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EVALUACIÓN PRELIMINAR DE MODELOS DE INFECCIÓN CRUZADA POR Fusarium sp., AISLADOS DE PROCESOS PATOLÓGICOS EN PLANTAS, ANIMALES Y HUMANOS

NATHALIE CAMACHO RAMÍREZ

JULIE ANDREA GIL GÓMEZ

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial para optar al título de

MICROBIÓLOGO AGRÍCOLA Y VETERINARIO y

MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

DIRECTOR María Ximena Rodríguez, Ph.D.

CODIRECTOR Claudia Marcela Parra Giraldo, M.Sc.

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Bogotá, D.C. 2008




APROBADO

__________ __________ Maria Ximena Rodríguez Claudia Marcela Parra

Director Codirector __________ __________ Silvia Restrepo Melva Linares Jurado 1 Jurado 2




APROBADO

__________ __________ Ingrid Schuler Janeth Arias Palacios Decana académica Directora de Carrera

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos

por sus alumnos en sus trabajos de tesis, solo velará por que no se

publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las

tesis no contengan ataques personales contra persona alguna,

antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la

justicia”

A mi Ángel de la Guarda, mi hermana por ser mi guía, compañía y

cómplice de mi vida y mis sueños.

Julie Andrea Gil Gómez

Pep, Nacito, Nereli y Pauli, gracias por su apoyo incondicional en

todas las fases de esta tesis, sin ustedes nada hubiera sido posible.

Nathalie Camacho Ramírez

v

AGRADECIMIENTOS

A nuestros padres por su apoyo incondicional y por creer siempre

en nosotras.

A Claudia Parra por abrirnos las puertas del laboratorio de

micología, por la confianza y el apoyo dado para la realización de

este trabajo.

A Maria Ximena Rodríguez por la excelente guía, con la cual se

culminó este trabajo.

A Julián Amaya y Pilar Montoya por toda la dedicación y

colaboración sin la cual este trabajo no habría culminado nunca.

A Gisela Castrillón Moreno por su asesoría en el análisis estadístico.

A Pedro Camacho y Lina Gómez por sus aportes en la redacción.

A todas las personas y amigos que de una u otra manera fueron

importantes en el desarrollo del proyecto.

vi

TABLA DE CONTENIDO

Página

Resumen xiii

Abstract xiv

1. Introducción 1

2. Marco teórico 4

2.1. Generalidades de Fusarium sp. 4

2.2. Características morfológicas de Fusarium sp. 5

2.3. Taxonomía del género Fusarium 6

2.4. Patogenicidad de Fusarium sp. 7

2.4.1. Fusarium sp., fitopatógeno 7

2.4.1.1. Tomate como especie susceptible a infección por

Fusarium sp. 10

2.4.2. Fusarium sp., patógeno humano y animal 11

2.5. Factores de virulencia 12

2.5.1. Factores de virulencia no enzimáticos 12

2.5.2. Factores de virulencia enzimáticos 14

2.5.2.1. Queratinazas 16

2.6. Hongos queratinofílicos 17

3. Justificación 19

3.1. Formulación del problema 19

3.2. Justificación 20

4. Objetivos 22

4.1. Objetivo general 22

4.2. Objetivos específicos 22

5. Materiales y métodos 23

5.1. Origen de los aislamientos de Fusarium sp. 23

vii

Página

5.2. Procesamiento de material vegetal 24

5.3. Toma y procesamiento de muestras animales 26

5.4. Realización de cultivos monospóricos 27

5.5. Identificación taxonómica de los aislamientos 28

5.6. Preservación de las cepas aisladas 29

5.6.1. Conservación de hongos en agua destilada estéril 29

5.6.2. Conservación en aceite mineral estéril 29

5.6.3. Conservación en papel filtro estéril 30

5.7. Ensayos de patogenicidad cruzada 31

5.7.1. Actividad fitopatógena 32

5.7.1.1. Preparación del inóculo 32

5.7.2. Inoculación de plántulas 33

5.7.3. Actividad patógena sobre tejido animal y humano 35

5.7.3.1. Modelo in vitro de patogenicidad animal y

humano 36

5.8. Análisis estadístico 38

6. Resultados y discusión 39

6.1. Origen de los aislamientos 39

6.2. Modelo de infección en plantas 47

6.3. Modelo de infección humano y animal 53

6.4. Fusarium sp., como modelo multihospedero 64

7. Conclusiones 66

8. Recomendaciones 68

9. Referencias 69

10. Anexos 81

viii

ÍNDICE DE TABLAS

Página

Tabla 6.1. Aislamientos de Fusarium sp. de origen

humano 39

Tabla 6.2. Procesamiento de muestras provenientes de

lesiones en animales 41

Tabla 6.3. Aislamientos a partir de material vegetal 45

Tabla 6.4.

Crecimiento en centímetros y área bajo la

curva de los aislamientos de Fusarium sp., en

ensayo fitopatógeno

50

Tabla 6.5. Prueba de Duncan para aislamientos en

ensayo fitopatógeno 51

Tabla 6.6.

Prueba cualitativa y cuantitativa de actividad

patógena de Fusarium sp. sobre tejidos

queratinizados

54

Tabla 6.7. Prueba de rango múltiple de Duncan para

tratamientos de queratina 55

Tabla 6.8.

Prueba de rango múltiple de Duncan para

agrupamiento de aislamientos según

degradación de queratina

60

Tabla 6.9. Prueba de Duncan para degradación de

queratina 62

Tabla 6.10.

Prueba de agrupamiento de Duncan de los

aislamientos en relación con la degradación

de casco

63

Tabla 6.11.

Prueba de agrupamiento de Duncan de los

aislamientos en relación con la degradación

de pelo

64

ix

Página

Tabla 6.12. Correlación de los modelos de patogenicidad 65

x

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 5.1. Cortes transversales 25

Figura 5.2. Lavado y desinfección de cortes

transversales 25

Figura 5.3. Puntos de siembra y crecimiento de agentes

fitopatógenos 25

Figura 5.4. Desprendimiento de conidios para

suspensión 27

Figura 5.5. Cultivos monospóricos 28

Figura 5.6. Discos de Agar-Micelio para conservación

en agua destilada 29

Figura 5.7. Conservación en aceite mineral 30

Figura 5.8. Metodología conservación en papel filtro 31

Figura 5.9. Cumplimiento de los postulados de Koch en

plántulas de tomate y clavel 32

Figura 5.10. Procedimiento inoculación de plántulas 34

Figura 5.11. Re-aislamiento de cepas, prueba

fitopatógena 35

Figura 5.12. Método de peso seco 37

Figura 5.13. Montaje de medios sólidos, prueba sobre

tejido queratinizado 38

Figura 6.1. Porcentaje de frecuencia de aislamiento de

hongos en muestras de animales 44

Figura 6.2. Control negativo prueba progresión de la

enfermedad 48

Figura 6.3. Prueba de colonización de plantas de

tomate por Fusarium sp. 49

xi

Página

Figura 6.4. Actividad queratinolítica Fusarium sp. 57

xii

ÍNDICE DE ANEXOS

Página

Anexo 1 Hojas de vida de los aislamientos de Fusarium

sp. 81

Anexo 2

Unidades de área bajo la curva de las 10

réplicas del progreso de la enfermedad de los

aislamientos de Fusarium sp. en plántulas de

tomate

147

Anexo 3 Agrupamiento de Duncan de área bajo la curva

de los aislamientos de Fusarium sp. 148

Anexo 4 Agrupamiento de Duncan de réplicas en

ensayo fitopatógeno 150

Anexo 5

Análisis estadístico del comportamiento de los

aislamientos de Fusarium sp. en prueba de

degradación in vitro de tejidos queratinizados.

151

Anexo 6

Análisis estadístico de la degradación de Casco

por aislamientos de Fusarium sp. en pruebas

in vitro.

155

Anexo 7

Análisis estadístico de la degradación de pelo

por aislamientos de Fusarium sp. en pruebas

in vitro.

157

xiii

RESUMEN

Fusarium es un género de hongos de distribución universal, que se

comporta como fitopatógeno. Algunas especies del género son

queratinofílicas y queratinolíticas, confiriéndole la capacidad de

colonizar tejidos de humanos y animales, convirtiéndose así en

agentes patógenos de estos hospederos.

En la presente investigación se realizaron aislamientos de Fusarium

sp. a partir de plantas y animales, ya que, previamente, se contaba

con aislamientos en humanos. Se desarrollaron tres modelos de

infección con tres aislamientos de cada hospedero, el modelo de

infección fitopatógeno con plántulas de tomate y, los modelos de

infección animal y humano con tejidos queratinizados (casco de

vaca y pelo de humano).

Los resultados mostraron que la presencia de Fusarium sp. en

animales es mayor de lo que se encuentra reportado, y en plantas

se confirmó su frecuencia. Por otro lado, los modelos de

patogenicidad confirmaron tendencias de infección en los

hospederos originales, y al mismo tiempo demostraron la capacidad

de Fusarium sp. de colonizar otros tejidos.

Con estos modelos se buscaba establecer el estudio de las

infecciones cruzadas entre hospederos. Por esta razón se realizó un

análisis donde se observó que no había relación entre las

procedencias y que éstas se comportan de manera independiente.

Este trabajo constituye un estudio preliminar, base para poder

llegar a conclusiones sobre el comportamiento de Fusarium como

multihospedero, a partir de la evaluación del 100% de los

aislamientos obtenidos.

xiv

ABSTRACT

Fusarium is a fungal genus of universal distribution which behaves

as phytopathogen. Some species are keratinophilic and keratinolitic,

conferring the ability of human and animal tissue colonization; this

capacity makes Fusarium a human and animal pathogen.

Fusarium sp. isolates from plants and animals were collected for

this study, human isolates were recovered from previous studies.

Three infection models were developed including three isolates from

each host. Tomato plants were used for plant infection model, and

keratinized tissues (bovine hoof and human hair) for animal and

human infection models.

The results showed that Fusarium sp. occurrence in animals is

higher than reported, and isolation frequency in plants was

confirmed. The pathogenicity models confirmed infection tendency

for the original host, and at the same time proved Fusarium

capacity of colonizing different tissues.

The pathogenicity models aimed to establish host cross infections

studies. We performed an analysis which showed that there is not a

relation between isolation origins due to their independent

behavior.

This work constitutes a preliminary study, which may possible to

conclude about multihost Fusarium behavior evaluating 100% of

collected isolates.

1

1. INTRODUCCIÓN

Fusarium es un género de hongos de distribución universal.

Usualmente se encuentra como saprófito de suelo; sin embargo, se

ha reportado como parásito facultativo de numerosos hospederos

en los que se incluyen plantas, animales y humanos.

Algunas especies del género Fusarium son habitantes del suelo. Se

reconocen por su impacto económico negativo en la agricultura

mundial, ya que son agentes causales del marchitamiento vascular

y pudrición basal de una gran variedad de plantas. Por otro lado, se

ha encontrado que algunas especies de este género han emergido

como patógenos oportunistas de humanos causando enfermedades

diseminadas en pacientes inmunocomprometidos, quemados, con

heridas abiertas y en ocasiones se han reportado, también, como

agentes causales de infecciones en pacientes inmunocompetentes.

Entre las características no enzimáticas asociadas con la virulencia

de este género se destaca su amplia distribución, atribuida a su

capacidad para crecer en gran número de substratos y a su eficaz

mecanismo de dispersión. En el mismo sentido se destaca la

adherencia que le confiere la capacidad de colonizar los tejidos y la

producción de toxinas.

Adicionalmente, los complejos enzimáticos producidos por las

especies de este género constituyen un importante factor de

virulencia. Se ha identificado la capacidad de producir el complejo

de enzimas polisacaridasas que pueden alterar o degradar los

2

distintos componentes (polisacáridos) presentes en las paredes

celulares. Dentro de éstas, se destaca la producción de pectinliasas,

celulasas, arabinasas, poligaracturonidasas, entre otras.

Algunas especies del género presentan capacidad queratinofílica y

queratinolítica que les confiere la capacidad de colonizar tejidos de

humanos y animales y, de esta forma, convertirse en agentes

patógenos.

Actualmente se desconoce hasta qué punto están conservados

estos factores de virulencia en los grupos de hospederos que afecta

Fusarium. Una de las principales causas es la falta de estudios y la

ausencia de modelos que permitan el análisis simultáneo de la

virulencia en plantas y animales.

Con la finalidad de contribuir al análisis de Fusarium como un

patógeno multihospedero, se llevó a cabo este trabajo que consistió

en realizar diez aislamientos de cada hospedero a evaluar (planta,

animal y humano) y hacer pruebas de inoculación cruzada entre

nueve aislamientos (tres de cada uno de los modelos de

hospedero).

La investigación plantea tres modelos de infección para Fusarium

sp., plántulas de tomate como modelo de infección fitopatógena y,

como modelo de infección animal y humano se manejaron tejidos

queratinizados (casco de vaca y pelo respectivamente).

3

Con estos modelos se busca preestablecer el estudio de las

infecciones cruzadas entre hospederos, basado en un modelo

fúngico multihospedero.

4

2. MARCO TEÓRICO

2.1. GENERALIDADES DE Fusarium sp.

Fusarium es un género de hongos de distribución universal, ubicuos

que se caracterizan por ser hongos moniliaceos (hialinos),

filamentosos, usualmente saprófitos de suelo, asociados a materia

orgánica en descomposición e insectos (Giani, 1997; Tosti et al.,

2000; Summerell et al., 2001).

Tosti y colaboradores (2000) al igual que Summerell y

colaboradores (2001), reportan el género Fusarium como parásitos

facultativos de numerosos hospederos, en los que se incluyen

plantas, humanos y animales.

La forma perfecta (telemorfo) de Fusarium en las especies que la

presentan, pertenecen al orden Hypocreales, a los géneros Nectria,

Calonectria, Micronectriella y Gibberella, que se caracterizan porque

las ascosporas son producidas en ascocarpos en forma de peritecio.

La forma anamorfa pertenece al filo Deuteromycota o Fungi

imperfecti (hongos mitospóricos). Se describen 30 especies, de las

cuales solo a 15 se les conoce su fase telemórfica (Nelson et al.,

1983; Pardo & Durán, 1999; Summerell et al., 2001).

5

2.2. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE Fusarium sp.

Las características morfológicas que permiten la identificación del

género Fusarium se determinan macroscópica y

microscópicamente. Éstas son agrupadas en características

primarias y secundarias que son utilizadas para separar las especies

en los sistemas taxonómicos existentes. Entre las características

primarias se incluyen la forma de los macroconidios, origen y forma

de los microconidios, tipo de conidióforo y por último la presencia o

ausencia de clamidiosporas (posición y número), mientras que, en

las características secundarias, se encuentran la presencia o

ausencia de esporodoquio, morfología y pigmentación de la colonia

(Nelson et al., 1994; Pardo & Durán, 1999).

Los conidios son esporas asexuales producidas por células

conidiógenas formadas por la diferenciación del extremo de la hifa.

La diversidad de estas estructuras ha permitido la utilización de

esta característica para la clasificación de los hongos (Moore,

1996). Partiendo de lo anterior, se ha determinado que la forma y

tamaño de éstos, es la característica principal para el

reconocimiento de Fusarium sp. Los macroconidios son curvados,

hialinos, pluriseptados, con una célula apical más o menos

puntiaguda y una célula basal en forma de pie que constituye la

base para la identificación. Los microconidios son producidos en el

micelio aéreo, comúnmente unicelulares, elipsoidales, fusiformes,

claviformes, piriformes o subglobosos, similares en ancho a los

macroconidios, con una base redondeada o truncada, por lo general

formando cabezuelas mucosas o cadenas basípetalas. No siempre

6

se producen los dos tipos de esporas (Moore, 1996; Alexopoulos et

al., 1996; Agrios, 2005).

El conidióforo es una parte de la hifa que soporta la célula

conidiógena, que puede ser monofiálides o polifiálides, ramificados

o simples. Las monofiálides producen conidios desde una sola

abertura y en las polifiálides surgen los conidios desde más de una

abertura en la misma célula (Booth, 1971; Carrillo, 2007).

Las colonias del género Fusarium sp. crecen rápidamente y

presentan diversos colores (blanco, rosado pálido, rojo, anaranjado,

púrpura, celeste, verde aceituna, pardo o no presentan pigmento),

aunque en el reverso de la colonia pueden presentar colores pardo

oscuro o negro. El micelio puede presentar una densidad alta o

baja, ya sea algodonoso o como un fieltro. Los pigmentos que

difunden en el agar suelen variar de color o tono con el pH.

(Summerell et al., 2001; Carrillo, 2007).

2.3. TAXONOMÍA DEL GÉNERO Fusarium sp.

El género Fusarium fue descrito por Link en 1809, como esporas

pluriseptadas fusiformes que crecen sobre estromas. Algunos años

más tarde, en 1821 el género fue validado por Fries, quien lo

incluyó en el orden Tuberculariae. Después Wollenweber y Reinking

en 1935, publicaron un trabajo sobre Fusarium. En este trabajo

estudiaron 1000 cepas de Fusarium y las organizaron en 16

secciones que contenían 65 especies, 55 variedades y 22 formas

especiales (Pardo & Durán, 1999; Summerell et al., 2001).

7

La taxonomía del género Fusarium ha sido muy complicada debido

a que las descripciones iniciales se hicieron con base en

características que varían frecuentemente según los medios que se

utilizaban. Adicionalmente, se debe considerar que este género

exhibe un importante grado de variación con respecto a la

morfología microscópica y a sus características fisiológicas, debido a

la habilidad de Fusarium para colonizar diversos hábitats ecológicos

en la mayoría de las áreas geográficas (Samson et al., 1981;

Nelson et al., 1994).

Los sistemas taxonómicos actuales independiente de la corriente

que sigan, se basan en el trabajo de Wollenweber y Reinking

(1935). Sin embargo, las clasificaciones taxonómicas más utilizadas

actualmente son la realizadas por Booth (1971) y por de Nelson y

colaboradores (1983). Este último, reúne los trabajos realizados

anteriormente por otros investigadores, selecciona lo mejor de cada

sistema y los combina de tal forma que reduce el número de

especies, variedades y formas (Samson et al., 1981; Nelson et al.,

1994; Pardo & Durán, 1999).

2.4. PATOGENICIDAD DE Fusarium sp.

2.4.1. Fusarium sp., fitopatógeno

Los hongos filamentosos constituyen un grupo de microorganismos

ubicuo y extremadamente versátil. La gran mayoría de las especies

viven como saprofitos sobre materia orgánica en descomposición;

8

sin embargo, algunas son capaces de colonizar organismos vivos y

provocar enfermedad. A pesar de tratarse de un número restringido

de especies, los patógenos fúngicos tienen un gran impacto en la

economía mundial (Agrios et al., 2005; Di Pietro & Roncero, 2005).

Según estimaciones de la FAO, la agricultura mundial pierde cada

año el 12% de su producción por daños causados por hongos

fitopatógenos, más que por cualquier otro agente (Agrios et al.,

2005; Di Pietro & Roncero, 2005).

El género Fusarium es un habitante del suelo de gran importancia

económica para la agricultura en el mundo ya que es causante del

marchitamiento vascular y pudrición basal (Monzón & Rodríguez,

2007).

Fusarium sp. se comporta como fitopatógeno al encontrar la planta

con las características apropiadas de hospedero. Este penetra las

diferentes capas de la corteza de la raíz hasta alcanzar el sistema

vascular. Una vez establecido, la colonización de la planta es

llevada a cabo rápidamente a través del xilema, que conlleva a la

sintomatología característica de marchitez (Roncero et al., 2000;

Agrios, 2005).

Algunas especies de Fusarium son patógenas de los cereales y

pueden producir micotoxinas en los granos aún antes de la cosecha.

Otras pueden crecer en el refrigerador y aquellas especies con

capacidad competitiva contribuir a la podredumbre de frutas y

hortalizas almacenadas. La persistencia de Fusarium sp. en el suelo

9

durante uno a varios años se debe, principalmente, a la presencia

de clamidosporas. Estas requieren para germinar fuentes exógenas

de nutrientes, por lo que son muy sensibles al antagonismo. Pero

su distribución casi universal indica la omnipresencia de los

microambientes específicos (Summerell, 2001; Agrios, 2005).

Las especies F. avenaceum, F. culmorum, F. graminearum, F. poae,

F. semitectum, F. sporotrichioides y F. tricinctum se encuentran en

cereales; F. nygamai, F. subglutinans y F. verticillioides en maíz; F.

thapsinum y F. chlamydosporum en sorgo; mientras que F.

nygamai y F. fujikuroi se hallan en arroz. En legumbres se observan

F. chlamydosporum y F. tumidum (Marasas, 1984; Carrillo, 2007).

F. solani se ha reportado como patógeno en varias especies

vegetales; entre éstas se encuentran: tomate, papa, pimentón,

alfalfa, berenjena, espárragos, maní, soja, apio, pimienta y fríjol

(Marasas, 1984; Carrillo, 2007). Por su parte, F. oxysporum se ha

reportado en algunos cultivos en los que se destacan: algodón,

tomate, tabaco, melón, garbanzo, plátano, caña de azúcar, clavel y

café, entre otros (Nelson et al., 1994; Agrios et al., 2005).

Se ha encontrado que algunas de las especies mencionadas con

anterioridad presentan formas especiales. Este taxón forma especial

(f. sp.) corresponde a cepas cuyas características morfológicas y de

cultivo son indistinguibles, pero muestran diferentes propiedades

fisiológicas en su habilidad para parasitar un hospedante especifico

(Booth, 1971).

10

La infección de Fusarium en clavel por Fusarium oxysporum f. sp.

dianthi (Fod), así como la infección en tomate por F. oxysporum f.

sp. lycopersici, y F. solani son las más estudiadas y se utilizan como

modelo de patogenicidad del género en plantas (Di Pietro &

Roncero, 2005).

2.4.1.1. Tomate como especie susceptible de infección por

Fusarium sp.

Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, es un fitopatógeno de gran

importancia ya que las plantas de tomate afectadas presentan

síntomas de marchitez, clorosis y necrosis foliar como consecuencia

de la invasión de este patógeno por el sistema vascular. Los

síntomas usualmente son visibles en las hojas basales como un

amarillamiento unilateral, que posteriormente se extiende por toda

la planta. Al realizar un corte transversal o longitudinal en los tallos

enfermos o en la base de los pecíolos se observa necrosis y tinción

de los vasos del xilema. Las condiciones óptimas para el desarrollo

de esta infección son: humedad relativa alta, aire y suelo cálido así

como temperaturas que oscilen alrededor de 28ºC. (Donoso &

Montealegre, 2003; Herrera, 2005).

Fusarium solani se ha reportado como el agente causal de la

podredumbre del pie del tomate; ésta infección se reconoce porque

su síntoma principal es una lesión necrótica de color pardo en el

tejido cortical de la base que asciende en forma unilateral a lo largo

del tallo, con la consecuente defoliación. En estados avanzados de

la enfermedad se produce la destrucción de la corteza en la zona

11

basal y una constricción del tallo a lo largo de la mancha. Ocurre

una podredumbre en las raíces secundarias. Se presenta

principalmente en plantas que han alcanzado la fructificación. Al

realizar un corte longitudinal de los tallos se evidencia en la

médula, una podredumbre seca de aspecto corchoso que supera en

longitud a la mancha externa (González et al., 1998; Herrera,

2005).

2.4.2. Fusarium sp., patógeno humano y animal

Especies del género Fusarium han emergido como patógenos

oportunistas en humanos, causando enfermedades diseminadas en

pacientes inmunocomprometidos, quemados y con heridas abiertas.

Sin embargo, en ocasiones se han reportado también como agente

causal de infecciones en pacientes inmunocompetentes. De ahí que

su importancia haya crecido exponencialmente (Hennequin et al.,

1997; Mayayo, 1999).

Las especies de Fusarium más comunes que se han asociado a

patologías son: F. solani, F. oxysporum y F. verticillioides (=F.

moniliforme). Igualmente existen otras especies que afectan en

menor grado, entre las cuales están F. proliferatum, F.

subglutinans, F. aquaeductuum, F. dimerum, F. incarnatum, F.

nygamai, F. clamydosporum, F. sacchari y F. antophilum (De Hoog

et al., 2000).

La puerta de entrada de las infecciones localizadas son las

pequeñas lesiones producidas por traumatismos. Las infecciones

12

sistémicas se pueden producir por la diseminación del

microorganismo desde la puerta de entrada. En la mayoría de las

ocasiones esta diseminación está condicionada por el estado

inmunológico del huésped, aunque también se han descrito otros

factores de virulencia, como la producción de toxinas y enzimas

(Curtis, 1996; Monzón & Rodríguez, 2007).

Las patologías a las cuales se ha asociado Fusarium sp. son:

intoxicación alimentaria, intoxicación por granos, queratitis,

infecciones en la piel, micetoma, onicomicosis, otitis, infección

intranasal invasiva, absceso cerebral, endocarditis y enfermedades

diseminadas (Nelson et al., 1994; Di Pietro & Roncero, 2005).

2.5. FACTORES DE VIRULENCIA

2.5.1. Factores de virulencia no enzimáticos

Una característica asociada con la virulencia de Fusarium sp., es su

amplia distribución atribuida a la capacidad para crecer en gran

número de substratos y a su eficaz mecanismo de dispersión,

donde el viento y la lluvia son el medio más importante para su

diseminación. Se ha demostrado que el aire puede llevar los

conidios hasta 400 Km. de distancia (Agrios, 2005; Monzón &

Rodríguez, 2007).

Otro factor que presenta Fusarium sp. es la adherencia que le

confiere la capacidad de colonizar los tejidos. La relación entre

germinación y adherencia se considera una de las principales

13

causas de virulencia. Sin embargo, Druts (1993) demostró que la

germinación no siempre es prerrequisito para la adherencia. Los

receptores de las células del hospedero para las adhesinas de

algunos hongos juegan un papel importante. Este es el caso de la

fibronectina, trombina, lectinas y factor G, esenciales para que el

microorganismo se establezca en el tejido (Mitola et al., 2001).

Por otro lado su capacidad para adherirse al material plástico como

catéteres y lentes de contacto, también representa un factor de

virulencia. Esta interacción se ha determinado mediante la

observación con microscopio electrónico. El hongo se adhiere a los

catéteres, pero no invade la pared de éstos. Por el contrario, se

adhieren, penetran y proliferan dentro de los lentes de contacto

(Monzón & Rodríguez, 2007).

Dentro del género Fusarium sp. se encuentran algunas especies

productoras de toxinas que producen más de 50 sustancias tóxicas,

que pueden causar sensibilidad del tejido o necrosis hasta la

extrema inmunodeficiencia y producir efectos mutagénicos y

cancerígenos tanto en el hombre como en animales (Marasas,

1984; Di Pietro & Roncero, 2005). Las micotoxinas son metabolitos

secundarios de bajo peso molecular y termoestables. Pueden ser

producidas en los alimentos como resultado del crecimiento del

hongo; algunas requieren condiciones especiales de humedad y

temperatura para su producción (Díaz, 1997).

14

2.5.2. Factores de virulencia enzimáticos

Fusarium sp. tiene la capacidad de producir enzimas tales como

pectinliasas, celulasas, arabinasas, poligaracturonidasas, entre

otras polisacaridasas que pueden alterar o degradar distintos

polisacáridos presentes en las paredes celulares. Este complejo

enzimático constituye un importante factor de virulencia para

Fusarium, ya que le permite no solo penetrar el tejido del

hospedero al mediar la maceración tisular y la disgregación de la

estructura de la pared, sino que es un mecanismo necesario para

obtención de nutrientes (Di Pietro & Roncero, 2005).

Fusarium sp. fitopatógeno necesita atravesar las paredes celulares

de sus hospederos para proliferar en el apoplasto y tener acceso al

protoplasto. Debido a que durante el proceso infeccioso el hongo

encuentra diversas barreras estructurales tales como endodermis,

paredes vesiculares, tilosas etc., se ha establecido que la secreción

de un complejo enzimático que actua en la degradación de la pared

celular (cell wall-degrading enzymes CWDEs) es el mecanismo

principal mediante el cual se depolimeriza cada uno de los

componentes de las paredes celulares (celulosa, xilano, pectinas,

ácidos poligalacturónicos y extensinas) (Di Pietro & Roncero, 2005).

Las CWDEs son utilizadas por los patógenos durante el proceso de

infección para diferentes propósitos, tales como penetración y

ramificación dentro de los tejidos de la planta hospedera, liberación

de nutrientes o interferencia con la respuesta de defensa de la

15

planta (Guevara, 1997; Roncero et al., 2000; Di Pietro & Roncero,

2005).

Algunos hongos presentan capacidad queratinofílica y

queratinolítica como un importante factor de virulencia, ya que les

permite colonizar tejidos de humanos y animales principalmente y

de esta forma convertirse en agentes patógenos. Estudios

realizados han establecido la existencia de dos tipos de enzimas.

Aquellas que presentan actividad “endo” (actúan en los enlaces

centrales de la molécula), capaces de producir maceración y por

tanto destrucción de tejidos; mientras el otro tipo que posee

actividad “exo” (actúan en los enlaces externos de la molécula),

proporcionan nutrientes al patógeno a partir de las sustancias

pécticas de la pared del hospedero (Imai, 1991).

Las enzimas extracelulares de hongos dermatofitos y

queratinofílicos habitantes del suelo son proteasas neutras o

alcalinas. Sin embargo no se ha podido establecer una clasificación

adecuada basada en las características de las proteasas purificadas

de hongos queratinofílicos (Richardson & Edgard, 2000). Otro grupo

de enzimas secretadas por estos hongos son las lipasas y esterasas

(Roncero et al., 2000; Kunert, 2000).

La producción y secreción de enzimas proteolíticas se lleva a cabo a

través del micelio activo de hongos dermatofitos y de géneros de

hongos queratinofílicos como Fusarium sp. (Richardson & Edgard,

2000). Los hongos queratinofílicos producen un complejo de

enzimas proteolíticas (Kunert, 2000). Pueden hidrolizar muchas

16

proteínas solubles (caseína, gelatina, albúmina, hemoglobina,

mioglobina, etc.) y otras insolubles (queratina, elastina, colágeno,

fibrina, fibronectina etc.) (Imai, 1991).

Los sustratos de queratina son atacados por proteasas no

específicas, y el índice de hidrólisis que presente esta proteína

depende del contenido de cistina, ya que entre mayor es el

contenido de dicho aminoácido no esencial (queratina dura) es más

lenta su descomposición (Imai, 1991; Muhsin & Hadi, 2002).

Otro grupo de enzimas que le confieren la capacidad de virulencia a

los hongos queratinofílicos, son las lipasas y las esterasas. La

actividad de las primeras se puede determinar utilizando sustratos

como aceite de oliva y Tweens (particularmente Tween 60 y 80)

(Brash & Zaldua, 1994). Para evaluar la presencia de esterasas y

fosfolipasa A, se utiliza como sustrato la tributirina, ya que estas

enzimas intervienen en el clivaje de esta molécula. (Kunert, 1988;

Brash & Zaldua, 1994; Papini, 1996; Kunert, 2000). En un estudio

realizado por Brasch y Zaldua (1994), se determinó que las lipasas

y las fosfolipasas son producidas no sólo en los medios que

contienen lípidos, sino también en medios con queratina (pelo

humano, uñas, cascos, plumas, etc.).

2.5.2.1. Queratinasas

La queratina, una escleroproteína altamente resistente, integra la

mayor parte del material contenido en las células que forman la

epidermis de la piel de mamíferos, pelos, uñas, escamas, plumas,

17

espinas, cuernos y pezuñas de animales; también, es componente

de la lana y la matriz de los dientes (Kunert, 2000; Mitola et al.,

2001).

La degradación de la queratina, es un proceso enzimático llevado a

cabo por las queratinasas (Paveia, 1975). Puede ser evidenciada

morfológicamente sobre sustratos queratináceos a través de la

expresión de estructuras fúngicas especializadas emitidas por los

hongos que los atacan, que son básicamente algunas variaciones en

el grosor y morfología de sus hifas (Mitola et al., 2001).

La degradación de la queratina es el resultado de la acción de tres

factores ligados a la acción enzimática: desaminación (crea un

ambiente alcalino necesario para el aumento del ataque al sustrato,

sulfitolisis y ataque proteolítico), sulfitolisis (desnaturaliza el

sustrato quitando puentes de disulfuro) y proteolisis (cliva el

sustrato desnaturalizando los productos solubles) (Kunert, 1988;

Kunert, 2000).

2.6. HONGOS QUERATINOFÍLICOS

En los hábitats naturales, la Queratinolisis fúngica la ejercen

especies de hongos queratinolíticos, casi siempre acompañados por

especies queratinofílicas. Las primeras se definen como las que

presentan capacidad para destruir y/o descomponer la queratina,

mientras las segundas, las cuales ocurren con frecuencia sobre los

sustratos queratináceos, sólo son capaces de utilizar materiales

asociados a la queratina tales como el contenido intercelular,

18

sedimentos protoplasmáticos o algunos derivados de la degradación

parcial de ésta (Mathison, 1962; Kunert, 2000; Muhsin & Hadi,

2002).

Los hongos queratinolíticos más activos son los dermatofitos

(particularmente especies de Microsporum y Trichophyton) y los

relacionados con éstos (Hilmioglu-Polat et al., 2005). Aunque

también hongos no dermatofitos como Fusarium presentan una

buena actividad queratinolitica. Estos hongos, aislados del suelo

como saprófitos, digieren queratina in vitro al utilizarla como

sustrato, y como patógenos invaden tejidos in vivo. No obstante, su

morfología en la fase de crecimiento parasítico es diferente de la

exhibida en cultivo (Kunert, 2000; Muhsin & Hadi, 2002).

Muchas analogías in vitro han sido referidas al modo en como son

atacados el pelo, las pezuñas, las plumas y las uñas; se ha asociado

como factor de patogenicidad indicando que el hongo que es capaz

de colonizar estos tejidos también tiene la capacidad de

comportarse como patógeno produciendo enfermedad sobre tejidos

queratinizados (Kunert, 2000; Mitola et al., 2001; Muhsin & Hadi,

2002).

19

3. JUSTIFICACIÓN

3.1. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

Fusarium es un género de hongos cosmopolita. Se encuentra

generalmente en el suelo y se ha reportado desde hace varios años

como patógeno de diversos cultivos de importancia económica,

tales como el del tomate y el del clavel, entre otros. Igualmente se

ha asociado a infecciones patógenas en tejidos animales, incluido el

hombre. En la literatura se citan algunas características que

facultan a Fusarium como patógeno de estos diferentes hospederos,

dentro de las que se destacan la producción de enzimas líticas que

favorecen el proceso de colonización del tejido, como queratinasas,

celulasas, proteasas y pectinasas, entre otras. Otra característica

que se destaca es la capacidad de adaptarse a diversos ambientes y

resistir condiciones de estrés, ya que produce estructuras de

resistencia como clamidosporas.

Actualmente se desconoce hasta qué punto están conservados los

mecanismos de infección en los diferentes grupos de hospedadores.

Una de las principales causas de esta falta de conocimiento es la

ausencia de modelos fúngicos que permitan el análisis simultáneo

de la virulencia en ambas clases de organismos.

De aquí surge la preocupación de la posibilidad que este género sea

capaz de producir infección cruzada y de esta manera poner en

riesgo la salud animal, humana y la producción agrícola. Aunque no

20

se ha reportado este peligro, tampoco existen publicaciones que

descarten este riesgo.

3.2. JUSTIFICACIÓN

La presente investigación comprende la primera etapa de un

proyecto que busca evaluar la capacidad que tendrían los

aislamientos de Fusarium sp. de infectar varios hospederos y

caracterizarlos enzimática y molecularmente.

Dentro de esta primera etapa se realizó el aislamiento de 30 cepas

de Fusarium sp. provenientes de procesos patológicos de plantas,

humanos y animales; y, la evaluación de la capacidad de tres cepas

de cada hospedero para producir infección cruzada entre los

mismos. Los modelos utilizados incluyen plántulas de tomate y

tejidos queratinizados (pelo humano y casco de vaca).

Teniendo en cuenta que la capacidad de evolución de los

microorganismos y su rápida capacidad para colonizar nuevos

hospederos, se planteó la necesidad de crear un proyecto donde se

evalúe esta capacidad para atacar importantes productos agrícolas

de exportación como el clavel y el tomate, entre otros, básicos para

la economía colombiana. También debe su interés a la posibilidad

de ser utilizado como controlador de cultivos ilícitos y, adicional, ser

reportado como un patógeno emergente tanto para humanos como

para animales, independiente del estado de su sistema

inmunológico.

21

Debido a que los modelos de patogenicidad cruzada permiten

establecer relaciones entre las infecciones en animales, humanos y

plantas, este proyecto aporta datos de partida, a nivel de

procedimientos y resultados para estudios de actividad enzimática,

que permitan esclarecer este tipo de relaciones y condicionamientos

para que estas se presenten.

22

4. OBJETIVOS

4.1. OBJETIVO GENERAL

Evaluar de forma preliminar la capacidad de producir infección

cruzada de cepas de Fusarium sp., aislados de procesos patológicos

de plantas, humanos y animales.

4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Establecer un banco de cepas de Fusarium a partir de

dermatomicosis y queratitis en animales y marchitamiento

vascular y pudrición basal en plantas.

• Recuperar aislamientos de Fusarium provenientes de

onicomicosis en humanos para su establecimiento en el banco

de cepas.

• Desarrollar pruebas de infección cruzada de las cepas

obtenidas de Fusarium sp., provenientes de plantas, animales

y humanos, sobre plántulas de tomate y tejidos

queratinizados.

23

5. MATERIALES Y MÉTODOS

El proyecto se desarrolló en el Laboratorio de Micología de la

Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana, y en el

invernadero construido en la Calle 146 Nº 54 – 57.

5.1. ORIGEN DE LOS AISLAMIENTOS DE Fusarium sp.

Los aislamientos de humanos fueron donados por el Laboratorio de

Micología de la Pontificia Universidad Javeriana. 12 de estos

provenían de lesiones de onicomicosis y se encontraban

conservados en agua destilada estéril, y un último aislamiento

provenía de una lesión de queratitis.

A partir de los frascos de conservación se tomó micelio que fue

sembrado en agar papa dextrosa (PDA). Una vez desarrollados los

hongos, se seleccionaron nueve aislamientos provenientes de

onicomicosis que cumplieran con las características de buen

desarrollo de la colonia y presencia de abundantes macro y

microconidias, y el aislamiento proveniente de queratitis.

Para la obtención de los aislamientos de lesiones en animales, se

procesaron un total de 62 muestras provenientes de lesiones que

presentaban sintomatología de infección por hongos en ojos

(opacos y con lagrimeo abundante) y piel (focos rojizos, en

ocasiones con pérdida de pelaje). Estas muestras se obtuvieron de

clínicas veterinarias urbanas o directamente en campo.

24

Los aislamientos de plantas se obtuvieron al procesar un total de 17

muestras de plantas (cinco de estas muestras fueron procesadas de

plantas de clavel, 11 solanáceas y una cucurbitácea); que

presentaban sintomatología típica de marchitamiento vascular y

pudrición basal, características de Fusarium sp.

5.2. PROCESAMIENTO MATERIAL VEGETAL

Para el aislamiento en laboratorio del patógeno presente en el

material vegetal con los síntomas característicos de Fusarium sp.,

se realizó un lavado superficial del material con agua corriente y se

realizaron 15 cortes transversales de 3-5 mm que incluyeran tejido

sano y afectado. A dichos cortes se les realizó una desinfección

superficial con agua destilada estéril por dos minutos;

posteriormente se sumergieron en hipoclorito de sodio (NaClO) al

2.6% v/v por dos minutos y por último se hicieron tres lavados en

agua destilada estéril por dos minutos (Forero, 2007).

El material vegetal fue secado con papel absorbente estéril y

finalmente se sembraron cinco cortes con inclinación aproximada de

30° por caja de Petri con PDA suplementado con cloranfenicol (50

ppm). Este procedimiento se realizó por triplicado para cada planta,

y fue incubado a temperatura ambiente (22 + 2ºC) por siete días.

Pasado este tiempo, se observaron las estructuras típicas de

Fusarium sp., y se procedió a realizar cultivos monospóricos de los

mismos (Riveros et al., 2001; Ardila & Higuera, 2005; Forero,

2007).

25

Figura 5.1. Cortes transversales

Figura 5.2. Lavado y desinfección de cortes transversales

Figura 5.3. Puntos de siembra y crecimiento de agentes fitopatógenos

26

5.3. TOMA Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS ANIMALES

A partir de lesiones cutáneas se tomaron muestras mediante

raspado de piel con bisturí. Después de hacer una desinfección del

área, con alcohol al 70% para remover detritus y contaminantes

secundarios. Los raspados se realizaron en el borde de las lesiones

para aumentar la probabilidad de encontrar el agente causal de la

lesión (Calado et al., 2005; Franco, 2006).

Una metodología alterna, utilizada para la obtención de muestras

de lesiones cutáneas, se realizó siguiendo el protocolo de Pulido

(2007), que consiste inicialmente en una desinfección con alcohol al

70% y la toma de la muestra con un hisopo humedecido en agua

estéril y posteriormente con un hisopo seco. Los dos hisopos se

guardaron como una sola muestra.

Para lesiones de queratitis las muestras fueron tomadas mediante

frotis del saco conjuntivo con un hisopo estéril humedecido en agua

estéril (Rosa et al., 2003; Hilmioglu-Polat et al., 2005).

Las muestras se transportaron en tubos de ensayo estériles

refrigerados y se sembraron, por triplicado, en PDA suplementado

con cloranfenicol (50 ppm) y agar Sabouraud suplementado con

cloranfenicol (50 ppm), pH 5.6 ± 0.2, y se incubaron a temperatura

ambiente por siete días, con observación macroscópica periódica. El

hongo que se presentaba en todos los puntos de siembra fue

repicado en PDA. Una vez identificado el aislamiento como

27

Fusarium sp., se procedió a la realización de cultivos monospóricos

(Rosa et al., 2003; Calado et al., 2005).

5.4. REALIZACIÓN DE CULTIVOS MONOSPÓRICOS

Los cultivos monospóricos se realizaron mediante una suspensión

de conidios en solución salina 0.85% p/v más Tween 0.1% v/v, con

una concentración mínima de 1.5 x 106 conidios/mililitro

determinada por recuento en cámara de Neubauer, a partir de la

cual se hicieron diluciones en base diez con un volumen final de

cinco mililitros con el fin de obtener una concentración de 100

esporas por mililitro, de la cual se sembraron 100 μL en superficie

en PDA con cloranfenicol (50 ppm) e incubada a 25 + 2°C.

La evaluación y selección de una espora germinada se realizó bajo

observación en estereoscopio a las 12 horas post-siembra y se dejó

incubando nuevamente durante 48 horas, tiempo en el cual el

tamaño de la colonia permitía realizar un repique a PDA.

5.4. Desprendimiento de conidios para suspensión.

28

Figura 5.5. Cultivos monospóricos.

5.5. IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA DE LOS

AISLAMIENTOS

La identificación taxonómica a nivel de género se llevó a cabo a

partir de los cultivos monospóricos, utilizando como base

metodologías y claves de identificación elaboradas por De Hoog y

colaboradores (2000), las cuales consideran la observación de

características microscópicas.

Las características morfológicas se determinaron por observaciones

macroscópicas de hongos filamentosos con textura algodonosa de

color blanco, crema, rosado, púrpura, salmón y morado con reverso

rosado, blanco, ámbar o morado; adicionalmente, mediante

microscopia directa con el objeto de determinar presencia de falsas

cabezas mucilaginosas, tipo de fiálides, macroconidios y presencia o

ausencia de clamidosporas de hongos desarrollados en PDA.

29

5.6. PRESERVACIÓN DE LOS AISLAMIENTOS

5.6.1. Conservación de hongos en agua destilada estéril

Los aislamientos repicados en PDA de los cultivos monospóricos,

fueron cortados en discos de seis milímetros de diámetro, utilizando

la parte posterior de pipetas Pasteur, trasladados a frascos de vidrio

con 30 mL de agua destilada estéril con tres ciclos de autoclavado

(121:15:15) para asegurar la esterilidad, sellados y almacenados a

temperatura ambiente (Bueno & Gallardo, 1998).

Figura 5.6. Discos de Agar-Micelio para conservación en agua destilada.

5.6.2. Conservación en aceite mineral estéril

El método utilizado fue el de capa de aceite mineral, que consistió

en inocular los hongos provenientes de los cultivos monospóricos ya

desarrollados en tubos que contienen agar PDA en pico de flauta,

que después de su desarrollo se cubrieron con una capa de aceite

mineral estéril (tres ciclos de autoclavado 121:15:15) y se

conservaron a temperatura ambiente (Panizo et al., 2005).

30

Figura 5.7. Conservación en aceite mineral.

5.6.3. Conservación en papel filtro estéril

Para realizar la metodología de conservación en papel, inicialmente

se cortaron cuadros de papel filtro de 1 x 1 cm que se llevaron a

esterilizar (tres ciclos de autoclavado 121:15:15). Paralelamente se

hicieron sobres en papel parafinado de 6 x 4 cm que se llevaron a

esterilizar (tres ciclos de autoclavado 121:15:15) junto con sobres

de papel bond de 8 x 5 cm.

Los cuadros de papel filtro estéril se trasladaron a medio PDA de tal

forma que el agar humedeciera el papel (21 cuadros por caja de

Petri); cada cuadro fue inoculado con el hongo a conservar

procedente del cultivo monospórico e incubado a temperatura

ambiente hasta obtener colonización del papel. Posteriormente

estos cuadros se trasladaron a cajas de Petri estériles y se secaron

a 26ºC por 15 días. Por último los cuadros de papel secos se

introdujeron en los sobres de papel parafinado estéril y estos a su

vez en los sobres de papel bond.

31

Para conservar los sobres se introdujeron en bolsas Ziploc (cada

cepa por separado) de tal forma que se permitiera la conservación

en la nevera sin afectar las propiedades físicas de los sobres de

papel por efecto de la humedad.

A. B.

C. Figura 5.8. Metodología conservación en papel filtro. A. Aislamientos crecidos en papel

filtro por 15 días; B. Traspaso cuadro de papel filtro colonizados a sobres papel

parafinado; C. Conservación sobres papel parafinado, en sobre de papel bond.

5.7. ENSAYOS DE PATOGENICIDAD CRUZADA

Para la realización de los ensayos de patogenicidad cruzada se hizo

un muestreo aleatorio sin reemplazo de tres aislamientos de cada

hospedero. El muestreo se realizó utilizando la tabla de números

aleatorios de Daniel (1997). Se evaluaron una totalidad de nueve

32

aislamientos (tres de cada hospedero) en cada uno de los ensayos

de patogenicidad.

Los aislamientos de plantas utilizados en este ensayo cumplieron

previamente con los Postulados de Koch, que consisten en la

inoculación de plántulas de tomate con los mismos, para confirmar

su capacidad patogénica y un posterior re-aislamiento confirmando

su presencia como agente causal de la enfermedad.

Figura 5.9. Cumplimiento de los postulados de Koch en plántulas de tomate y clavel.

5.7.1. Actividad fitopatógena

5.7.1.1. Preparación del inóculo

De cada cepa de Fusarium sp., originaria de cultivo monospórico, se

realizaron subcultivos en PDA que fueron incubados por siete días a

25 + 2ºC donde se observó una alta producción de conidios. La

colección de conidios se llevó a cabo por desprendimiento de la

colonia con perlas de vidrio estéril y 10 mL de solución salina

0.85% p/v más Tween 0.1% v/v, realizando movimientos

rotacionales (Astudillo & Blanco, 1999). Esta suspensión se diluyó

33

en 50 mL de solución salina estéril al 0.85% p/v pH 5.5 + 0.2 hasta

alcanzar una concentración celular de 106 conidios/mL. El recuento

fue realizado en cámara de Neubauer (Marín, 2003).

5.7.2. Inoculación de plántulas

La evaluación de actividad fitopatógena se realizó en plántulas de

tomate, variedad Chonto Santa Clara, susceptible a infección por

Fusarium sp. Las plántulas de tomate con dos pares de hojas

verdaderas, de aproximadamente 30 días post-germinación, fueron

compradas en una empresa germinadora de semillas de tomate.

Para la inoculación de las plántulas de tomate, inicialmente se

realizó un lavado al sistema radicular con agua corriente para

eliminar los residuos de sustrato; se realizaron pequeños cortes a

los ápices de las raíces y se sumergieron en el inóculo durante 30

minutos. Este procedimiento se realizó en 10 plántulas por cada

cepa a evaluar. Se utilizaron como control negativo 10 plántulas

inoculadas con solución salina 0.85% p/v estéril, para un total de

100 plántulas (Rodríguez-Molina et al., 2003).

Las plantas se mantuvieron en sustrato (suelo - cascarilla de arroz,

relación 3:1, esterilizado con tres ciclos de autoclavado,

homogenizando entre ciclos para eliminar vapores tóxicos) bajo

condiciones de invernadero a temperatura aproximada de 22°C, en

macetas individuales para cada plántula. La distribución de las

plántulas en el invernadero se hizo de forma aleatoria y la

fertilización se hizo con una formulación comercial de macro y

34

micro nutrientes (Nutriponic). La revisión de síntomas se realizó

semanalmente durante 51 días, al cabo de los cuales se realizó un

re-aislamiento de las cepas mediante la metodología de Jiménez

(2004) (Lara, 1999; Marín, 2003; Rodríguez-Molina et al., 2003).

A. B. 5.10. Procedimiento inoculación de plántulas. A. Corte de los ápices de las raíces. B.

Plántula sumergida en inoculo.

La metodología de Jiménez (2004) es un método cuantitativo que

permite valorar la progresión de la enfermedad, en tallo y raíces.

La muestra a evaluar se tomó ubicando la corona y a partir de esta

se tomaron 5 cm del tallo y 5 cm de la raíz principal. Una vez

realizado el corte de tallo y raíz principal, se efectuó un lavado con

agua corriente para eliminar residuos del sustrato y posteriormente

una desinfección del material (inmersión y agitación por un minuto

en NaClO al 2.5% v/v y tres enjuagues por dos minutos en agua

destilada estéril). Luego de secado el material vegetal en papel

filtro, previamente esterilizado en luz UV por 24 horas, se procedió

al corte en secciones de 0,5 cm y siembra en espiral, de dichas

35

secciones, en forma descendente en cajas de Petri con PDA

suplementado con cloranfenicol (50 ppm).

Los cultivos se incubaron a 22 + 2°C durante 6 días, en los cuales

se le hizo seguimiento diario para poder determinar la progresión

de la enfermedad.

A. B.

C. Figura 5.11. Re-aislamiento de cepas, prueba fitopatógena. A. desinfección de plantas. B.

cortes de tallo, corona y raíz. C. Siembra de cortes en espiral.

5.7.3. Actividad patógena sobre tejido animal y humano.

Se desarrollaron dos modelos de infección in vitro, asociados a la

degradación de queratina sobre cascos de vaca pulverizados y

cabello humano castaño cortado en secciones de un cm.

36

5.7.3.1. Modelo in vitro de patogenicidad animal y humano

Para el análisis de la degradación de queratina, a partir de los

sustratos anteriormente mencionados, se utilizó el método de

pérdida de peso, utilizado por Singh (1999 y 2002).

Las nueve cepas se sembraron utilizando como inóculo un disco de

6 mm de diámetro en 25 mL de caldo glucosa gelatina (glucosa

10g/l, gelatina 10g/l, K2HPO4 1 g/l, MgSO4*7H2O 0.5 g/l, pH 7.0)

en erlenmeyer de 150 mL con agitación constante durante 21 días.

Estos cultivos fueron tomados como control positivo de crecimiento

y producción de biomasa de cada aislamiento.

Simultáneamente, las cepas fueron sembradas en caldo glucosa-

gelatina modificado, en el cual la gelatina fue remplazada por 250

mg del sustrato (pelo ó casco) previamente esterilizado

(121:15:15). También se hizo una siembra con los sustratos en

ausencia de glucosa. La inoculación se realizó de la misma manera

que el control positivo de crecimiento y se mantuvo bajo las

mismas condiciones de incubación. Como control de peso de

queratina se realizó el montaje de erlenmeyers que contenían sales,

sustrato (pelo o casco) y sin inoculación.

Los cultivos fueron observados macroscópicamente a diario y

pasado el tiempo de incubación, se analizaron microscópicamente

para asegurar su pureza.

37

Después del tiempo de incubación, los cultivos fueron filtrados y

secados en papel filtro estéril a 80ºC por 12 horas. Posteriormente

se pesaron para obtener un peso seco total (sustrato más micelio).

A. B. 5.12. Método de peso seco. A. Filtración de incubado. B. secado a 80º C.

La degradación de queratina fue determinada mediante la

diferencia del peso seco total y la biomasa total, determinada en el

control positivo de crecimiento. Este resultado se le restó al peso

seco de la queratina no inoculada (Singh, 1999).

También se hicieron siembras en los mismos medios con adición de

agar-agar, para tener una apreciación cualitativa del crecimiento de

los aislamientos sobre el sustrato de queratina. La inoculación se

llevó a cabo de la misma manera que en los medios líquidos,

introduciendo un disco de 6 mm de diámetro en el centro de la caja

de Petri sobre el sustrato queratinizado.

38

Figura 5.13. Montaje de medios sólidos, prueba sobre tejido queratinizado.

5.8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Se realizó un análisis de varianza a los resultados, utilizando el

programa estadístico SAS, mediante la aplicación de la prueba de

rango múltiple de Duncan para obtener agrupaciones de las

variables analizadas.

Los resultados de la progresión de la enfermedad en plantas se

analizaron mediante la técnica de área bajo la curva y a partir de

estos resultados se realizaron los análisis anteriormente

mencionados.

A partir de los resultados de las pruebas de Duncan realizadas a los

tres modelos se realizó un análisis de correlaciones.

39

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1. ORIGEN DE AISLAMIENTOS

Los aislamientos de hospedero humano se obtuvieron a partir de la

recuperación de conservaciones en agua de 12 cultivos de hongos

que provenían de onicomicosis. Se obtuvo un buen desarrollo de

diez de estos y los dos restantes crecieron con flora acompañante.

La selección de las nueve cepas a trabajar, se realizó teniendo en

cuenta el buen desarrollo de las colonias en PDA y se descartó el

aislamiento que presentó menor esporulación con respecto a los

otros. Para completar los diez aislamientos necesarios para el

desarrollo del proyecto, se obtuvo un aislamiento proveniente de

queratitis que estaba siendo utilizado en el proyecto de

investigación “Estudio in vitro de germinación de Fusarium sp. en

los materiales de lentes de contacto blandos y eficacia de las

soluciones multipropósito contra este microorganismo”. Esta cepa

se encontraba en PDA con un buen desarrollo y alta esporulación

(Tabla 6.1).

Tabla 6.1. Aislamientos de Fusarium sp. de origen humano

Número identificación Origen Lesión Organismo

aislado 201 Clínico Onicomicosis Fusarium sp. 202 Clínico Onicomicosis Fusarium sp. 203 Clínico Queratitis Fusarium sp. 204 Clínico Onicomicosis Fusarium sp. 205 Clínico Onicomicosis Fusarium sp. 206 Clínico Onicomicosis Fusarium sp. 207 Clínico Onicomicosis Fusarium sp. 208 Clínico Onicomicosis Fusarium sp. 209 Clínico Onicomicosis Fusarium sp. 210 Clínico Onicomicosis Fusarium sp.

40


aislado 211 Clínico Onicomicosis Fusarium sp. 212 Clínico Onicomicosis Fusarium sp. 213 Clínico Onicomicosis Fusarium sp.

El porcentaje de recuperación de los aislamientos de humanos

conservados en agua, tomando las 12 muestras procesadas como el

100%, corresponde al 83%. Este porcentaje no difiere en gran

medida de los resultados obtenidos por Bueno y Gallardo (1998) y

por Panizo y colaboradores (2005), en los estudios orientados a

evaluar la viabilidad del método de conservación de cepas en agua

destilada, en los cuáles se obtuvo un porcentaje de recuperación

del 100%, debido a que ninguno presentó contaminación

bacteriana, por ácaros o por otros hongos. La razón por la cuál

durante el desarrollo del presente trabajo se obtuvo el 83% de

recuperación, se atribuye a la presencia de contaminación en dos

de las muestras, la cual puede ser relacionada a errores

experimentales en el momento de la conservación, como lo

relacionaron Panizo y colaboradores en su estudio.

El presente estudio no permite establecer ningún tipo de incidencia

y/o predilección de las patologías causadas por Fusarium sp.,

debido a que la cantidad de aislamientos es muy baja para este tipo

de estudios. Sin embargo, se logró corroborar que este género está

relacionado con patologías en humanos, como se ha venido

reportando desde hace ya dos décadas y que se puede comprobar

con el origen y la hoja de vida de estos aislamientos (Anexo 1). Y

permite confirmar que entre las patologías producidas por Fusarium

sp. en humanos, se destacan afecciones dérmicas y oftálmicas

41

relacionadas con la característica de ser hongos queratinolíticos, lo

que concuerda con lo reportado por Hennequin y colaboradores

(1997), Mayayo (1999), Kunert (2000), Garces y colaboradores

(2001).

A partir de lesiones provenientes de animales, se procesaron un

total de 62 muestras, de las cuales 24 resultaron positivas para

hongos (Tabla 6.2), y en 10 de estas se aisló Fusarium sp. Las 38

muestras restantes no se tuvieron en cuenta ya que presentaban

contaminación bacteriana o porque el cultivo no presentaba

crecimiento del mismo agente aislado en todos los puntos de

siembra.

Tabla 6.2. Procesamiento de muestras provenientes de lesiones de animales


aislado 101 Canino Dermatitis generalizada en lomo Micelio estéril

108 Bovino Lagrimeo abundante e inflamación del párpado Fusarium sp.

111 Canino Dermatitis generalizada, extremidades anteriores Fusarium sp.

112 Canino Lesión costrosa interdigital Micelio estéril 116 Bovino Descamación de piel en lomo Micelio estéril 119 Ave Descamación en pata Dermatofito 120 Ave Descamación en pata Aspergillus sp.

121 Canino Dermatitis generalizada, lomo zona anterior Fusarium sp.

122 Bovino Lagrimeo abundante y tumor en ojo Micelio estéril

127 Bovino Descamación en pata Dermatofito

131 Canino Dermatitis en lomo, zona anterior Fusarium sp.

138 Ave Descamación pata Micelio estéril 143 Bovino Costras en hocico Scopulariopsis sp. 146 Bovino Costras en párpado Scopulariopsis sp. 152 Canino Dermatitis generalizada en lomo Aspergillus sp. 153 Canino Dermatitis cola Aspergillus sp 154 Bovino Dermatitis lomo zona media Dermatofito 155 Canino Dermatitis lomo zona posterior Fusarium sp.

42


aislado 156 Canino Dermatitis lomo zona posterior Fusarium sp.

157 Canino Lagrimeo abundante e inflamación párpado Aspergillus sp.

159 Canino Dermatitis generalizada zona abdominal Fusarium sp.

160 Bovino Dermatitis en lomo, zona media Fusarium sp. 161 Canino Dermatitis zona media del lomo Fusarium sp. 162 Canino Dermatitis lomo zona posterior Fusarium sp.

La incidencia de los hongos en las muestras de animales analizadas

presenta un valor de 39%, el cual es relativamente bajo si se tiene

en cuenta que las infecciones por dermatofitos fueron las primeras

enfermedades infecciosas descritas y reconocidas desde el siglo

pasado, como lo menciona Mitchell (1983) en su trabajo. A partir

del reconocimiento de hongos patógenos, los estudios

histopatológicos van orientados principalmente para el diagnóstico

de micosis en patología veterinaria, como lo mencionan Pérez y

Carrasco (2000). Adicionalmente, si se tiene en cuenta que otros

organismos que afectan la dermis de animales son agentes

patógenos oportunistas (bacterias y ácaros), los resultados

obtenidos de las lesiones evaluadas se pueden correlacionar con los

estudios y reportes mencionados anteriormente. Sin embargo, es

importante resaltar que las muestras que no se identificaron como

hongos (61%), agrupan no solo a otros agentes patógenos, sino

también a los casos donde no todos los puntos de siembra

presentaban el mismo agente aislado, y aquellas muestras en

donde se presentaba carga bacteriana debido a la dificultad de

realizar una correcta desinfección en la dermis del animal. Este

último caso pudo ser un factor que imposibilitó el crecimiento

fúngico, debido a que las muestras a analizar no se sometieron a

ningún tratamiento de inmersión en antibióticos, y el medio

43

preparado fue PDA sin suplementos. Los resultados obtenidos

fueron un punto de corrección durante el desarrollo del trabajo ya

que, para realizar los repiques y purificación de los aislamientos, se

tuvo en cuenta la importancia de suplementar PDA con

cloranfenicol.

El porcentaje de aislamiento de Fusarium sp., en el total de las

muestras tomadas de animales es del 16%. No obstante, en la

Figura 6.1 se observa que la incidencia de aislamiento de Fusarium

sp. frente a otros hongos es de 41.7%, comprobando lo establecido

en varios estudios llevados a cabo en los últimos años por Andrew y

colaboradores (1998) y, Betbeze y colaboradores (2006), donde se

ha visto incrementada su relación con afecciones oftálmicas y

sistémicas principalmente. Este estudio permite demostrar la

incidencia que presenta este hongo como agente causal de micosis

superficiales (infecciones dérmicas), que se reportan con menor

frecuencia frente a otras patologías causadas por este género,

como son intoxicaciones por producción de toxinas, onicomicosis en

los cascos e infecciones sistémicas. (Oliveira et al., 2002; Ortoneda,

2003; Elligot et al., 2006).

44

Frecuencia aislamiento

20,8

41,7

16,7

12,58,3

Micelio estéril Fusarium sp. Aspergillus sp.

Dermatófitos Scopularipsis sp.

Figura 6.1. Porcentaje de frecuencia de aislamiento de hongos en muestras animales

Algunos de los patrones que se pueden establecer a partir de los

resultados obtenidos en este proyecto, permiten establecer a

Fusarium sp., como agente causal no solo de queratomicosis sino

también como patógeno frecuente que causa lesiones superficiales

en la dermis de una gran variedad de especies animales.

Igualmente permite establecer que causa infecciones con mayor

frecuencia en caninos y bovinos como lo indica la Tabla 6.2.

Adicionalmente, se comprobó lo reportado por Ortoneda (2003) y

Godoy y colaboradores (2004), quienes afirman que las patologías

causadas por Fusarium sp. son mayores en áreas tropicales y

subtropicales (clima cálido y húmedo) aumentando su incidencia en

temporadas de lluvia por las variaciones de temperatura y

humedad, condiciones que se relacionan directamente con la

capacidad de germinación de las esporas del microorganismo y de

esta forma causar patologías.

El último origen de aislamiento pertenece a especies vegetales, de

las cuales se procesaron un total de 17 muestras de plantas (diez

45

solanáceas, una cucurbitácea y seis claveles) siendo positivas 16

para Fusarium sp, como se muestra en la Tabla 6.3.

Tabla 6.3. Aislamientos a partir de material vegetal

Número identificación Origen Sintomatología Hongo aislado

301 Tomate

Marchitamiento generalizado y pudrición de haces vasculares

Fusarium sp.

302 Clavel

Marchitamiento unilateral de la planta y pudrición de haces vasculares

Fusarium sp.

303 Tomate


Fusarium sp.

304 Tomate de árbol


Fusarium sp.



Fusarium sp.

306 Tomate


Fusarium sp.

307 Calabacín Marchitamiento Fusarium sp.

308 Tomate


Fusarium sp.

309 Tomate


Fusarium sp

310 Tomate


Fusarium sp

311 Tomate


Fusarium sp

46

Número identificación Origen Sintomatología Hongo aislado

312 Tomate


Fusarium sp

313 Clavel

Marchitamiento unilateral de la planta, pudrición de haces vasculares

Fusarium sp.

314 Clavel


Fusarium sp.

315 Clavel


Fusarium sp.

316 Lulo


No identificado

317 Clavel


Fusarium sp.

La Tabla 6.3 permite establecer una prevalencia del 94% de

Fusarium sp. en las muestras analizadas, confirmando la frecuencia

que tiene este patógeno en las especies investigadas (solanáceas y

clavel) y cómo puede ser aislado frecuentemente (Caracuel et al.,

2003; Ardila & Higuera, 2005). Por otro lado, esto permite

confirmar que la sintomatología que ha sido descrita por varios

autores como típica de la infección causada por este género, orienta

eficazmente a la identificación de Fusarium sp. como fitopatógeno.

A su vez, los resultados permiten ratificar la razón por la cual el

género Fusarium sp., ha sido uno de los más estudiados como

47

fitopatógeno, por su alta prevalencia en cultivos de importancia

económica y su severidad en estos hospederos (Monzón &

Rodríguez, 2007).

6.2. MODELO DE INFECCIÓN EN PLANTAS

Los inóculos de los nueve aislamientos de Fusarium sp. utilizados

en la prueba, se prepararon como suspensión de conidios en 50 mL

de solución salina 0.85% p/v más Tween 0.1% v/v, con

concentración final de 106 conidios/mL. Estas se mantuvieron a

temperatura ambiente (19 + 2°C) durante dos horas, tiempo en el

cual se preparó el material vegetal a infectar. La concentración del

inóculo fue establecida por varios autores y la han considerado

como la presión del inóculo que asegura una infección y un

desarrollo adecuado de la enfermedad, como lo reporta Larco

(2004).

Previo a las pruebas de patogenicidad cruzada de los nueve

aislamientos escogidos, se probaron los postulados de Koch para

los ocho aislamientos de Fusarium sp. obtenidos de plantas de

tomate. El procedimiento realizado fue el mismo que se describió

para la actividad fitopatógena ejecutando el re-aislamiento del

agente patógeno a los 12 días post inoculación, momento en el cual

las plantas empezaron a presentar clorosis. Como conclusión se

cumplieron correctamente los postulados de Koch, ya que todas las

cepas analizadas se re-aislaron de las plantas demostrando que

efectivamente eran los agentes etiológicos de la infección (Roy,

1997; Salas et al., 1999)

48

En las pruebas de actividad fitopatógena, se observó que las

plantas control inoculadas con solución salina estéril no presentaron

ningún síntoma, ni mostraron contaminación por hongos o bacterias

en el montaje de las secciones de tallo y raíz (Figura 6.2), resultado

que valida las pruebas realizadas y así mismo da confiabilidad a los

resultados obtenidos.

Figura 6.2. Control negativo prueba progresión de la enfermedad.

Por otro lado, las plantas inoculadas con los diferentes aislamientos,

no mostraron sintomatología significativa que permitiera evidenciar

la enfermedad. En algunas se observó clorosis y retardo de

crecimiento, pero este parámetro no se tuvo en cuenta ya que no

era generalizado en las réplicas de los montajes. La ausencia de

síntomas pudo deberse a que estos solamente aparecen cuando el

sistema vascular de los pecíolos y las hojas han sido invadidos,

fenómeno que sucede después de la colonización del tallo, como lo

afirman Rodríguez-Molina y colaboradores (2003).

49

Por lo anterior, solo se tuvo en cuenta la recuperación del hongo a

nivel de laboratorio. Como se observa en la Figura 6.3, el

crecimiento de algunas réplicas de todos los aislamientos

independiente de la procedencia, mostraron un crecimiento

discontinuo, lo que probablemente indica que los mecanismos de

defensa de la planta estaban ejerciendo resistencia ante el

patógeno bloqueando puntos de infección e inhibiendo la

germinación y el crecimiento micelial y, por ende, no desarrollaron

la sintomatología típica de la enfermedad producida por Fusarium

sp. (Rodríguez-Molina et al., 2003).

Figura 6.3. Prueba de colonización de plantas de tomate por Fusarium sp.

50

La Tabla 6.4 muestra los resultados del crecimiento de los

aislamientos de Fusarium sp. en el montaje de colonización de

tejidos de raíz y tallo. Se encuentran las medias de las diez réplicas

y el área bajo la curva de cada una. Los datos de todas las réplicas

se pueden encontrar en el Anexo 2.

Tabla 6.4. Crecimiento en centímetros y área bajo la curva, de los aislamientos de

Fusarium sp. en ensayo fitopatógeno.

Aislamiento Fusarium sp.

Día 2 (cm)

Día 4 (cm)

Día 6 (cm)

Día 8 (cm)

Área bajo la curva

156 1.7±0.9 5±1.74 6.1±1.36 7.6±1.04 62.8

111 1.5±0.82 4.5±1.22 5.6±1.35 7.7±1.31 52.9

121 2.6±1.01 5.5±2 5.9±1.3 6.1±1.01 62.6

203 1.5±0.91 5.2±0.78 5.9±1.25 7.3±1.1 61.7

206 1.6±0.7 3±1.46 6.3±1.17 7.7±1.35 55.6

210 1.8±0.9 3.8±1 6.4±0.98 7.3±1.15 58.5

303 2±0.27 5.8±1.52 6.6±1.2 7.8±0.64 68.9

308 0.6±0.72 1.5±0.63 5.8±1.67 7.1±1.41 44.5

310 1.5±0.77 5±1.11 6.9±1.18 7.9±1.16 64.3

Dentro del análisis estadístico realizado a los resultados obtenidos,

se observa que según el agrupamiento de Duncan (Anexo 3),

existen diferencias significativas entre cada uno de los días y van

en orden; es decir, que a medida que pasaban los días, el hongo

ocupaba más secciones sembradas. Esto se puede explicar por la

cantidad de inóculo que tenía cada sección de la planta; así, a

mayor inóculo, es más rápido el crecimiento del hongo, y esta

mayor concentración puede deberse a una mayor afinidad del

mismo a ciertas partes de la planta o a la actividad de los

51

mecanismos de defensa de la planta anteriormente nombrados

(Mitola et al., 2001; Larco, 2004; Quilambaqui, 2005).

Por otro lado, se realizó análisis estadístico de varianza y

comparaciones de medias entre las réplicas de cada aislamiento

(Anexo 4), mostrando que no hay diferencias significativas entre

ellas, arrojando un valor F de 0.9305, dato confirmado con la

prueba de rango múltiple de Duncan, donde todas las réplicas se

encuentran en el mismo grupo; de tal forma que el comportamiento

es el esperado.

Al realizar el mismo análisis entre los aislamientos (Tabla 6.5), los

codificados como 303 y 310 presentaron mayor actividad

fitopatógena (68.9 y 64.3 unidades de área bajo la curva

respectivamente) y se encuentran dentro del mismo grupo, como

era de esperarse, ya que provienen de plantas y no han perdido

actividad fitopatógena, fenómeno que al parecer ocurrió con el

aislamiento 308 que presentó la menor actividad fitopatógena de

todos los aislamientos (44.5 unidades de área bajo la curva). Este

comportamiento puede ser atribuido a problemas del aislamiento,

ya que también presentó la menor actividad de degradación de

queratina (Anexo 6).

Tabla 6.5. Prueba de Duncan para aislamientos en ensayo fitopatógeno

Aislamiento N Media Agrupamiento de Duncan

303 10 68.9 A

310 10 64.3 A B

156 10 62.8 A B C

121 10 62.6 A B C

52


203 10 61.7 A B C

210 10 58.5 A B C

206 10 55.6 B C

111 10 52.9 C D

308 10 44.5 C D

Los aislamientos provenientes de humanos y animales se

encontraron todos dentro de un mismo grupo, indicando que no hay

diferencias estadísticamente significativas en lo que se refiere a su

actividad fitopatógena. Esto puede deberse a que los tejidos que

estaban afectando en su hospedero original, tenían composición

parecida, pero dentro de esta no se encuentra celulosa, sustrato en

mayor concentración en las plantas, mostrando así que los factores

de patogenicidad pueden estar relacionados al producir

polisacaridasas permitiéndoles afectar a las plantas (Roncero et al.,

2000; Di Pietro & Roncero, 2005).

Dentro de este grupo también se puede resaltar que los

aislamientos 156 y 121, provenientes de animales, mostraron

mayor actividad fitopátogena (62.8 y 61.6 unidades de área bajo la

curva respectivamente) que los provenientes de humanos,

indicando que la conservación, los repiques y el tiempo de los

aislamientos in vitro pueden afectar la patogenicidad de los mismos

y que se debió realizar una activación enzimática previa para

estimular la producción de enzimas y así mismo su capacidad

patogénica.

53

Dentro de la agrupación obtenida, también cabe destacar que los

aislamientos 111 y 308 se encuentran en el mismo grupo y

mostraron las menores actividades fitopatógenas (52.9 y 44.5

unidades de área bajo la curva respectivamente), comportamientos

inesperados ya que el aislamiento 308 es originario de este

hospedero y los dos tienen poco tiempo de haber sido aislados;

este resultado refleja que tres aislamientos de cada hospedero son

muy pocos para este tipo de análisis y no son representativos de

las tendencias que puede tener cada grupo.

6.3. MODELO DE INFECCIÓN HUMANO Y ANIMAL

El modelo de patogenicidad utilizado fue degradación de queratina,

ya que las queratinasas son el factor de virulencia más importante

en las patologías causadas por Fusarium sp. La queratina es una

esclero-proteína que se caracteriza por presentar una alta

resistencia a la degradación. En la naturaleza, los sustratos

queratinizados pueden ser degradados por enzimas queratinolíticas

que poseen algunos microorganismos (Tosti et al., 2000; Apprich et

al., 2006), como lo demostró Fusarium sp. en el presente estudio.

Los resultados de las pruebas de actividad queratinolítica se

muestran en la Tabla 6.6. La actividad cuantitativa se muestra

como la hidrólisis de sustrato queratinizado y la actividad cualitativa

se muestra como el crecimiento micelial sobre el sustrato evaluado

(casco de vaca o pelo humano). Los controles de las pruebas no

presentaron contaminación, haciendo válidas todas las pruebas.

54

Tabla 6.6. Prueba cualitativa y cuantitativa de actividad patógena de Fusarium sp. sobre tejidos queratinizados.

Prueba cuantitativa Aislamiento

Sustrato de queratina utilizado

Glucosa Prueba cualitativa Degradación

queratina (g) Biomasa

(g)

+ CM 0,1098 Pelo

humano - CP 0,1326

+ CM 0,1785 111

Casco de

vaca - CM 0,2648

0,1006

+ CM 0,1055 Pelo

humano - CM 0,0888

+ CM 0,2188 121

Casco de

vaca - CM 0,2503

0,0491

+ CM 0,1224 Pelo

humano - CP 0,1513

+ CM 0,1905 156

Casco de

vaca - CP 0,2623

0,1036

+ CM 0,0365 Pelo

humano - CP * 0,0762

+ CM 0,1938 203

Casco de

vaca - CM 0,2244

0,0364

+ CM 0,0141 Pelo

humano - CP * 0,1618

+ CM 0,1914 206

Casco de

vaca - CM 0,1648

0,0982

+ CM 0,0515 Pelo

humano - CM * 0,1229

+ CM 0,1861 210

Casco de

vaca - CM 0,2398

0,0764

+ CM 0,0684 303 Pelo

humano - CM * 0,1247

0,0805

55

Prueba cuantitativa Aislamiento


Glucosa Prueba cualitativa Degradación

queratina (g) Biomasa

(g)

+ CM 0,1971 Casco de

vaca - CM 0,251

+ CM 0,1278 Pelo

humano - CP 0,1167

+ CM 0,1788 308

Casco de

vaca - CP 0,2343

0,0530

+ CM 0,0341 Pelo

humano - CP 0,0949

+ CP* 0,1492 310

Casco de

vaca - CP* 0,1988

0,0639

CM: Crecimiento Masivo; CP: Crecimiento Pobre; *: Formación de micelio vegetativo. Aislamientos 121, 111 y 156 origen animal; 203, 206 y 210 origen humano; 303, 308 y 310 origen vegetal.

Los resultados cuantitativos fueron sometidos a un análisis de

varianza (Anexo 5 y Tabla 6.7) arrojando como resultado que todos

los tratamientos son estadísticamente diferentes y por lo tanto no

son agrupables.

Tabla 6.7. Prueba de rango múltiple de Duncan para tratamientos de queratina.

Tratamiento N Media Agrupamiento

Duncan

Casco sin glucosa 27 0.23226 A

Casco con glucosa 27 0.18715 B

Pelo sin glucosa 27 0.11889 C

Pelo con glucosa 27 0.07446 D

De acuerdo con la Tabla 6.7, los resultados con valores más altos

de degradación de queratina se obtuvieron con los tratamientos de

56

casco, en primer lugar sin glucosa, seguido por el tratamiento casco

con glucosa y en tercer y cuarto lugar, los tratamientos de pelo en

el mismo orden.

Lo anterior indica que todos los aislamientos examinados tenían la

capacidad de liberar queratinasas en diferentes cantidades y

concentraciones según el sustrato que estaba utilizando como

fuente de carbono y nitrógeno para obtener los nutrientes

necesarios en su crecimiento, casco de vaca molido o pelo (Apprich

et al., 2006)

De las diferentes fuentes de carbono utilizadas (glucosa, pelo y

casco como fuentes de queratina) se observó que, en presencia de

glucosa, hay menor degradación de queratina, indicando una

inhibición de la producción de queratinasas, ya que la glucosa

representa una fuente de carbono de fácil acceso, resultado que

concuerda con los obtenidos por Singh (2002).

La Tabla 6.6, la Figura 6.4 y la prueba de rango múltiple de Duncan

(Tabla 6.7. y Anexo 5) indican claramente que cuando se utiliza

casco como fuente de queratina, existe una mayor degradación

(casco sin glucosa: media 0,232g equivalente al 92.9% del sustrato

inicial y casco con glucosa: media 0,187g equivalente al 74.85%

del sustrato inicial).

57

-0,05

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

111 121 156 203 206 210 303 308 310

AISLAMIENTOS

TO

TA

L Q

UE

RA

TIN

A D

EG

RA

DA

DA

(g

)

Pelo + glucosa Pelo Casco + glucosa Casco Figura 6.4. Actividad queratinolítica Fusarium sp.

La degradación de queratina involucra dos mecanismos muy

cercanos. Primero, penetración mecánica del sustrato por la

elongación de la hifa; este proceso es responsable del ataque

inicial; y, segundo, la degradación enzimática por las queratinasas

secretadas desde la pared celular (Singh, 1999). Esto permite

plantear que el tamaño de la partícula puede influenciar en el

proceso de colonización de los sustratos, ya que confiere mayor

superficie de contacto hifa-sustrato y este es uno de los factores

que se pueden tener en cuenta como punto de partida para

determinar una de las razones de mayor degradación en casco en

comparación con el pelo, teniendo en cuenta que el casco se

encontraba molido, mientras que el pelo estaba en trozos que

impedían una mayor superficie de contacto y obligaban al hongo a

realizar una penetración mecánica. Adicionalmente, la pulverización

del casco puede ocasionar la ruptura de los puentes bisulfuro

58

presentes en la queratina, haciéndola más asequible para el hongo

(Vignardet et al., 2001).

Otra razón que pudo influenciar el alto porcentaje de degradación

de queratina en casco es, como lo afirman Apprich y colaboradores

(2006), que la producción de queratinasas es estimulada con la

adición de diferentes fuentes de queratina al medio de cultivo y,

según la naturaleza de dicho sustrato (casco o pelo), la producción

puede variar sustancialmente.

Existe otra razón por la cual el sustrato casco se pudo haber

degradado en una alta proporción. Según Lal (1999), existe la

posibilidad que el casco posea sustratos no queratinosos de fácil

degradación para el hongo. Pero, esta teoría no pudo ser

comprobada en este estudio ya que no se realizaron análisis de

caracterización del casco, como tampoco de cambio de pH del

medio, parámetro que también es indicador de la degradación de

queratina. El complejo mecanismo de queratinolisis involucra la

acción cooperativa de sulfitolisis y un sistema proteolítico, lo que

conlleva a una consecuente liberación de nitrógeno ocasionando la

alcalinización progresiva del medio de cultivo (Singh, 2002; Di

Pietro & Roncero, 2005; Gupta & Ramnani, 2006).

Por otro lado, la Tabla 6.6, la Figura 6.4 y la prueba de rango

múltiple de Duncan (Tabla 6.7. y Anexo 5) también indican que

cuando se emplea pelo como fuente de queratina, el porcentaje de

degradación es menor (pelo sin glucosa: media 0.119 equivalente a

59

47.6% del sustrato inicial y pelo con glucosa media 0,075 g

equivalente a 29.8% del sustrato inicial).

Esta menor degradación de queratina pudo deberse a la utilización

de pelo castaño, ya que en los trabajos donde se reporta el uso de

"cebo de pelo", para evaluar actividad queratinolitica utilizando pelo

como sustrato (Ulfig, 2000; Mitola et al., 2001), afirman que debe

usarse pelo castaño claro preferiblemente, ya que la melanina,

responsable del oscurecimiento del pelo, hace que este sea más

resistente al ataque por microorganismos (Nosanchuk & Casadevall,

2003).

Otro factor que pudo influenciar el bajo porcentaje de degradación

de queratina y el crecimiento pobre que se encontró en las pruebas

cualitativas, cuando se usó pelo como sustrato, fue que el pelo

utilizado además de ser castaño, era grueso y ondulado lo que

indica un alto contenido de metionina y según la fisiología de los

hongos queratinolílticos descrita por Kunert (2000), este

aminoácido puede ser utilizado como fuente de sulfuro, pero en

caso de estar en concentraciones mayores a 1mM, es altamente

inhibitorio.

Según el ajuste del modelo del análisis de rango múltiple de

Duncan se encuentra que entre las procedencias no hay diferencias

estadísticamente significativas entre humanos y plantas, y sí las

hay para animales (Tabla 6.8, Anexo 5), aislamientos que

presentaron una mayor actividad queratinolítica tanto en

60

degradación de queratina de casco, como en degradación de

queratina de pelo.

Tabla 6.8. Prueba de rango múltiple de Duncan para agrupamiento de aislamientos según

degradación de queratina

Procedencia N Media Agrupamiento

Duncan

Animal 36 0.172975 A

Planta 36 0.147978 B

Humano 36 0.138611 B

Aunque no hubo diferencias significativas entre procedencias de

humanos y plantas, mostraron una mayor actividad queratinolítica

los aislamientos de plantas frente a los aislamientos de humanos,

resultado inesperado ya que, debido a la ausencia de queratina en

las plantas, no se espera que tengan una buena actividad

queratinolítica; porque para la actividad fitopatógena deben tener

el complejo enzimático CWDE activo, mecanismo principal mediante

el cual se depolimeriza cada uno de los componentes de las

paredes celulares (celulosa, xilano, pectinas, ácidos

poligalacturónicos y extensinas) (Di Pietro & Roncero, 2005). Estos

resultados son interesantes para próximos estudios.

Por otro lado, la poca actividad queratinolitica por parte de los

aislamientos de humanos se puede explicar por que no se realizó

una activación enzimática. Los aislamientos estaban conservados

en agua y no se tiene historial de la cantidad de repiques que

tuvieron antes de la conservación. La conservación en agua puede

tener un alto porcentaje de viabilidad pero puede ocasionar pérdida

61

de características fisiológicas como la capacidad de virulencia

(Borba et al., 1992). Este efecto que también puede ser ocasionado

por la utilización del método de transferencia seriada (repiques)

(Monaghan et al., 1999), teniendo en cuenta estas observaciones,

se debió realizar una activación enzimática. Consiste en someter al

hongo a crecer en un sustrato de composición igual o parecida al

sustrato del cual fue aislado inicialmente (tejido afectado del

hospedero), estimulando la producción de enzimas queratinolíticas

y así mismo su actividad patogénica original.

Los aislamientos procedentes de animales presentaron mayor

degradación de queratina en los dos sustratos. Se debe a que

tenían pocos repiques antes de ser utilizados; por lo tanto, estaban

expresando todas sus características patogénicas. Como el modelo

animal fue el casco, era en éste donde se esperaba mayor

actividad, pero también se encontró en el pelo. Así mismo, este

resultado puede deberse a que las principales zonas de aislamiento

estaban cubiertas de pelo, lo que indica que éste también puede

ser empleado como modelo de patogenicidad en animales.

El análisis estadístico de agrupamiento de Duncan, haciendo una

comparación de medias de todos los aislamientos, arroja tres

agrupamientos, en el primero se encuentran los aislamientos 121,

111, 156, 310, 303 y 210, de los cuales los cuatro últimos

pertenecen también al segundo grupo, junto con los aislamientos

206 y 203, y estos dos últimos a su vez pertenecen al tercer grupo

junto con el aislamiento 308 (Tabla 6.9 y Anexo 5). El orden

anterior fue dado de mayor a menor degradación de queratina,

62

indicando que los aislamientos que inician con 100 son procedentes

de animal, confirmando el agrupamiento de procedencias; los 200

son de humanos y los 300 de plantas. En estos resultados se pude

destacar que el aislamiento 308 fue significativamente diferente en

cuanto a la degradación de queratina y al comportamiento de las

procedencias, pero no afecta el agrupamiento de las mismas; por lo

tanto, no se tiene en cuenta, ya que la cantidad de aislamientos

evaluados por procedencia no es un número representativo para

poder definir una tendencia en comportamiento como patógeno

multihospedero.

Tabla 6.9. Prueba de Duncan para degradación de queratina.

Aislamiento N Media Agrupamiento de

Duncan

121 12 0.18166 A

111 12 0.17141 A

156 12 0.16586 A B

310 12 0.16430 A B

303 12 0.16030 A B

210 12 0.15008 A B C

206 12 0.13302 B C

203 12 0.13274 B C

308 12 0.1194 C

Al analizar los modelos humano y animal por separado (Tabla 6.10

y 6.11; Anexos 6 y 7) encontramos diferencias sustanciales que

permiten plantear que cada procedencia tiene una mayor capacidad

de atacar su hospedero original (111 procedente de animal

63

presentó una media de degradación de casco de 0.265 y 206

procedente de humano presentó una media de degradación de pelo

0.162). No obstante, hay que tener en cuenta las características y

la ubicación de la lesión originaria y así mismo la similitud de los

tejido evaluados, ya que el modelo humano utilizado fue pelo, pero

el 90% de los aislamientos de animales estaban en contacto directo

con este sustrato de origen animal, en tanto que el 90% de los

aislamientos procedentes de humanos fueron aislados de lesiones

de uña, tejido que se asemeja al casco en su composición y función

(Lal et al., 1999). Por lo anterior y porque se trabajan los modelos

de patogenicidad in vitro, no se puede reconocer la importancia que

tiene la función del sistema inmune de cada hospedero, siendo esta

una de las principales diferencias que puede interferir en los

modelos evaluados.

Tabla 6.10. Prueba de agrupamiento de Duncan de los aislamientos en relación con la

degradación de casco.

Aislamiento N Media Agrupamiento

de Duncan

111 3 0.26467 A

156 3 0.26233 A

303 3 0.25097 A

121 3 0.25027 A

210 3 0.23977 A

308 3 0.23427 A B

203 3 0.22437 A B

310 3 0.21543 A B

206 3 0.16480 B

64

Tabla 6.11. Prueba de agrupamiento de Duncan de los aislamientos en relación con la

degradación de pelo.

Aislamiento N Media Agrupamiento

de Duncan

206 3 0.16177 A

156 3 0.15133 A

111 3 0.13263 A B

303 3 0.12470 A B

210 3 0.12293 A B

308 3 0.11683 A B

310 3 0.09487 A B

121 3 0.08877 A B

203 3 0.04323 B

6.4. Fusarium sp., COMO MODELO MULTIHOSPEDERO

A partir de los resultados obtenidos en los tres modelos de

patogenicidad desarrollados en el presente estudio, se realizó un

análisis estadístico de correlaciones que buscaba evaluar la

capacidad multihospedera de Fusarium sp., teniendo en cuenta que

en esta prueba se toman valores cercanos a 1 y -1 como un índice

de correlación representativo. La Tabla 6.12 indica que el

comportamiento de las tres clases de procedencia es diferente y no

se correlacionan.

65

Tabla 6.12. Correlación de los modelos de patogenicidad

Queratina pelo Queratina casco Área bajo la curva (Planta)

Queratina pelo 1 Queratina casco -0,09995258 1 Área bajo la curva (Planta) 0,03037409 0,45926013 1

Aunque los resultados estadísticos del presente estudio de

correlación no indiquen un valor representativo, varios autores han

reportado a Fusarium sp., como un hongo capaz de causar

patologías en varios tejidos y comportarse como multihospedero.

Di Pietro y Roncero (2005) encontraron en su estudio que una cepa

de Fusarium procedente de tomate, F. oxysporum f.sp. lycopesici,

presentaba capacidad de infectar de manera sistémica y causar de

forma consecuente la muerte de ratones inmunodeprimidos. De la

misma forma, González y colaboradores (1998) reportaron que los

animales domésticos (perros y gatos), representan un importante

reservorio de Fusarium sp., causante de dermatomicosis en el

hombre.

Adicionalmente, los resultados de este estudio permiten observar

que todos los aislamientos independientemente de su procedencia,

mostraron capacidad de infectar los tres tejidos evaluados en

diferentes proporciones, indicando una posible capacidad

multihospedera; por lo tanto se puede concluir que el número de

aislamientos utilizados no es representativo para este tipo de

análisis estadístico.

66

7. CONCLUSIONES

De un total de 62 muestras de lesiones en animales el 16% fueron

positivas para Fusarium sp.

De las muestras de lesiones en animales analizadas

(dermatomicosis y queratitis), Fusarium mostró una alta incidencia

constituyendo el 41% de aislamiento de hongos miceliares.

Se pudo confirmar la alta frecuencia de Fusarium sp. como

fitopatógeno, obteniéndose un porcentaje de aislamiento del 94%

de las muestras analizadas.

Las pruebas de infección cruzada permitieron confirmar a Fusarium

sp. como un patógeno multihospedero , teniendo en cuenta que los

aislamientos independientemente de su procedencia, mostraron

capacidad de infectar los tres tejidos evaluados en diferentes

proporciones.

Aunque se confirmó que la capacidad de Fusarium sp. de

comportarse como patógeno multihospedero, también se concluyó

que los mayores índices de actividad patogénica se presentan sobre

el modelo de patogénesis correspondiente a su hospedero original.

Los porcentajes de degradación de sustrato queratinizado

confirman que el casco es un sustrato más fácilmente degradable.

67

Se confirma que la presencia de glucosa en el medio inhibe la

actividad queratinolítica para los dos modelos evaluados.

La definición del comportamiento de un patógeno como

multihospedero, requiere de la comparación de más de 3

aislamientos por cada tipo de hospedero, con el fin de poder

establecer tendencias en comportamiento con un soporte

estadístico significativo.

68

8. RECOMENDACIONES

• Para desarrollar estudios en patógenos con capacidad

multihospedera, es indispensable trabajar con más de tres

aislamientos de cada hospedero, ya que este número no es

representativo y no permite establecer tendencias en el

comportamiento de los aislamientos como patógenos, como quedo

demostrado en el presente estudio, que se enfocó principalmente

en el aislamiento de Fusarium sp. a partir de lesiones en animales y

a la estandarización de los ensayos de infectividad cruzada, con

solo tres aislamientos de cada tipo de hospedero.

• Se sugiere llevar a cabo reactivación de los aislamientos de

origen humano y animal, previo a los ensayos de actividad

queratinolítica, para garantizar la estimulación de la actividad

patogénica. Una alternativa para la reactivación de los aislamientos,

es hacer un cultivo en medio de sales basales con adición de

sustrato queratinizado.

• Para las pruebas que permiten medir la actividad

queratinolítica, es importante medir la variación de pH que presente

el medio, ya que éste es uno de los principales indicadores

reportados de esta actividad enzimática, ya que al tratarse de un

proceso conjunto de sulfitolisis y proteolisis, se presenta como

consecuencia la liberación de nitrógeno al medio, ocasionando su

alcalinización.

69

9. REFERENCIAS

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81

10. ANEXOS ANEXO 1. Hojas de vida de la colección de Fusarium sp

COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M 108 Microorganismo Fusarium sp.

Fuente Bovino Origen: Hisopado de lesión en ojo de vaca

Fecha de muestreo: 27 Julio de 2007

Almacenamiento

Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol

Historial Cepario desde: 10 Julio de 2007

Nivel de seguridad 1 T° Ambiente

Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días

Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: AGAR PDA: Colonias con crecimiento radial. Micelio algodonoso, en acumulo de apariencia seca, color hueso. REVERSO DE LA COLONIA. Color hueso inicialmente y luego se torna café, sin difusión de pigmento al agar

Características Microscópicas:

Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias redondas

Identificación de Peligros

Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce

Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Desconocidas

82

Medidas de Protección / Manipulación

- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.

Conservación del microorganismo

El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos

Observaciones

- Número de repiques antes de realización de monospórico: 4

- Fecha de realización de monospórico: 15 septiembre 2007

- Número de repiques antes de conservación: 3

- Fecha de conservación en agua: 6 octubre 2007

- Fecha de conservación en aceite: 17 octubre 2007

- Fecha de conservación en papel: 29 octubre 2007

Características de la lesión

83

COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M 111 Microorganismo Fusarium sp.

Fuente Canino Origen: Hisopado de lesión superficial en extremidades anteriores de canino criollo.


Almacenamiento

Caja Petri grande con agar sabouraud suplementado con cloranfenicol




Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: AGAR PDA: Colonias con presencia de diámetro de 5 cm a los 5 días. Micelio algodonoso, aéreo, en acumulo, inicialmente blanco y luego se torna color hueso con pigmentaciones amarillas en la parte más superficial. Apariencia seca, correosa. REVERSO DE LA COLONIA. Color curuba.


Hifas septadas e hialinas, con clamidosporas intercalares, Presencia de macroconidias fusiformes, septadas.



Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente No reportadas

84





Observaciones








85



Fuente Canino Origen: Hisopado de lesión superficial en lomo, zona anterior, de canino criollo


Almacenamiento





Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: AGAR PDA: Colonias con presencia de diámetro de 5 cm a los 5 días. Micelio algodonoso, aéreo, ampliamente esparcido de forma flocosa, blanco con pigmentaciones púrpura, más cercana en la superficie del medio de cultivo. REVERSO DE LA COLONIA. Púrpura, sin pigmento difusible al medio


Presencia de hifas hialinas septadas, macroconidias en forma de granitos de arroz, con tres y cuatro septos. Presencia de clamidosporas intercalares y terminales. Microconidias redondeadas.

Presencia de microconidias a partir de fiálide laterales, agrupadas en falsas. Presencia de macroconidias, septadas, curvadas.

86




Tratamiento





Observaciones




- Fecha de conservación en agua: 6 noviembre 2007

- Fecha de conservación en aceite: 9 octubre 2007 Fecha de conservación en papel: 18 octubre 2007


87



Fuente Canino Origen: Raspado de lesión superficial lomo zona anterior. Canino

Fecha de muestreo: 26 de Junio de 2007

Almacenamiento





Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: AGAR PDA: Colonias con micelio algodonoso, aéreo, en acumulos, color café claro en la parte central y con borde blanco. Presenta exudados color miel. REVERSO DE LA COLONIA. Color hueso.


Hifas septadas anchas, hialinas, con presencia de clamidosporas intercalares y terminales.



Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Desconocidas.

88

Tratamiento





Observaciones




- Fecha de conservación en agua: 30 octubre de 2007


- Fecha de conservación en papel: 13 noviembre 2007


89



Fuente Canino Origen: Raspado de lesión superficial lomo zona anterior. Canino

Fecha de muestreo: 5 de Julio de 2007

Almacenamiento





Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: AGAR PDA: Colonia floculada algodonosa, color blanco con pigmento púrpura sobre la zona de la estría inicialmente. Colonias con más de 15 días toman coloración púrpura y solo en la parte externa de la colonia que presenta crecimiento radial se ve micelio algodonoso color blanco. REVERSO DE LA COLONIA. Pigmento difusible al medio color amarillo claro


Hifas hialinas septadas, con presencia de vesículas internamente, abundantes clamidosporas hialinas intercalares y terminales macro y microconidias.




90





Observaciones







Característica de la lesión

91



Fuente Canino Origen: Raspado de lesión superficial lomo zona posterior. Canino

Fecha de muestreo: 27 de Junio de 2007

Almacenamiento


Historial Cepario desde: 10 de Julio de 2007



Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: En Médio PDA se desarrolla comunmente con colonias de 5cm de diámetro floculadas algodonosas a los 5 días. Color rosado intenso. La zona externa de la colonia presenta color más claro que en la zona central. REVERSO DE LA COLONIA. Color morado claro y no presenta pigmento difusible al medio.






92





Observaciones








93



Fuente Canino

Origen: Hisopado de lesión superficial en canino criollo, articulación de extremidad posterior


Almacenamiento





Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: Colonia de crecimiento radial, con color ocre en la zona central de la colonia y bordes color vinotinto. REVERSO DE LA COLONIA. Color vinotinto con pigmento difusible al medio color ocre.






94





Observaciones








95



Fuente Bovino Origen: Raspado de lesión cutánea en zona media del lomo. De bovino

Fecha de muestreo: 5 agosto de 2007

Almacenamiento


Historial

Cepario desde: 9 agosto de 2007



Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: Colonia floculada algodonosa color púrpura, con presencia de acumulo, y secciones de color blanquecino inicialmente, en cultivos con más de 15 días las zonas blancas tienden a tomar color ocre.. REVERSO DE LA COLONIA. Color púrpura. Con pigmento difusible al medio color ocre.






96





Observaciones








97



Fuente Canino Origen: Raspado de lesión cutánea en cola, canino raza Pitbull.

Fecha de muestreo: 5 agosto de 2007

Almacenamiento


Historial

Cepario desde: 9 agosto de 2007



Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: Colonia algodonosa de crecimiento radial. Color púrpura concentrado alrededor del punto de siembra y a partir de este halo se desarrolla colonias moradas claras que alternan en secciones con zonas blancas. La zona externa de la colonia presenta un halo que rodea color púrpura. REVERSO DE LA COLONIA. Color púrpura haciendo halo alrededor del punto de siembra, y a partir de esto la colonia toma color crema. En la zona externa presenta coloración púrpura. Pigmento difusible al medio color amarillo claro


Hifas septadas e hialinas, con clamidosporas intercalares, Presencia de macroconidias fusiformes con 3 y 4 septos.

98








Observaciones








99



Fuente Canino Origen: hHisopado de lesión cutánea en lomo superior.

Fecha de muestreo: 4 de agosto de 2007

Almacenamiento


Historial

Cepario desde: 9 de agosto de 2007



Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: Colonia algodonosa floculada color blanco, y en sección de estría presenta coloración morada clara. De aspecto seco y crecimiento radial. REVERSO DE LA COLONIA. Color crema con pigmento difusible al medio amarillo claro.






100





Observaciones







101


PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M201 Microorganismo Fusarium sp.

Fuente Humano Origen: Onicomicosis

Fecha de recuperación: 23 Agosto de 2007

Almacenamiento


Historial Colección de Cepario de micología PUJ



Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: En agar PDA desarrolla colonias de crecimiento radial húmedas de color morado con micelio blanquecino tenue. Presenta coloración más concentrada alrededor del punto de siembra que no tiene un patrón radial. En la zona externa de la colonia se evidencia coloración morada muy clara haciendo un halo externo. REVERSO DE LA COLONIA. Color morado claro con pigmento difusible color amarillo claro. En el reverso se observa con mayor claridad que a partir del punto de siembra hay zonas moradas más concentradas que no tienen patrón de desarrollo radial.


Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes septadas.

102



Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Onicomicosis





Observaciones





- Fecha de conservación en aceite: 6 noviembre 2007

- Fecha de conservación en papel: 21 Enero 2008

103





Almacenamiento





Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: En agar PDA desarrolla colonias moradas muy claras de crecimiento restringido, pero no sigue un patrón de crecimiento radial. La colonia es floculada algodonosa, aunque el micelio no es abundante. La zona externa de la colonia presenta desarrollo de hifas color crema. REVERSO DE LA COLONIA. Color morado claro, y se evidencia con mayor facilidad que el desarrollo de la colonia no sigue patrón radial. No presenta pigmento difusible.


Hifas hialinas septadas, con clamidosporas intercalares hialinas principalmente. Las macroconidias son fusiformes y septadas.




104





Observaciones







105



Fuente Humano Origen: Queratitis


Almacenamiento





Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: En agar PDA se desarrollan colonia de crecimiento irregular color crema, con secciones que toman color blanco y otras secciones de color morado tenue. Floculadas algodonosas. REVERSO DE LA COLONIA. Color morado y blanco de aparición irregular ya que no presentan un patrón de desarrollo radial. Sin difusión de pigmento al medio


Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con dos y tres septos.



Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Queratitis

106





Observaciones





- Fecha de conservación en aceite: 10 diciembre 2007


107





Almacenamiento





Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: En Agar PDA: Colonias con crecimiento radial. Aspecto húmedo de las colonias color púrpura. Zona externa de la colonia presenta color más tenue y se evidencia el desarrollo micelial algodonoso muy tenue. REVERSO DE LA COLONIA. Color morado con zona externa de la colonia hacia una tonalidad rosada. No hay evidencia de difusión de pigmento.


Hifas hialinas septadas, presencia. Macroconidias fusiformes septadas y microconidias redondas




108





Observaciones






- Fecha de conservación en papel: 18 octubre de 2007

109





Almacenamiento





Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: En PDA las colonias se desarrollán tomando un aspecto seco y la zona de la estría toma coloración blanca en el centro y pigmentación morada en la zona externa. Sin embargo la colonia en general presenta color crema y es de aspecto floculada algodonoso. Desarrollo irregular de la colonia. REVERSO DE LA COLONIA. Color morado claro en la zona de la estría, y hueso en el resto de la colonia.


Hifas hialinas septadas, clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes septadas y microconidias redondas




110





Observaciones







111





Almacenamiento





Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: En agar PDA crecen colonias de aspecto húmedo de crecimiento irregular, color crema con zonas de pigmentación púrpuras especialmente alrededor del punto de siembra. REVERSO DE LA COLONIA. Color morado alrededor del punto de siembra y crema en el rededor, sin difusión de pigmento al medio.


Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias ovaladas




112





Observaciones


- Fecha de realización de monospórico: 10 septiembre





113





Almacenamiento





Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: Sobre PDA desarrolla colonias algodonosas con micelio tenue color morado claro. De aspecto húmedo en algunas zonas y crecimiento que sigue un patrón de desarrollo radial. La zona externa de la colonia toma coloración hueso. REVERSO DE LA COLONIA. Color morado claro, y en zona externa de la colonia presenta color hueso. No presenta difusión de pigmento al medio


Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes septadas y microconidias redondas




114





Observaciones







115





Almacenamiento





Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: Sobre PDA se desarrollan colonias floculadas algodonosas blancas con zonas de pigmentación color morado claro de desarrollo irregular. REVERSO DE LA COLONIA. Color morado en zona de estría y hueso alrededor de las mismas. No hay pigmento difusible al medio






116





Observaciones







117





Almacenamiento





Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: En agar PDA las colonias son de color blanco algodonosas y en zona alrededor del punto de siembra presenta tonalidad rosada. REVERSO DE LA COLONIA. El punto de siembra toma tonalidad morada sn embargo el revés de la colonia es color hueso.






118





Observaciones


- Fecha de realización de monospórico: 10 septiembre





119





Almacenamiento





Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: En agar PDA se observan colonia de crecimiento radial. Micelio de aspecto húmedo con zonas blanquecinas en su mayoría y alguna secciones se tornan de color morado. REVERSO DE LA COLONIA. Color morado tenue, con mayor tendencia hacia el blanco. Sin difusión de pigmento al agar


Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con dos y tres septos.




120





Observaciones







121

COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M301 Microorganismo Fusarium sp.

Fuente Vegetal Origen: Haces vasculares planta de tomate

Fecha de muestreo: 6 Agosto de 2007

Almacenamiento


Historial

Cepario desde: 9 Agosto de 2007



Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: En agar PDA presenta colonias con crecimiento radial. Micelio floculado algodonoso, salmón claro y en ocasiones y zonas de color blanco. REVERSO DE LA COLONIA. Color hueso, sin difusión de pigmento al agar


Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias ovaladas.




122




El hongo se encuentra conservado en aceite mineral estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos

Observaciones







123



Fuente Vegetal Origen: Haces vasculares planta de clavel


Almacenamiento


Historial




Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: Colonias en PDA algodonosas con floculo. Color morado oscuro en punto de siembra y morado claro alrededor de dicho punto. Algunas zonas presentan color blanco. Desarrollo radial REVERSO DE LA COLONIA. Color morado y en zona externa de la colonia se observa un halo con cimentaciones color hueso y café. No hay difusión de pigmento al medio.


Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias ovaladas que semejan granos de arroz.




124





Observaciones







125





Almacenamiento


Historial




Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: Las colonias sobre agar PDA se desarrollan presentando crecimiento radial. Micelio algodonoso blanco, REVERSO DE LA COLONIA. Color crema con tendencia hacía el blanco. Sin difusión de pigmento al agar


Hifas hialinas septadas, con presencia de cadenas de clamidosporas hialinas, y presencia de las mismas en posición intercalar. Macroconidias fusiformes con cuatro septos y microconidias redondas




126





Observaciones







127





Almacenamiento


Historial




Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: En PDA presenta colonias algodonosas blancas con un tenue color morado. Presenta desarrollo radial. REVERSO DE LA COLONIA. Color hueso, y en zonas del punto de siembra toma coloración púrpura y alrededor de estas se torna un hacia una tonalidad rosácea.






128





Observaciones





- Fecha de conservación en aceite: 10 diciembre 2007


129





Almacenamiento


Historial




Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: En PDA se desarrollan colonias color morado algodonosas floculadas. De crecimiento radial. De aspecto seco. REVERSO DE LA COLONIA. Color púrpura con pigmento difusible al medio color ocre.






130





Observaciones







131





Almacenamiento


Historial




Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: En PDA presenta colonias blancas con un poco de pigmento morado claro en zona central. Micelio algodonoso floculado. Crecimiento irregular REVERSO DE LA COLONIA. Color hueso y en punto de siembra color morado. No hay difusión de pigmento.






132





Observaciones







133





Almacenamiento


Historial




Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: PDA colonias de aspecto húmedo color morado solo en punto de siembra, no hay evidencia clara del micelio. REVERSO DE LA COLONIA. Color amarillo debido al pigmento difusible y en punto de siembra se observa color morado muy tenue. Características Microscópicas:





134





Observaciones






- Fecha de conservación en papel: 31 enero 2008

135




Fecha de muestreo: 14 septiembre de 2007

Almacenamiento


Historial

Cepario desde: 17 septiembre de 2007



Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: En PDA colonia con acumulo de aspecto húmedo color hueso y en algunas zonas presenta pigmentación púrpura. En zona externa presenta se observa la parte algodonosa de la colonia. REVERSO DE LA COLONIA. Color hueso,, sin difusión de pigmento al agar






136





Observaciones


- Fecha de realización de monospórico: 1 octubre 2007


- Fecha de conservación en agua: 10 diciembre 2007



137




Fecha de muestreo: 14 septiembre de 2007

Almacenamiento


Historial

Cepario desde: 17 septiembre de 2007



Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: PDA colonias de aspecto húmedo color morado solo en punto de siembra, no hay evidencia clara del micelio. REVERSO DE LA COLONIA. Color amarillo debido al pigmento difusible y en punto de siembra se observa color morado muy tenue.






138





Observaciones







139




Fecha de muestreo: 13 octubre de 2007

Almacenamiento


Historial

Cepario desde: 16 octubre de 2007



Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: AGAR SABOURAUD: Colonias con crecimiento radial. Micelio algodonoso, color blanco REVERSO DE LA COLONIA. Color rosado hueso inicialmente y luego se torna café, sin difusión de pigmento al agar






140





Observaciones





- Fecha de conservación en aceite: - Fecha de conservación en papel: 20

noviembre 2007

141




Fecha de muestreo: 23 noviembre de 2007

Almacenamiento


Historial

Cepario desde: 26 noviembre de 2007



Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: AGAR SABOURAUD: Colonias con crecimiento radial. Micelio algodonoso floculado, color blanco, con pigmento morado. Zonas color caramelo en la superficie con aspecto húmedo. REVERSO DE LA COLONIA. Color rosado, sin difusión de pigmento al agar






142





Observaciones


- Fecha de realización de monospórico: 12 enero 2008


- Fecha de conservación en agua: 5 Febrero 2008

143





Almacenamiento


Historial




Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: AGAR SABOURAUD: Colonias con crecimiento radial. Micelio algodonoso, de apariencia húmeda, color rosada. REVERSO DE LA COLONIA. Color rosado






144





Observaciones




- Fecha de conservación en agua: 5 febrero 2008

145





Almacenamiento


Historial




Pruebas biológicas

Características morfológicas Características Macroscópicas: AGAR SABOURAUD: Colonias con crecimiento radial. Micelio floculado algodonoso, color blanco REVERSO DE LA COLONIA. Color morado en punto de siembra y blanco alrededor, sin difusión de pigmento.






146





Observaciones




- Fecha de conservación en agua: 5 Febrero 2008

147

ANEXO 2.

Unidades de área bajo la curva de las 10 réplicas del

progreso de la enfermedad de los aislamientos de Fusarium

sp. en plántulas de tomate.

Aislamiento Réplica Área Aislamiento Réplica Área Aislamiento Réplica Área

1 0 1 55 1 77 2 53 2 64 2 61 3 52 3 61 3 80 4 71 4 60 4 71 5 59 5 65 5 58 6 62 6 62 6 58 7 61 7 60 7 57 8 55 8 69 8 75 9 63 9 51 9 84

111

10 53

203

10 70

303

10 68 1 68 1 60 1 59 2 78 2 53 2 44 3 40 3 51 3 37 4 65 4 65 4 44 5 62 5 64 5 44 6 60 6 58 6 52 7 45 7 60 7 46 8 66 8 49 8 33 9 80 9 48 9 51

121

10 62

206

10 48

308

10 35 1 73 1 66 1 70 2 59 2 49 2 73 3 53 3 54 3 68 4 46 4 60 4 61 5 57 5 62 5 56 6 52 6 55 6 60 7 72 7 67 7 56 8 72 8 54 8 61 9 76 9 59 9 65

156

10 68

210

10 59

310

10 73

148

ANEXO 3.

Análisis de varianza y agrupamiento de Duncan de

evaluación de aislamientos de Fusarium sp. en modelo

fitopatógeno (área bajo la curva en prueba de colonización

de raíz y tallo)

Análisis de varianza

Ajuste de un modelo para verificar si las variables aislamiento y

réplica tienen efecto sobre el comportamiento de la variable área.

Variable dependiente: Área Suma de Cuadrado de

Fuente DF cuadrados la media F-Valor Pr > F

Modelo 17 4615.40000 271.49412 2.36 0.0062

Error 72 8283.88889 115.05401

Total correcto 89 12899.28889

R-cuadrado Coeficiente Variación Raíz MSE Área Media

0.357803 18.15286 10.72632 59.08889

Cuadrado de

Fuente DF Tipo I SS la media F-Valor Pr > F

Aislamiento 8 4199.888889 524.986111 4.56 0.0002

Réplica 9 415.511111 46.167901 0.40 0.9305

149

Prueba de rango múltiple de Duncan

Para realizar las comparaciones de medias de las áreas se utiliza la

prueba del rango múltiple de Duncan.

Medias con la misma letra no son significativamente diferentes

Alfa 0.05

Número de medias 2 3 4 5 6 7 8 9 Rango crítico 9.22 9.70 10.02 10.26 10.44 10.58 10.70 10.80


303 10 68.900 A

310 10 64.300 A B

156 10 62.800 A B C

121 10 62.600 A B C

203 10 61.700 A B C

210 10 58.500 A B C

206 10 55.600 B C

111 10 52.900 C D

308 10 44.500 C D

150

ANEXO 4.

Agrupamiento de Duncan de evaluación de aislamientos de

Fusarium sp. en modelo fitopatógeno (promedio de réplicas

de área bajo la curva en prueba de colonización de raíz y

tallo)

Las comparaciones de medias por replicas se realizan para

comprobar que esta variable no explica el comportamiento del área.

Para esto se utiliza la prueba del rango múltiple de Duncan.


Alfa 0.05

Réplica N Media Agrupamiento de Duncan

9 9 64.111 A

4 9 60.333 A

10 9 59.556 A

2 9 59.333 A

8 9 59.333 A

1 9 58.667 A

5 9 58.556 A

7 9 58.222 A

6 9 57.667 A

3 9 55.111 A

151

ANEXO 5.


evaluación de aislamientos de Fusarium sp. en prueba de

degradación in vitro de tejidos queratinizados.

Ajuste de un modelo donde se observa que variables explican el

comportamiento de la variable Queratina.

Variable dependiente: QUERATINA Suma de Cuadrado de


Modelo 11 0.44065714 0.04005974 23.66 <0.0001

Error 96 0.16256221 0.00169336


R-cuadrado Coeficiente Variación Raíz MSE KERA Media

0.730509 26.86269 0.041150 0.153188

Cuadrado de


Aislamiento 8 0.04159392 0.00519924 3.07 0.0040

Procedencia 0 0.00000000 . . .

Tratamiento 3 0.39906322 0.13302107 78.55 <0.0001

La variable Procedencia no tiene ningún efecto en el modelo.

152

Para realizar las comparaciones de medias se utiliza la prueba del

rango múltiple de Duncan, la cual agrupa lo que se desee comparar

dependiendo si son estadísticamente diferentes o no.


Alfa 0.05


121 12 0.18166 A

111 12 0.17141 A

156 12 0.16586 A B

310 12 0.16439 A B

303 12 0.16030 A B

210 12 0.15008 A B C

206 12 0.13302 B C

203 12 0.13274 B C

308 12 0.11924 C

153

Comparación entre procedencias, determinar si hay diferencia

significativa dependiendo de la procedencia del aislamiento de

Fusarium sp., sobre la degradación de queratina, mediante la

prueba de rango múltiple de Duncan.

Medias con la misma letra no son significativamente diferentes.

Alfa 0.05

Procedencia N Media Agrupamiento Duncan

Animal 36 0.172975 A

Planta 36 0.147978 B

Humano 36 0.138611 B

154

Comparación entre tratamientos del modelo de infección de tejido

queratinizado in vitro (pelo de humano y casco de vaca en ausencia

y presencia de glucosa). Para esta prueba se utiliza la prueba del

rango múltiple de Duncan.

Tratamientos del modelo de infección en tejido queratinizado

Tratamiento Codificación

Pelo en presencia de glucosa P+G

Pelo en ausencia de glucosa P*

Casco en presencia de glucosa C+G

Casco en ausencia de glucosa C*


Alfa 0.05 Tratamiento N Media Agrupamiento Duncan

C* 27 0.23226 A

C+G 27 0.18715 B

P* 27 0.11889 C

P+G 27 0.07446 D

Nota: La prueba del rango múltiple de Duncan, controla el índice de error

comparisonwise de tipo I, no el índice de error experimentwise.

155

ANEXO 6.



degradación in vitro de tejidos queratinizados – casco –

modelo animal.


comportamiento de la variable Degradación de Casco.

Variable dependiente: DEGRADACIÓN CASCO Suma de Cuadrado de


Modelo 10 0.03817874 0.00381787 2.55 0.0464

Error 16 0.02399797 0.00149987


R-cuadrado Coeficiente Variación Raíz MSE D. Casco Media

0.614036 16.54370 0.038728 0.234096

Cuadrado de


Aislamiento 8 0.02266530 0.00283316 1.89 0.1328

Réplica 2 0.01551345 0.00775672 5.17 0.0185

La variable Aislamiento parece no tener ningún efecto en los

resultados de la variable Degradación de Casco. Sin embargo, se

realiza comparación de medias utilizando la prueba del rango

múltiple de Duncan.

156


Alfa 0.05 Aislamiento N Media Agrupamiento de Duncan

111 3 0.26467 A

156 3 0.26233 A

303 3 0.25097 A

121 3 0.25027 A

210 3 0.23977 A

308 3 0.23427 A B

203 3 0.22437 A B

310 3 0.21543 A B

206 3 0.16480 B



157

ANEXO 7.



degradación in vitro de tejidos queratinizados – pelo –

modelo humano.


comportamiento de la variable Degradación de Pelo.

Variable dependiente: DEGRADACIÓN PELO Suma de Cuadrado de


Modelo 10 0.04447874 0.00444787 1.97 0.1089

Error 16 0.03608344 0.00225521


R-cuadrado Coeficiente Variación Raíz MSE D. pelo Media

0.552104 41.21258 0.047489 0.115230

Cuadrado de


Aislamiento 8 0.03066622 0.00383328 1.70 0.1744

Réplica 2 0.01381252 0.00690626 3-06 0.0748

La variable Aislamiento no es significativa; sin embargo, se realiza

comparación de medias, utilizando la prueba del rango múltiple de

Duncan.

158

Medias con la misma letra no son significativamente diferentes Alfa 0.05 Aislamiento N Media Agrupamiento de Duncan

206 3 0.16177 A

156 3 0.15133 A

111 3 0.13263 A B

303 3 0.12470 A B

210 3 0.12293 A B

308 3 0.11683 A B

310 3 0.09487 A B

121 3 0.08877 A B

203 3 0.04323 B




N. Camacho, J.A. Gil. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Microbiologia Industrial, Microbiologia Agrícola y

Veterinaria

Fusarium es un género de hongos de distribución universal, que se comporta como fitopatógeno. Algunas especies del género son queratinofílicas y queratinolíticas, confiriéndole la capacidad de colonizar tejidos de humanos y animales, convirtiéndose así en agentes patógenos de estos hospederos. En la presente investigación se realizaron aislamientos de Fusarium sp. a partir de plantas y animales, ya que se contaba con aislamientos de humanos. Se desarrollaron tres modelos de infección con tres aislamientos de cada hospedero, el modelo de infección fitopatógeno con plántulas de tomate y, los modelos de infección animal y humano con tejidos queratinizados (casco de vaca y pelo de humano). Los resultados mostraron que la presencia de Fusarium sp. en animales es mayor de lo que se encuentra reportado, y en plantas se confirmó su frecuencia. Por otro lado, los modelos de patogenicidad confirmaron tendencias de infección en los hospederos originales, y al mismo tiempo demostraron la capacidad de Fusarium sp. de colonizar otros tejidos. Con estos modelos se buscaba establecer el estudio de las infecciones cruzadas entre hospederos, por esta razón se realizó un análisis de donde se observó que no habían relaciones entre las procedencias y que estas se comportan de manera independiente. Este trabajo constituye un estudio preliminar, base para poder llegar a conclusiones sobre el comportamiento de Fusarium como multihospedero, a partir de la evaluación del 100% de los aislamientos obtenidos. Fusarium is a fungal genus of universal distribution which behaves as phytopathogen. Some species are keratinophilic and keratinolitic, conferring the ability of human and animal tissue colonization; this capacity makes Fusarium a human and animal pathogen. Fusarium sp. isolates from plants and animals were collected for this study, human isolates were recovered from previous studies. Three infection models were developed including three isolates from each host. Tomato plants were used for plant infection model, and keratinized tissues (bovine hoof and human hair) for animal and human infection models. The results showed that Fusarium sp. occurrence in animals is higher than reported, and isolation frequency in plants was confirmed. The pathogenicity models confirmed infection tendency for the original host, and at the same time proved Fusarium capacity of colonizing different tissues. The pathogenicity models aimed to establish host cross infections studies. We performed an analysis which showed that there is not relation between isolation origins due to their independent behavior. This work constitutes a preliminary study, which may possible to conclude about multihost Fusarium behavior evaluating 100% of collected isolates. __________________________________________________________________________________________

Fusarium es un género de hongos de distribución universal. Usualmente se encuentra como saprófito de suelo; sin embargo, se ha reportado como parásito facultativo de numerosos hospederos en los que se incluyen plantas, animales y humanos. (Giani, 1997; Tosti et al., 2000; Summerell et al., 2001). Algunas especies del género Fusarium son habitantes del suelo, se reconocen por su importancia económica para la agricultura en el mundo ya que son agentes causales del marchitamiento vascular y pudrición basal de una gran variedad de plantas. Por otro lado, se ha encontrado que algunas especies de este género han emergido como patógenos oportunistas de humanos causando enfermedades diseminadas en pacientes inmunocomprometidos, quemados, con heridas abiertas y en ocasiones se han reportado, también, como agentes causales de infecciones en pacientes inmunocompetentes. (Agrios et al., 1997; Hennequin et al., 1997; Mayayo, 1999; Di Pietro & Roncero, 2005; Monzón & Rodríguez, 2007). Entre las características no enzimáticas asociadas con la virulencia de este género se destaca su amplia distribución, atribuida a su capacidad para crecer en gran número de substratos y a su eficaz mecanismo de dispersión. En el mismo sentido se destaca la adherencia que le confiere la capacidad de colonizar los tejidos y la producción de toxinas. (Marasas, 1984; Agrios, 1997; Díaz, 1997; Mitola et al., 2001; Di Pietro & Roncero, 2005; Monzón & Rodríguez, 2007) Adicionalmente, los complejos enzimáticos producidos por las especies de este género constituyen un importante factor de virulencia. Se ha identificado la capacidad de producir el complejo de enzimas polisacaridasas que pueden alterar o degradar los distintos componentes (polisacáridos) presentes en las paredes celulares. Dentro de estas, se destaca la producción de pectinliasas, celulasas, arabinasas,

poligaracturonidasas, entre otras. (Guevara, 1997; Roncero et al., 2000; Di Pietro & Roncero, 2005). Algunas especies del género presentan capacidad queratinofílica y queratinolítica que les confiere la capacidad de colonizar tejidos de humanos y animales y, de esta forma, convertirse en agentes patógenos. (Imai, 1991) Actualmente se desconoce hasta qué punto están conservados estos factores de virulencia en los grupos de hospederos que afecta Fusarium. Una de las principales causas es la falta de estudios y la ausencia de modelos que permitan el análisis simultáneo de la virulencia en plantas y animales. Con la finalidad de contribuir al análisis de Fusarium como un patógeno multihospedero, se llevo a cabo este trabajo que consistió en realizar diez aislamientos de cada hospedero a evaluar (planta, animal y humano) y hacer pruebas de inoculación cruzada entre nueve aislamientos (tres de cada uno de los modelos de hospedero). La investigación plantea tres modelos de infección para Fusarium sp., plántulas de tomate como modelo de infección fitopatógena y, como modelo de infección animal y humano se manejaron tejidos queratinizados (casco de vaca y pelo respectivamente). MATERIALES Y METODOS El proyecto se desarrolló en el Laboratorio de Micología de la facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana, y en el invernadero construido en la Calle 146 Nº 54 – 57. ORIGEN DE LOS AISLAMIENTOS DE Fusarium sp. Los aislamientos de humanos fueron donados por el Laboratorio de Micología de la Pontificia Universidad Javeriana, 12 de estos provenían de lesiones de onicomicosis y se encontraban conservados en agua destilada estéril, y un último aislamiento provenía de una lesión de queratitis.

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Para la obtención de los aislamientos de lesiones en animales, se procesaron un total de 62 muestras provenientes de lesiones de individuos que presentaban sintomatología de infección por hongos en ojos (opacos y con lagrimeo abundante) y piel (focos rojizos, en ocasiones con pérdida de pelaje). Estas muestras se obtuvieron de clínicas veterinarias urbanas o directamente en campo. Los aislamientos de plantas se obtuvieron al procesar un total de 17 muestras de plantas (cinco de estas muestras fueron procesadas de plantas de clavel, 11 solanáceas y una cucurbitácea); que presentaban sintomatología típica de marchites vascular y pudrición basal, características de Fusarium sp. Procesamiento material vegetal Para el aislamiento en laboratorio del patógeno presente en el material vegetal con los síntomas característicos de Fusarium sp., se realizó un lavado superficial del material y se realizaron cortes transversales de 3-5 mm. A dichos cortes se les realizó una desinfección superficial con agua destilada estéril e hipoclorito de sodio (NaClO) al 2.6% v/v por dos minutos (Forero, 2007). El material vegetal fue secado y posteriormente se sembrado e incubado por siete días a T ambiente en medio PDA suplementado con cloranfenicol (50 ppm), procedimiento que se realizó por triplicado. Pasado este tiempo se observaron las estructuras típicas de Fusarium sp., y se procedió a realizar cultivos monospóricos de los mismos (Riveros et al., 2001; Ardila & Higuera, 2005; Forero, 2007). Toma y procesamiento de muestras animales A partir de lesiones cutáneas se tomaron muestras, mediante el raspado de piel con bisturí, después de hacer una desinfección del área con alcohol al 70%. (Calado et al., 2005; Franco, 2006). Al mismo tiempo se realizo una metodología alterna, utilizada para la obtención de muestras de lesiones cutáneas, se realizó siguiendo el protocolo de Pulido (2007), que consiste inicialmente en una desinfección y la toma de la muestra con un hisopo humedecido en agua estéril y posteriormente con un hisopo seco. Para lesiones de queratitis las muestras fueron tomadas mediante frotis del saco conjuntivo con un hisopo estéril humedecido en agua estéril (Rosa et al., 2003; Hilmioglu-Polat et al., 2005). Las muestras se trasportaron en tubos de ensayo estériles refrigerados y se sembraron, por triplicado, en PDA suplementado con cloranfenicol (50 ppm) y se incubaron a temperatura ambiente por siete días, con observación macroscópica periódica. El hongo que se presentaba en todos los puntos de siembra fue repicado en PDA. Una vez identificado el aislamiento como Fusarium sp., se procedió a la realización de cultivos monospóricos (Rosa et al., 2003; Calado et al., 2005). Cultivos monospóricos Los cultivos monospóricos se realizaron mediante una suspensión de conidios en solución salina 0.85% p/v más Tween 0.1% v/v, con una concentración mínima de 1.5 x 106 conidios/mililitro; a partir de la cual se hicieron diluciones con el fin de obtener una concentración de 100 esporas por mililitro, la cual se sembró en superficie en PDA con cloranfenicol (50 ppm) e incubada a 25 + 2°C. La evaluación y selección de una espora germinada se realizó bajo observación en estereoscopio a las 12 horas post-siembra y se dejó incubando nuevamente durante

48 horas tiempo en el cual el tamaño de la colonia permitía realizar un repique a PDA. Identificación taxonómica de los aislamientos La identificación taxonómica a nivel de género se llevó a cabo a partir de los cultivos monospóricos, utilizando como base metodologías y claves de identificación elaboradas por De Hoog y colaboradores (2000) las cuales consideran la observación de características microscópicas. Conservación de los aislamientos

• Conservación de hongos en agua destilada estéril.

Los aislamientos repicados en PDA de los cultivos monospóricos, fueron cortados en discos de seis milímetros de diámetro, y trasladados a frascos de vidrio con 30 mL de agua destilada estéril, sellados y almacenados a temperatura ambiente (Bueno & Gallardo, 1998).

• Conservación en aceite mineral estéril El método utilizado consistió cubrir con una capa de aceite mineral estéril all hongo crecido en tubos de agar PDA en pico de flauta y se conservaron a temperatura ambiente (Panizo et al., 2005).

• Conservación en papel filtro estéril Inicialmente se tenían cuadros de papel filtro de 1 x 1 cm, sobres en papel parafinado de 6 x 4 cm y sobres de papel bond de 8 x 5 cm estériles. Los cuadros de papel filtro estéril se trasladaron a medio PDA, cada cuadro fue inoculado con el hongo a conservar e incubado a temperatura ambiente hasta obtener colonización del papel. Posteriormente se trasladaron a cajas de Petri estériles y se secaron a 26ºC por 15 días. Por último los cuadros de papel secos se introdujeron en los sobres de papel parafinado estéril y estos a su vez en los sobres de papel bond. Estos sobres se conservaron a temperatura de refrigeración dentro de bolsas Ziploc ENSAYOS DE PATOGENICIDAD CRUZADA Para la realización de los ensayos de patogenicidad cruzada se hizo un muestreo aleatorio sin reemplazo de tres aislamientos de cada hospedero (Daniel, 1997). Se evaluaron una totalidad de nueve aislamientos en cada uno de los ensayos de patogenicidad. Los aislamientos de plantas utilizados en este ensayo cumplieron previamente con los Postulados de Koch. Actividad fitopatógena Preparación del inóculo De cada cepa de Fusarium sp., originaria de cultivo monospórico, se realizaron subcultivos. La colección de conidios se llevó a cabo por desprendimiento de la colonia con perlas de vidrio y solución salina 0.85% p/v más Tween 0.1% v/v (Astudillo & Blanco, 1999), esta suspensión se diluyó en solución salina estéril al 0.85% p/v pH 5.5 + 0.2 hasta alcanzar una concentración celular de 106 conidios/mL (Marín, 2003). Inoculación de plántulas La evaluación de actividad fitopatógena se realizó en plántulas de tomate con dos pares de hojas verdaderas variedad Chonto Santa Clara compradas en una empresa germinadora de semillas de tomate. Para la inoculación de las plántulas de tomate, inicialmente se realizó un lavado al sistema radicular y, las cuales fueron heridas con pequeños cortes a los ápices de las raíces y se sumergieron en el inóculo durante 30 minutos. Este procedimiento se realizó en 10 plántulas por cada cepa a evaluar. Se utilizaron como control negativo 10 plántulas inoculadas con solución salina 0.85% p/v estéril (Rodríguez-Molina et al., 2003).

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Las plantas se mantuvieron en sustrato (suelo-cascarilla de arroz 3:1 estéril, bajo condiciones de invernadero a temperatura aproximada de 22°C, en macetas individuales con fertilización comercial. La distribución de las plántulas en el invernadero se hizo de forma aleatoria. La revisión de síntomas se realizó semanalmente durante 51 días, al cabo de los cuales se realizó un re-aislamiento de las cepas mediante la metodología de Jiménez (2004). (Lara, 1999; Marín, 2003; Rodríguez-Molina et al., 2003). La metodología de Jiménez (2004) es un método cuantitativo que permite valorar la progresión de la enfermedad. La muestra a evaluar se tomó ubicando la corona y a partir de esta se tomaron 5 cm del tallo y 5 cm de la raíz principal. Una vez realizado el corte de tallo y raíz principal se efectuó un lavado y desinfección con agua y hipoclorito de sodio 2.5% v/v. Luego de secado el material vegetal, se procedió al corte en secciones de 0,5 cm y siembra en espiral, de dichas secciones, en forma descendente en cajas de Petri con PDA suplementado con cloranfenicol (50 ppm). Los cultivos se incubaron a 22 + 2°C durante 8 días, en los cuales se le hizo seguimiento diario para poder determinar la progresión de la enfermedad. Actividad patógena sobre tejido animal y humano. Se desarrollaron dos modelos de infección in vitro, asociados a la degradación de queratina sobre cascos de vaca pulverizados y cabello humano castaño cortado en secciones de un cm. Modelo in vitro de patogenicidad animal y humano Para el análisis de la degradación de queratina, a partir de los sustratos anteriormente mencionados, se utilizó el método de pérdida de peso, utilizado por Singh (1999 y 2002). Las nueve cepas se sembraron utilizando como inóculo un disco de 6 mm de diámetro en 25 mL de caldo glucosa gelatina (glucosa 10g/l, gelatina 10g/l, K2HPO4 1 g/l, MgSO4*7H2O 0.5 g/l, pH 7.0) en erlenmeyer de 150 mL con agitación constante durante 21 días. Estos cultivos fueron tomados como control positivo de crecimiento y producción de biomasa de cada aislamiento. Simultáneamente, las cepas fueron sembradas en caldo glucosa-gelatina modificado, en el cual la gelatina fue remplazada por 250 mg del sustrato (pelo ó casco). También se hizo una siembra con los sustratos en ausencia de glucosa. La inoculación se realizó de la misma manera que el control positivo de crecimiento y se mantuvo bajo las mismas condiciones de incubación. Como control de peso de queratina se realizó el montaje de erlenmeyers que contenían sales, sustrato (pelo o casco) y sin inoculación. Los cultivos fueron observados macroscópicamente a diario, y pasado el tiempo de incubación se analizaron microscópicamente para asegurar su pureza. Después del tiempo de incubación, los cultivos fueron filtrados y secados en papel filtro estéril a 80ºC por 12 horas. Posteriormente se pesaron para obtener un peso seco total (sustrato más micelio). La degradación de queratina fue determinada mediante la diferencia del peso seco total y la biomasa total, determinada en el control positivo de crecimiento. Este resultado se le restó al peso seco de la queratina no inoculada (Singh, 1999). También se hicieron siembras en los mismos medios con adición de agar-agar, para tener una apreciación cualitativa del crecimiento de los aislamientos sobre el sustrato de queratina. La inoculación se llevó a cabo de

la misma manera que en los medios líquidos, introduciendo un disco de 6 mm de diámetro en el centro de la caja de Petri sobre el sustrato queratinizado. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Se realizó un análisis de varianza a los resultados, utilizando el programa estadístico SAS, mediante la aplicación de la prueba de rango múltiple de Duncan para obtener agrupaciones de las variables analizadas. Los resultados de la progresión de la enfermedad en plantas se analizaron mediante la técnica de área bajo la curva y a partir de estos resultados se realizaron los análisis anteriormente mencionados. A partir de los resultados de las pruebas de Duncan realizadas a los tres modelos se realizó un análisis de correlaciones. RESULTADOS Y DISCUSION ORIGEN DE AISLAMIENTOS Los aislamientos de hospedero humano se obtuvieron a partir de la recuperación de conservaciones en agua de 12 cultivos de hongos que provenían de onicomicosis. Se obtuvo un buen desarrollo de diez de estos y los dos restantes crecieron con flora acompañante. La selección de las nueve cepas a trabajar, se realizó teniendo en cuenta el buen desarrollo de las colonias en PDA y se descartó el aislamiento que presentó menor esporulación con respecto a los otros. Para completar los diez aislamientos necesarios para el desarrollo del proyecto, se obtuvo un aislamiento proveniente de queratitis que estaba siendo utilizado en el proyecto de investigación “Estudio in vitro de germinación de Fusarium sp. en los materiales de lentes de contacto blandos y eficacia de las soluciones multipropósito contra este microorganismo”. Esta cepa se encontraba en PDA con un buen desarrollo y alta esporulación El porcentaje de recuperación de los aislamientos de humanos conservados en agua, tomando las 12 muestras procesadas como el 100%, corresponde al 83%. Este porcentaje no difiere en gran medida de los resultados obtenidos por Bueno y Gallardo (1998) y por Panizo y colaboradores (2005), en los estudios orientados a evaluar la viabilidad del método de conservación de cepas en agua destilada, en los cuáles se obtuvo un porcentaje de recuperación del 100%, debido a que ninguno presentó contaminación bacteriana, por ácaros o por otros hongos. La razón por la cuál durante el desarrollo del presente trabajo se obtuvo el 83% de recuperación, se atribuye a la presencia de contaminación en dos de las muestras, la cual puede ser relacionada a errores experimentales en el momento de la conservación, como lo relacionaron Panizo y colaboradores en su estudio. El presente estudio no permite establecer ningún tipo de prevalencia y/o predilección de las patologías causadas por Fusarium sp., debido a que la cantidad de aislamientos es muy baja para este tipo de estudios. Sin embargo, se logró corroborar que este género está relacionado con patologías en humanos, como se ha venido reportando desde hace ya dos décadas y que se puede comprobar con el origen y la hoja de vida de estos aislamientos. Y permite confirmar que entre las patologías producidas por Fusarium sp. en humanos, se destacan afecciones dérmicas y oftálmicas relacionadas con la característica de ser hongos queratinolíticos, lo que concuerda con lo reportado por Hennequin y colaboradores (1997), Mayayo (1999), Kunert (2000), Garcés y colaboradores (2001). A partir de lesiones provenientes de animales, se procesaron un total de 62 muestras, de las cuales 24

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resultaron positivas para hongos (Tabla 1), y en 10 de estas se aisló Fusarium sp. Las 38 muestras restantes no se tuvieron en cuenta ya que presentaban contaminación bacteriana o porque el cultivo no presentaba crecimiento del mismo agente aislado en todos los puntos de siembra. Tabla 1. Procesamiento de muestras provenientes de lesiones de animales

Nº identificación

Origen Lesión Organismo

aislado

101 Canino Dermatitis generalizada en lomo

Micelio estéril

108 Bovino Lagrimeo abundante e inflamación del párpado

Fusarium sp.

111 Canino Dermatitis generalizada, extremidades anteriores

Fusarium sp.

112 Canino Lesión costrosa interdigital

Micelio estéril

116 Bovino Descamación de piel en lomo

Micelio estéril

119 Ave Descamación en pata Dermatofito

120 Ave Descamación en pata Aspergillus sp.

121 Canino Dermatitis generalizada, lomo zona anterior

Fusarium sp.

122 Bovino Lagrimeo abundante y tumor en ojo

Micelio estéril

127 Bovino Descamación en pata Dermatofito

131 Canino Dermatitis en lomo, zona anterior

Fusarium sp.

138 Ave Descamación pata Micelio estéril

143 Bovino Costras en hocico Scopulariopsis sp.

146 Bovino Costras en párpado Scopulariopsis sp.

152 Canino Dermatitis generalizada en lomo

Aspergillus sp.

153 Canino Dermatitis cola Aspergillus sp

154 Bovino Dermatitis lomo zona media Dermatofito

155 Canino Dermatitis lomo zona posterior

Fusarium sp.


Fusarium sp.

157 Canino Lagrimeo abundante e inflamación párpado

Aspergillus sp.

159 Canino Dermatitis generalizada zona abdominal

Fusarium sp.

160 Bovino Dermatitis en lomo, zona media

Fusarium sp.

161 Canino Dermatitis zona media del lomo

Fusarium sp.


Fusarium sp.

La prevalencia de los hongos en las muestras de animales analizadas presenta un valor de 39%, el cual es relativamente bajo si se tiene en cuenta que las infecciones por dermatofitos fueron las primeras enfermedades infecciosas descritas y reconocidas desde el siglo pasado, como lo menciona Mitchell (1983) en su trabajo. A partir del reconocimiento de hongos patógenos, los estudios histopatológicos van orientados principalmente para el diagnóstico de micosis en patología veterinaria, como lo mencionan Pérez y Carrasco (2000). Adicionalmente, si se tiene en cuenta que otros organismos que afectan la dermis de animales son agentes patógenos oportunistas (bacterias y ácaros), los resultados obtenidos de las lesiones evaluadas se pueden correlacionar con los estudios y reportes mencionados anteriormente. Sin embargo, es importante resaltar que las muestras que no se identificaron como hongos (61%), agrupan no solo a otros agentes patógenos, sino también a los casos donde no todos los puntos de siembra presentaban el mismo agente aislado, y aquellas muestras en donde se presentaba carga bacteriana debido a la dificultad de realizar una correcta

desinfección en la dermis del animal. Este último caso pudo ser un factor que imposibilitó el crecimiento fúngico, debido a que las muestras a analizar no se sometieron a ningún tratamiento de inmersión en antibióticos, y el medio preparado fue PDA sin suplementos. Los resultados obtenidos fueron un punto de corrección durante el desarrollo del trabajo ya que, para realizar los repiques y purificación de los aislamientos, se tuvo en cuenta la importancia de suplementar PDA con cloranfenicol. El porcentaje de aislamiento de Fusarium sp., en el total de las muestras tomadas de animales es del 16%. No obstante, en la Figura 6.1 se observa que la incidencia de aislamiento de Fusarium sp. frente a otros hongos es de 41.7%, comprobando lo establecido en varios estudios llevados a cabo en los últimos años por Andrew y colaboradores (1998) y, Betbeze y colaboradores (2006), donde se ha visto incrementada su relación con afecciones oftálmicas y sistémicas principalmente. Este estudio permite demostrar la incidencia que presenta este hongo como agente causal de micosis superficiales (infecciones dérmicas), que se reportan con menor frecuencia frente a otras patologías causadas por este género, como son intoxicaciones por producción de toxinas, onicomicosis en los cascos e infecciones sistémicas. (Oliveira et al., 2002; Ortoneda, 2003; Elligot et al., 2006).

Frecuencia aislamiento

20,8

41,7

16,7

12,58,3

Micelio estéril Fusarium sp. Aspergillus sp.

Dermatófitos Scopularipsis sp.

Figura 1. Porcentaje de frecuencia de aislamiento de hongos en muestras animales Algunos de los patrones que se pueden establecer a partir de los resultados obtenidos en este proyecto, permiten establecer a Fusarium sp., como agente causal no solo de queratomicosis sino también como patógeno frecuente que causa lesiones superficiales en la dermis de una gran variedad de especies animales. Igualmente permite establecer que causa infecciones con mayor frecuencia en caninos y bovinos como lo indica la Tabla 6.2. Adicionalmente, se comprobó lo reportado por Ortoneda (2003) y Godoy y colaboradores (2004), quienes afirman que las patologías causadas por Fusarium sp. son mayores en áreas tropicales y subtropicales (clima cálido y húmedo) aumentando su incidencia en temporadas de lluvia por las variaciones de temperatura y humedad, condiciones que se relacionan directamente con la capacidad de germinación de las esporas del microorganismo y de esta forma causar patologías. El último origen de aislamiento pertenece a especies vegetales, de las cuales se procesaron un total de 17 muestras de plantas (diez solanáceas, una cucurbitácea y seis claveles) siendo positivas 16 para Fusarium sp, como se muestra en la Tabla 2. Tabla 2. Aislamientos a partir de material vegetal

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Nº identificación

Origen Sintomatología Hongo aislado

301 Tomate Marchites generalizada y pudrición de haces vasculares

Fusarium sp.

302 Clavel Marchites unilateral de la planta y pudrición de haces vasculares

Fusarium sp.


Fusarium sp.


Marchites generalizada y pudrición de haces vasculares

Fusarium sp.


Marchites generalizada y pudrición de haces vasculares

Fusarium sp.


Fusarium sp.

307 Calabacín Marchites Fusarium

sp.


Fusarium sp.


Fusarium sp


Fusarium sp


Fusarium sp


Fusarium sp

313 Clavel Marchites unilateral de la planta, pudrición de haces vasculares

Fusarium sp.


Fusarium sp.


Fusarium sp.

316 Lulo Marchites unilateral de la planta y pudrición de haces vasculares

No identificado


Fusarium sp.

La Tabla2 permite establecer una prevalencia del 94% de Fusarium sp. en las muestras analizadas, confirmando la frecuencia que tiene este patógeno en las especies investigadas (solanáceas y clavel) y cómo puede ser aislado frecuentemente (Caracuel et al., 2003; Ardila & Higuera, 2005). Por otro lado, esto permite confirmar que la sintomatología que ha sido descrita por varios autores como típica de la infección causada por este género, orienta eficazmente a la identificación de Fusarium sp. como fitopatógeno. A su vez, los resultados permiten ratificar la razón por la cual el género Fusarium sp., ha sido uno de los más estudiados como fitopatógeno, por su alta prevalencia en cultivos de importancia económica y su severidad en estos hospederos (Monzón & Rodríguez, 2007). MODELO DE INFECCIÓN EN PLANTAS Los inóculos de los nueve aislamientos de Fusarium sp. utilizados en la prueba, se prepararon como suspensión de conidios en 50 mL de solución salina 0.85% p/v más Tween 0.1% v/v, con concentración final de 106 conidios/mL. Estas se mantuvieron a temperatura ambiente (19 + 2°C) durante dos horas, tiempo en el cual se preparó el material vegetal a infectar. La concentración del inóculo fue establecida por varios autores y la han considerado como la presión del inóculo

que asegura una infección y un desarrollo adecuado de la enfermedad, como lo reporta Larco (2004). Previo a las pruebas de patogenicidad cruzada de los nueve aislamientos escogidos, se probaron los postulados de Koch para los ocho aislamientos de Fusarium sp. obtenidos de plantas de tomate. El procedimiento realizado fue el mismo que se describió para la actividad fitopatógena ejecutando el re-aislamiento del agente patógeno a los 12 días post inoculación, momento en el cual las plantas empezaron a presentar clorosis. Como conclusión se cumplieron correctamente los postulados de Koch, ya que todas las cepas analizadas se re-aislaron de las plantas demostrando que efectivamente eran los agentes etiológicos de la infección (Roy, 1997; Salas et al., 1999) En las pruebas de actividad fitopatógena, se observó que las plantas control inoculadas con solución salina estéril no presentaron ningún síntoma, ni mostraron contaminación por hongos o bacterias en el montaje de las secciones de tallo y raíz, resultado que valida las pruebas realizadas y así mismo da confiabilidad a los resultados obtenidos. Por otro lado, las plantas inoculadas con los diferentes aislamientos, no mostraron sintomatología significativa que permitiera evidenciar la enfermedad. En algunas se observó clorosis y retardo de crecimiento, pero este parámetro no se tuvo en cuenta ya que no era generalizado en las réplicas de los montajes. La ausencia de síntomas pudo deberse a que estos solamente aparecen cuando el sistema vascular de los pecíolos y las hojas han sido invadidos, fenómeno que sucede después de la colonización del tallo, como lo afirman Rodríguez-Molina y colaboradores (2003). Por lo anterior, solo se tuvo en cuenta la recuperación del hongo a nivel de laboratorio. Como se observa en la Figura 6.3, el crecimiento de algunas réplicas de todos los aislamientos independiente de la procedencia, mostraron un crecimiento discontinuo, lo que probablemente indica que los mecanismos de defensa de la planta estaban ejerciendo resistencia ante el patógeno bloqueando puntos de infección e inhibiendo la germinación y el crecimiento micelial y, por ende, no desarrollaron la sintomatología típica de la enfermedad producida por Fusarium sp. (Rodríguez-Molina et al., 2003). La Tabla 3 muestra los resultados del crecimiento de los aislamientos de Fusarium sp. en el montaje de colonización de tejidos de raíz y tallo. Se encuentran las medias de las diez réplicas y el área bajo la curva de cada una. Tabla 3. Crecimiento en centímetros y área bajo la curva, de los aislamientos de Fusarium sp. en ensayo fitopatógeno.


Día 2 (cm)

Día 4 (cm)

Día 6 (cm)

Día 8 (cm)

Área bajo la curva

156 1.7±0.9 5±1.74 6.1±1.36

7.6±1.04

62.8

111 1.5±0.82

4.5±1.22

5.6±1.35

7.7±1.31

52.9

121 2.6±1.01

5.5±2 5.9±1.3

6.1±1.01

62.6

203 1.5±0.91

5.2±0.78

5.9±1.25

7.3±1.1

61.7

206 1.6±0.7 3±1.46 6.3±1.17

7.7±1.35

55.6

210 1.8±0.9 3.8±1 6.4±0.98

7.3±1.15

58.5

303 2±0.27 5.8±1. 6.6±1. 7.8± 68.9

6


Día 2 (cm)

Día 4 (cm)

Día 6 (cm)

Día 8 (cm)

Área bajo la curva

52 2 0.64 308 0.6±0.7

2 1.5±0.63

5.8±1.67

7.1±1.41

44.5

310 1.5±0.77

5±1.11 6.9±1.18

7.9±1.16

64.3

Dentro del análisis estadístico realizado a los resultados obtenidos, se observa que según el agrupamiento de Duncan, existen diferencias significativas entre cada uno de los días y van en orden; es decir, que a medida que pasaban los días, el hongo ocupaba más secciones sembradas. Esto se puede explicar por la cantidad de inóculo que tenía cada sección de la planta; así, a mayor inóculo, es más rápido el crecimiento del hongo, y esta mayor concentración puede deberse a una mayor afinidad del mismo a ciertas partes de la planta o a la actividad de los mecanismos de defensa de la planta anteriormente nombrados (Mitola et al., 2001; Larco, 2004; Quilambaqui, 2005). Por otro lado se realizó análisis estadístico de varianza y comparaciones de medias entre las réplicas de cada aislamiento, mostrando que no hay diferencias significativas entre ellas, arrojando un valor F de 0.9305, dato confirmado con la prueba de rango múltiple de Duncan donde todas las replicas se encuentran en el mimo grupo; de tal forma que el comportamiento es el esperado. Al realizar el mismo análisis entre los aislamientos (Tabla 4), encontramos que los codificados como 303 y 310 presentaron mayor actividad fitopatógena (68.9 y 64.3 unidades de área bajo la curva respectivamente) y se encuentran dentro del mismo grupo, como era de esperarse, ya que provienen de plantas y no han perdido actividad fitopatógena, fenómeno que al parecer ocurrió con el aislamiento 308 que presentó la menor actividad fitopatógena de todos los aislamientos (44.5 unidades de área bajo la curva). Este comportamiento puede ser atribuido a problemas del aislamiento, ya que también presentó la menor actividad de degradación de queratina Tabla 4 Prueba de Duncan para aislamientos en ensayo fitopatógeno


303 10 68.9 A 310 10 64.3 A B 156 10 62.8 A B C 121 10 62.6 A B C 203 10 61.7 A B C 210 10 58.5 A B C 206 10 55.6 B C 111 10 52.9 C D 308 10 44.5 C D

Alfa 0.05 P valor = 0.0002 Los aislamientos provenientes de humanos y animales se encontraron todos dentro de un mismo grupo, indicando que no hay diferencias estadísticamente significativas en lo que se refiere a su actividad fitopatógena. Esto puede deberse a que los tejidos que estaban afectando en su hospedero original, tenían composición parecida, pero dentro de esta no se encuentra celulosa, sustrato en mayor concentración en las plantas, mostrando así que los factores de patogenicidad pueden estar relacionados al producir polisacaridasas permitiéndoles afectar a las plantas (Roncero et al., 2000; Di Pietro & Roncero, 2005).

Dentro de este grupo también se puede resaltar que los aislamientos 156 y 121, provenientes de animales, mostraron mayor actividad fitopátogena (62.8 y 61.6 unidades de área bajo la curva respectivamente) que los provenientes de humanos, indicando que la conservación, los repiques y el tiempo de los aislamientos in vitro pueden afectar la patogenicidad de los mismos y que se debió realizar una activación enzimática previa para estimular la producción de enzimas y así mismo su capacidad patogénica. Dentro de la agrupación obtenida, también cabe destacar que los aislamientos 111 y 308 se encuentran en el mismo grupo y mostraron las menores actividades fitopatógenas (52.9 y 44.5 unidades de área bajo la curva respectivamente), comportamientos inesperados ya que el aislamiento 308 es originario de este hospedero y los dos tienen poco tiempo de haber sido aislados; este resultado refleja que tres aislamientos de cada hospedero son muy pocos para este tipo de análisis y no son representativos de las tendencias que puede tener cada grupo. Modelo de infección humano y animal El modelo de patogenicidad utilizado fue degradación de queratina, ya que las queratinasas son el factor de virulencia más importante en las patologías causadas por Fusarium sp. La queratina es una esclero-proteína que se caracteriza por presentar una alta resistencia a la degradación. En la naturaleza, los sustratos queratinizados pueden ser degradados por enzimas queratinolíticas que poseen algunos microorganismos (Tosti et al., 2000; Apprich et al., 2006), como lo demostró Fusarium sp. en el presente estudio. Los resultados de las pruebas de actividad queratinolítica se muestran en la Tabla 5. La actividad cuantitativa se muestra como la hidrólisis de sustrato queratinizado y la actividad cualitativa se muestra como el crecimiento micelial sobre el sustrato evaluado (casco de vaca o pelo humano). Los controles de las pruebas no presentaron contaminación, haciendo válidas todas las pruebas. Tabla 5. Prueba cualitativa y cuantitativa de actividad patógena de Fusarium sp. sobre tejidos queratinizados.

Prueba cuantitativa Aisl

amiento


Glucosa

Prueba cualitativa

Degradación queratina (g)

Biomasa (g)

+ CM 0,1098 Pelo humano - CP 0,1326

+ CM 0,1785 111

Casco de vaca - CM 0,2648

0,1006

+ CM 0,1055 Pelo humano - CM 0,0888

+ CM 0,2188 121


0,0491


+ CM 0,1905 156

Casco de vaca - CP 0,2623

0,1036

+ CM 0,0365 Pelo humano - CP * 0,0762

203

Casco + CM 0,1938

0,0364

7

Prueba cuantitativa Aisl

amiento


Glucosa

Prueba cualitativa

Degradación queratina (g)

Biomasa (g)

de vaca - CM 0,2244

+ CM 0,0141 Pelo humano - CP * 0,1618

+ CM 0,1914 206


0,0982

+ CM 0,0515 Pelo humano - CM * 0,1229

+ CM 0,1861 210


0,0764

+ CM 0,0684 Pelo humano - CM * 0,1247

+ CM 0,1971 303


0,0805


+ CM 0,1788 308

Casco de vaca - CP 0,2343

0,0530


+ CP* 0,1492 310

Casco de vaca - CP* 0,1988

0,0639

CM: Crecimiento Masivo; CP: Crecimiento Pobre; *: Formación de micelio vegetativo. Aislamientos 121, 111 y 156 origen animal; 203, 206 y 210 origen humano; 303, 308 y 310 origen vegetal. Los resultados cuantitativos fueron sometidos a un análisis de varianza Tabla 6. arrojando como resultado que todos tratamientos son estadísticamente diferentes y por lo tanto no son agrupables. Tabla 6. Prueba de rango múltiple de Duncan para tratamientos de queratina.

Tratamiento N Media Agrupamiento Duncan

Casco sin glucosa 27 0.23226 A Casco con glucosa 27 0.18715 B Pelo sin glucosa 27 0.11889 C Pelo con glucosa 27 0.07446 D

Alfa 0.05 P valor = 0.0040 De acuerdo con la Tabla 6 los resultados con valores más altos de degradación de queratina se obtuvieron con los tratamientos de casco, en primer lugar sin glucosa, seguido por el tratamiento casco con glucosa y en tercer y cuarto Lo anterior indica que todos los aislamientos examinados tenían la capacidad de liberar queratinasas en diferentes cantidades y concentraciones según el sustrato que estaba utilizando como fuente de carbono y nitrógeno para obtener los nutrientes necesarios en su crecimiento, casco de vaca molido o pelo (Apprich et al., 2006) De las diferentes fuentes de carbono utilizadas (glucosa, pelo y casco como fuentes de queratina) se observó que, en presencia de glucosa, hay menor degradación de queratina, indicando una inhibición de la producción de queratinasas, ya que la glucosa representa una fuente de

carbono de fácil acceso, resultado que concuerda con los obtenidos por Singh (2002). La Tabla 5, la tabla 6 y la Figura 2 indican claramente que cuando se utiliza casco como fuente de queratina existe una mayor degradación (casco sin glucosa: media 0,23226g equivalente al 92.9% del sustrato inicial y casco con glucosa: media 0,18715g equivalente al 74.85% del sustrato inicial).

-0,05

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

111 121 156 203 206 210 303 308 310

AISLAMIENTOS

TO

TA

L Q

UER

AT

INA

DE

GR

AD

AD

A

(g)

Pelo + glucosa Pelo Casco + glucosa Casco Figura 2. Actividad queratinolítica Fusarium sp. La degradación de queratina involucra dos mecanismos muy cercanos. Primero, penetración mecánica del sustrato por la elongación de la hifa; este proceso es responsable del ataque inicial; y, segundo, la degradación enzimática por las queratinasas secretadas desde la pared celular (Singh, 1999). Esto permite plantear que el tamaño de la partícula puede influenciar en el proceso de colonización de los sustratos, ya que confiere mayor superficie de contacto hifa-sustrato y este es uno de los factores que se pueden tener en cuenta como punto de partida para determinar una de las razones de mayor degradación en casco en comparación con el pelo, teniendo en cuenta que el casco se encontraba molido, mientras que el pelo estaba en trozos que impedían una mayor superficie de contacto y obligaban al hongo a realizar una penetración mecánica. Adicionalmente, la pulverización del casco puede ocasionar la ruptura de los puentes bisulfuro presentes en la queratina, haciéndola más asequible para el hongo (Vignardet et al., 2001). Otra razón que pudo influenciar el alto porcentaje de degradación de queratina en casco es, como lo afirman Apprich y colaboradores (2006), que la producción de queratinasas es estimulada con la adición de diferentes fuentes de queratina al medio de cultivo y, según la naturaleza de dicho sustrato (casco o pelo), la producción puede variar sustancialmente. Existe otra razón por la cual el sustrato casco se pudo haber degradado en una alta proporción. Según Lal (1999), existe la posibilidad que el casco posea sustratos no queratinosos de fácil degradación para el hongo. Pero, esta teoría no pudo ser comprobada en este estudio ya que no se realizaron análisis de caracterización del casco, como tampoco de cambio de pH del medio, parámetro que también es indicador de la degradación de queratina. El complejo mecanismo de queratinolisis involucra la acción cooperativa de sulfitolisis y un sistema proteolítico, lo que conlleva a una consecuente liberación de nitrógeno ocasionando la alcalinización progresiva del medio de cultivo (Singh, 2002; Di Pietro & Roncero, 2005; Gupta & Ramnani, 2006). Por otro lado, la Tabla 5 la Figura 2 y la prueba de rango múltiple de Duncan (Tabla 6) también indican que cuando se emplea pelo como fuente de queratina, el porcentaje de degradación es menor (pelo sin glucosa:

8

media 0.119 equivalente a 47.6% del sustrato inicial y pelo con glucosa media 0,075 g equivalente a 29.8% del sustrato inicial). Esta menor degradación de queratina pudo deberse a la utilización de pelo castaño, ya que en los trabajos donde se reporta el uso de "cebo de pelo", para evaluar actividad queratinolitica utilizando pelo como sustrato (Ulfig, 2000; Mitola et al., 2001), afirman que debe usarse pelo castaño claro preferiblemente, ya que la melanina, responsable del oscurecimiento del pelo, hace que este sea más resistente al ataque por microorganismos (Nosanchuk & Casadevall, 2003). Otro factor que pudo influenciar el bajo porcentaje de degradación de queratina y el crecimiento pobre que se encontró en las pruebas cualitativas, cuando se usó pelo como sustrato, fue que el pelo utilizado además de ser castaño, era grueso y ondulado lo que indica un alto contenido de metionina y según la fisiología de los hongos queratinolílticos descrita por Kunert (2000), este aminoácido puede ser utilizado como fuente de sulfuro, pero en caso de estar en concentraciones mayores a 1mM, es altamente inhibitorio. Según el ajuste del modelo del análisis de rango múltiple de Duncan se encuentra que entre las procedencias no hay diferencias estadísticamente significativas entre humanos y plantas, y sí las hay para animales, aislamientos que presentaron una mayor actividad queratinolítica tanto en degradación de queratina de casco, como en degradación de queratina de pelo. Tabla 7. Prueba de rango múltiple de Duncan para agrupamiento de aislamientos según degradación de queratina

Procedencia N Media Agrupamiento Duncan

Animal 36 0.172975 A Planta 36 0.147978 B Humano 36 0.138611 B

Alfa 0.05 P valor = 0.0040 Aunque no hubo diferencias significativas entre procedencias de humanos y plantas, mostraron una mayor actividad queratinolítica los aislamientos de plantas frente a los aislamientos de humanos, resultado inesperado ya que, debido a la ausencia de queratina en las plantas, no se espera que tengan una buena actividad queratinolítica; porque para la actividad fitopatógena deben tener el complejo enzimático CWDE activo, mecanismo principal mediante el cual se depolimeriza cada uno de los componentes de las paredes celulares (celulosa, xilano, pectinas, ácidos poligalacturónicos y extensinas) (Di Pietro & Roncero, 2005). Estos resultados son interesantes para próximos estudios. Por otro lado, la poca actividad queratinolitica por parte de los aislamientos de humanos se puede explicar por que no se realizó una activación enzimática. Los aislamientos estaban conservados en agua y no se tiene historial de la cantidad de repiques que tuvieron antes de la conservación. La conservación en agua puede tener un alto porcentaje de viabilidad pero puede ocasionar pérdida de características fisiológicas como la capacidad de virulencia (Borba et al., 1992). Este efecto que también puede ser ocasionado por la utilización del método de transferencia seriada (repiques) (Monaghan et al., 1999), teniendo en cuenta estas observaciones, se debió realizar una activación enzimática. Consiste en someter al hongo a crecer en un sustrato de composición igual o parecida al sustrato del cual fue aislado inicialmente (tejido afectado del hospedero), estimulando la producción de enzimas queratinolíticas y así mismo su actividad patogénica original.

Los aislamientos procedentes de animales presentaron mayor degradación de queratina en los dos sustratos. Se debe a que tenían pocos repiques antes de ser utilizados; por lo tanto, estaban expresando todas sus características patogénicas. Como el modelo animal fue el casco, era en éste donde se esperaba mayor actividad, pero también se encontró en el pelo. Así mismo, este resultado puede deberse a que las principales zonas de aislamiento estaban cubiertas de pelo, lo que indica que éste también puede ser empleado como modelo de patogenicidad en animales. El análisis estadístico de agrupamiento de Duncan, haciendo una comparación de medias de todos los aislamientos, arroja tres agrupamientos, en el primero se encuentran los aislamientos 121, 111, 156, 310, 303 y 210, de los cuales los cuatro últimos pertenecen también al segundo grupo, junto con los aislamientos 206 y 203, y estos dos últimos a su vez pertenecen al tercer grupo junto con el aislamiento 308 (Tabla 8). El orden anterior fue dado de mayor a menor degradación de queratina, indicando que los aislamientos que inician con 100 son procedentes de animal, confirmando el agrupamiento de procedencias; los 200 son de humanos y los 300 de plantas. En estos resultados se pude destacar que el aislamiento 308 fue significativamente diferente en cuanto a la degradación de queratina y al comportamiento de las procedencias, pero no afecta el agrupamiento de las mismas; por lo tanto, no se tiene en cuenta, ya que la cantidad de aislamientos evaluados por procedencia no es un número representativo para poder definir una tendencia en comportamiento como patógeno multihospedero. Tabla 8. Prueba de Duncan para degradación de queratina.


121 12 0.18166 A

111 12 0.17141 A

156 12 0.16586 A B

310 12 0.16430 A B

303 12 0.16030 A B

210 12 0.15008 A B C

206 12 0.13302 B C

203 12 0.13274 B C

308 12 0.1194 C

Alfa 0.05 P valor = 0.004 Al analizar los modelos humano y animal por separado (Tabla 9 y 10) encontramos diferencias sustanciales que permiten plantear que cada procedencia tiene una mayor capacidad de atacar su hospedero original (111 procedente de animal presentó una media de degradación de casco de 0.265 y 206 procedente de humano presentó una media de degradación de pelo 0.162). No obstante, hay que tener en cuenta las características y la ubicación de la lesión originaria y así mismo la similitud de los tejido evaluados, ya que el modelo humano utilizado fue pelo, pero el 90% de los aislamientos de animales estaban en contacto directo con este sustrato de origen animal, en tanto que el 90% de los aislamientos procedentes de humanos fueron aislados de lesiones de uña, tejido que se asemeja al casco en su composición y función (Lal et al., 1999). Por lo anterior y porque se trabajan los modelos de patogenicidad in vitro, no se puede reconocer la importancia que tiene la función del sistema inmune de cada hospedero, siendo esta una de las principales diferencias que puede interferir en los modelos evaluados.

9

Tabla 9. Prueba de agrupamiento de Duncan de los aislamientos en relación con la degradación de casco.


111 3 0.26467 A 156 3 0.26233 A 303 3 0.25097 A 121 3 0.25027 A 210 3 0.23977 A 308 3 0.23427 A B 203 3 0.22437 A B 310 3 0.21543 A B 206 3 0.16480 B

Alfa 0.05 P valor = 0.1328 Tabla 10. Prueba de agrupamiento de Duncan de los aislamientos en relación con la degradación de pelo.


206 3 0.16177 A 156 3 0.15133 A 111 3 0.13263 A B 303 3 0.12470 A B 210 3 0.12293 A B 308 3 0.11683 A B 310 3 0.09487 A B 121 3 0.08877 A B 203 3 0.04323 B

Alfa 0.05 P valor = 0,1744 Fusarium sp., COMO MODELO MULTIHOSPEDERO A partir de los resultados obtenidos en los tres modelos de patogenicidad desarrollados en el presente estudio, se realizó un análisis estadístico de correlaciones que buscaba evaluar la capacidad multihospedera de Fusarium sp., teniendo en cuenta que en esta prueba se toman valores cercanos a 1 y -1 como un índice de correlación representativo. La Tabla 10 indica que el comportamiento de las tres clases de procedencia es diferente y no se correlacionan. Tabla 10. Correlación de los modelos de patogenicidad

Queratina pelo

Queratina casco

Área bajo la curva (Planta)

Queratina pelo 1

Queratina casco

-0,09995258 1

Área bajo la curva (Planta)

0,03037409 0,45926013 1

Aunque los resultados estadísticos del presente estudio de correlación no indiquen un valor representativo, varios autores han reportado a Fusarium sp., como un hongo capaz de causar patologías en varios tejidos y comportarse como multihospedero. Di Pietro y Roncero (2005) encontraron en su estudio que una cepa de Fusarium procedente de tomate, F. oxysporum f.sp. lycopesici, presentaba capacidad de infectar de manera sistémica y causar de forma consecuente la muerte de ratones inmunodeprimidos. De la misma forma, González y colaboradores (1998) reportaron que los animales domésticos (perros y gatos), representan un importante reservorio de Fusarium sp., causante de dermatomicosis en el hombre. Adicionalmente, los resultados de este estudio permiten observar que todos los aislamientos independientemente de su procedencia, mostraron capacidad de infectar los

tres tejidos evaluados en diferentes proporciones, indicando una posible capacidad multihospedera; por lo tanto se puede concluir que el número de aislamientos utilizados no es representativo para este tipo de análisis estadístico. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Agrios GN. 2005. Plant pathology. 5th Edition. Elsevier Academic. Amsterdam. Andrew SE, Brooks DE, Smith PJ, Gelatt KN, Chmielewski NT, Whittaker CJ. 1998. Equine ulcerative keratomycosis: visual outcome and ocular survival in 39 cases (1987-1996). Equine Veterinary Journal, 30(2): 109 – 116. Apprich V, Spergser J, Rosengarten R, Stanek C. 2006. In vitro degradation of equine keratin by dermatophytes and other keratinophilic fungi. Veterinary Microbiology, 114: 352 – 358. Ardila H, Higuera BL. 2005. Inducción diferencial de Polifenoloxidasa y β-1,3.Glucanasa en clavel (Dianthus caryophyllus) durante la infección por Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2. Acta Biológica Colombiana, 10 (2): 61 – 74. Astudillo MC, Blanco B. 1999. Establecimiento de los parámetros para producción semi-industrial del hongo Trichoderma harzianum, utilizado en control biológico. Tesis de pregrado para optar al título de Microbiólogo Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología. Bogotá, Colombia. Betbeze CM, Wu CC, Krohne SG, Stiles J. 2006. In vitro fungistatic and fungicidal activities of silver sulfadiazine and natamycin on pathogenic fungi isolated from horses with keratomycosis. American Journal of Veterinary Research, 67: 1788 – 1793. Bueno L, Gallardo R. 1998. Preservación de hongos filamentosos en agua destilada estéril. Revista Iberoamericana de Micología, 15: 166 – 168. Calado NB, Sousa F Jr., Gómez NO, Cardoso FR, Zaror LC, Milan EP. 2005. Fusarium nail and skin infection: a report of eight cases from Natal, Brazil. Mycopathologia, 161 (1): 27 – 31. Caracuel Z, Roncero MIG, Espeso EA, González-Verdejo CI, García-Maceira FI, Di Pietro A. 2003. The pH signalling transcription factor PacC controls virulence in the plant pathogen Fusarium oxysporum. Molecular Microbiology, 48 (3): 765 – 779. Daniel W. 1997. Bioestadística: base para el análisis de las ciencias de la salud. Tercera edición. Editorial Limusa: Grupo Noriega Editores. Madrid. De Hoog GS, Guarro J, Gene J, Figueras MJ. 2000. Atlas of clinical fungi. Centraalbureau voor Shimmelculteres. Utrecht. Díaz G. 1997. Micotoxinas y micotoxicosis en salud humana y animal. Veterinaria al día, 2(1): 28–34; 2(3): 3–8 Di Pietro A, Roncero MIG. 2005. Temas de actualidad: Fusarium oxysporum: un modelo para el análisis de la patogénesis fúngica en plantas y humanos. Actualidad Sem, 37: 6–13. Elligott CR, Wilkie DA, Kuonen VJ, Bras ID, Neihaus A. 2006. Primary Aspergillus and Fusarium keratitis in a Holstein cow. Veterinary Ophthalmology, 9 (3): 175 – 178. Forero MC. 2007. Manual de laboratorio, Fitopatología. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá, Colombia. Franco M. 2006. Manual de prácticas de laboratorio, Micología. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá, Colombia. Garcés de Granada E, Orozco de Amézqita M, Bautista GR, Valencia H. 2001. Fusarium oxysporum el hongo que nos falta conocer. Acta Biológica Colombiana, 6 (1): 30 – 33.

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