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EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA DE LA PROPIEDAD BIOCIDA DEL ACEITE ESENCIAL DE Pelargonium graveolens L'Hér. APLICADO A SOPORTE DE PAPEL DE CARÁCTER PATRIMONIAL Y DE LAS POSIBLES ALTERACIONES DE LA CELULOSA
EN EL PROCESO.
DANIEL CAMILO RIPOLL ARISTIZABAL
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACION
LICENCIATURA EN QUIMICA MINISTERIO DE CULTURA - BIBLIOTECA NACIONAL DE COLOMBIA
BOGOTA 2019
EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA DE LA PROPIEDAD BIOCIDA DEL ACEITE ESENCIAL DE Pelargonium graveolens L'Hér. APLICADO A SOPORTE DE PAPEL DE CARÁCTER PATRIMONIAL Y DE LAS POSIBLES ALTERACIONES DE LA CELULOSA
EN EL PROCESO.
DANIEL CAMILO RIPOLL ARISTIZABAL
TRABAJO DE GRADO PRESENTADO COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL TITULO DE: Licenciado en Química
Directora: Beatriz Ofelia Devia, Química, Ph. D. Codirectora: Luz Stella Villalba, Microbióloga, MSc.
Asesor: Darío Rodríguez, Químico, Esp.
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACION
LICENCIATURA EN QUIMICA MINISTERIO DE CULTURA - BIBLIOTECA NACIONAL DE COLOMBIA
BOGOTA 2019
Nota De Aceptación
Director (a)
Beatriz Ofelia Devia Castillo
Firma Jurado
Josué Anselmo García Ortiz
AGRADECIMIENTOS
Reflexionando en torno a lo que significa culminar esta etapa académica; hoy, después de
múltiples aprendizajes no me queda más que decir que estoy sumamente agradecido por la
oportunidad que me ha brindado la vida de formarme no solo profesionalmente, sino también
como persona en uno de los espacios que personalmente considero más que
enriquecedores para consolidar las bases que me acercan al escenario de vida que anhelo.
Con espíritu de eterno agradecimiento, he de seguir mi camino con el objetivo de retribuirle al
mundo de la mejor manera, no sin antes reconocer que todo esto es posible gracias a Dios y
a las personas que me han acompañado en este Camino.
Y es que en efecto, los frutos de este trabajo hoy son visibles, sin embargo le debo todo esto
a el apoyo incondicional de mi familia que me incentivo a continuar aún en las etapas más
difíciles; las enseñanzas de mi directora de grado Beatriz Ofelia Devia Castillo quién me dejo
importantes lecciones de vida sobre la rigurosidad y responsabilidad con la que se debe
asumir una tarea; los consejos y la oportunidad brindada por Luz Stella Villalba, Darío
Rodríguez y Liliana Mejia al permitirme trabajar de manera articulada con la Biblioteca
Nacional de Colombia y el Archivo de Bogotá en este proyecto; el apoyo brindado por Javier
Matulevich y Diego Silva en el análisis instrumental; a todos los docentes que aportaron en el
proceso que implico mi formación; la colaboración de mis compañeros de las líneas de
investigación de colorantes naturales y productos naturales vegetales como Nasly Quintero y
Estefanía Rodriguez; y en especial a mi querida Universidad Distrital Francisco José de
Caldas que me acogió y permitió adentrarme en este mundo de conocimiento.
TABLA DE CONTENIDO
RESUMEN ................................................................................................................................ 1
INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 2
1. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA ........................................................................................ 3
2. ANTECEDENTES ............................................................................................................. 3
3. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 5
3.1 OBJETIVO GENERAL ............................................................................................... 5
3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS ...................................................................................... 5
4. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................... 5
5. MARCO REFERENCIAL .................................................................................................. 6
5.1 PATRIMONIO DOCUMENTAL .................................................................................. 6
5.1.1 Definición & Marco Legal Colombiano ...................................................................... 6
5.1.2 Biblioteca Nacional de Colombia (BNC) ................................................................... 7
5.2 GENERALIDADES DEL PAPEL ..................................................................................... 7
5.2.1 Historia ..................................................................................................................... 7
5.2.2 Características, Propiedades y Tipos ....................................................................... 8
5.2.2.1 Características generales .................................................................................. 8
5.2.2.2 Algunas Propiedades físicas .............................................................................. 8
5.2.3 Composición química ................................................................................................. 15
5.2.3.1 Celulosa .............................................................................................................. 15
5.2.3.2 Hemicelulosa ....................................................................................................... 16
5.3 DETERIORO EN SOPORTES DE PAPEL ................................................................... 16
5.3.1 Generalidades ........................................................................................................ 16
5.3.1.1 Factores intrínsecos. ........................................................................................ 17
5.3.1.2 Factores extrínsecos. ....................................................................................... 17
5.3.2 Biodeterioro ............................................................................................................ 18
5.3.2.1 Clasificación de principales microorganismos que causan el biodeterioro ...... 18
5.3.2.2 El mecanismo de afección de los microorganismos ........................................ 19
5.3.3 Evaluación química del deterioro de la celulosa ..................................................... 22
5.3.4 La preservación y conservación del material bibliográfico ...................................... 22
5.4 ACEITES ESENCIALES (AE) ....................................................................................... 23
5.4.1 Generalidades ........................................................................................................ 23
5.4.2 Actividades biológicas de los AE y su papel como agentes microbicidas .............. 23
5.4.3 Terpenos ................................................................................................................ 24
5.5 TAXONOMIA VEGETAL Y CARACTERISTICAS DE LA ESPECIE ............................. 25
5.5.1 Familia Geraniaceae .............................................................................................. 25
5.5.2 Genero Pelargonium .............................................................................................. 25
5.5.3 Especie Pelargonium graveolens L'Hér (Geraniaceae) .......................................... 26
5.5.3.1 Características morfológicas ............................................................................ 26
5.5.3.2 Distribución geográfica .................................................................................... 27
5.5.3.3 Caracterización del AE de P. graveolens ......................................................... 27
6. METODOLOGÍA ............................................................................................................. 29
6.1 CARACTERIZACIÓN FISICA Y QUÍMICA DEL AE DE P. graveolens ......................... 29
6.1.1 Recolección del material vegetal ............................................................................ 29
6.1.2 Preparación del material ......................................................................................... 29
6.1.3 Extracción de los AE(s) .......................................................................................... 29
6.1.4 Caracterización química por CG-EM ...................................................................... 31
6.2 EVALUACIÓN DE LAS POSIBLES ALTERACIONES FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LA
CELULOSA POR TRATAMIENTOS CON EL AE de P. graveolens. .................................. 32
6.2.1 Identificación de la muestra de papel empleada .................................................... 32
6.2.1.2 Preparación de muestras .................................................................................... 32
6.2.2 Determinación de pH .............................................................................................. 32
6.2.3 Cuantificación de azúcares reductores ................................................................... 32
6.2.3.1 Selección del método para la cuantificación de azúcares ................................ 32
6.2.3.2 Determinación de azúcares reductores ........................................................... 33
6.2.4 Evaluación de la tonalidad ...................................................................................... 33
6.3 EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA BIOCIDA DEL AE SOBRE EL PAPEL ................ 34
6.3.1 Cultivo de microrganismos y preparación del consorcio ......................................... 34
6.3.2 Preparación de muestras de papel ......................................................................... 34
6.3.3 Inoculación de la muestra de papel ........................................................................ 34
6.3.4 Preparación de la solución del AE .......................................................................... 34
6.3.5 Tratamiento de las muestras de papel con la solución del AE ............................... 35
6.3.6 Evaluación de la acción microbicida. ...................................................................... 35
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ........................................................ 36
7.1 CARACTERIZACIÓN FISICA Y QUÍMICA DEL AE DE P. graveolens ......................... 36
7.1.1 Recolección del material vegetal ............................................................................ 36
7.1.2 Determinación del % de humedad de la muestra de P. graveolens ....................... 36
7.1.3 Extracción del AE de P. graveolens: Caracterización fisica ................................... 36
7.1.4 Caracterización química por CG-EM ...................................................................... 37
7.2 EVALUACIÓN DE LAS POSIBLES ALTERACIONES FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LA
CELULOSA POR TRATAMIENTOS CON EL AE ............................................................... 40
7.2.1. Caracterización general del soporte de papel ...................................................... 40
7.2.2 Evaluación del nivel de pH .................................................................................... 41
7.2.3. Cuantificación de azúcares reductores ................................................................. 41
7.2.3.1 Selección del método para la cuantificación de azúcares ................................ 42
7.2.3.2 Determinación de azúcares reductores .......................................................... 43
7.2.4 Evaluación colorimétrica (Tonalidad en coordenadas CIEL*a*b*) .......................... 45
7.3 EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA BIOCIDA DEL AE SOBRE EL PAPEL ................ 50
8. CONCLUSIONES ........................................................................................................... 57
9. RECOMENDACIONES ................................................................................................... 57
10. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................. 58
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 01. Características de los sistemas de color para la determinación de la tonalidad en
una muestra. ........................................................................................................................... 14
Tabla 02. Características generales de microorganismos encontrados generalmente en
acervos documentales. ........................................................................................................... 21
Tabla 03. Algunas ubicaciones de los aceites esenciales en las plantas. .............................. 23
Tabla 04. Clasificación de algunos terpenos en AE según el número de asociaciones de
moléculas de isopreno ............................................................................................................ 24
Tabla 05. Comparativo de componentes de P. graveolens de diferente procedencia. .......... 28
Tabla 06. Rampas de temperatura del cromatógrafo ............................................................. 31
Tabla 07. Concentración final de la dilución directa del patrón de azúcar. ............................ 33
Tabla 08. Extracciones de P. graveolens ............................................................................... 37
Tabla 09. Constantes físicas del aceite esencial P. graveolens ............................................. 37
Tabla 10. Compuestos identificados en el aceite esencial P. graveolens. ............................. 38
Tabla 11. Abundancia y clasificación de compuestos mayoritarios del AE de P. graveolens 38
Tabla 12. Descripción de la muestra de papel estudiada ....................................................... 40
Tabla 13. Resultados medición del pH del grupo de papel patrimonial con respectivos
tratamientos. ........................................................................................................................... 41
Tabla 14. Cuantificación de azúcares reductores en muestra de referencia .......................... 44
Tabla 15. Cuantificación de azúcares reductores en muestra impregnada con AE ............... 44
Tabla 16. Cuantificación de azúcares reductores en muestra sometida a envejecimiento
acelerado ................................................................................................................................ 45
Tabla 17. Cuantificación de azúcares reductores en muestra impregnada con el AE y con
envejecimiento ........................................................................................................................ 45
Tabla 18. Concentración de azúcares reductores en muestras de papel .............................. 45
Tabla 19. Resultados colorimétricos del papel en los sistemas CIE L*a*b* en muestra control
y muestra envejecida .............................................................................................................. 46
Tabla 20. Variación de tonalidad de color ΔE en las muestras ............................................. 46
Tabla 21. Resultados colorimétricos del papel en los sistemas CIE L*C*h* & x, y & z ......... 46
Tabla 22. Acción microbiológica del AE de P. graveolens mediante técnica de siembra en
superficie ................................................................................................................................ 51
Tabla 23. Acción microbiológica del AE de P. graveolens mediante técnica de 25 puntos de
inoculación. ............................................................................................................................. 52
Tabla 24. Promedio sobre los 25 puntos de siembra y porcentajes de inhibición y recuperación
de los microrganismos. ........................................................................................................... 52
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 01. A: Mecanismo general de las reacciones de oxidación. B: Proceso de formación de
grupo carbonilo a partir de un hidroperóxido. ......................................................................... 12
Figura 02. Composición y estructuración de la celulosa. ....................................................... 16
Figura 03. Principales tipos de deterioro en acervos documentales. ..................................... 17
Figura 04. A: Estructura del peptidoglicano. B: Comparación de las envolturas celulares
bacterianas ............................................................................................................................. 19
Figura 05. Hidrolisis enzimática de fibras vegetales (celulosa). ............................................. 20
Figura 06. Especie Pelargonium graveolens L'Hér (Geraniaceae). ....................................... 26
Figura 07. Distribución geográfica del Pelargonium graveolens L’Hér ex Aiton..................... 27
Figura 08. Metodología experimental de trabajo .................................................................... 30
Figura 09. Zona de cultivo del material vegetal adquirido ...................................................... 36
Figura 10. Cromatograma del AE de P. graveolens en las condiciones de estudio. .............. 39
Figura 11. Libro en proceso de restauración de la BNC ........................................................ 40
Figura 12. Barrido espectrofotométrico de soluciones de glucosa (0.01 a 0.08 mg/mL) en
fenol-ácido sulfúrico a longitudes de onda de 400 a 700 nm. ................................................. 42
Figura 13. Curva de calibración y regresión lineal. ................................................................ 42
Figura 14. Barrido espectrofotométrico de soluciones de glucosa (0.01 a 0.08 mg/mL) en ácido
sulfúrico a longitudes de onda de 200 a 400 nm .................................................................... 43
Figura 15. Curva de calibración y regresión lineal. ................................................................ 43
Figura 16. Espacio cromático CIE 1931 que identifica el color del papel para las muestras
estudiadas .............................................................................................................................. 47
Figura 17. Diagrama CIE 1976 UCS (Escala de cromaticidad uniforme) que identifica el color
del papel para las muestras estudiadas ................................................................................. 48
Figura 18. Esquematización del grupo de colores de las muestras de papel estudiado ....... 49
Figura 19. A: Muestras (1 y 2) con biodeterioro activo. ......................................................... 50
Figura 19. B: Muestras (3) control negativo........................................................................... 50
Figura 20. Resultados del crecimiento de los cinco (5) géneros microbianos del consorcio por
siembra de superficie ............................................................................................................. 50
Figura 21. Relación en diagrama de barras del efecto microbicida del AE para los
microrganismos evaluados en el consorcio. ........................................................................... 53
Figura 22. Resultados del crecimiento de los cinco (5) géneros microbianos del consorcio por
siembra de superficie. ............................................................................................................ 53
Figura 23. De izquierda a derecha: Proteína BslA, geraniol y citronelol. ............................... 55
ANEXOS
Anexo 1. Métodos para determinación de azúcares que emplean ácido sulfúrico ................ 63
Anexo 2. Certificado de identificación del material vegetal estudiado. .................................. 64
Anexo 3. Procesamiento colorimétrico .................................................................................. 65
ACRONIMOS Y ABREVIATURAS
AE(s) Aceite(s) esencial(es)
AGN Archivo General de la Nación
BNC Biblioteca Nacional de Colombia
CG-EM Cromatografía de Gases acoplada a Espectroscopia de Masas
EtOH Etanol
G.A. Grado analítico
HF Hidroxi furfural
HMF Hidroxi-metil furfural
m/z Relación masa/carga
MeOH Metanol
MWHD
NHC
Hidrodestilación asistida por radiación de microondas
No hay crecimiento
OFF
PDA
Ortofenilfenol
Papa Dextrosa Agar Difco®
P. graveolens
SHC
Pelargonium graveolens L’Hér ex Aiton
Si hay crecimiento
SIC Sistema Integrado de Conservación
UDBC Herbario Forestal
UDFJC Universidad Distrital Francisco José de Caldas
UV/VIS Ultravioleta visible
1
RESUMEN
En el presente trabajo se evaluó la respuesta de la propiedad microbicida del aceite esencial
(AE) extraído de la especie Pelargonium graveolens L'Hér (Geraniaceae) aplicado sobre
soportes de papel elaborado a finales de siglo XVIII. Los AE’s fueron extraídos mediante
destilación por arrastre con vapor a partir de material vegetal seco, su porcentaje de
rendimiento fue de 0.43%, su índice de refracción 1.468 y su densidad 0.9010 g/mL. La
composición global del aceite determinada por CG-EM, indico como compuestos más
representativos el trans-geraniol (29,9%), β-citronelol (10,51%), β-linalool (6,11%), (-)
aristoleno (4,4%) y (-) mentona (4,17%).
Se prepararon 4 grupos de muestras del papel en cuestión las que corresponden a: A. Muestra
de referencia, B. Muestra impregnada con AE, C. Muestra sometida a envejecimiento
acelerado y D. Muestra impregnada con AE y sometida a envejecimiento acelerado. Se
determinaron las variaciones en el nivel de pH siendo en promedio de 6.74, 6.58, 7.41 y 6.83
respectivamente. Para la cuantificación de azúcares reductores se seleccionó el método de
Dubois al compararlo con el método del Ácido sulfúrico-UV. Los azúcares reductores fueron
0.62749, 0.79432, 1.2383 y 1.70748 mg/g de papel respectivamente.
Se evaluó la tonalidad de las muestras empleando un colorímetro de contacto. La
representación se realizó en los sistemas CIE L*a*b, CIE L*C* h*, CIE XYZ y Munsell. Los
resultados fueron graficados con el Software Origin 2018b de 64 Bit en los diagramas de
cromaticidad CIE 1931 y CIE 1976 UCS y la rueda cromática de Adobe Color. La variación de
la tonalidad (ΔE*) reporta valores entre 0.58 y 0.7 los cuales basados en la norma ISO 12647-
2 de estándares de impresión son despreciables.
Finalmente, siguiendo el protocolo del Laboratorio de Ciencias de la Biblioteca Nacional de
Colombia y empleando soporte de papel manual y microorganismos habitualmente
encontrados en los acervos documentales: Bacillus Subtilis (Bacteria Gram positiva +),
Rhodororula mucilaginosa (Levadura) y los géneros de hongos filamentosos Aspergillus sp,
Penicillium sp y Stachybotrys sp se realizaron ensayos de actividad microbicida a una solución
del AE al 1% en EtOH al 75%. El porcentaje de inhibición fue del 100% para los hongos
filamentosos y no filamentosos (levadura), y no se presentó actividad microbicida frente al
Bacillus Subtilis bajo las condiciones de estudio, posiblemente por la hidrofobicidad de la
membrana del organismo que dificultaría las interacciones con el solvente, la capacidad para
formar endósporas y la posible formación de biofilm.
2
INTRODUCCIÓN
La humanidad se ha desarrollado a través de los años dejando a su paso un legado histórico
que hoy por hoy son las bases que simbolizan nuestro estadio actual como sociedad. En éste
proceso, el ser humano ha realizado distintos trabajos, cuyos restos son catalogados como
documentos históricos; ellos nos permiten comprender el actuar y pensar de las sociedades
así como también reconocer nuestra identidad; por lo que su preservación y conservación
representa una necesidad colectiva por mantener nuestro legado y memoria cultural (Astudillo,
2010). Ahora bien, “La preservación patrimonial es una práctica que se da en comunidades a
distintos niveles: una nación, un poblado, una institución o toda la humanidad” (Gutiérrez Soto,
Serra Larín, Álvarez Hinojosa, & Luis Gonzalvez, 2014); y en marco del contexto Colombiano,
bajó la ley 594 del año 2000 se reconoce el patrimonio documental como el "Conjunto de
documentos conservados por su valor histórico o cultural" (Congreso de Colombia, 2000).
Durante el almacenamiento de los documentos anteriormente descritos, el biodeterioro se
presenta por la naturaleza química de los soportes almacenados y las condiciones físicas del
entorno, comprometiendo entonces sus propiedades como consecuencia de “las actividades
vitales de algunos organismos”, lo que causa un estado indeseable –hasta daños irreparables-
en su estructura (Alexander & Schiesser, 2016). Para el control de los organismos que causan
biodeterioro, como lo son algunos microorganismos -bacterias y hongos- se han empleado
técnicas físicas (abrasión) en conjunto con métodos químicos (Alexander & Schiesser, 2016),
como lo es la implementación de sustancias, las cuales son perjudiciales por no ser amigables
con el ambiente y por las afecciones de salud pública que se le han adjudicado (Valdés Pérez,
Borrego Alonso, Vivar González, Anaya Villalpanda, & Molina Veloso, 2016).
En respuesta a las contraindicaciones por el uso tradicional de sustancias de síntesis químicas,
por ejemplo el timol y ortofenilfenol en el control del biodeterioro de documentos patrimoniales
causado por microrganismos en soportes de papel (Valdés Pérez et al., 2016); surgen
investigaciones que responden a las necesidad de reducir el impacto ambiental, y por ejemplo
el reconocimiento de las diferentes actividades biológicas (insecticida, anti-fúngica,
antimicrobiana, etc.) presentadas por los aceites esenciales (AE(s)), los posiciona como objeto
de interés en el estudio en el campo de los productos naturales como posibles agentes en el
control del biodeterioro (Maguna, Romero, Garro, & Okulik, 2006).
En el presente trabajo desarrollado entre la línea de investigación de colorantes naturales del
proyecto curricular de Licenciatura en Química de la Universidad Distrital Francisco José de
Caldas (UDFJC) y la línea de investigación de Productos de control de biodeterioro y
biocontaminación a cargo de Saneamiento Documental y en marco del Sistema Integrado de
Conservación (SIC) se hace estudio y caracterización del aceite esencial extraído de
Pelargonium graveolens L’Her (Geraniaceae), y se evalúa sobre soporte de papel de carácter
patrimonial, tanto la respuesta de su propiedad biocida cómo el comportamiento y/o variación
de sus propiedades físicas y químicas (pH, tonalidad y azúcares reductores).
3
1. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
La Biblioteca Nacional de Colombia (BNC) cuenta con una amplia colección bibliográfica que
por su valor e interés histórico y/o cultural debe ser protegida y conservada; el biodeterioro
representa una de las más grandes amenazas en la preservación y conservación de éstos
documentos por lo que la BNC en conjunto con la Universidad Distrital Francisco José de
Caldas (UDFJC) apuntan a la búsqueda e implementación de productos naturales que, como
posibles productos para el control del biodeterioro, reemplacen el uso de sustancias que
producen impactos medio ambientales, además de que se caractericen por ser económicos y
fáciles de adquirir.
2. ANTECEDENTES
A nivel mundial son diversos los autores quienes reconocen que el uso tradicional de
sustancias empleadas como agentes biocidas como por ejemplo el timol, ortofenilfenol, óxido
de etileno entre otros, son tóxicos y perjudiciales, tanto de manera directa con el medio
ambiente y quienes los manipulan como de manera indirecta dados sus procesos de obtención
(Almeida & Bojanoski, 2009; Farro & Ramos, 2016; Gómez, 2001; Valentín, 2011). El uso de
estas sustancias para el control biológico en documentos patrimoniales representa una serie
de problemáticas ambientales y de salud pública, por lo que cada vez más se hace un llamado
para evitar el uso de estas sustancias y buscar alternativas más sustentables (Gómez, 2001).
En respuesta a las necesidades por conservar y preservar los millones de vestigios históricos
de nuestra humanidad, distintas instituciones a nivel mundial han sido pioneras al aprovechar
las propiedades biológicas que exhiben los AE(s) en el campo de la preservación y
conservación de documentos, destacando entonces aportes por parte de Centro de
investigación para la preservación de documentos gráficos (CRCDG) Paris - Francia, quienes
emplearon el vapor de nueve aceites esenciales de diversas especies vegetales para
investigar su actividad antifúngica en especies de hongos filamentosos que habitualmente se
encontrarían en acervos documentales. El brillo o grado de polimerización de los documentos
estudiados no se encontró comprometido, pero por su parte si hubo disminución en los niveles
de pH (Rakotonirainy & Lavédrine, 2005).
En el año 2007 Arenas et al. presentaron en el XII Simposio Latinoamericano de
Farmacobotánica su estudio titulado "Plantas con actividad biocida de aplicación en el control
del biodeterioro que afecta al patrimonio cultural" en el que evaluaron los extractos etanólicos
y acuosos de 9 especies vegetales frente a microorganismos que se le atribuyen casos de
biodeterioro; empleando la técnica de disco de papel encontraron que los extractos acuosos
no exhibieron actividad antibacteriana y los extractos etanólicos si bien no exhibieron actividad
frente a la bacteria Bacillus cereus, si lo hicieron de manera moderada contra las cepas de
bacterias Pseudomonas spp. (Arenas, Gomez, Guiamet, De la Paz, & Borrego, 2007).
4
En 2016, Valdés et al. Estudió el aceite esencial de clavo de olor en el control del biodeterioro
fúngico de documentos, evaluando entonces la respuesta del AE de Syzygium aromaticum con
tres cepas fúngicas aisladas del Archivo Nacional de la República de Cuba, así como la
respuesta del AE sobre soportes documentales. El AE exhibió actividad fungicida hasta
concentraciones 25% (v/v) sin provocar "daños de gran magnitud sobre el papel" (Valdés Pérez
et al., 2016).
En respuesta a las problemáticas y preocupaciones a nivel mundial, y reconociendo la riqueza
patrimonial en Colombia, en el año 2013 se da inicio al proyecto de investigación titulado
“Estudio de aceites esenciales a partir de especies vegetales promisoras, como posibles
productos del control del biodeterioro del Patrimonio bibliográfico Colombiano” desarrollado
entre la línea de investigación de colorantes naturales del proyecto curricular de Licenciatura
en Química de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas (UDFJC) y la línea de
investigación de Productos de control de biodeterioro y biocontaminación en marco del Sistema
Integrado de Conservación (SIC) de la Biblioteca Nacional de Colombia (BNC).
En marco del proyecto, Silva y Téllez (2013) con su “Estudio de aceites esenciales obtenidos
de cinco especies vegetales, como posibles productos de control del biodeterioro del
patrimonio cultural colombiano” realizaron la estandarización del método de destilación de
aceites esenciales por arrastre con vapor y una primera aproximación a la respuesta de la
actividad fungicida de aceites esenciales (Silva & Tellez, 2013).
Laverde con su proyecto de investigación denominado “Evaluación del aceite esencial extraído
del Arrayán (Myrciantes rophaloides) aplicado a soporte de papel de carácter patrimonial.
Aspectos químicos y microbiológicos” demuestra que la acción del aceite de Myrciantes
rophaloides, presenta actividad fungistática en las condiciones de estudio; así mismo reporta
el método de Dubois como técnica apropiada para la determinación de azúcares reductores
en muestras de papel con respecto al método de Nelson-Somogyi (Laverde, 2015).
Posteriormente estudios demostraron las actividades fungicida del aceite de Ocimum basilicum
y fungistática del aceite Ocimum campechianum frente a los microorganismos Strachybotris,
Fusarium y Penicullum. Así mismo fue introducida la aplicación de técnicas colorimétricas
como parámetro para evaluar las posibles alteraciones que sufriría la celulosa en el proceso
de adición del aceite sobre los soportes de papel (Beltrán, 2016).
Finalmente, en 2017 Jaramillo y Pinto encontraron que la especie vegetal Pelargonium
graveolens L’Her: presenta un mayor rendimiento para la extracción de sus aceites esenciales
empleando material vegetal seco (hojas), reporta actividad microbicida frente a los géneros de
hongos filamentosos Stachybotrys, Fusarium y Penicilium habitualmente encontrados en
acervos documentales y su aplicación sobre soportes de papel no contribuye de manera
significativa en el aumento del nivel de pH, pero si lo hace en el aumento del contenido de
azúcares reductores (Jaramillo & Pinto, 2017).
5
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar la respuesta de la propiedad biocida del aceite esencial de Pelargonium graveolens
L’Hér aplicado a soportes de papel de carácter patrimonial así como las posibles alteraciones
de la celulosa en el proceso.
3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
Extraer el aceite esencial (AE) de la especie Pelargonium graveolens L’Hér y caracterizar
sus propiedades físicas tales como densidad e índice de refracción.
Evaluar la acción biocida del aceite esencial de Pelargonium graveolens L’Hér aplicado
sobre soportes de papel de carácter patrimonial con índices de biodeterioro provocados por
un consorcio de microorganismos (Bacillus subtilis, Rhodotorula mucilaginosa, Aspergillus
sp, Penicillium sp y Stachybotrys sp) encontrados comúnmente en acervos documentales.
Seleccionar un método óptimo para la determinación de azúcares reductores como medida
de biodeterioro en papel patrimonial dadas las posibles alteraciones de la celulosa en el
proceso de tratamiento con el AE.
Valorar algunos de los efectos físicos y químicos (nivel de pH, cambios de tonalidad y
azúcares reductores) ocasionados por la aplicación del AE de P. graveolens en los soportes
de papel patrimonial.
4. JUSTIFICACIÓN
En continuidad con el proyecto "Estudio de aceites esenciales a partir de especies vegetales
promisoras, como posibles productos de control del biodeterioro del patrimonio bibliográfico
colombiano" desarrollado entre las líneas de investigación de colorantes naturales de la
Universidad Distrital Francisco José de Caldas (UDFJC) y de Productos de control de
biodeterioro y biocontaminación de la Biblioteca Nacional de Colombia (BNC), y bajo las
sugerencias de Jaramillo y Pinto 2017 se evaluará la acción microbicida del AE extraído de la
especie vegetal Pelargonium graveolens sobre un consorcio de microorganismos causantes
de biodeterioro en soportes de papel patrimonial, como metodología practica que asemeja las
condiciones reales de afección de soportes bibliográficos, así como las posibles alteraciones
de la celulosa en el proceso; valorando entonces los cambios en los niveles de acidez y
estableciendo técnicas para: cuantificar la variación del contenido azúcares reductores en
micro muestras de papel y determinar los cambios en la tonalidad del papel.
6
5. MARCO REFERENCIAL
5.1 PATRIMONIO DOCUMENTAL
5.1.1 Definición & Marco Legal Colombiano
En el año 1992 la UNESCO (Organización de las Naciones Unidas para la Educación, la
Ciencia y la Cultura) creó el programa Memoria del Mundo con el fin de preservar y conservar
los vestigios históricos que pueden ser víctimas por factores tanto naturales (biodeterioro)
como sociales (“guerras, saqueos, dispersión, comercio ilícito entre otros disturbios sociales”)
(Edmondson & UNESCO, 2002).
Es preciso aclarar lo que “Patrimonio documental” significa, reconociendo en primera instancia
que “Un documento es aquello que “documenta” o “consigna” algo con un propósito intelectual
deliberado” y que “un documento consta de dos componentes, uno informativo que pudo ser
inscrito con tinta, lápiz, pintura u otro medio y el soporte que puede ser de papel, plástico,
papiro, pergamino, hojas de palmera, corteza, tela, piedra, etc.” (Edmondson & UNESCO,
2002).
Aunque es posible recoger ciertas particularidades en cuanto a lo que instituciones
internacionales acogen por Patrimonio documental, nos permitimos esclarecer por medio de la
autonomía nacional, que en Colombia por medio de la ley 594 del año 2000 se reconoce el
patrimonio documental a el "Conjunto de documentos conservados por su valor histórico o
cultural" (Congreso de Colombia, 2000) y extendiendo un poco su definición por la ley 1379
del año 2010 se reconoce el patrimonio documental y bibliográfico al “Conjunto de obras o
documentos que conforman una colección nacional, que incluye las colecciones recibidas por
depósito legal y toda obra que se considere herencia y memoria, o que contribuya a la
construcción de la identidad de la Nación en su diversidad. Incluye libros, folletos y
manuscritos, microformas, material gráfico, cartográfico, seriado, sonoro, musical, audiovisual,
recursos electrónicos, entre otros.” (Congreso de Colombia, 2010).
En cuanto a la Ley de Bibliotecas Públicas 1379 de 2010 refiere el patrimonio bibliográfico
colombiano como "toda obra o conjunto de obras o documentos en cualquier soporte [...] que
se valore por los individuos o la sociedad como herencia, memoria o elemento representativo
de la identidad nacional" (Ministerio de Cultura et al., 2010). En torno a la regulación del
patrimonio bibliográfico, el título I artículo 4 de la Ley 594 del año 2000 le designa al Archivo
General de la Nación funciones de estado para orientar y coordinar la función archivística para
la protección del patrimonio documental, y por medio de los artículos 46, 47 y 48 del título XI,
de la Ley 1185 del 2008 los cuales son desarrollados en el acuerdo 006 del 2014, estipulan
que:
7
ARTÍCULO 3. DEFINICIONES. Sistema Integrado de Conservación (SIC). Es el
conjunto de planes, programas, estrategias, procesos y procedimientos de conservación
documental y preservación digital, […] independiente del medio o tecnología con la cual
se haya elaborado […] (Archivo General de la Nación, 2014).
ARTÍCULO 12. PLAN DE CONSERVACIÓN DOCUMENTAL. Es el conjunto de
acciones a corto, mediano y largo plazo que tienen como fin implementar los
programas, procesos y procedimientos, tendientes a mantener las características
físicas y funcionales de los documentos de archivo […] a través de tiempo”
(Archivo General de la Nación, 2014)
5.1.2 Biblioteca Nacional de Colombia (BNC)
La Biblioteca Nacional de Colombia como institución se ha encargado de recuperar, preservar
y catalogar el patrimonio bibliográfico y documental del país en relación con el Programa
Nacional de Preservación (PNP) así como también “velar por la institucionalización y
aplicación de sus políticas” (Ministerio de Cultura & Biblioteca Nacional de Colombia, 2017;
Vargas, 2011).
Resulta oportuno reconocer que la BNC y en general Colombia cuenta con extensas
colecciones de documentos patrimoniales entre los que se abarcan “manuscritos, libros,
periódicos, revistas, fotografías, mapas, partituras, grabados, folletos, videos, discos, cintas y
publicaciones digitales recientes” y donde “el soporte más representativo es el papel”
(Vargas, 2011; Biblioteca Nacional de Colombia, n.d.)
5.2 GENERALIDADES DEL PAPEL
5.2.1 Historia
Se estima que los primeros procesos para elaborar papel fueron desarrollados en China hacia
el año 100 d.C., en periodos del emperador Ho-Ti dada la necesidad por encontrar soportes
para que la comunicación escrita fuese más práctica. Inicialmente el papel se constituía por
"una pasta proteínica proveniente de trapos de seda desmenuzados" (De Lera, 2011; Theile,
2015).
La técnica fue migrando a países como Corea y Japón y así mismo se dio a conocer en el resto
del mundo gracias a los musulmanes por medio de la ruta de la seda desde Oriente Medio y
África del norte hasta llegar a España entre los siglos IX & X; no sin antes, por los elevados
costos de producción introducir en el proceso el uso de trapos, algodón, cáñamo y lino
(Calderón Delgado, 2008; De Lera, 2011).
8
El papel como era conocido es introducido en América hacia el siglo XVI por la conquista
previa del territorio. Los procesos para la elaboración de papel eran de alta calidad; sin
embargo, dada la constante demanda de este material y a factores socioeconómicos
presentados a lo largo del siglo XIX por la crisis algodonera, se introducen fibras de madera
para la elaboración de estos soportes, comprometiendo así la calidad del papel y aumentando
en él, procesos de degradación dado el contenido de lignina en esta nueva materia prima
(Calderón Delgado, 2008; De Lera, 2011).
5.2.2 Características, Propiedades y Tipos
5.2.2.1 Características generales
Cuando hablamos de papel es común visualizar un cuerpo homogéneo, sin embargo, al
adentrarnos un poco en la estructura y composición del mismo, es posible reconocer que el
papel no es más que un alto entramado de fibras celulósicas organizadas heterogéneamente.
La densidad de estas fibras cómo estructuras individuales pueden rondar por los 1.5 g/cm3
mientras que el papel en general puede tener densidades entre los 0.5 – 0.8 g/cm3, resultando
entonces del papel, un material altamente poroso. Los valores característicos del papel no
pueden considerarse ni absolutos ni únicos; en primer lugar porque reconocemos el papel
como un material heterogéneo y en segundo lugar porque existen y existieron gran variedad
de procesos para su elaboración dadas las necesidades sociales (Melorose, Perroy, & Careas,
2015; Zanuttini, 2008). Aun así, es posible hablar de sus características particulares como:
Ancho de hoja
Calibre
Peso base
Tensiones longitudinales
Porcentaje de elongación
5.2.2.2 Algunas Propiedades físicas
A. Propiedades estructurales
Porosidad: La porosidad como se mencionó en el apartado 5.2.2.1 de Características
generales (pág. 8) es producto de la organización de las millones de fibras que componen el
papel; esta propiedad brinda la capacidad para absorber fluidos (tintas u otros líquidos). Cabe
señalar, que entre más alta sea la porosidad de una fibra, menor será tanto su densidad, así
como tendrá un bajo nivel de unión entre fibras (Melorose et al., 2015; Zanuttini, 2008)
Absorción de la humedad y humedad relativa: Muchas de las propiedades del papel son
consecuencia de la variación de la humedad en su estructura, medida que es dependiente de
la humedad del ambiente, la temperatura, la presión y estabilidad del papel.
11
El papel ésta compuesto principalmente por fibras celulósicas (de las que hablaremos
detalladamente en el apartado 5.2.3.1 pág. 15) caracterizadas por ser higroscópicas, que en
contacto de agua iniciarían un proceso de hinchamiento y dilatación; ello debido a que la
celulosa se compone de un polímero conformado por monómeros de glucosa, cuya cadena
presenta numerosos grupos hidroxilo (OH)- que forman puentes de hidrogeno y dotan de un
carácter hidrofílico a la estructura. Las moléculas de agua pueden disponerse entonces entre
enlaces laterales de la celulosa. (Calderón Delgado, 2008; Marquerie & Santos, 2015;
Melorose et al., 2015; Turrado, Saucedo, Ramos, & Reynoso, 2008).
La calidad del papel presenta relación con los niveles de agua y humedad; en niveles óptimos
de humedad el pH se encuentra estable y la calidad del soporte es alta, mientras que:
La disminución del contenido de agua aumenta la acidez del soporte y provoca que las
fibras sean más rígidas y menos flexibles
El aumento del contenido de agua aumenta la alcalinidad del soporte y produce una
debilitación de los enlaces entre las fibras. (Calderón Delgado, 2008; Marquerie &
Santos, 2015; Turrado et al., 2008)
Estabilidad dimensional: La estabilidad del papel depende en gran medida de los cambios
que sufren las fibras durante su elaboración, productos de la tensión y contracción de las hojas
de papel. Las relaciones directas con la estabilidad dimensional consideran factores como lo
es la contracción de las fibras en procesos de secado, la calidad de las fibras y su grado de
fracturación (entre menos fracturada, presenta mayor estabilidad), la interconexión de la
celulosa por medios químicos (tratamiento con resinas) y la implementación de fibras no
absorbentes (Melorose et al., 2015).
B. Propiedades ópticas
La estructura del papel se asemeja a un grupo de láminas dispuestas unas sobre otras,
dotando así a la estructura de un área de superficie alto. Si bien el papel no es homogéneo ni
paralelo (más complejo que las láminas), al incidirle con un haz de luz ocasionará una serie de
reflexiones y absorciones que podemos cuantificar (Zanuttini, 2008). Entre estas podemos
encontrar medidas que señalaremos a continuación:
Blancura (ISO Brightness): Corresponde al índice de reflectividad determinada con uso del
espectro de sensibilidad a 457 nm.
Opacidad: Hace referencia a la propiedad del papel por obstruir el paso de la luz.
Brillo: Capacidad del papel por reflejar la luz en forma especular.
12
Tonalidad: La tonalidad se reconoce como una propiedad del color, el cual es evaluado por
medio del modelo de color CIE Lab, quien mide parámetros de L, luminosidad; a (+) tinte en
eje rojo y (-) tinte en eje verde; b (+) tinte en eje amarillo y (-) tinte en eje azul. (Conceptos
recuperados de Zanuttini, 2008)
Alteración de la propiedad óptica de tonalidad
Alteración en las propiedades ópticas: La estructura general de la celulosa, y con ella sus
propiedades ópticas (tonalidad), pueden sufrir alteraciones químicas por reacciones tanto de
foto-oxidación como termo-oxidación en presencia de oxígeno y fuentes energéticas
(Calor/UV). La absorción de energía puede iniciar una reacción en etapas con formación de
radicales (iniciación); los radicales formados experimentarían procesos de oxidación
(propagación) formando peróxidos e hidroperóxidos (naturalmente inestables), y por último el
producto de las especies reaccionarían entre sí para formar moléculas más estables
(terminación) (Ver figura 01,A). Cuando los procesos de oxidación son dados en carbonos de
tipo terciario, se puede dar lugar a la formación de peróxido (-O-O-) e hidroperóxido (-O-OH-)
que en una etapa de finalización, formaría el grupo carbonilo (C=O) que actuaría como
comóforo y sería responsable del amarillamiento del polímero de la celulosa (Ver figura 01,B)
(San Andres, Chercoles, De la Roja, & Gómez, 2010)
Figura 1. A: Mecanismo general de las reacciones de oxidación. B: Proceso de formación de
grupo carbonilo a partir de un hidroperóxido. Tomado de San Andrés, Chercoles, De la Roja &
Gómez, 2010
13
Representación de la propiedad óptica del color: Sistemas de color.
Resulta fascinante el pensar que no todas personas observan exactamente el mismo color;
esto debido a que el color no es más que la interpretación de las longitudes de onda visible
que perciben nuestros órganos visuales y el cerebro quien se encarga de procesar dichas
señales. Entonces hablar de color puede involucrar cuestiones subjetivas a la hora de
determinar si un color es por ejemplo Rojo (aunque en realidad hablemos de una única
tonalidad rojiza entre millones).
Reconociendo esto percibimos que nuestro vocabulario no es más que limitado para referirnos
a millones de colores que nuestros ojos pueden percibir; y entonces ¿cómo podemos
cerciorarnos de que en realidad nos referimos a un color en específico? Distintos pensadores
y organizaciones han desarrollado sistemas que permiten cuantificar el color y expresarlo por
medio de modelados matemáticos que buscan relacionar los distintos atributos de los colores
para referirnos a ellos de la manera en la que lo hacemos con las longitudes o los pesos; por
ejemplo Munsell ideo un método para expresar el color de acuerdo a su tonalidad (T),
luminosidad (valor: V) y saturación (croma: C); por su parte la Comisión Internacional de
l’Eclairage (CIE: 1931 y 1976) es una organización para la determinación de sistemas de luz y
color y ha estructurado diversos sistemas como CIE XYZ, CIE L*a*b*, y CIE L*C*h* para la
determinación del color de un objeto.
En la tabla 01 se muestran las características de estos sistemas (Konica Minolta, n.d.;
Meganck, Wallim, & Martin, 2018).
14
Tabla 1. Características de los sistemas de color para la determinación de la tonalidad en una
muestra. Información adaptada de Beltrán, 2016; Konica Minolta, n.d.; Meganck et al., 2018;
Universidad de Palermo, n.d.
SISTEMA: CARACTERÍSTICAS
CIELAB L*a*b Sistema de espacio de color uniforme en donde se
considera que dos colores no pueden ser al tiempo
rojo-verde o amarillo-azul. El sistema expresa los
valores L*=Luminosidad, a*=coordenadas rojo (+) /
verde (-) y b*= coordenadas amarillo (+) / azul (-). CIEL L*C*h Representa el mismo diagrama que el espacio de
color L*a*b* pero sus coordenadas se representan
circularmente. Al igual que en L*a*b*, L* indica
luminosidad, pero C* representa croma o saturación,
y h* es el ángulo de matiz (0° es +a* o rojo, 90° es +b
o amarillo, 180° es –a* o verde y 270° es –b o Azul).
CIE-XYZ Corresponde a un estándar de medida basados en la
teoría de que el ojo humano es capaz de percibir tres
colores primarios (verde, azul y rojo) aunque estos no
son más que imaginarios matemáticos (al azul y rojo
se les asigna luminancia de cero y cualquier
luminancia se asocia con el color verde primario). Los
colores se determinan por sus componentes de rojo
y azul más la luminancia que tenga el verde. Ahora
bien, por las complicaciones a la hora de graficar, se
estandarizo un procedimiento para obtener dos
valores cromáticos a partir de los valores XYZ; así el
color puede evidenciarse en dos dimensiones de un
sistema cartesiano en el espacio cromático CIE
1931. Dadas problemáticas que se pueden presentar
cuando dos colores presentan luminancia similar,
surge el Diagrama de Cromaticidad UCS CIE 1976
para representar un espacio de color más uniforme.
Munsell Es un sistema basado en la percepción humana para
especificar y relacionar los colores al asignar valores
a tres diferentes propiedades: Tonalidad (H) para 5
colores primarios rojo (R), amarillo (Y), verde (G),
Azul (B) y purpura (P) así como a sus intermedios
(YR, GY, BG
, PB y RP); Valor (V) que comprende 10 valores de
iluminación (0 para negro 10 para blanco) y Croma o
saturación (C) que varía entre 0 (gris) y 18 (mayor
croma). El sistema atiende a una configuración (3D).
15
5.2.3 Composición química
En un papel generalmente pueden encontrarse fibras de celulosa, cargas minerales,
pigmentos, agentes blanqueadores y de resistencia como sosa y almidones respectivamente
así como resinas y otros encolantes. Sin embargo, el componente principal del papel como
soporte, son fibras cuya calidad depende de su procedencia y el proceso de elaboración. Las
fibras en general pueden proceder de
I) Fibras no madereras (Hebras de seda, sisal, yute, cáñamo, lino y algodón)
II) Fibras de Coníferas (Abeto, ciprés, pino etc.) caracterizadas por ser resistentes y con buen
grado de polimerización
III) Fibras de Latifolias (Álamo, eucalipto etc.) con bajos grados de polimerización y alto
contenido hemicelulósico. (De Lera, 2011; Zanuttini, 2008).
Las fibras vegetales no madereras se componen de α-celulosa y β-celulosa mientras que las
fibras madereras originalmente poseen otras impurezas como la lignina, pectina, taninos entre
otros, por lo cual se requiere de tratamientos como lo es la degradaciones enzimática de lignina
con la ayuda de enzimas ligninolíticas aisladas de Hongos (Aspergillus sp y Neurospora,
Pycnoporus cinnabarinus, Myceliophthora thermophila). Pese a los intentos por eliminar las
impurezas, dado a su composición inicial, los grados de polimerización de la celulosa se
encuentran disminuidos en fibras provenientes de maderas (más en Latifolias que en
Coníferas) en relación con otras fibras vegetales no madereras de mayor resistencia como el
algodón, lino, cáñamo entre otros (De Lera, 2011; Prinsen, 2009).
5.2.3.1 Celulosa
La celulosa es reconocida por ser el biopolímero más abundante, así como importante por ser
responsable de funciones estructurales en el mundo vegetal. Se compone de una serie de
monosacáridos de β-D-glucosa unidos linealmente por enlaces β-1,4 O-glucosídicos; el grado
de polimerización varía dependiendo del origen de la celulosa; una celulosa nativa puede variar
entre 3000 y 10000 unidades del monómero de glucosa, y a medida que esta envejece las
cadenas pueden acortarse, encontrando así, celulosas comerciales con 500 a 2000 unidades
de glucosa. Los monomeros de la macromolécula de celulosa poseen una alta cantidad de
grupos funcionales -OH que forman puentes de hidrogeno e interacciones por Van der Waals
capaces de unir las cadenas laterales y formando así micelas de celulosa y microfibrillas
(Figura 02); su disposición tridimensional reconoce organizaciones cristalinas que se
organizan de manera compacta y zonas amorfas con estructuraciones desordenadas. Se
reconoce además que las cadenas de la zona amorfa son más propensas a ser degradas por
celulasas, a la vez que se reconoce que en la madera, hay mayor número de zonas amorfas
que en otras fibras vegetales como el algodón (De Lera, 2011; Prinsen, 2009)
16
Figura 2. Composición y estructuración de la celulosa. Recuperado De Lera 2011 & Marquerie 2015
5.2.3.2 Hemicelulosa
Las hemicelulosas son un biopolimero vegetal con propiedades estructurales; sin embargo,
contrario a la celulosa esta se constituye de polisacáridos con grupos heterogéneos por la
presencia de monómeros como xilosa, arabinosa, glucosa, galactosa, fructosa o manosa
(Pentosas y hexosas). Su polimerización es de entre 100 y 200 unidades en fibras de maderas.
Las hemicelulosas cuentan con una cadena principal (glucosa, xilosa y/o manosa) enlazada β-
(1⟶4) entre sí y ramificaciones cuyos enlaces pueden ser β-(1⟶2), β-(1⟶3), β-(1⟶6)
dependiendo de la estereoquímica del monómero (Prinsen, 2009). Las interacciones por
puentes de hidrogeno, permiten que la hemicelulosa interactúe con las microfibrillas de
celulosa, y por su estructura ramificada, aporta a la hoja mayor flexibilidad a los soportes de
papel pese a ser menos estable que la celulosa (Marquerie & Santos, 2015).
5.3 DETERIORO EN SOPORTES DE PAPEL
5.3.1 Generalidades
Los soportes documentales son expuestos a un conjunto de efectos causales que provocan
un deterioro y alteración en las propiedades y características originales del documento. El
deterioro puede responder a razones congénitas (factores intrínsecos) o puede deberse a la
interacción con su entorno (factores extrínsecos) como lo es su naturaleza física, química,
biológica y en base a su actuación habitual; el grupo de alteraciones por esas causas pueden
presentarse de manera individual o en conjunto (Crespo, Carmen, Viñas, & Vicente, 1984).
17
5.3.1.1 Factores intrínsecos.
Ya hemos visto la naturaleza orgánica de las fibras de celulosa que componen el papel, así
como también se hizo un reconocimiento de otros elementos que se pueden encontrar en el
papel, tales como cargas minerales, pigmentos, y otros aditivos. Ahora bien, las alteraciones
intrínsecas de los soportes responden a los efectos naturales de las materias primas que lo
componen; siendo el papel entonces, susceptibles a fenómenos de oxidación dada la influencia
de, por ejemplo elementos metálicos con los que se fabricaron las tintas, o también pueden
presentarse casos de variación del pH en respuesta a la pérdida natural de agua por el tipo de
fibra y la presencia de algunos aditivos, aportando como consecuencia una mayor rigidez y
disminución de la flexibilidad en los documentos (Calderón Delgado, 2008; Crespo et al., 1984).
5.3.1.2 Factores extrínsecos.
Las circunstancias de deterioro por causas extrínsecas puede dividirse en 4 grupos (ver figura
03), como lo es el deterioro biológico, químico, físico y por intervenciones humanas (Crespo et
al., 1984).
Figura 3. Principales tipos de deterioro en acervos documentales. Recuperado de Jaramillo & Pinto
2017
TIPOS DE DETERIORO DEL PAPEL
Biológico
Hongos y bacterias
Manchas
Debilitamiento del soporte
Foxing
Insectos y roedores
Perforaciones
Abrasión y erosión
Manchas de excremento
Químico
Oxidación
Alteración crómatica
Corrosión de tintas
Foxing
Físico
Rasgaduras y roturas
Manchas por humedad,
adhesivos y suciedad
Abrasión
Deformación del plano
Intervenciones humanas
Vandalismo
Almacenamiento inadecuado
Manipulación incorrecta
18
5.3.2 Biodeterioro
El deterioro biológico o biodeterioro es un término implementado por Hueck en 1965 como
"Cualquier cambio indeseable en las propiedades de un material a cusa de las actividades
vitales de los organismos" (Alexander & Schiesser, 2016). Bajo estas consideraciones se
reconocen múltiples organismos (roedores, insectos, hongos y bacterias) los que de alguna u
otra medida interfieren y las propiedades de los soportes. Algunos roedores por ejemplo,
atraídos por libros, maderas, textiles, etc. ejercen acciones mecánicas destructivas y pueden
dejar excrementos que mancharían los soportes; insectos consumidores de papel (bibliófagos)
principalmente en su estado larval requerirían de grandes fuentes energéticas y se verían
atraídos para alimentarse de la composición celulósica del papel, provocando entonces
perforaciones. Por otro lado, algunos microorganismos provocan efectos sobre distintos
sustratos orgánicos como la celulosa y por los intereses particulares de esta pasantía, se
abundará en la forma en que estos actúan. (Crespo et al., 1984).
5.3.2.1 Clasificación de principales microorganismos que causan el biodeterioro
Los microorganismos son seres vivos caracterizados por su reducido tamaño; a grandes
rasgos los podemos clasificar en bacterias y hongos (Redi, 2000).
Las bacterias son microorganismos procariotas caracterizados por ser organismos
unicelulares y sus sistemas enzimáticos así como los productos de secreción tales como
algunos ácidos que guardan relación con la degradación en soportes históricos (Valentín,
2011). Las bacterias presentan diferencias morfológicas entre las que se destacan dos grandes
grupos; bacterias Gram negativas (-) y Gram positivas (+).
Las bacterias Gram (-) se caracterizan por que su envoltura nuclear se compone de una
membrana citoplasmática, una delgada capa de peptidoglicano (ver figura 04, A) formado de
polímeros de N-acetil-glucosamina y ácido N-acetilmuránico –“derivados de carbohidratos
asociados a cortas cadenas peptídicas” (Pírez, 2006) y una membrana externa, mientras que
las bacterias Gram (+) se caracterizan porque su envoltura nuclear consta de una membrana
citoplasmática y una serie de capas de peptidoglicano (ver figura 04, B) (Mora, 2012).
19
Figura 4. A: Estructura del peptidoglicano. B: Comparación de las envolturas celulares
bacterianas. 1. Membrana citoplasmática, 2. Peptidoglicano, 3. Fosfolípidos, 4. Proteínas, 5. Ácido lipoteicoico, 6. Espacio
periplasmático, 7. Membrana externa, 8. Lipoproteína, 9. Lipopolisacáridos y 10. Porinas. Tomado de Mora, 2012; UNAM,
2014
Los Hongos son microorganismos eucariotas los cuales pueden ser unicelulares o
pluricelulares, se dividen en dos grandes grupos, filamentosos y no filamentosos. Entre los
hongos no filamentosos encontramos las levaduras las cuales son unicelulares, de estructura
redonda o elipsoide, y cuya reproducción se da por gemación o fisión binaria; por su parte, los
hongos filamentosos, son organismos multicelulares y de estructura micelar formada por una
serie de fragmentos conocidos individualmente como hifas y su tipo de reproducción es por
medio de la proliferación de esporas (Ramirez, n.d.; Suquillo, 2017).
5.3.2.2 El mecanismo de afección de los microorganismos
Algunos microorganismos cuentan con sistemas enzimáticos específicos que les permite
obtener energía de diversas fuentes. Así, las celulasas, xilanasas, proteasas, gluconasas,
ligninasas e incluso la secreción de algunos ácidos orgánicos les sirven para valerse y
descomponer fibras vegetales las cuales transformarían eventualmente en monómeros de
glucosa de la que se alimentaran (Ver Figura 05). Producto de sus funciones especializadas,
dichos microrganismos afectan de manera significativa los soportes, sea por la mera oxidación
de las fibras cambiando su tonalidad y resistencia o por la producción secundaria de sustancias
que podrían evidenciarse como manchas en los documentos (Farro & Ramos, 2016; Valentín,
2007, 2011; L. S. Villalba, Mikán, & Sánchez, 2004).
20
Figura 5. Hidrolisis enzimática de fibras vegetales (celulosa). Tomado de Sánchez et al., 2014
Entre los microorganismos más comúnmente encontrados en acervos aislados se han aislado
tanto bacterias y hongos pertenecientes a los siguientes géneros Bacillus, Rhodotorula,
Aspergillus sp, Penicillium sp y Stachybotrys sp (Farro & Ramos, 2016; Mallo, Nitiu, Elíades, &
Mario, n.d.; Vargas, 2011; L. S. Villalba et al., 2004). En la tabla 02 se detallan algunas de las
características de estos microorganismos.
21
Tabla 2. Características generales de microorganismos encontrados generalmente en acervos documentales.
Microorganismo Tipo Generalidades Mecanismos Autores.
Bacillus subtilis Bacteria
(Gram
positiva +)
Produce endósporas
resistentes a factores físicos y
químicos como la
temperatura, la desecación, la
radiación UV y los ácidos. Es
que capaz de generar biofilm
Cuenta con enzimas hidrofílicas
celulares (celulasas) las cuales
contribuyen con el debilitamiento de
polisacáridos (celulosa como
constituyente del papel patrimonial).
Cuervo, 2010
Rhodotorula
mucilaginosa
Hongo no
filamentoso
(Levadura)
Levaduriforme (puede
encontrarse en una diversidad
de lugares, incluyendo los
seres humanos)
Produce metabolitos de tipo
secundario de tipo carotenoides,
posible responsable de la generación
de manchas amarillas en soportes de
papel
Cabero, Orden, &
Ángel, 2012;
Carrillo et al., 2007;
Maldonade, 2003
Aspergillus sp Hongo
filamentoso
Se encuentra formado por
hifas hialinas septadas y su
reproducción puede ser tanto
sexual (formación de
ascosporas) como asexual
(conidios).
Hongo celulósico capaz de afectar
soportes de papel. Produce
metabolitos secundarios tóxicos como
algunas aflotoxinas, ocratoxinas y
alcaloides ergoticos capaces de
afectar la salud humana.
Cortés &
Mosqueda, 2013;
Mallo, Nitiu,
Elíades, & Mario,
n.d.; Molina Veloso
& Borrego A, 2016
Penicillium sp Hongo
filamentoso
Se reproduce asexualmente
mediante conidios que son
formados en el extremo de
hifas especializadas
(conidióforos).
Cuenta con sistemas enzimáticos
complejos capaces de producir
xilanasas, afectando y degradando
así las hemicelulosas presentes en el
papel.
Nigam, 2013
Stachybotrys sp Hongo
filamentoso
Requiere para sobrevivir de
ambientes húmedos y
materiales con alto contenido
celulósico y bajo en nitrógeno.
Hongo capaz de degradar la celulosa
dado su sistema enzimático; la
presencia de este tipo de hongos
puede ser responsable de manchas
negras en soportes de papel.
Bitnun & Nosal,
1999
22
5.3.3 Evaluación química del deterioro de la celulosa
Como hemos visto, las fibras de celulosa se caracterizan por su alto grado de polimerización
cuyos enlaces de tipo β-1,4-O-glucosidicos son constituidos por monómeros de glucosa en
forma acetálica de naturaleza no reductora. Si hablamos del papel, reconocemos en su
estructura a la de un polisacárido del tipo no reductor; sin embargo, ya sea por:
I) Procesos de hidrolisis enzimática provocada por microorganismos,
II) Hidrolisis catalizadas por los efectos de absorción de energía (calórica o lumínica)
III) El tipo de procesos con los que se elaboraron el papel
Es posible encontrar grupos de moléculas con disposiciones hemiacetálicas (de naturaleza
reductora). Dadas las anteriores implicaciones, una de las formas para evaluar el deterioro en
soportes de papel, es la cuantificación de los azúcares reductores (Jaramillo & Pinto, 2017;
San Andres et al., 2010).
En 2015, Laverde comparó los métodos para cuantificar azúcares reductores por medio del
método de Nelson-Somogyi y el método de Dubois que pese a corresponder a un método para
la cuantificación de azúcares totales, la forma de procesar la muestra permite el análisis de los
azúcares reductores. Acorde con los resultados de Laverde y lo abordado por Jaramillo & Pinto
2017, el método de Dubois, pese a sus limitaciones, es más apropiado que el de Nelson-
Somogyi para la cuantificación de los azúcares reductores en el papel.
En contraste López, Taramuel, Arboleda, Segura, & Restrepo en el año 2017 compararon 3
métodos que emplean ácido sulfúrico para la determinación de azúcares totales, determinando
finalmente el método del ácido sulfúrico-UV como el más óptimo y sensible dada la capacidad
de absorción del hidroximetilfurfural HMF (Producto de la reacción entre el ácido sulfúrico
concentrado y los respectivos azúcares) en la región del UV. En el Anexo 1 es posible
encontrar el fundamento de los métodos (López, Taramuel, Arboleda, Segura, & Restrepo,
2017).
5.3.4 La preservación y conservación del material bibliográfico
La disposición de los materiales bibliográficos suele encontrarse en archivos, museos y
bibliotecas; quienes, con una gran responsabilidad social se hacen cargo tanto de su
preservación como de su conservación pese a los desafíos que enfrentan. La preservación en
sí es objeto de prevención y se le atribuye las acciones que pueden anticipar un daño; para
ello es necesario regular los microclimas y controlar la contaminación e higiene de las
muestras. La conservación por su parte, busca detener los procesos de deterioro los cuales
por fines prácticos ya fueron categorizados (5.3.3.1 & 5.3.3.2), En respuesta a los factores
extrínsecos por deterioro biológico (biodeterioro), se ha empleado a lo largo de la historia
distintos métodos para prever su propagación (Paz, Hernandez, & Sanchez, 2015).
23
5.4 ACEITES ESENCIALES
5.4.1 Generalidades
Los aceites esenciales (AE’s) corresponden a un grupo de metabolitos secundarios
caracterizados por ser altamente volátiles; se componen principalmente por mezclas complejas
de hidrocarburos como terpenos de bajo peso molecular, alcoholes, compuestos carboxílicos,
aldehídos aromáticos y fenoles; siendo este grupo de compuestos los responsables de los
aromas en las plantas. Se puede encontrar en distintos organelos de plantas (Ver tabla 03) y
en sus procesos de extracción se suelen encontrar rendimientos de entre 0.01 y 6% aunque
en promedio las plantas herbáceas poseen entre 0.5 y 2% de aceite esencial. El uso de estas
sustancias ha recobrado gran interés en distintas industrias por sus propiedades aromáticas y
las actividades biológicas que pueden expresar, además de ser naturales, biodegradables y
poco tóxicos (Pino, 2005; Stashenko, 2009).
Tabla 3. Algunas ubicaciones de los aceites esenciales en las plantas. Tomado de Pino 2005
Organelo Familia
Tubo esquizógenos Umbelliferae
Tubos oleíferos o vitas Lauraceae
Canales lisígenos Pinaceae
Canales esquizógenos Rutaceae
Células modificadas del peréquima Piperaceae
Tricomas Labiatae, Solanaceae, Asteraceae, Geraniaceae
Glándulas Rutaceae
5.4.2 Actividades biológicas de los AE y su papel como agentes microbicidas
El uso de los AEs no es algo reciente, pues se reconocen registros históricos que revelan el
uso de esencias de Boswelia thurifera en pomadas hace más de 3300 años en Egipto.
(Stashenko, 2009). En la actualidad, se conoce una diversidad de estudios en torno al uso de
los aceites esenciales en la industria farmacéutica e incluso en la elaboración de cosméticos y
saborizantes. Se ha reportado distintos estudios en los que AEs exhiben actividades biológicas
como: efectos insectisidas, antioxidantes, antibacterianos, antinflamatorio, antiespasmódico
entre otros (Maguna et al., 2006).
Es importante recordar que los AEs se constituyen de mezclas complejas por lo que no es
correcto atribuir a un grupo de compuestos sus actividades biologías; sin embargo, se ha
señalado a los terpenos como principales responsables de la actividad antimicrobiana donde
se sugiere que su actividad varia de mayor a menos si son terpenos con alcoholes, aldehídos,
y grupos centónicos (Maguna et al., 2006). Y aunque aún no son develados los mecanismos
que ejercen los AE sobre distintos microrganismo, su actividad antimicrobiana puede
igualmente asociarse a los siguientes factores:
24
1. Carácter hidrófobo de pequeñas moléculas: Interaccionan con la membrana celular
(estructura lipídica), ello ocasiona la ruptura de la membrana así como una desnaturalización
de distintas macromoléculas.
2. Composición química: El alto contenido de estructuras fenólicas contribuye en las
propiedades antimicrobianas. Y por ejemplo, se ha reportado que el carvacrol provoca la
pérdida de protones y potasio inhibiendo la síntesis de ATP, así como el aceite de citronela
compuesto por citronelal, citronelol y geraniol interviene en procesos metabólicos,
evidenciando así que estos compuestos no solo afectan la pared celular sino que presentan
otros efectos.
3. Tipo de microrganismo que ataca: Las bacterias Gram positiva (+) y Gram negativa (-)
interactuan de manera distinta frente a los AEs, se cree que esta respuesta es debida a los
marcados caracteres hidrófobos de las bacterias Gram (-) haciéndolas a estas más propensas
a los efectos antimicrobianos de los AEs (Reyes, Palou, & Lopez, 2012).
5.4.3 Terpenos
Originalmente, los terpenos recibieron su nombre por el grupo de hidrocarburos aislados de la
trementina (Balsamum terebinthinae); actualmente se conocen más de 30 mil compuestos, los
cuales se caracterizan por estar constituidos por asociaciones de isoprenos (C5H8)n, este grupo
de metabolitos puede clasificarse según el número de isoprenos que comprenden la molécula-
El grupo de terpenos que constituye a los AE(s) son los de bajo peso molecular (principalmente
monoterpenos y sesquiterpenos, ver tabla 04) aunque en algunas oportunidades en posible
encontrar algunos diterpenos (Pino, 2005).
Tabla 4. Clasificación de algunos terpenos en AE según el número de asociaciones de
moléculas de isopreno. Adaptado de Breitmaier., 2006 & Stashenko, 2009
Unidades
de isopreno
Numero de
carbonos
Clasificación Tipo
1
5 Hemiterpeno Bajo peso molecular (Metabolito volátil)
(isopreno)
2 10 Monoterpeno Bajo peso molecular (Metabolito volátil)
(β-Mirceno)
2 10 Monoterpeno
oxigenado
Bajo peso molecular (Metabolito volátil)
(Geraniol)
3 15 Sesquiterpeno Bajo peso molecular (Metabolito volátil)
(Farneseno)
25
Tanto en el grupo de monoterpenos como el de los sesquiterpenos se pueden encontrar
compuestos lineales o cíclicos y estos pueden sufrir de algunas reacciones tanto de
eliminación (reducción) como de adición (oxidación) en las que recibirían moléculas de oxígeno
en forma de alcoholes, cetonas, aldehídos y esteres (hablamos entonces de terpenos
oxigenados). (Breitmaier, 2006; Pino, 2005).
5.5 TAXONOMIA VEGETAL Y CARACTERISTICAS DE LA ESPECIE
5.5.1 Familia Geraniaceae
La familia Geraniaceae comprende 7 géneros (California, Erodium, Geranium, Hypseocharis,
Monsonia, Pelargonium, Sarcocaulon) y clasifica más de 600 especies. Entre sus
características podemos encontrar que son plantas herbáceas y sus ciclos de vida pueden ser
anuales o perennes; su base suele ser bastante ramificada y sus hojas pueden ser opuestas
o alternas, dentadas, largamente pecioladas, espatuladas o altamente lobuladas, simples o
compuestas. Sus inflorescencias pueden ser terminales o axilares, actinomorfas o zigomorfas,
u tanto su cáliz como corola consta de 5 pétalos. Frutos esquizocárpicos que se dividen en 5
mericarpos. (Jussieu, 1996; Rzedowski, 1995).
5.5.2 Genero Pelargonium
El género Pelargonium acoge más de 280 especies, cuentan con tallos ya sean erguidos,
ascendentes o postrados los cuales se caracterizan por que estos se han adaptado para
retener agua como semi-suculentos; sus hojas suelen ser lanceoladas y pueden disponerse
tanto de manera alterna como opuesta, sus peciolos son largos y carnosos y presentan
estípulas (enteras o bífidas). Este género ha sido bastante confundido con el Geranium, sin
embargo estos se diferencian sustancialmente por la manera en que se presentan sus
inflorescencias; el Geranium suele tener flores actinomorfas mientras que las flores del genero
Pelargonium son zigomorfas con presencia de hipanto, estas a su vez se componen de 5
pétalos con distintos patrones de color en la disposición de sus 2 petalos superiores y sus 3
pétalos inferiores. Se caracterizan por ser umbeliformes, y pueden ser axilares y opuestas con
pendiculos simples o ramificados. En cuanto a sus ovarios, estos tienen 5 lóculos en donde
cada uno presenta 2 rudimentos (Crespo, 2008; Maggs, Vorster, & Van Der Walt, 1995).
26
5.5.3 Especie Pelargonium graveolens L'Hér (Geraniaceae)
Reino: Plantae
Subreino: Tracheobionta
Filo: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Rosidae
Familia: Geraniaceae
Género: Pelargonium
Especie: Pelargonium graveolens L'Hér ex
Aiton
Figura 6. Especie Pelargonium graveolens L'Hér (Geraniaceae). Fotografía del autor
5.5.3.1 Características morfológicas
Pelargonium graveolens L'Hér. ex Aiton (Figura 06), conocido comúnmente como geranio rosa,
es un arbusto fragante que alcanza los 20 u 80 cm de altitud. Sus tallos presentan un alto grado
de ramificación siendo estos erectos de tipo leñoso con coloración marrón obscura en su base
y verde hacia el ápice.
La disposición de sus hojas es alternada y se conocen por ser de tipo palmatipartida
presentando en ellas de 5 a 7 divisiones, son profundamente lobuladas y suaves al tacto, su
peciolo mide de 2 a 8 cm y cuenta con estipulas de 6-10x4-9 mm. La inflorescencia de esta
especie es de tipo simple umbeliforme (4-13 flores) y zigomorfa, sus pétalos superiores son
ovalados siendo de colores rosados o blancos y con manchas purpuras en su base, sus pétalos
inferiores son más angostos y pálidos. Cuenta con tricomas glandulares en hojas donde son
encontrados principalmente los AE(s) y tricomas no glandulares distribuidos partes aéreas
(Boukhris et al., 2013; Crespo, 2008)
27
5.5.3.2 Distribución geográfica
Figura 7. Distribución geográfica del Pelargonium graveolens L’Hér ex Aiton. Tomado de
https://www.naturalista.mx/taxa/127298-Pelargonium-graveolens
Las especies de la familia Geraniaceae se encuentran distribuidas en Sudáfrica y se han
introducido en Europa, Asia, y África del norte. La especie Pelargonium graveolens se ha
encontrado en países como China, Francia, España, Egipto, Marruecos, Argelia, Tunez; y tal
como se referencia la figura 07, igualmente se ha reportado en Australia y algunas regiones
de América (Boukhris et al., 2013).
5.5.3.3 Caracterización del AE de P. graveolens
La composición metabólica de las plantas suele responder a estímulos del entorno como lo
son las condiciones climáticas y la disposición de recursos en el medio; por lo que si bien se
estima que coincidan los perfiles cromatográficos de aceites esenciales extraídos de la misma
especie vegetal y diferentes muestra, suelen encontrarse algunas variaciones en cuanto al
porcentaje del grupo de metabolitos en los AE (Kumar, Ram, Naqvi, Verma, & Patra, 2005).
En la región del Himalaya occidental - India, se realizó un estudio comparativo para estimar la
variación de la composición del AE en diferentes estaciones del año, encontrando porcentajes
y composición metabólica de geraniol (11,9–31,9%), citronelol (16,1–30,2%), formiato de
citronelilo (5.2–8.9%), linalool (3.7–6.4%), isomenthone (4.0–6.3%), 10-epi-γ-eudesmol (4.4–
5.2%) y formiato de geranilo (4.3–5.0%). Los AE con mayor contenido de geraniol fueron
28
extraídos en temporadas del año con altos periodos de precipitación y en periodos de invierno
se evidenciaba un aumento de citronelol. La proporción del resto de metabolitos fue estable en
el transcurso del año (Verma, Ur Rahman, Verma, Chauhan, & Singh, 2013).
En la investigación dirigida por Birendra Kumar en Pantnagar-India se determinó que la
composición del aceite esencial de P. graveolens obtenido a partir de material vegetal fresco
corresponde a citronelol (35.4%), geraniol (20.2%), formiato de citronelilo (9.4%), iso-
menthone (7.3%),10-epi-γ-eudesmol (6,5%), linalol (3,2%), formiato geranilo (2,7%) y tiglato
de geranilo (1,2%). Composición que al compararse con muestras extraídas 2, 3, 4 y 5 días
después de su recolección presenta variación sistemática con disminución en el porcentaje de
citronelol y un aumento del porcentaje de geraniol (Kumar et al., 2005).
De acuerdo a las investigaciones anteriores, la composición de los AE’s de P. graveolens es
sensible a factores como el clima y la diferencia de tiempo entre: la recolección de la especie
y su posterior extracción del AE.
Así mismo, A nivel mundial se han realizado distintas caracterizaciones del AE en cuestión,
por lo que en la tabla 05 se encuentra un comparativo de la composición de los metabolitos
volátiles presentes en el AE de P. graveolens obtenido por hidrodestilación convencional e
hidrodestilación asistida de microondas (MWHD).
Tabla 5. Comparativo de componentes de P. graveolens de diferente procedencia. Tomado de
Jaramillo & Pinto, 2017
Componente mayoritario
Cantidad relativa (%)
Tunesa, 1 Brasila, 2 Tayikistana,3 Colombiab, 4
Geraniol 30,6 42,3 6,0 14,9
Citronelol 15,2 15,6 37,5 7,5
Linalool 7,3 16,4 3,0 2,90
Formiato de citronelilo 12,6 - - 8,4
Formiato de geranilo 5,6 - 2,0 3,2
10-epi-γ-eudesmol 6,0 - - 0,07
6-9-guaiadieno - - - 7,4
a Aceite obtenido por hidrodestilación; b Aceite obtenido por MWHD
29
6. METODOLOGÍA
El estudio se desarrolló en tres etapas principales y la figura 8 muestra el proceso.
I) Caracterización física y química del AE de P. graveolens,
II) Evaluación de las posibles alteraciones físicas y químicas de la celulosa por
tratamientos con el AE y
III) Evaluación de la respuesta biocida del AE sobre el papel.
6.1 CARACTERIZACIÓN FISICA Y QUÍMICA DEL AE DE P. graveolens
6.1.1 Recolección del material vegetal
La especie fue adquirida entre los meses de febrero y marzo de 2018 en la Plaza de hierbas
Samper Mendoza ubicada en la localidad de Mártires en Bogotá. El material vegetal que fue
comprado proviene de un cultivo ubicado en la vereda la balsa vía Guaymaral del municipio de
Chía, Cundinamarca.
6.1.1.1 Identificación de la especie
La identificación del material botánico se realizó en el Herbario Forestal “Gilberto Emilio
Mahecha Vega” (Facultad de Medio Ambiente, UDFJC) atendiendo a la guía de procesamiento
(secado y cuarentena) y el sistema de clasificación APG III (2009).
6.1.2 Preparación del material
Los tallos y las hojas fueron separados de la especie vegetal de manera selectiva. Acorde con
los resultados de Jaramillo & Pinto 2018, en el presente trabajo solo se emplearon las hojas,
las cuales fueron extendidas y secadas a la sombra durante periodos de tiempo de ocho (8)
días a una temperatura ambiente de 18 ± 2 °C.
6.1.2.1 Determinación del % de humedad de la muestra de P. graveolens
La determinación de la humedad relativa de la especie se realizó empleando la ecuación 1
considerando una cantidad determinada del material vegetal, el cual fue pesado en estado
fresco (peso inicial) y seco (peso final).
% Humedad relativa =Peso final (g)
Peso inicial (g)∗ 100
6.1.3 Extracción de los AE(s)
Se trabajó con el material seco; éste se pesó y se dispuso en un balón de fondo plano con
capacidad de 3L el cual fue ajustado al equipo de destilación por arrastre de vapor del
Laboratorio de Investigación de Fitoquímica de la UDFJC, siguiendo la metodología descrita
por Silva y Téllez (2013). Al obtener el aceite, éste se secaba sobre sulfato de sodio anhidro
(Na2SO4) MERK G.A. y se colectaba en viales de vidrio sellados herméticamente para
almacenarnos a -5°C hasta su eventual uso.
(1)
30
Figura 8. Metodología experimental de trabajo
I) C
arac
teri
zaci
ón
fis
ica
y q
uím
ica
del
ae
de
P. g
rave
ole
ns
Recolección de material vegetal
Identificación de la especie
Preparación del materialDeterminación del (%)
Humedad
Extracción de los AE(s)
Determinación del (%) de Rendimiento
Determinación de constantes físicas
Caracterización química por CG-EM*
Preparación de las muestras
Cuantificación por patrón interno
Analisis de la composición química
II) E
valu
ació
n d
e la
s p
osi
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cio
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fís
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y q
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icas
de
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celu
losa
po
r tr
atam
ien
tos
con
el A
E.
Identificación de las fibras, gramaje y calibre del papel
Jaramillo & Pinto, 2017
Determinación del pH
Cuantificación de Azucares reductores
Selección del método
Método de Dubois
Método del ácido sulfurico UV
Cuantificación
Evaluación del cambio de tonalidad
III)
Eval
uac
ión
de
la r
esp
ues
ta b
ioci
da
del
AE
sob
re e
l pap
el.
Cultivo de microrganismos y preparación del consorcio
Preparación de muestras de papel
Inoculación de la muestra de papel
Preparación de la solución del AE
Tratamiento de las muestras de papel con la solución del
AE
Evaluación de la acción microbicida.
31
6.1.3.1 Determinación del % de rendimiento
El porcentaje rendimiento de AE se calculó a partir de la ecuación 2, que relaciona el volumen
de aceite obtenido con el peso del material vegetal seco antes de la extracción.
% Rendimiento =Masa del aceite (kg)
Masa vegetal (kg)∗ 100
6.1.3.2 Determinación de constantes físicas
Índice de refracción: Se determinó en un refractómetro ABBE AE4 disponiendo en el
equipo una gota del AE previamente extraído.
Densidad: Se pesó un tubo Eppendorf tanto vacío como con un contenido de 500µL en
una balanza analítica AYD Co. Ltd Gr-200. Su determinación finalmente, relaciona la
ecuación 3
Densidad =Masa (𝑔𝑎𝑐𝑒𝑖𝑡𝑒+𝑒𝑝𝑝𝑒𝑛𝑑𝑜𝑟𝑓 − 𝑔𝑒𝑝𝑝𝑒𝑛𝑑𝑜𝑟𝑓)
Volumen de aceite
Los ensayos para la determinación de constantes físicas fueron realizados por triplicado.
6.1.4 Caracterización química por CG-EM
El equipo empleado para este análisis fue un cromatógrafo de gases SHIMADZU ref. QP2010-
plus acoplado a un espectrómetro de masas con corriente de ionización electrónica de 70 eV,
analizador de masas cuadrupolar y espectros de masas de la librería interna del equipo (NIST
08).
6.1.4.1 Preparación de muestras
En un vial de vidrio se dispuso de una alícuota de 50µL del AE, 1µL de n-tetradecano y 949µL
de cloroformo MERK G.A.
6.1.4.2 Condiciones cromatográficas
Se empleó una columna Restek ref. RTX 5MS de 25 mm x 0,25 μm y longitud de 60m de
referencia con fase estacionaria 95% de dimetilpolixiloxano y 5% de difenil.
El tipo de inyección fue Splitless a una temperatura de 250°C con un tiempo de muestreo de 1
minuto a presión de 132,4 kPa, el flujo total fue de 16.2 mL min-1 y el flujo de la columna fue
de 1.20 mL min-1. La rampa de temperatura del horno se ajustó como se indica en la tabla 06.
Tabla 6. Rampas de temperatura del cromatógrafo
Velocidad Temperatura (°C) Tiempo de espera (min)
0.0 40 5.00
4.00 160.0 0.00
2.5 220.0 0.00
8.00 280.0 4.00
(2)
(3)
32
6.2 EVALUACIÓN DE LAS POSIBLES ALTERACIONES FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LA
CELULOSA POR TRATAMIENTOS CON EL AE de P. graveolens
6.2.1 Identificación de la muestra de papel empleada
La caracterización de las fibras responde a la metodología y los resultados obtenidos por
Jaramillo y Pinto 2017 dadas las consideraciones en marco del proyecto “Estudio de aceites
esenciales a partir de especies vegetales promisoras, como posibles productos del control del
biodeterioro del Patrimonio bibliográfico Colombiano”.
6.2.1.2 Preparación de muestras
Los análisis fueron realizados en un grupo de 16 muestras de papel con longitudes de 19 x
3.8 cm, las cuales fueron obtenidas de los marcos de un libro seleccionado del Laboratorio de
Conservación de la BNC. Las muestras fueron clasificadas en 4 grupos para los posteriores
análisis los cuales corresponden a: A) Control, B) Control + aceite, C) Envejecido y D) Solución
de AE + Envejecimiento. Los grupos B y D fueron humedecidos con 1mL de una solución
previamente preparada al 1% del AE en etanol al 75% y para los grupos C y D se realizó un
envejecimiento acelerado en un horno a una temperatura de 80°C durante un periodo de 72
horas.
6.2.2 Determinación de pH
El pH de las muestras de papel (grupos A, B, C y D) se determinó con un pH-metro HANNA
HI5221 con electrodo de punta plana a una temperatura ambiental de 20,3°C. Para el ensayo
se humedeció el electrodo con agua destilada y se dispuso sobre la superficie en 5 puntos de
las probetas de papel seleccionado, siguiendo la metedelogia descrita en la Norma NTC 4849.
6.2.3 Cuantificación de azúcares reductores
6.2.3.1 Selección del método para la cuantificación de azúcares
Preparación de muestras (Extracción de azúcares)
Se pesó una muestra de 1,496g de papel carta Reprograf de caña de azúcar y 1,503g de papel
periódico comercial, los cuales se cortaron en pequeños trozos (2x2 mm) en un beaker’s de
50mL. Posteriormente se adicionó 25mL de una solución previamente preparada 8:2 agua
desionizada/metanol. Con la ayuda de un agitador horizontal Shaker Thermo Scientific, se
sometió a agitación constante durante un periodo de 24 horas. Finalmente los productos fueron
filtrados y diluidos 1:1 como Sln azúcares A y Sln azúcares B respectivamente.
Preparación del patrón de azúcares
Se pesaron 20mg de glucosa (MERK G.A.) en una balanza analítica AYD Co. Ltd Gr-200 la
cual fué llevados a un volumen de 100mL en un balón aforado (Solución patrón). A partir de
esta solución se realizaron diluciones de tipo directas como se indica en la tabla 07.
33
Tabla 7. Concentración final de la dilución directa del patrón de azúcar.
Volumen (mL)
Solución Relación Stock-Agua
Cf (mg/mL)
STOCK (100) 0 - 0,2
100 1 4:6 0,08
10 2 3:7 0,06
10 3 2:8 0,04
10 4 1:9 0,02
10 5 0.5:9.5 0,01
Método de Dubois
Se dispuso de 8 tubos de ensayo a los que se les adicionó 1 mL de las soluciones 1, 2, 3, 4,
5, Sln A, Sln B y agua destilada respectivamente. Posteriormente a cada tubo se adicionó
0.5mL de fenol 5% e inmediatamente 2.5mL de ácido sulfúrico (MERK G.A.), acto seguido se
agito durante 30 segundos y se dejó en reposo durante 10 minutos. Transcurrido el tiempo se
sumergió en un baño de agua a temperatura ambiente durante 20 minutos (López et al., 2017).
Una vez se cumplieron los 30 minutos se realizó un barrido espectrofotométrico de las
soluciones en celdas de vidrio y con longitudes de onda de 400 y 700nm (visible) en el equipo
Shimadzu UV-Vis 1800.
Método del ácido sulfúrico-UV
Se dispuso de 8 tubos de ensayo a los que se les adicionó 1 mL de las soluciones 1, 2, 3, 4,
5, Sln A, Sln B y agua destilada respectivamente. Posteriormente a cada tubo se le adicionó
3mL de ácido sulfúrico (MERK G.A.) y se sumergió en un baño con hielo durante dos minutos.
Se realizó un barrido espectrofotométrico de las soluciones en celdas de cuarzo y con
longitudes de onda entre los 200 y 400nm (UV) en el equipo Shimadzu UV-Vis 1800.
6.2.3.2 Determinación de azúcares reductores
Acorde con los resultados previos, se seleccionó el método de Dubois (6.2.2.1) para la
cuantificación de los azúcares reductores en las probetas de papel. El procesamiento de las
muestras (grupos A, B, C y D) se realizaron acorde a la metodología descrita en el apartado
6.2.1 y el respectivo análisis, siguiendo la metodología del apartado 6.2.2.
6.2.4 Evaluación de la tonalidad
La evaluación de la tonalidad fue realizada en los 4 grupos de muestras de papel anteriormente
mencionados, al disponer sobre ellos un colorímetro de contacto marca BYK spectro-guide
45/0 gloss, siguiendo el protocolo descrito por Rodríguez, 2015. Los ensayos fueron realizados
por pentaplicado (5 veces) registrando valores en las coordenadas CIE L*a*b*.
34
A partir del protocolo descrito en el Anexo 3, se realizan las conversiones del sistema CIE
L*a*b* al sistema CIE L*C*h* y al sistema CIE XYZ. Los valores obtenidos se ubicaron con
ayuda del Software Origin 2018b de 64 Bit y la plantilla de diagrama de cromaticidad tanto en
el espacio cromático en CIE 1931 como en el diagrama de CIE 1976 UCS (escala de
cromaticidad uniforme) y con ayuda de la Rueda cromática de Adobe Color CC.
6.3 EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA BIOCIDA DEL AE SOBRE EL PAPEL
Los ensayos de actividad microbicida del AE de P. graveolens fueron realizados bajo la
dirección de la coordinadora del laboratorio de Ciencias, Bacterióloga MSc. Luz Stella Villalba
Corredor, siguiendo el protocolo del Laboratorio de la Biblioteca Nacional de Colombia, Fase
II: Evaluación de Consorcio Microbiano (Villalba & Patiño, 2011).
6.3.1 Cultivo de microrganismos y preparación del consorcio
Se realizó el cultivo de los microrganismos Bacillus subtilis: BDM7, Rhodotorula mucilaginosa:
LRVIAL15, Aspergillus sp: AspAM5, Penicillium sp: PDM1 y Stachybotrys sp: STACHYHD322
Las condiciones del cultivo fueron:
Tipo de siembra: Hongos por medio de plugs; bacterias y levadura por técnica de agotamiento
en superficie.
Medio de cultivo: PDA (Papa Dextrosa Agar Difco®)
Temperatura: Ambiente
Tiempo de crecimiento: Hongos (7 días), bacterias y levaduras (2 días).
El consorcio microbiano se preparó a patir de 3 mL de cada microorganismo, considerando el
tubo No 3 de la escala de turbidez de McFarland para la bacteria y levadura y para los hongos
el inóculo a 108 conidias/mL. Los 15 mL se agregaron a 35mL de solución salina estéril para
completar un volumen de 50mL, el cual fue utilizado como el consorcio microbiano final.
6.3.2 Preparación de muestras de papel
Se extrajeron 24 muestras de papel con longitudes de 2*4cm, las cuales fueron obtenidas de
las márgenes de las hojas de un libro del siglo XVIII seleccionado del Laboratorio de
Conservación de la BNC. Las muestras fueron esterilizadas en autoclave a 121ºC y 15psi.
6.3.3 Inoculación de la muestra de papel con el consorcio microbiano
Se empleó un consorcio microbiano para la inoculación el soporte, con el fin de semejar las
condiciones reales de biodeterioro causada por microrganismos
Las muestras de papel fueron clasificadas como: 1. muestras para el tratamiento con el aceite
(18), 2. Control positivo (3) y 3. Control negativo (3). Los grupos de muestras 1 y 2 fueron
inoculados con el consorcio de microorganismos por el método de inmersión en cabina de
bioseguridad, se dispusieron de a tres muestras en las cajas de petri estériles y se dejaron a
temperatura ambiente. Diariamente se adicionaban 150mL de agua estéril sobre la probeta
para facilitar la inducción del biodeterioro.
35
6.3.4 Preparación de la solución del AE
Se preparó la solución del AE de P. graveolens al 1% tomando 0.1mL del AE obtenido del
apartado 6.1.3: Extracción de los AE(s) (pág. 30) y se llevó a volumen del 10mL de EtOH al
75%.
6.3.5 Tratamiento de las muestras de papel con la solución del AE
Las muestras correspondientes a los grupos 1 y 3 se humedecieron completamente con 150µL
de la solución del AE de P. graveolens al 1%.
6.3.6 Evaluación de la acción microbicida.
Las muestras fueron sometidas a dos técnicas de cultivo para comprobar la eficacia del AE:
siembra en superficie y técnica de los 25 puntos de inoculación.
A. Siembra de superficie
Las 24 muestras correspondientes a los grupos 1, 2 y 3 fueron dispuestas una a una en
erlemeyers de 25mL con agua destilada estéril. Posteriormente se agitó vigorosamente
en vortex por 30 segundos. Los productos fueron clasificados como Solución SS1, 2 y
3 y Muestras MP1, 2 y 3 (muestras de papel). De la solución SS (agua del Erlemyer) se
tomaron 500µL y se sembraron en superficie en medio PDA. Las muestras se incubaron
a temperatura ambiente.
B. Técnica de 25 puntos
De las muestras MP1, 2 y 3, se tomaron 25 pequeños fragmentos los cuales fueron
sembrados en cajas de Petri con medio de cultivo PDA en una disposición de 5 x 5 con
a una distancia de 1cm entre sí para su incubación.
Debido al tiempo de crecimiento que presenta los diferentes microorganismos que
posiblemente se encontrarían, se evaluaron los resultados a 3, 6 y 10 días. La verificación de
crecimiento a nivel macroscopico de los microrganismos; seria realizada de acuerdo a las
siguientes características morfológicas (Inf. Laboratorio de Ciencias. Cepario):
BDM7: Colonia plana de coloración blanca con producción de pigmento al medio de color marrón.
No produce exudados y su borde es irregular.
LRVIAL15: Colonia elevada brillante de coloración rosa y sin producción de pigmento al medio. Su
borde es regular
AspAM5: Hongo xerófilo de coloración blanca, su centro es verde y no produce pigmento en el
medio. Su textura es aterciopelada, tiene exudados traslucidos y sus bordes son
regulares.
PDM1: Colonia de coloración verde oscuro sin la producción de pigmento al medio, su textura es
aterciopelada y sus bordes son irregulares
STACHYHD322: Colonia de coloración negra o café con producción de pigmento al medio de color café,
su textura es aterciopelada, tiene exudados marrones y sus bordes son irregulares
36
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
7.1 CARACTERIZACIÓN FISICA Y QUÍMICA DEL AE DE P. graveolens
7.1.1 Recolección del material vegetal
La especie fue adquirida en la Plaza de hierbas Samper
Mendoza ubicada en la localidad de Mártires en Bogotá,
y las indicaciones del proveedor que ha sido constante a
lo largo del proyecto muestran que la recolección de la
especie Pelargonium graveolens se llevó a cabo en la
vereda La Balsa del municipio de Chía, Cundinamarca
en las coordenadas geográficas 4°50’34.7’’N
74°04’23.7’’W entre los meses de febrero y marzo de
2018 (figura 09).
Figura 9. Zona de cultivo del material vegetal adquirido
7.1.1.1 Identificación del material
La identificación taxonómica de la especie se realizó en el Herbario Forestal UDBC (Facultad
de Medio Ambiente, UDFJC) a cargo de Lyndon Carvajar Rojas. La especie identificada
corresponde a Pelargonium graveolens L'Hér. ex Aiton (Consular Anexo 2)
7.1.2 Determinación del % de humedad de la muestra de P. graveolens
El porcentaje de humedad relativa de la especie corresponde al 75% de su peso. Resultado
semejante al reportado por Jaramillo y Pinto 2017 el cual fue del 78.5%. Las variaciones del
porcentaje de humedad son atribuidas a los distintos indices de precipitación en el municipio
de Chía en los meses de recolección de la especie.
7.1.3 Extracción del AE de P. graveolens: Caracterización fisica
Se realizó un total de 5 extracciones de AE(s) de la especie vegetal Pelargonium graveolens
(Geraniaceae) cuyas caracterizaciones se encuentran acontinuación:
7.1.3.1 Determinación del % de rendimiento
La coloración del AE es verde palido. En la tabla 08 se pueden encontrar los respectivos
porcentajes de rendimiento. El promedio del porcentaje correspondio a 0.43% el cual se
asemeja a lo reportado por Jaramillo & Pinto 2017.
37
Tabla 8. Extracciones de P. graveolens
7.1.3.2 Determinación de constantes físicas
Los ensayos para la determinación de los índices de refracción y densidad del AE se realizaron por triplicado, obteniendo así los resultados consignados en la tabla 09. Tabla 9. Constantes físicas del aceite esencial P. graveolens
Tipo de ensayo: T de 18 ± 2 °C. Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3 Promedio
Índice de refracción 1.468 1.469 1.468 1.468
Densidad (g/mL) 0.908 0.911 0.911 0.910
El AE de P. graveolens obtenido presenta un índice de refracción de 1.468 y una densidad de
0.910 g/mL a 18 ± 2 °C, presentando concordancia con las constantes físicas expuestas por
Jaramillo & Pinto 2017 quienes reportan valores de 1.465 y 0.914 en las mismas condiciones,
y la casa comercial Sigma-Aldrich informa que el índice de refracción del AE es de 1.493 y su
densidad es de 0.887 g/mL a 25°C (Sigma-Aldrich, 2018).
El índice de refracción del AE obtenido (1.468) es cercano al índice de refracción del AE
comercial (1.463) y las diferencias posiblemente se deben a factores como la temperatura, el
lugar de recolección de las muestras y las condiciones en las que se extrajeron los aceites.
Para el presente estudio, se realizó la extracción con material vegetal seco, recolectado en el
municipio de Chía de igual forma que en la investigación desarrollada por Jaramillo y Pinto
2017, lo que permite asociar la similitud de los resultados (Reichert Technologies, n.d.).
Por su parte, las diferencias entre las densidades de los AE experimentales y el AE comercial,
se puede deber principalmente a la variación en la temperatura, la cual es inversamente
proporcional a la densidad como podemos apreciar al comprar las condiciones en las que se
realizaron las mediciones.
7.1.4 Caracterización química por CG-EM
La caracterización cromatografica de la especie vegeral P. graveolens responde a los intereses
del proyecto titulado “Estudio de aceites esenciales a partir de especies vegetales promisoras,
como posibles productos del control del biodeterioro del Patrimonio bibliográfico Colombiano”;
por lo que el reporte anexo (Tabla 10 y figura 10) responde a los resultados cromatograficos
de Jaramillo y Pinto 2017 enmarcados en el mismo proyecto dado a que por problemas de
disponibilidad del equipo, no fue posible repetir este análisis en el actual trabajo.
Fecha de extracción
Órgano empleado
Masa vegetal (g)
Volumen obtenido (mL)
Masa obtenida (g)
% de rendimiento
11-04-18 Hojas-secas 318.4 1.6 1.46 0.46
12-04-18 Hojas-secas 277.0 1.4 1.27 0.46
18-04-18 Hojas-secas 310.6 1.4 1.27 0.41
19-04-18 Hojas-secas 293 1.2 1.10 0.38
26-04-18 Hojas-secas 296 1.4 1.27 0.43
38
Tabla 10. Compuestos identificados en el aceite esencial P. graveolens. Recuperado de
Jaramillo & Pinto 2017
Señal NOMBRE % AREA CONC. ppm CLAS. IR
TEORICO IR
EXPERIMENTAL
1 α-Pineno 0,48 29 M* 939 933
2 β-Mirceno 0,47 29 M 991 987
3 α-Felandreno 0,3 18 M 1005 1005
4 Limoneno 0,41 25 M 1031 1021
5 β-cis-Ocimeno 0,4 25 M 1040 1035
6 Cis-Sabineno 0,43 26 M 1068 1043
7 β-Linalool 6,11 374 MO* 1098 1097
8 p-Mentona 4,17 255 MO 1154 1149
9 α-Terpineol 0,85 52 MO 1189 1181
10 β-Citronelol 10,51 644 MO 1228 1229
11 Trans-Geraniol 29,99 1837 MO 1255 1255
13 α-Citral 0,66 40 MO 1270 1263
14 2-Undecenal 0,31 19 AC* NR 1338
15 Neril acetato 0,78 48 E* 1365 1356
16 Ácido Decanoico 2,38 146 AC NR 1353
17 β-Elemeno 0,36 22 S* 1375 1481
18 α-Copaeno 0,46 28 S 1376 1365
19 Acetato geranilo 2,94 180 E 1383 1380
20 β-Bourboneno 0,62 38 S 1384 1381
21 (-)-Aristoleno 4,4 270 S 1416 1415
22 Cariofileno 0,3 18 S 1418 1407
23 Neril propionato 1,64 100 E 1454 1447
24 Germacreno D 1,42 87 S 1480 1478
25 α-Bulneseno 0,52 32 S 1505 1419
26 γ-Cadineno 0,49 30 S 1513 1514
27 δ-Cadineno 0,31 19 S 1524 1531
28 Geranil butirato 0,65 40 E 1562 1567
29 Fenil etil tiglato 1,32 81 E 1584 1597
30 γ-Eudesmol 2,64 162 SO* 1630 1628
31 Geranil tiglato 2,67 164 E 1700 1697
Tabla 11. Abundancia y clasificación de compuestos mayoritarios del AE de P. graveolens
* TIPO DE COMPUESTO MAYORITARIO # %
M MONOTERPENOS 6 2.49
MO MONOTERPENOS OXIGENADOS 6 52.29
S SESQUITERPENOS 9 8.06
SO SESQUITERPENOS OXIGENADOS 1 2.64
E ESTERES 6 10
AC ACIDOS 2 2.69
39
Figura 10. Cromatograma del AE de P. graveolens en las condiciones de estudio.
Se identificó que el 78.99% del aceite esencial estaba conformado por 30 compuestos (la señal
12 correspondía al patrón interno); y si bien se evidencio en la composición del aceite, un grupo
de 6 monoterpenos, 6 monoterpenos oxigenados, 9 sesquiterpenos, un sesquiterpeno
oxigenado, 6 ésteres y 2 ácidos (ver tabla 11); los monoterpenos oxigenados son el grupo más
representativos en la composición del aceite, conformando así el 52.29% del AE y del cual el
29.99% es trans-geraniol, el 10.51% β-citronelol y el 6.11% linalool (Jaramillo & Pinto, 2017).
Al analizar los resultados y en concordancia con la investigación de Birendra Kumar, se
observa que el porcentaje de trans-geraniol es mayor al de β-citronelol, esto debido a que los
AE fueron extraídos en una fecha post recolección del material vegetal (Kumar et al., 2005).
Ahora bien, bajo las consideraciones del apartado 5.5.3.3 sobre la caracterización del AE de
P. graveolens (pág. 27), se asume que el grupo de metabolitos que se encuentra en el AE
obtenido en la presente investigación es similar al grupo de metabolitos que fueron
encontrados en la investigación realizada por Jaramillo & Pinto 2017. Y, que las posibles
diferencias metabolicas que se pudieran presentar, corresponderian a variaciones mínimas en
el porcentraje de abundancia de cada uno de los contituyentes del AE, debido a que factores
como el lugar de procedencia de la muestra y el estado en que fue extraida (seca) responden
a la misma metodología.
40
7.2 EVALUACIÓN DE LAS POSIBLES ALTERACIONES FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LA
CELULOSA POR TRATAMIENTOS CON EL AE
7.2.1. Caracterización general del soporte de papel
Las muestras de papel utilizado en la investigación fueron seleccionadas de un documento
que como se caracteriza en la tabla 12 corresponde a papel elaborado manualmente a
mediados del siglo XVIII. En la figura 11 se muestra el documento, el cual presenta marcos
amplios sin información consignada; las muestras fueron tomadas de allí con el fin de no alterar
su propiedad intelectual. Además de esto, la elección del material se realizó debido que este
no responde a los parámetros de documento patrimonial consignados en el apartado 5.1.1
del marco legal colombiano (pág. 6-7), donde la ley 594 del 2000 considera que un documento
patrimonial contribuye a la historia y cultural nacional y la ley 1379 del 2010 que amplia esta
definición a la construcción de identidad nacional. Sin embargo la muestra seleccionada es
catalogada como un soporte patrimonial dada su procedencia y su tipo fabricación.
Tabla 12. Descripción de la muestra de papel estudiada
Descripción
Fecha de elaboración Medidados del siglo XVIII
Generalidades Coloración amarilla con signos de oxidación en los bordes
Gramaje 71,597 g/m2
Calibre 0,273 mm
Tipo de Fibra Papel manual con fibras alargadas, cortas, estriadas con
líneas transversales y dobleces en forma de cinta con
canales estrechos, características de fibras de lino y
algodón
Procedencia Pulpa de trapo
Figura 11. Libro en proceso de restauración de la BNC
41
7.2.2 Evaluación del nivel de pH
El pH de la muestra de papel patrimonial y los grupos de probetas tratadas A) Control, B)
Control + aceite, C) Envejecido y D) Solución de AE + Envejecimiento. El ensayo se realizó a
una temperatura de 20.3°C y los resultados son consignados en la tabla 13
Tabla 13. Resultados medición del pH del grupo de papel patrimonial con respectivos tratamientos.
Muestra 1 2 3 4 5 Prom.
Control 6.73 6.67 6.96 6.67 6.68 6.74
Control + AE 6.49 6.69 6.51 6.60 6.65 6.58
Envejecido 7.44 7.35 7.40 7.37 7.49 7.41
Envejecido + AE 6.96 6.85 6.95 6.82 6.61 6.83
El nivel de pH del papel depende del contenido de agua en las muestras y el grado de oxidación
del mismo; la adición de AE de P. graveolens al 1% en EtOH al 75% provoca una ligera
disminución en la escala de pH, como se puede observar en la tabla 13. Esta variación se
considera baja y posiblemente se deba a la interacción celulosa-agua con el solvente, el cual
podría cambiar el equilibrio y la cantidad de agua en la celulosa, como consecuencia de la
polaridad del solvente, el cual puede acaparar el agua al formar puentes de hidrogeno,
favoreciendo la volatilización de moléculas de agua en la muestra, y provocando así el
aumento en el nivel de acidez en el soporte (Calderón Delgado, 2008).
En cuanto a la variación de los niveles de pH provocados por el proceso de envejecimiento
acelerado, se denota un aumento de alcalinidad en la muestra (de 6.74 a 7.41). Estos
resultados se encuentran en contradicción al ser comparados con lo reportado por Jaramillo y
Pinto 2017, quienes evidencian un aumento en la acidez en los soportes a casusa del proceso
de envejecimiento para este mismo tipo de muestras (de 6,75 a 6,54). El resultado se considera
anómalo ya que por el mismo proceso de envejecimiento acelerado, en el cual se someten las
muestras a una temperatura de 80°C en un horno por un periodo de 72 horas, se esperaría
que los niveles de agua disminuyan y aumenten los niveles de acidez. Sin embargo la
heterogeneidad de las muestras de PAPEL ARTESANAL, las cuales si bien proceden del
mismo libro, no lo hacen de la misma hoja; pueden ser los causantes de los valores observados
y el comportamiento que presento.
7.2.3. Cuantificación de azúcares reductores
Para la cuantificación de los azúcares reductores, se realizó una comparación de dos métodos
debido a que, en los anteriores marcos del proyecto, se ha encontrado limitaciones
experimentales para el método de Dubois por el rango de concentración para los valores en la
curva de calibración (Jaramillo & Pinto, 2017) y la posible sulfonación del fenol (López et al.,
2017).
42
Sobre el método de Dubois, se busca disminuir el rango de concentración para la detección y
con el método del ácido sulfúrico-UV se quiere observar el comportamiento que se presenta
en ausencia del fenol. De acuerdo a López, el método de ácido sulfúrico-UV es más óptimo
por la estabilidad de los complejos de HMF formados en la reacción del azúcar con el ácido y
su capacidad de absorber en el espectro UV (López et al., 2017).
7.2.3.1 Selección del método para la cuantificación de azúcares
Curva de calibración método del fenol sulfúrico (Dubois): A continuación se presenta el
barrido espectrofotométrico de 400 a 700nm y los máximos de absorbancia (490nm) realizado
en el equipo Shimadzu UV/VIS 1800 para cada una de las diluciones preparadas en el apartado
6.2.2 (Ver figura 12).
Figura 12. Barrido espectrofotométrico de soluciones de glucosa (0.01, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 mg/mL)
en fenol-ácido sulfúrico a longitudes de onda de 400 a 700 nm.
Se realizó la respectiva regresión lineal (figura 13),
con la curva de calibración obtenida y se calculó el
valor de R en 0,99577. Considerando la ecuación de
Ley de Beer-Lambert se determinó que la
concentración para la solución A es de 0.01695
mg/mL (0.2399 mg/g papel) y para la solución B es
de 0.02675 mg/mL (0.4097 mg/g papel).
A partir de los resultados anteriores, es posible destacar que la muestra de papel procedente
de Sln B presenta un mayor contenido azúcares reductores en relación con Sln A. Estas
variaciones responden a los procesos de elaboración del papel para ambas muestras
(apartado 5.2.1 de historia pág. 8 y 5.2.3 de composición química pág 13), debido a que la Sln
A proviene de fibras de caña de azúcar con altos grados de polimerización en la celulosa y Sln
B proviene de procesos de reciclaje en los que se encuentran diferentes fuentes de celulosa y
Figura 13. Curva de calibración y regresión lineal.
0
0,5
1
1,5
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
43
cuya estabilidad dimensional sería menor dada la fracturación de la celulosa en el momento
de la elaboración de este soporte, causando que las que las fibras se encuentren en menores
grados de polimerización y cuente con un mayor contenido de azúcares reductores tal como
se evidencia (Melorose et al., 2015).
Curva de calibración método del ácido sulfúrico – UV: A continuación se presenta el barrido
espectrofotométrico de 200 a 400nm y los máximos de absorbancia (315 nm) realizado en el
equipo Shimadzu UV/VIS 1800 para cada una de las diluciones preparadas en el apartado
6.2.2 (Ver figura 14).
Figura 14. Barrido espectrofotométrico de soluciones de glucosa (0.01, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08
mg/mL) en ácido sulfúrico a longitudes de onda de 200 a 400 nm
Se realizó la respectiva regresión lineal (figura 15), con
la curva de calibración obtenida y se calculó el valor de
R en 0,92525. Dadas las variaciones en medida de la
absorbancia para esta región, el método no se
considera para la evaluación de azúcares reductores en
muestras de papel.
Figura 15. Curva de calibración y regresión lineal.
Al observar los resultados del barrido espectrofotométrico en la curva de calibración por el
método del ácido sulfúrico-UV, se denota: 1. Señales de ruido por el alto contenido de enlaces
dobles y pares de electrones libres que presenta la molécula de hidroximetil furfural (HMF)
formada por la reacción (Retomar anexo 1), y 2. Un efecto hipercrómico e hipocrómico de
variación en la intensidad de la absorbancia, el cual podría estar asociado a los cambios en la
concentración de las muestras, lo que cuestionaría la sensibilidad de este método en la
cuantificación de azúcares (Universidad de Granada, 2004).
44
De igual forma, al llevar este método a la cuantificación de azúcares en soportes de papel, es
necesario considerar que por la reacción de deshidratación de azúcares con ácido sulfúrico
(Retomar anexo 1) se formaría tanto HMF proveniente de la deshidratación de los
constituyentes de la celulosa, como algunos derivados del HMF provenientes de las
hemicelulosas en el papel, por ejemplo el Hidroxifurfual (HF) que se forma por la deshidratación
de pentosas. Las diferencias estructurales en los productos formados ocasionarían efectos
batocrómicos y/o hipsocrómicos (variación de la longitud de onda de máxima de absorción);
como consecuencia de los diferentes sustituyentes en los productos en la reacción; se
entorpecen los procesos de cuantificación (Universidad de Granada, 2004).
Pese a que el tratamiento de las muestras para el método de Dubois y ácido sulfúrico-UV en
la determinación de azúcares se realizó en las mismas condiciones como lo sugieren los
autores López, Taramuel, Arboleda, Segura, & Restrepo, 2017, se encuentra que es necesario
replantear los rangos de concentración de la curva de calibración y evaluar sensibilidad del
método ácido sulfúrico-UV, como también es necesario considerar que para el tipo de muestras
con alta complejidad en el contenido metde azúcares, se enmascararían los resultados por el
método del ácido sulfúrico-UV, presentando un mayor número de limitaciones en el ensayo.
Finalmente, con los cambios realizados en la concentración de las muestras por el método de
Dubois se logró observar una respuesta confiable en la lectura de las muestras desconocidas,
y al controlar el orden y los tiempos en la adición de los reactivos (adición de fenol a la muestra
de azúcar e inmediatamente después el ácido sulfúrico) se disminuye la posibilidad de la
sulfonación del fenol. Por lo anterior se selecciona el método de Dubois para la cuantificación
de azúcares reductores en los soportes de papel.
7.2.3.2 Determinación de azúcares reductores
En las tablas 14, 15, 16 y 17 presentadas a continuación se expresan los resultados de la
cuantificación de azúcares reductores en las muestras de papel evaluadas, donde A.
corresponde a la muestra de referencia, B. a la muestra impregnada el AE, C. a la muestra
sometida a envejecimiento acelerado y D. Muestra impregnada el AE y sometida a
envejecimiento acelerado.
Tabla 14. Cuantificación de azúcares reductores en muestra de referencia
A Abs. Papel (g) Azúcares [mg/mL]
70%
Azúcares [mg/mL]
100%
Azúcares [mg/g papel]
1 0,377 0,5123 0,02288 0,03268 0,63792
2 0,382 0,5227 0,02320 0,03314 0,63408
3 0,342 0,4823 0,02061 0,02944 0,61049
Promedio 0,62749
Tabla 15. Cuantificación de azúcares reductores en
muestra impregnada con AE
B Abs. Papel (g) Azúcares [mg/mL]
70%
Azúcares [mg/mL]
100%
Azúcares [mg/g papel]
1 0,599 0,6215 0,03725 0,05321 0,85618
2 0,45 0,5341 0,02760 0,03943 0,73829
3 0,579 0,6514 0,03595 0,05136 0,78849
Promedio 0,79432
45
Tabla 16. Cuantificación de Azúcares reductores en
muestra sometida a envejecimiento acelerado
C Abs. Papel (g) Azúcares [mg/mL]
70%
Azúcares [mg/mL]
100%
Azúcares [mg/g papel]
1 0,649 0,4579 0,04049 0,05784 1,26307
2 0,648 0,5124 0,04042 0,05774 1,12692
3 0,865 0,5873 0,05447 0,07781 1,32491
Promedio 1,2383
Tabla 17. Cuantificación de azúcares reductores en
muestra impregnada con el AE y con
envejecimiento
D Abs. Papel (g) Azúcares [mg/mL]
70%
Azúcares [mg/mL]
100%
Azúcares [mg/g papel]
1 1,472 0,5674 0,09376 0,13395 2,36075
2 1,114 0,5736 0,07059 0,10084 1,75802
3 0,961 0,5232 0,06068 0,08669 1,65693
Promedio 1,70748
*No se considera como dato como confiable
Tabla 18. Concentración de azúcares reductores en muestras de papel
Muestra Azúcares reductores [mg/g papel] Aumento de azúcares (%)*
Referencia 0,62749 -
Con AE 0,79432 26.59
Envejecido 1,23830 97.34
Envejecido + AE 1,70748 172.11
*El % de aumento de los azúcares reductores fue realizado bajo una consideración del 100% de la muestra de referencia
La cuantificación de azúcares reductores evidencia un aumento significativo en las muestras
de papel que fueron impregnadas con el AE (ver tabla 18), evidenciando un aumento del
26.59% de los azúcares reductores con respecto a la muestra de referencia. Dicho aumento
puede deberse a su carácter higroscópico (Ver: Propiedades estructurales: absorción y
humedad relativa pág. 8-9), que le permite absorber el solvente utilizado en la preparación de
AE adicionado (EtOH 75%), lo cual debilita los enlaces entre las fibras de la celulosa, y podría
disminuir su grado de polimerización, facilitando su degradación al aumentar el % de azúcares
reductores en la muestra (Marquerie & Santos, 2015; Melorose et al., 2015).
De igual forma, el proceso de envejecimiento acelerado contribuye en gran medida al aumento
de azúcares reductores en las muestras de papel, ya que como lo vimos en la alteración en
las propiedades ópticas pág. 11 y en la evaluación química del deterioro de la celulosa pág.
20; el suministro de energía requerido para simular el proceso de envejecimiento que sufriría
el papel en 50 años, daría lugar a procesos de lisis que degradarían la celulosa, aumentando
el nivel de azúcares reductores, el cual se puede observar al comparar la muestra de referencia
con la del proceso de envejecimiento acelerado, que provoca un aumento del 97.34% de los
azúcares reductores. Así mismo, cuando se trata de muestras de papel la impregnación del
AE más el envejecimiento acelerado, se suman los efectos que provocarían un aumento de
los azúcares reductores siendo este aumento del 172.11%.
7.2.4 Evaluación colorimétrica (Tonalidad en coordenadas CIEL*a*b*)
Se determinaron los valores de las coordenadas CIEL*a*b* con el equipo Spectro-Guide 45/0
gloss – BYK. Los valores numéricos fueron tratados estadísticamente y posteriormente fueron
evaluados (transformados) en los distintos sistemas de coordenadas para representar las
tonalidades de color. En la tabla 19 se muestran los resultados colorimétricos de las muestras
estudiadas.
46
Tabla 19. Resultados colorimétricos del papel en los sistemas CIE L*a*b* en muestra control
y muestra envejecida
A B C D
L a* b* L a* b* L a* b* L a* b*
88,92 0,74 8,82 88,07 0,92 8,77 88,50 0,97 7,92 88,59 0,8 8,82
88,87 0,77 8,55 87,99 0,88 8,48 88,20 1,02 7,99 87,59 0,84 8,55
88,81 0,78 8,25 88,24 0,88 9,46 87,67 1,15 8,4 88,19 0,81 8,25
88,77 0,84 9,01 88,25 0,87 8,28 88,92 0,89 8,66 87,8 0,95 9,01
88,14 0,82 9,02 87,64 0,93 8,91 88,57 0,92 8,52 87,88 0,99 9,02
�̅� 88,702 0,79 8,73 88,038 0,896 8,78 88,372 0,99 8,298 88,01 0,878 8,73
Para evaluar las variaciones en del color se estima el valor ΔE*=(( L*1-L*2)2 + (a*1-a*2)2+(b*1-
b*2)2 )1/2 (tonalidad); el cual bajo la norma ISO 12647-2 (estándar de impresión); establece que
los umbrales de tolerancia de ΔE inferiores a 1 son de calidad excelente, 1-2 buenos, 2-4
normales, 4-5 suficientes y mayores a 5 malos.
Tabla 20. Variación de tonalidad de color ΔE en las muestras Muestra L a* b* ΔE
Control 88,702 0,79 8,73 -
Envejecimiento 88,372 0,99 8,298 0,58
AE 88,038 0,896 8,78 0,67
AE + Envejecimiento 88,010 0,878 8,73 0,7
Cómo se denota en la tabla 20, las muestras de papel presentan ΔE entre 0.58 y 0.7, lo que
acorde con la norma ISO 12647-2, las variaciones tanto por la aplicación del aceite esencial
como por su envejecimiento acelerado, presentan diferencias apenas perceptibles y su umbral
de tolerancia presenta una calidad excelente.
Los resultados colorimétricos del papel en los sistemas CIE L*a*b* fueron debidamente
transformados a las coordenadas CIE L*C*h* para realizar la debida asignación de los colores
según el registro de Munsell y al sistema x, y & z para su debida ubicación en el espacio. En
la tabla 21 se encuentran los valores de acuerdo a los sistemas anteriormente enunciados.
Tabla 21. Resultados colorimétricos del papel en los sistemas CIE L*C*h* & x, y & z
Sistema L* C* h* Sistema x, y, z
L* C* h* x y z
A 88,702 8,76567168 84,829 0,31861971 0,33463754 0,34674274
B 88,372 8,356847731 83,196 0,31845647 0,33431588 0,34722765
C 88,038 8,825600036 84,173 0,31874157 0,33468282 0,34657561
D 88,01 8,774040346 84,2569 0,31870213 0,33465464 0,34664322
A. Muestra de referencia, B. Muestra impregnada con AE, C. Muestra sometida a envejecimiento acelerado y D.
Muestra impregnada con AE y sometida a envejecimiento acelerado.
Para los resultados anteriores, el grupo de muestras A, B, C y D reciben el nombre Amarillo
blanco débil en la representación de Munsell, con un orden de: 5Y 8/2.
47
A continuación, en la figura 16 se denota el diagrama de cromaticidad en el espacio CIE 1931
y en la figura 17 se denota el diagrama CIE 1976 USC (escala de cromaticidad uniforme)
realizado en el Software Origin 2018b de 64 Bit, en las que se representa la tonalidad de las
muestras evaluadas (OriginLab, Northampton, 2018).
Figura 16. Espacio cromático CIE 1931 que identifica el color del papel para las muestras
estudiadas, donde:
A. Muestra de referencia,
B. Muestra impregnada con AE
C. Muestra sometida a envejecimiento acelerado
D. Muestra impregnada con AE y sometida a envejecimiento acelerado
48
Figura 17. Diagrama CIE 1976 UCS (Escala de cromaticidad uniforme) que identifica el color
del papel para las muestras estudiadas, donde:
A. Muestra de referencia,
B. Muestra impregnada con AE
C. Muestra sometida a envejecimiento acelerado
D. Muestra impregnada con AE y sometida a envejecimiento acelerado
49
En la figura 18 se encuentra la representación de la tonalidad del grupo de muestras estudiado
realizada en la rueda cromática de Adobe Color CC (Adobe Systems Incorporated, 2018).
Figura 18. Esquematización del grupo de colores de las muestras de papel estudiado donde:
A. Muestra de referencia,
B. Muestra impregnada con AE
C. Muestra sometida a envejecimiento acelerado
D. Muestra impregnada con AE y sometida a envejecimiento acelerado.
50
7.3 EVALUACIÓN DE LA RESPUESTA BIOCIDA DEL AE SOBRE EL PAPEL
Los ensayos para la evaluación microbicida del AE fueron realizados una vez se evidenciaron
signos de biodeterioro en los grupos de muestras 1 y 2 (ver figura 19).
Figura 19. A: Muestras (1 y 2) con
biodeterioro activo. Foto laboratorio de Ciencias
Biblioteca Nacional.
Figura 20. B: Muestras (3) control negativo.
Foto laboratorio de Ciencias Biblioteca Nacional.
Evaluación de la respuesta microbicida
A continuación, se presentan los resultados de la acción microbicida del AE de P. graveolens
frente al consorcio microbiano compuesto por: la bacteria Bacillus subtilis, la levadura
Rhodotorula mucilaginosa y los géneros de hongos Aspergillus sp, Penicillium sp y
Stachybotrys sp.
A. Técnica de siembra en superficie
Los resultados de la siembra en superficie a partir de las suspensiones en agua
destilada estéril de las muestras con Biodeterioro (Soluciones SS), evidenciaron
crecimiento positivo en placa, solo de la Bacteria aerobia Bacillus subtillis, como se
observa en la tabla 22 y en el siguiente registro fotográfico:
A Control negativo: ausencia de
crecimiento microbiano
. B Control Positivo: crecimiento
positivo en superficie de los 5 géneros
microbianos del consorcio
C Resultados del ensayo:
Crecimiento positivo en superficie de
Bacillus subtillis.
Figura 21. Resultados del crecimiento de los cinco (5) géneros microbianos del consorcio por
siembra de superficie
51
Tabla 22. Evaluación de la Acción microbicida del AE de P. graveolens mediante técnica de
siembra en superficie
G. Ensayo Consorcio
PDM1* ASPAM5* BS BDM7** LRVIAL15* STACHYHD322*
G-1 SS-I No hay crecimiento (NHC)
NHC Si hay crecimiento (SHC)
NHC NHC
SS-II NHC NHC SHC NHC NHC
SS-III NHC NHC SHC NHC NHC
SS-IV NHC NHC SHC NHC NHC
SS-V NHC NHC SHC NHC NHC
SS-VI NHC NHC SHC NHC NHC
SS-VII NHC NHC SHC NHC NHC
SS-VIII NHC NHC SHC NHC NHC
SS-IX NHC NHC SHC NHC NHC
SS-X NHC NHC SHC NHC NHC
SS-XI NHC NHC SHC NHC NHC
SS-XII NHC NHC SHC NHC NHC
SS-XIII NHC NHC SHC NHC NHC
SS-XIV NHC NHC SHC NHC NHC
SS-XV NHC NHC SHC NHC NHC
SS-XVI NHC NHC SHC NHC NHC
SS-XVII NHC NHC SHC NHC NHC
SS-XVIII NHC NHC SHC NHC NHC
G-2 (+) I Si hay crecimiento (SHC) SHC SHC SHC SHC
(+) II SHC SHC SHC SHC SHC
(+) III SHC SHC SHC SHC SHC
G-3 (-) I NHC NHC NHC NHC NHC
(-) II NHC NHC NHC NHC NHC
(-) III NHC NHC NHC NHC NHC
SS: Siembra en superficie para el grupo 1 provenientes de la Solución SS
Nota: La evaluación se realizó a los 3**, 6** y 10** días la siembra.
B. Técnica de los 25 puntos de inoculación.
Los resultados de la técnica de los 25 puntos de inoculación a partir de las muestras
con biodeterioro tratadas (Muestras MP), evidenciaron crecimiento positivo en placa,
solo de la Bacteria aerobia Bacillus subtillis con un porcentaje de recuperación del
100%, como se observa en las tablas 23-24 y figuras 21-22:
52
Tabla 23. Evaluación de la Acción microbicida del AE de P. graveolens mediante técnica de
25 puntos de inoculación.
G. Ensayo Consorcio
PDM1* ASPAM5* BS BDM7** LRVIAL15* STACHYHD322*
G-1 MP-I No hay crecimiento (NHC 0/25)
NHC 0/25 Si hay crecimiento (SHC 25/25)
NHC 0/25 NHC 0/25
MP-II NHC 0/25 NHC 0/25 SHC 25/25 NHC 0/25 NHC 0/25
MP-III NHC 0/25 NHC 0/25 SHC 25/25 NHC 0/25 NHC 0/25
MP-IV NHC 0/25 NHC 0/25 SHC 25/25 NHC 0/25 NHC 0/25
MP-V NHC 0/25 NHC 0/25 SHC 25/25 NHC 0/25 NHC 0/25
MP-VI NHC 0/25 NHC 0/25 SHC 25/25 NHC 0/25 NHC 0/25
MP-VII NHC 0/25 NHC 0/25 SHC 25/25 NHC 0/25 NHC 0/25
MP-VIII NHC 0/25 NHC 0/25 SHC 25/25 NHC 0/25 NHC 0/25
MP-IX NHC 0/25 NHC 0/25 SHC 25/25 NHC 0/25 NHC 0/25
MP-X NHC 0/25 NHC 0/25 SHC 25/25 NHC 0/25 NHC 0/25
MP-XI NHC 0/25 NHC 0/25 SHC 25/25 NHC 0/25 NHC 0/25
MP-XII NHC 0/25 NHC 0/25 SHC 25/25 NHC 0/25 NHC 0/25
MP-XIII NHC 0/25 NHC 0/25 SHC 25/25 NHC 0/25 NHC 0/25
MP-XIV NHC 0/25 NHC 0/25 SHC 25/25 NHC 0/25 NHC 0/25
MP-XV NHC 0/25 NHC 0/25 SHC 25/25 NHC 0/25 NHC 0/25
MP-XVI NHC 0/25 NHC 0/25 SHC 25/25 NHC 0/25 NHC 0/25
MP-XVII NHC 0/25 NHC 0/25 SHC 25/25 NHC 0/25 NHC 0/25
MP-XVIII NHC 0/25 NHC 0/25 SHC 25/25 NHC 0/25 NHC 0/25
G-2 (+) I Si hay crecimiento (SHC)
SHC SHC SHC SHC
(+) II SHC SHC SHC SHC SHC
(+) III SHC SHC SHC SHC SHC
G-3 (-) I NHC 0/25 NHC 0/25 NHC 0/25 NHC 0/25 NHC 0/25
(-) II NHC 0/25 NHC 0/25 NHC 0/25 NHC 0/25 NHC 0/25
(-) III NHC 0/25 NHC 0/25 NHC 0/25 NHC 0/25 NHC 0/25
MP: Inoculación de 25 puntos para el grupo 1 provenientes de las muestras MP1
Nota: La evaluación se realizó a los 3**, 6** y 10** días la siembra
Tabla 24. Promedio sobre los 25 puntos de siembra y porcentajes de inhibición y recuperación
de los microrganismos. MICROOGANISMOS
DEL CONSORCIO CRECIMIENTO POSTIVO
(SOBRE 25 PUNTOS)
PORCENTAJE DE
INHIBICIÓN (%)
PORCENTAJE DE
RECUPERACIÓN (%)
Penicillium sp 0 100 0
Aspergillus sp 0 100 0
Bacillus subtillis 25 0 100
Rodothorulla Rubra 0 100 0
Stachybotris sp 0 100 0
53
Figura 22. Relación en diagrama de barras del efecto microbicida del AE para los
microrganismos evaluados en el consorcio.
A. Control negativo: Ausencia de
crecimiento microbiano.
B. Control positivo: Crecimiento
positivo en los 25 puntos de
siembra de los 5 géneros
microbianos el consorcio.
C. Resultados del ensayo:
Crecimiento positivo en los 25
puntos de siembra de Bacillus
subtillis.
Figura 23. 24 Resultados del crecimiento de los cinco (5) géneros microbianos del consorcio
por siembra de superficie. Foto laboratorio de Ciencias. Biblioteca Nacional de Colombia
En las condiciones del estudio, fue posible observar la acción microbicida –fungicida, del AE
de P. graveolens (Tablas 22 y 23) frente a la levadura Rhodotorula mucilaginosa y los géneros
de hongos Aspergillus sp, Penicillium sp y Stachybotrys sp, es decir los hongos filamentosos
y no filamentosos; dicha actividad posiblemente se debe al tipo de interacciones entre los
componentes globales del AE, y los microorganismos. La presencia de monoterpenos como
trans-geraniol, β-citronelol y linalool (ver tabla 10, pág. 38) por su naturaleza química serían
capaces de interactuar con la membrana celular de los microorganismos provocando su lisis,
denaturalizar distintas macromoléculas, y posiblemente afectar de distintos sistemas
metabólicos (Reyes et al., 2012; Fisher & Phillips, 2008).
0
20
40
60
80
100
Penicillium sp Aspergillus sp Bacillussubtillis
RodothorullaRubra
Stachybotrissp
0 0
25
0 0
100 100
0
100 100
0 0
100
0 0
CRECIMIENTO POSTIVO (SOBRE 25PUNTOS)PORCENTAJE DE INHIBICIÓN (%)
PORCENTAJE DE RECUPERACIÓN (%)
54
Así mismo, el AE de P. graveolens no presentó repuesta microbicida frente a la bacteria
Bacillus subtilis en las condiciones de estudio como podemos observar en la tabla 22 y la figura
21, posiblemente por diferencias morfológicas y/o fisiológicas que presenta esta especie de
bacteria. B. subtilis como se describe en la tabla 02 pág. 21 es una bacteria del orden Gram
positiva (+) capaz de generar endósporas, las cuales se producen en ambientes de estrés y
estructuras asociativas conocidas como biofilm.
Las endósporas en el caso de B. subtillis, se componen de proteínas y ácido poli-β-
hidroxibutírico que en conjunto brinda resistencia química y enzimática; de igual modo
cuenta con una capa muy gruesa de peptidoglucano, conocida como corteza lo que la hace
altamente resistente en situaciones desfavorables (Cornell, 2018; Franco & Sarmiento,
2018; Márquez, 2007).
La estructura de las endósporas es especializada y sus sistemas bioquímicos la hacen
resistente frente al calor, la congelación, desecación, radiación y algunos productos
químicos que por sus interacciones no serían capaces de penetrarle; por lo que nos
referimos a las endósporas como aquellas células no reproductivas que son mecanismos
de defensa con los que podría sobrevivir la especie aún sin la célula madre, dada su alta
capacidad de adaptación y de permanecer en un estado latente hasta que las condiciones
del entorno mejoren (Cornell, 2018; Franco & Sarmiento, 2018; Márquez, 2007).
Considerando que la especie B. subtilis se encontraba inicialmente en un medio celulósico con
otros microorganismos (Rhodotorula mucilaginosa, Aspergillus sp, Penicillium sp y
Stachybotrys sp); se cree posible que la formación de endósporas se presentó una vez se
reducía la disponibilidad de los recursos alimenticios en el medio.
Así mismo, B. subtilis es capaz de formar estructuras asociativas complejas denominadas
biofilms, en las que las células se unen a manera de cadenas en un estado sésil (asociadas
entre sí) proporcionando rigidez y una serie de ventajas para desarrollarse en el entorno.
La matriz estructural de un biofilm cuenta con una serie de proteínas y polisacáridos que
las mantienen juntas; y en presencia del ácido poli-γ-glutámico (γ-PGA) su morfología y
robustez se ve favorecida (Yu et al., 2016). De acuerdo con lo anterior, se ha reportado
que hongos del genero Aspergillus sp durante la degradación de fuentes de carbono como
la celulosa, liberan el γ-PGA al entorno, de manera que es posible que se hubiera
presentado la formación de biofilm de B. subtilis y que además este se beneficiase por los
productos (γ-PGA) antes del tratamiento con el AE dada la presencia de Aspergillus sp en
el consorcio microbiano (Quijano & Zuleta, 2006). De igual forma, el biofilm de B. subtilis
produce exopolisacáridos (EPS) y proteínas como la BslA en la parte superior del biolfilm
que sirven como capa hidrofóbica lo cuál brinda mayor protección a la especie (Mielich-
Süss & Lopez, 2015; Rao et al., 2013).
55
En el contexto anterior, la presencia de B. subtilis después del tratamiento con AE de P.
graveolens al 1% en EtOH al 75% puede estar asoaciada a:
La hidrofobicidad de la membrana del organismo, la cual cuenta con una gran cantidad
de capas de peptidoglicano compuesta por polimeros derivados de carbohidratos (N-
acetil-glucosamina y ácido N-acetilmuránico) de gran tamaño molecular y una serie de
peptidos formados por aminoacidos como L-Alanina, D-Ácido glutámico, L-Lisina y D-
Alanina que la dotan la estructura de un marcado carácter hidrofobo que no permitiria
facilmente interacciones con el solvente del AE.
Su capacidad para formar endósporas, las cuales por su carácter igualmente hidrofobo
y la serie de capas que la conforman (proteinas, polisacaridos, y peptidoglicano) le
permetirian permetirian resistir de manera latente hasta que las condiciones del medio
mejoren y favorezcan de nuevo su germinación y desarrollo.
La posible formación de biofilm robusto dada la presencia de γ-PGA en el medio, el cual
estaria compuesto por una serie de EPS (polimeros de carbohidratos con proteinas de
caracteristica hidrofoba) y proteinas como la BslA igualmente de carácter hidrofobo.
Figura 25. De izquierda a derecha: Proteína BslA, geraniol y citronelol. Tomado de Rao et
al., 2013
La proteina BslA (ver figura 23) es una hidrofobina altamenta apolar que en conjunto
con el grupo de EPS dificultaria las interacciones de la membrana del microorganismo
con el solvente (EtOH 75%) y el grupo de metabolitos presentes en el AE como
monoterpenos oxigenados (principalmente trans-generiol y β-citronelol). Su caracter
hidrófobo protegerian a la bacteria de procesos de lisis y denaturalización de sus
macromoleculas ocasionados normalmente por las interacciones de los componentes
metabolicos de los AE (Rao et al., 2013)
56
Por otra parte, Fisher & Phillips, 2008 mencionan que la actividad microbiocida de los AE en
bacterias puede depender de:
1. La Concentración del aceite
2. El Tiempo de exposición: Las diferencias morfologicas de algunos microorganismos
hacen que las intereacciones de sus membranas con los AE se vea entorpecida y
requiera de más tiempo para producir el efecto. Según la NTC 5230, los procesos de
desinfección tradicional requieren normalmente de entre 5 y 15 minutos, y en el ensayo
se dejó un tiempo mayor a 24horas con ningún efecto microbicida para la bacteria.
Así, se ha reportado un efecto microbiocida del AE de P. graveolens en concentraciones del
50 y 20% frente al B. subtilis, mientras que no se reportaba este mismo efecto en
concentraciones del 10% (Prabuseenivasan, Jayakumar, & Ignacimuthu, 2006).
En las condiciones de estudio, el AE de P. graveolens se encontraba al 1% en EtOH al 75%
y la evaluación de su efecto microbicida inicio 48 horas post aplicación. Acorde a los resultados
de Prabuseenivasan, Jayakumar & Ignacimuthu, 2006 y las consideraciones de Fisher &
Phillips, 2008 dejamos la siguiente pregunta abierta en el contexto de la investigación.
¿Se justificaría evaluar el AE de P. graveolens considerando que la preparación de 1L de AE
al 1% en EtOH representaría un costo de $52.800, al 10% representaría un costo de $528.000
y al 25% $1.320.000 sin considerar el costo del etanol?
En la actualidad la BNC realiza este tipo de tratamientos con el desinfectante TIMSEN
conformado por 40% de radicales alquílicos y bencílicos y un 60% de urea quelatadatipo
G.R.A.S. (Amonios cuaternarios). El costo de 1Kg de TIMSEN es de 200.000 y se requiere de
1g/L para realizar los tratamientos de desinfección de los soportes de papel, por lo que con
1Kg de TIMSEN se prepararian 1000 L de solución desinfectante, sin embargo a pesar de su
rendimiento, los resultados de los controles de calidad que se hacen en el labororatorio,
evidencia un efecto microbicida no significativo sobre bacterias aerobias, esporuladas.
Por lo tanto es necesario continuar investigando nuevas moleculas que brinden un amplio
espectro de acción frente a la diversidad de agentes deteriorantes, siempre identificar los
microorganismos para conocer la fenomenología de la posible resistencia que generen los
productos de control y pensar en la vulnerabilidad permanente de los soportes a los
compuestos químicos de diferente naturaleza.
57
8. CONCLUSIONES
El rendimiento de la extracción del AE de P. graveolens por arrastre de vapor empleado
material vegetal seco corresponde a un 0.43%
Se considera que el método de Dubois adaptado en el presente trabajo, es el más apropiado
para la cuantificación de los azúcares reductores en soportes de papel tipo manual.
En la aplicación del AE de P. graveolens al 1% en EtOH al 75% sobre soportes de papel de
carácter patrimonial tipo manual, se observa que en parámetros como acidez y tonalidad, no
hubo alteración significativa. Sin embargo se evidencia el aumento de los azucares reductores
de un 26.59%
El AE de P. graveolens al 1% en EtOH al 75% presenta actividad microbicida frente a la
levadura Rhodotorula mucilaginosa y los géneros de hongos Aspergillus sp, Penicillium sp y
Stachybotrys sp cuando estos se encuentran en un consorcio microbiano sobre soportes de
papel tipo manual.
La bacteria B. subtilis persiste en los soportes de papel, aún después de la aplicación del AE
de P. graveolens al 1% en EtOH al 75%.
Se logró desarrollar un método experimental inoculando el soporte de papel con un consorcio
de microganismos que simula las condiciones reales de biodeterioro microbiano en soportes
documentales.
9. RECOMENDACIONES
Continuar con el método de evaluación de productos de control de biodeterioro utilizando
consorcios de microorganismos, lo cual permite una mayor aproximación a las condiciones
reales post tratamiento del material patrimonial.
El aceite esencial de Pelargonium graveolens a la concentración evaluada, no tiene efecto
bactericida frente a Bacillus subtilis en las condiciones de estudio, y dados los altos costos de
obtención, no se recomienda continuar los ensayos a concentraciones mayores del AE.
El aceite esencial de Pelargonium graveolens presenta actividad microbicida frente a hongos
filamentosos y no filamentos, por lo que se sugiere la posibilidad de realizar ensayos con
mezclas de aceites esenciales que afecten la totalidad de microorganismos de los consorcios
(Bacterias y hongos filamentosos y no filamentosos). En marco del proyecto, se sugiere
mezclas con los aceites extraídos de las especies vegetales: Ocinimum basilicum, Lippia alba
y Pelargonium graveolens, este último en mezclas a baja concentración, y centrando gran
interés en Lippia alba por su contenido de monoterpenos como D-limoneno y carvona y sus
porcentajes de rendimiento.
58
Otro aspecto importante a considerar en el estudio de los AE como agentes microbicidas para
el control de biodeterioro en soportes documentales, es el diseño experimental de un
procedimiento que permita evaluar los costos de su aplicación en materiales de la BNC.
10. BIBLIOGRAFÍA
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63
ANEXOS
Anexo 1. Métodos para determinación de azúcares que emplean ácido sulfúrico. Recuperado de
Jaramillo & Pinto 2017 y adaptado de López, Taramuel, Arboleda, Segura, & Restrepo, 2017
Dubois El método se fundamenta en la reacción de azúcares reductores con
ácido sulfúrico concentrado para formar furfurales (HM con pentosas)
o 5- hidroximetilfurfurales (HMF con hexosas). Dicho derivado entra
en procesos de protonación/desprotonación debido al medio
fuertemente ácido y es reconocido por el fenol en exceso, presente
en el medio, formándose compuestos de color amarillo/café que se
pueden leer a 490 nm.
O
H
HO
H
HO
H
OH
OHHH
OH
H2SO4 O
OH
O
+
OH
O
OH
O
OH
O
2
Glucosa Hidroxi-metil furfural Fenol
[5-( hidroximetil) furan-2-il]( difenoxi) metanol Ác. Sulfúrico-Fenol En concordancia con el método de Dubois, la reacción de fenol-ácido
sulfúrico ocurre una sulfonación del fenol, el ácido fenolsulfónico
formado es capaz disminuir la intensidad de color del HMF, el furfural
entre otros, afectando las lecturas espectrofotométricas.
Por lo que en esta metodología se sugiere un intercambio en el orden
de adición de los reactivos, manteniendo el fundamento de Dubois.
Ác. Sulfurico-UV
El HMF producido por la deshidratación de alcoholes con ácido
súlfurico concentrado, posee la capacidad de absorción en longitudes
de onda de luz en el rango ultravioleta
64
Anexo 2. Certificado de identificación del material vegetal estudiado.
65
Anexo 3. Procesamiento colorimétrico
Conversión coordenadas cromáticas Sistema CIE L*a*b* al Sistema CIE L*C*h*
Para calcular L*: es el mismo del sistema L*a*b* Para
calcula C*: 𝐶∗ = √(𝑎∗)2 + (𝑏∗)2
Para calcular h*:
El resultado se expresa en grados (°)
Nombre sistemático del color y asignación del orden Munsell: L* h*/C*
Se consultan las tablas que se anexan y se asignan los valores L*, C* y h* siguiendo el
orden mostrado arriba. Para asignar el nombre sistemático del color, inicialmente se
toma el valor h*, luego el valor C* y por último el valor L*. Si se compara el color Munsell
con los catálogos, primero se toma el valor del matiz (H), después el valor (V) y por
último el croma (C).
Conversión de valores del sistema CIE L*a*b* al sistema XYZ y coordenadas cromáticas x y z.
Inicialmente se calculan las dimensiones Yn, Xn y Zn usando las siguientes fórmulas:
Luego se calcula X Y Z usando las siguientes fórmulas:
X = 95,047 Xn Y = 100 Yn Z = 108,883 Zn
Los resultados se aproximan y expresan en números enteros.
Para calcular las coordenadas cromáticas x y z se calcula el cociente entre el valor X, Y
o Z y la sumatoria de los tres valores.
La sumatoria de las coordenadas debe ser igual a 1.
66
Sistema de asignación de nombres de colores del sistema CIE L*C*h* y Munsell.
Laboratorio de fisicoquímica Escuela de conservación, Restauración y Muséografía, INAH
Calle general Anata No. 187, Col. San Diego Churubusco, 04120 (Coyoacán) México, D.F., México
Tel. 56045188 Ext. 4531, Fax 56045163 [email protected]
Sistema de asignación de los nombres de los colores.
(Registro L*C*h* y Munsell)
Asignación de los nombres de los valores de claridad L*
Nomenclatura Valor L* Orden Munsell
Blanco
96-100 8
91-96 7
86-91 6
Muy claro 75-86 5
Claro 56-75 4
Medio 35-56 3
Oscuro 27-35 2.5
20-27 2
Muy oscuro 11-20 1
Negro 0-11 0
Asignación de los nombres de los valores de croma o saturación C*
Valor C* Nomenclatura Orden Munsell
0 Gris 0
1-7 Grisáceo 1
7-25 Débil 2
25-45 Medio 3
45-65 Vivo 4
65-80 Puro 5
Asignación de los nombres de los valores de croma o saturación C*
para el color amarillo
Valor C* Nomenclatura Orden Munsell
0 Gris 0
1-7 Grisáceo 1
7-25 Débil 2
25-45 Medio 3
45-65 Fuerte 4
65-80 Vivo 5
80-100 Puro 6
67
Asignación de nombres a los valores de tono h*
Ángulo en grados Léxico Orden Munsell 357-4 Magenta
R
4-11 Magenta rojizo
11-19 Magenta rojo
19-27 Rojo magenta
27-34 Rojo
34-41 Rojo anaranjado
YR
41-49 Rojo naranja
49-57 Naranja rojizo
57-64 Naranja
64-71 Naranja amarillento
71-79 Naranja amarillo
Y
79-87 Amarillo anaranjado
87-94 Amarillo
94-101 Amarillo limonado
101-109 Amarillo Limón
109-117 Limón amarillento
GY 117-124 Limón
124-131 Limón verdoso
131-139 Limón verde
139-147 Verde limonado
G
147-153 Verde
153-161 Verde esmeraldado
161-169 Verde esmeralda
169-177 Esmeralda verdoso
177-184 Esmeralda
184-191 Esmeralda cyanado
BG 191-199 Esmeralda cyan
199-207 Cyan esmeraldado
207-214 Cyan
214-221 Cyan turquesado
B
221-229 Cyan turquesa
229-237 Turquesa cyanado
237-243 Turquesa
243-251 Turquesa azualado
251-259 Turquesa azul
PB
259-267 Azul turquesado
267-273 Azul
273-281 Azul violado
281-289 Azul violeta
289-297 Violeta azulado
P
297-304 Violeta
304-311 Violeta purpúreo
311-319 Violeta púrpura
319-327 Púrpura violado
327-334 Púrpura
RP 334-341 Púrpura magentado
341-349 Púrpura magenta
349-357 Magenta purpúreo