMicosis conidial
73
90 (+) ND ND (+) ND TBC pulmonar H.S.B. E.D.A. crónica, candidiasis oral, Herpes,Hepatitis B, Gonorrea.
65+ (+) ND ND (+) ND TBC pulmonar y miliar H.S.B. Tratamiento previo inconcluso, Urocultivo(+) para TBC
0,78 (+) ND ND (+) ND TBC pulmonar y miliar H.S.B.Profilaxis pata TBC. Presencia deMicobacterias atípicas
0,18 (+) ND ND (+) ND (-) H.S.B. Lesión ocular, Hepatitis B hace 7 años1+ (+) ND ND (+) ND (-) H.S.B. Diarrea crónica.
272 (+) ND ND (+) ND (-) H.S.B. Diarrea crónica, Sarcoma de Kaposi.Pneumocitosis previa.
286 (+) ND ND (+) ND TBC pulmonar H.S.B. Pneumocitosis previa.295 (+) ND ND (+) ND (-) H.S.B.
TB por GS. Diagnóstico de tuberculosis por patrón de oro.PPD. Prueba de la tuberculina ( positiva > 10 mm de induración).BCG. Vacunación con el bacilo de Calmette-Guerin.VIH. Diagnóstico confirmado de infección con el virus de la inmunodeficiencia humana.UNAL. Universidad Nacional de Colombia. Sede Bogotá.H.S.B. Hospital Simón Bolívar. Bogotá.L.A.T.C. Liga anti tuberculosa colombiana.
C.C. Clínica Corpas. C.C.LL.R. Clínica Carlos Lleras Restrepo.
ND. No hay datos.NS. El paciente encuestado no sabe o no responde.
74
ANEXO 6. SOLUCIONES USADAS PARA LOS ENSAYOS
INMUNOENZIMATICOS (ELISA INDIRECTA)
Buffer salino-fosfato (PBS).
Fosfato dibásico de sodio (Na2HPO4) 16.7 g.
Fosfato monobásico de sodio (NaH2PO4) 5.7 g.
Cloruro de sodio (NaCl) 85 g.
Agua destilada 10 L
pH final 7.4
Buffer de cobertura.
Carbonato de sodio (Na2CO3) 4.24 g
Carbonato ácido de sodio (NaHCO3) 5.04 g.
Agua destilada 1 L
pH final 9.6
Buffer citrato-fosfato.
Fosfato dibásico de sodio (Na2HPO3) 5.25 g.
Ácido cítrico (C6H7O7.H2O) 17.9 g.
Agua destilada 1L
pH final 5
75
ANEXO 7. ANÁLISIS DE TABLAS TETRACORICAS (4 X 4) PARA LA
DETERMINACIÓN DE LOS VALORES DE RENDIMIENTO OPERATIVO DE
UNA PRUEBA DIAGNÓSTICA.
Patrón de oro POSITIVO NEGATIVO Prueba a POSITIVO a b a+bevaluar NEGATIVO c d c+d a+c b+d a+b+c+d
a. Número de pacientes con resultado positivo por la prueba en estudio
que son además positivos por el patrón de oro (Verdaderos positivos).
b. Número de falsos positivos.
c. Número de falsos negativos.
d. Número de pacientes con resultado negativo que son además
negativos por el patrón de oro ( Verdaderos negativos).
SENSIBILIDAD: a / a + c
ESPECIFICIDAD: d / b + d
VPP: a / a + b
VPN: d / c + d