EVALUACIÓN DE LA RESISTENCIA GENÉTICA DE ESPECIES DE Passiflora spp A Fusarium spp, AGENTE CAUSAL DE LA “SECADERA”

JENNIFER LONDOÑO ARAMBURO

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

COORDINACION GENERAL DE POSTGRADOS

PALMIRA

2012

  

  

EVALUACIÓN DE LA RESISTENCIA GENÉTICA DE ESPECIES DE Passiflora spp A Fusarium spp, AGENTE CAUSAL DE LA “SECADERA”

JENNIFER LONDOÑO ARAMBURO

Trabajo de grado para optar al título de:

MAGÍSTER EN CIENCIAS AGRARIAS ÉNFASIS PROTECCIÓN DE CULTIVOS

DIRIGIDO POR:

EYDER DANIEL GÓMEZ LÓPEZ

Ingeniero Agrónomo, Ph. D.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

COORDINACION GENERAL DE POSTGRADOS

PALMIRA

2012

  

  

  

  

“La facultad y los jurados de la tesis de grado

no se harán responsables de las

ideas emitidas”

Articulo 24, resolución 04 de 1974

  

  

DEDICATORIA

Este trabajo está dedicado primeramente a Dios por permitirme alcanzar este

importante logro, al haberse constituido en mi permanente acompañante y guía,

fortaleciéndome siempre en los momentos cruciales en cada paso de mi vida. A

mis padres JORGE ENRIQUE y MARÍA EUGENIA, y mi hermano JULIO

ENRIQUE, quienes con su continua ayuda y apoyo fijaron en mi sendero de la

superación y consagración.

JENNIFER

  

  

AGRADECIMIENTOS

Quiero expresar mis más sinceros agradecimientos a una persona que admiro mucho, al Dr Eyder Daniel Gómez, por su dirección, paciencia, comprensión, apoyo permanente y formación profesional.

Al Dr. Edgar Iván Estrada, por su estimulo a continuar estudiando, por su apoyo incondicional y amistad.

Al Dr. Carlos Alberto Huertas, por su ayuda, generosidad y amistad. Un ejemplo a seguir.

A la I.A., M.Sc. Martha Liliana Bonilla, por la confianza que depositó en mí, y al acompañarme en cada una de las etapas de este trabajo.

Al I.A., M.Sc. Andrés Mauricio Posso, por abrirme las puertas en el laboratorio de Biología Molecular, por su enseñanza y generosa ayuda.

A la I.A., M.Sc. Carolina Cardozo, por su apoyo en el proceso de este trabajo y por brindarme buenos momentos durante este trayecto.

Al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, por contribuir con el apoyo económico de este trabajo.

A la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria “CORPOICA” Palmira, por abrir las puertas para el desarrollo de este trabajo, y contribuir con el apoyo científico y logístico.

Al Dr. Jaime Eduardo Muñoz, por su asesoría en los análisis estadísticos.

A CENICAFE, por donar varias de las especies de Passifloras, utilizadas en la evaluación de la resistencia.

A la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira, por la formación que me ha brindado.

A mis amigos Carlos Alberto Hoyos y Neidy Yalile Quiñonez, por colaborarme, apoyarme en gran parte de este trabajo y por su bonita amistad.

A todas las personas que de una u otra forma colaboraron, aportando su granito de arena para culminar este trabajo. A todos, Dios los bendiga.

  

I  

CONTENIDO

Pág.

INTRODUCCIÓN 22

1. OBJETIVOS 25

1.1 OBJETIVO GENERAL 25

1.2 Objetivos específicos 25

2. MARCO TEÓRICO 26

2.1 La familia Passifloraceae 26

2.2 El género Passiflora 26

2.3 DESCRIPCIÓN TAXONÓMICA DEL MARACUYÁ 27

2.4 Passiflora edulis sims var flavicarpa Degner (Maracuyá) 28

2.4.1 Condiciones y requerimientos agroecológicos del Maracuyá 30

2.5 Importancia Económica 30

2.6 Enfermedades del Maracuyá 33

2.6.1 Muerte descendente en ramas 33

2.6.2 Enfermedades foliares: Mancha parda 33

2.6.3. Enfermedades en frutos 34

2.6.4. LA SECADERA DEL MARACUYÁ 34

2.7 Género Fusarium sp 36

2.7.1 Clasificación taxonómica del Género Fusarium sp 36

2.8 Alternativa de control de la secadera en maracuyá 37

  

II  

3. MATERIALES Y MÉTODOS 39

3.1 LOCALIZACIÓN GEOGRÁFICA 39

3.2 Estandarización de una metodología eficiente de inoculación para hongos del género Fusarium spp agente causal de la secadera

39

3.2.1 Método de inmersión de raíces 39

3.2.2 Método de incisión de tallo 40

3.3 Evaluación de la respuesta de la inoculación del hongo Fusarium sp. a las diferentes especies de Passifloras

41

3.3.1Diseño experimental 41

3.4 Identificación morfológica y molecular de las especies del género Fusarium aislados de Passifloras con síntomas de secadera en el Valle del Cauca, Colombia.

44

3.4.1 Caracterización morfológica. 45

3.4.2 Caracterización molecular 46

3.4.3 EXTRACCIÓN DE ADN DE Fusarium 46

3.4.3.1 Preparación de los aislados para la extracción de

ADN 46

3.4.3.2 Procedimiento de la extracción de ADN 46

3.4.3.3 PCR para amplificación de la región ITS1 – ITS4 y

posterior secuenciación de los aislados del género

Fusarium que manifiestan síntomas de secadera en

plantas de maracuyá

48

3.4.3.4 Purificación y secuenciación del fragmento

amplificado de la región ITS1-ITS4 49

  

III  

3.5 Cepas de referencias 49

3.6. Caracterización molecular de las especies de Passifloras seleccionadas para la evaluación de resistencia a Fusarium sp

50

3.6.1 Colecta del material vegetal 50

3.6.2 Material vegetal 52

3.6.3 Extracción de ADN 52

3.6.4 Evaluación de cantidad y calidad de ADN 52

3.6.5 Marcadores moleculares RAMs 53

3.6.6 Análisis de la información 54

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 55

4.1 Estandarización de inoculación para hongos del género Fusarium

spp agente causal de la secadera 55

4.2 Evaluación de la respuesta de la inoculación del hongo Fusarium

sp. a las diferentes especies de Passifloras 56

4.3 Identificación morfológica y molecular de las especies del género

Fusarium aislados de Passifloras con síntomas de secadera en el

Valle del Cauca, Colombia

59

4.3.1 Caracterización morfológica de las especies encontradas

en este estudio. 59

4.3.2 Fusarium solani 60

4.3.3 Fusarium oxysporum 66

4.3.4 Fusarium verticillioides 71

4.3.5 Fusarium brachygibbosum 73

  

IV  

4.4 Identificación de los aislados por secuenciación 75

4.5 Caracterización molecular de las especies de Passifloras

seleccionadas. 81

4.5.1 Extracción de ADN 81

4.5.2 Características de los cebadores 82

4.5.3 Análisis descriptivo 85

4.5.4 Heterocigosidad esperada (He) y porcentaje de loci

polimórficos 88

5. CONCLUSIONES 90

6. RECOMENDACIONES 92

BIBLIOGRAFÍA 93

ANEXOS 102

  

V  

LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. Proceso de inoculación del hongo Fusarium sp. a las especies de Passifloras

40

Figura 2. Proceso de inoculación del hongo Fusarium sp. a las especies de Passifloras, a través del método incisión de tallo

41

Figura 3. Evaluación del método de inmersión de raíces e incisión de tallo

55

Figura 4. Prueba de promedio Duncan P (0.005) 57

Figura 5. Evaluación de la resistencia de Passifloras resistentes al hongo del género Fusarium sp. agente causal de la secadera del maracuyá

58

Figura 6. Evaluación de la resistencia de especies de Passifloras susceptibles al hongo del género Fusarium sp. agente causal de la secadera del maracuyá

58

Figura 7. MUC1. A. Abundantes clamidosporas individuales y en parejas y B. microconidos

60

Figura 8. MUC1. Colonia blanca con micelio aéreo. 61

Figura 9. MUC2. A – C. microconidos B - D. clamidosporas 61

Figura 10. MUC 2. Colonia blanca con escaso micelio aéreo. 62

Figura 11. MUC 4. A, B - C. micro, meso y macroconidios 62

Figura 12. MUC 4. Colonia crema con escaso micelio aéreo. 63

Figura 13. MUC7. A - B. micro y macroconidios. C – D. Clamidosporas en cadena.

63

Figura 14. MUC7. Colonia blanca con micelio aéreo de estructura algodonosa.

64

Figura 15. MUC12. A. microconidios. C – D. Clamidosporas en cadenas e 64

  

VI  

individuales

Figura 16. MUC12. Colonia blanca con escaso micelio aéreo. 65

Figura 17. MUC13. A. Clamidosporas individuales B. microconidios 65

Figura 18. MUC13. Colonia blanca con escaso micelio aéreo. 66

Figura 19. MUC3. A - B. clamidosporas en pareja e individuales, C. macro y microconidio

67

Figura 20. MUC3. Colonia violeta, escaso micelio aéreo. 67

Figura 21. MUC5. A - B. meso y microconidio 68

Figura 22. Colonia violeta, escaso micelio aéreo. 68

Figura 23. A - B. micro, meso y macroconidio C – D. Clamidosporas individuales y en cadena

69

Figura 24. MUC9. Colonia blanca-violeta, escaso micelio aéreo. 69

Figura 25. MUC10. A - B. abundantes clamidosporas en cadena, pareja e individuales. C - D micro, meso y macroconidio

70

Figura 26. MUC10. Colonia violeta, escaso micelio aéreo. 70

Figura 27. MUC6. A. Células agrandadas. B. microconidios 71

Figura 28. MUC6. Colonia blanca - violeta, con micelio aéreo. 72

Figura 29. MUC8. A. micro, meso y macroconidios. B. Células agrandadas

72

Figura 30. MUC8. Colonia blanca – rosado, micelio aéreo de estructura algodonosa.

73

Figura 31. MUC11. A – B. Estructuras desconocidas. C. microconidios 74

Figura 32. MUC11. Colonia blanca – violeta con escaso micelio aéreo. 75

Figura 33. Amplificación en gel agarosa de los hongos del género Fusarium

76

Figura 34.  Árbol filogenético, la raíz es Acremonium, donde muestra la agrupación de las 13 especies de Fusarium sp. aislados del

78

  

VII  

cultivo de maracuyá con síntomas de secadera, colectadas en seis municipios del Valle del Cauca y amplificado por PCR-ITS, con los iniciadores ITS 1 e ITS 4. Y cuatro cepas de referencias. 0.1 indica la distancia genética. El árbol filogenético se construyó con el progama Treecom. Los porcentajes se calcularon con 1000 réplicas

Figura 35. Árbol filogenético relacionando las secuencias ITS de los diferentes aislados de F. solani, mediante el programa Treecom versión 1.3b., se indica valores de “bootstrap” > 98%.

80

Figura 36. Árbol filogenético relacionando las secuencias ITS de los diferentes aislados de F. oxysporum, mediante el programa Treecom versión 1.3b., se indica valores de “bootstrap” > 96%.

80

Figura 37. ADN de las accesiones de las especies de Passiflloras, extraído mediante la metodología de Dellaporta et al (1983) con modificaciones

82

Figura 38. Heterocigocidad y porcentaje de loci polimórficos (95%) para cada uno de los cebadores RAMs utilizados

85

Figura 39.

Dendrograma de distancia genética de 28 introducciones de Passifloras, basado en el coeficiente de similitud de Dice Nei-Li (1978) y calculado con los datos combinados de los cuatro cebadores RAMs

87

  

VIII  

LISTA DE TABLAS

Pág.

Tabla 1. Departamentos con mayor producción de maracuyá en Colombia.

32

Tabla 2. Escala de evaluación de daño en tallos y raíces en maracuyá propuesta por Rodríguez et al., 1991

43

Tabla 3. Aislamientos obtenidos de cultivo de maracuyá en el Valle del Cauca, presentando síntomas de marchitamiento (Secadera).

44

Tabla 4. Cepas de referencia. 50

Tabla 5. Introducciones y especies de Passifloras seleccionada para la evaluación de resistencia.

51

Tabla 6. Cebadores RAMs utilizados en la caracterización molecular. 53

Tabla 7. Análisis de Varianza 56

Tabla 8. Análisis del programa BLAST para comparar la máxima identidad de las 13 especie de Fusarium sp.

76

Tabla 9. Bandas totales y polimórficas obtenida con los cebadores RAMs utilizados para la evaluación de la diversidad genética.

83

Tabla 10. Valores de Heterocigosidad y porcentaje de lous polimórficos (95%) para los cebadores RAMs utilizados.

84

  

IX  

LISTA DE ANEXOS

    Pág.

ANEXO A. Medios de cultivos 102

ANEXO B. Tabla 1. Aislamiento de ADN genómico 103

ANEXO C. Tabla 2. Evaluación de la resistencia de 28 introducciones de 17 especies de Passifloras.

104

ANEXO D. Tabla 3. Secuencia de los 13 aislamientos de los hongos del género Fusarium

114

  

X  

Abreviaturas empleadas ADN Ácido desoxirribonucleico

ANDr Ácido desoxirribonucleico ribosómico

ARN Ácido ribonucleico

Blast Basic Local Alignement Sequence Tool

CECT Colección Española de Cultivos Tipo

CLA Carnation Leaf Agar

Cm Centímetro

CTAB Bromuro de cetil-trimetil-amonio

dNTPs Desoxinucleotidos trifosfato

EDTA Ácido etilendiaminotetracético

F. Fusarium

g Gramo

gmol-1 Gramos mol

He Heterocigocidad esperada

ITS Región espaciadora intergénica

ITS Internal Transcribed Spacer Regions

Kb kilobases (1000 pb)

Kg Kilogramos

M Molar

mg Miligramo

mL Mililitro

mm Milímetros

  

XI  

mM Milimolar

msnm Metro sobre nivel del mar

NCBI National Center For Biotecnology Information

ng nanogramo

°C Grados centígrados

PCR Polymerase Chain Reaction (reacción en cadena de la polimerasa)

PDA Agar Patata Dextrosa

P. Passiflora

RAMs Random Amplified Microsatellites

Rpm Revoluciones por minuto

Seg Segundos

sp. Especie

spp. Especies

TE Tris-EDTA

µg Microgramos

µL Microlitro

µm Micrómetro

U Unidades

UPGMA Unweighted pair-group method with arithmetic mean

V Voltios

  

XII  

RESUMEN

El maracuyá amarillo Passiflora edulis Sims var flavicarpa Degener, representa un

renglón importante en la fruticultura colombiana, por su aceptación en el mercado

nacional y por su potencial de exportación.

El departamento del Valle del Cauca es considerado como el de mayor

participación en la producción nacional de esta fruta, a pesar que los cultivos

presentan alta incidencia de una enfermedad vascular conocida como secadera,

causado por el hongo Fusarium oxysporum f. sp. passiflorae.

Una solución a esta problematica es el uso de portainjertos resistentes para

controlar los hongos fitopatógenos del suelo y prevenir pérdidas en el maracuyá,

por esta razón se debe buscar especies del género Passiflora que sean

resistentes o tolerantes. Es así como Corpoica mantiene el banco de

germoplasma de Passifloras en el Centro de Investigación La Selva, algunas

especies con potencial comercial, que expresan una notoria variabilidad genética,

interespecífica e intraespecífica. De este banco se seleccionaron 28

introducciones pertenecientes a 17 especies de Passifloras para evaluar la

resistencia a Fusarium oxysporum f. sp. passiflorae causante de la secadera del

maracuyá. A estas introducciones se le realizó un estudio de diversidad genética

para determinar la distancia filogenética entre las especies seleccionadas.

Para la evaluación de las Passifloras seleccionadas, se probaron dos

metodologías para inocular: el método de incisión de tallo y el método de

inmersión de raíces. Se utilizó el aislamiento más patogénico (MUC5), obtenido en

estudios anteriores.

Se aislaron 13 hongos del género Fusarium, obtenidos a partir de tallo y raíz de

plantas afectadas con síntomas de secadera del maracuyá detectados en cinco

municipios del departamento del Valle del Cauca. Una vez obtenidos los aislados

  

XIII  

se identificaron morfológica y molecularmente. En este estudio se determinó que

los 13 aislamientos pertenecen al género Fusarium; estos aislamientos se

agruparon en cuatro especies: F. verticillioides, Fusarium oxysporum, Fusarium

brachygibbosum, y Fusarium solan;, además se encontró que hay diferencias inter

e intraespecies.

Palabras clave: Fusarium, región ITS, variabilidad genética, Passifloras,

resistencia.

  

XIV  

SUMMARY

The yellow passion fruit Passiflora edulis Sims var flavicarpa Degener, it’s an

important asset for Colombian fruit, for its acceptance in the domestic market and

export potential.

The department of Valle del Cauca is considered the largest share in domestic

production of this fruit, though the crops have high incidence of vascular disease,

known as dry wilt caused by the fungus Fusarium oxysporum f. sp. passiflorae.

A solution to this problem is the use of resistant rootstocks to control fungal

pathogens and prevent soil loss in the passion fruit, therefore species of Passiflora

that are resistant or tolerant should be sought. Thus Corpoica keeps Passifloras

genebank Research Center La Selva, including some species with commercial

potential, which express a remarkable genetic variability, interspecific and

intraspecific. From this bank 28 introductions species were selected belonging to

17 Passifloras to assess resistance to Fusarium oxysporum f. sp. passiflorae

causing passion fruit dry wilt. These introductions will be a study of genetic

diversity, to determine the phylogenetic distance between selected species.

To evaluate the selected Passifloras, two methods were tested to inoculate, cut the

stem and the roots immersion. Insulation was used most pathogenic (MUC5)

obtained in previous studies.

13 Fusarium fungi were isolated, they were obtained from the stem and the root of

plants affected with symptoms of dry wilt of passion fruit in five municipalities in the

department of Valle del Cauca. After obtaining the isolated they were identified

morphologically and molecularly. This study found that 13 isolated belong to the

genus Fusarium, these isolated were grouped in four species: F. verticillioides,

Fusarium oxysporum, Fusarium brachygibbosum, and Fusarium solani, it was also

found that inter and intraspecies differences.

  

XV  

Keywords: Fusarium, ITS region, genetic variability, Passifloras, resistance.

  

‐ 22 ‐  

INTRODUCCIÓN

El género Passiflora de la familia Passifloraceae está conformado por 450

especies, ubicadas en su mayoría en el trópico. Se destacan por su valor

económico, medicinal y ornamental. Solo algunas especies son cultivadas, la

mayor parte son silvestres cuyos frutos son consumidos localmente. Esta planta

se adapta a un sin número de hábitats. Colombia es el país con la mayor

diversidad de Passifloras en el mundo. Se registran 165 especies en la región

Andina por encima de los 1.800 msnm; se concentran las especies del subgénero

Tacsonia (curubas), y las especies del subgénero Passiflora (granadillas, badea,

chulupa) con una distribución desde el nivel del mar hasta los 2.400 msnm

aproximadamente (Escobar, 1991).

En Colombia, Brasil y Ecuador se cultiva dos especies de maracuyá: la de color

púrpura Passiflora edulis Sims y la amarilla P. edulis Sims var flavicarpa Degener,

siendo el segundo el más cultivado comercialmente. En Colombia el área cultivada

a nivel comercial está dominada por una sola especie: el maracuyá amarillo

Passiflora edulis Sims var flavicarpa Degener (García, 2002).

En el Valle del Cauca, el maracuyá Passiflora edulis Sims var flavicarpa Degener,

es uno de los frutales con un gran potencial agrícola desde el punto de vista

económico por su aceptación en los mercados nacionales e internacionales, los

altos rendimientos en el área sembrada y por la generación de empleo.

En el cultivo de maracuyá se han venido incrementando diversos problemas

fitosanitarios que limitan su producción, razón por la cual su siembra se ha

desestimulado (González et al., 2002). Una de las más importantes, es la

secadera del maracuyá según algunos autores es causada por hongos del género

Fusarium de difícil control por los sistemas convencionales, disminuyendo los

  

‐ 23 ‐  

rendimientos en forma considerable e incrementando los costos de producción,

motivo por el cual, se considera necesario incrementar los conocimientos con

relación al cultivo con miras a buscar alternativas de manejo que mejoren su

sostenibilidad. El Valle del Cauca es considerado por la encuesta nacional

agropecuaria 2006 (CCI, 2007), uno de los departamentos con mayor participación

en la producción nacional de esta fruta (31%); no obstante debido a su alta

susceptibilidad los cultivos presentan alta incidencia de secadera. (Proyecto

Corpoica Palmira, 2011).

En Colombia existen registros de que esta enfermedad ocasionó en el norte del

Valle del Cauca, entre el 30 y el 100% de muerte de las plantas en el periodo de

1997-1999 (Torres et al., 2000). Actualmente su incidencia está entre un 10 y

40%; es de resaltar que los cultivos comerciales en este momento alcanzan una

vida útil de 15 meses aproximadamente.

Una alternativa para el control de esta enfermedad es la utilización de variedades

o genotipos que ofrezcan resistencia genética a este patógeno del suelo, los

cuales deben conservar las características agronómicas y de calidad exigida por el

mercado nacional e internacional.

Según lo reportado por Meletti et al., (2005) en estudios de evaluacion de la

resistencia de especies de Passifloras, describen que han sido identificada

algunas especies con resistencia a Fusarium oxysporum como Passiflora giberti,

P. alata y P. caerulea.

Teniendo en cuenta que las especies silvestres pueden presentar incompatibilidad

con los brotes a injertar dado que sus tallos son muy finos, se ha estandarizado

otra alternativa de manejo, el método de injertación. El método de injerto

hipocotiledonal, que consiste en germinar las semillas del patrón y la semilla del

portainjerto; cuando estas tienen dos hojas verdaderas se corta el patrón y se

hace una hendidura en el centro del tallo y sobre este se injerta la copa cortando

  

‐ 24 ‐  

por debajo del los cotiledones (Nogueira et al., 2005), el método de injerto de cuña

o hendidura y el método del injerto de empalme (Gardner 1987).

Con el presente trabajo, se evaluó la resistencia genética de 28 introducciones,

pertenecientes a 17 especies de Passiflora spp a Fusarium spp, agente causal de

la “secadera”.

  

‐ 25 ‐  

1. OBJETIVOS

1.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar bajo condiciones controladas la resistencia de 28 introducciones de

Passifloras spp a Fusarium spp agente causal de la secadera.

1.2 Objetivos específicos

Estandarizar una metodología eficiente de inoculación para hongos del

género Fusarium spp agente causal de la secadera.

Evaluación de la respuesta de la inoculación del hongo Fusarium sp. a las

diferentes especies de Passifloras.

Identificar morfológica y molecularmente las especies del género Fusarium

aislados de Passifloras con síntomas de secadera en el Valle del Cauca

COLOMBIA.

Caracterizar molecularmente las 28 introducciones de Passifloras

seleccionadas para la evaluación de resistencia a Fusarium sp.

  

‐ 26 ‐  

2. MARCO TEÓRICO

El nombre de Passiflora fue dado por Pluckenet en 1696, el cual se deriva del latín

“Flor Passionis” flor de la pasión (Escobar, 1988; Vecchia, 2000). Inicialmente, fue

la flor que atrajo la atención tanto de expertos botánicos como de coleccionistas

por su gran belleza, sin embargo los frutos poco a poco se fueron consolidando

como alimentos muy apetecidos por su valor nutricional y medicinal tanto en

Europa como en América del Norte (Ijjász, 1999).

2.1 La familia Passifloraceae

Es una familia de plantas de tamaño medio, las cuales pueden encontrarse en

forma de lianas o enredaderas herbáceas con zarcillos axilares, hasta arboles

bajos y arbustos. Su descripción taxonómica corresponde a que presentan hojas

siempre alternas, pecioladas con estípulas pequeñas o a veces caedizas, en

general ovadas o bilobuladas, muy a menudo con nectarios en el haz, cáliz floral

en forma de copa; fruto en forma de baya globosa, con semillas, de testa dura y

endospermo carnoso. (Killip, 1938; Uribe, 1972; Cronquist, 1978; Heywood, 1985;

Escobar, 1988).

2.2 El género Passiflora.

El género Passiflora, pertenece a la familia Passifloraceae, se distribuye en

regiones tropicales y subtropicales desde el nivel del mar hasta altitudes

superiores a 3000 m.s.n.m., pero la mayor riqueza en especies se encuentra en

las regiones moderadamente cálidas y templadas, entre 400 y 2000 m.s.n.m. Los

siguientes autores hacen una revisión taxonómica de este género donde Feuillet y

McDougal, 2003; Ulmer y McDougal, 2004, redujo de 22 (Killip, 1938) a cuatro los

  

‐ 27 ‐  

subgéneros: Astrophea (57 especies), Deidamioides (13 especies), Decaloba (214

especies) y Passiflora (236 especies).

Cerca del 90% de las 520 especies de Passiflora son originarias en América

(Escobar, 1988). En Colombia se han registrado 165 especies (Ocampo et al.,

2007), 58 de ellas se han considerado como endémicas. Sin embargo, varias

especies andinas están amenazadas y algunas ya se consideran extintas. La

elevada diversidad de la zona cafetera colombiana, hogar del 59% de las especies

de Passifloraceae, ha sido afectada por la intensa fragmentación de las selvas

andinas (Kattan, 1997).

En Colombia las Passifloras comerciales como el maracuyá (Passiflora edulis

Sims var flavicarpa Degener), la granadilla (Passiflora ligularis) representan un

renglón relevante en la fruticultura. En el mercado de las frutas, Colombia se

encuentra dentro de los tres primeros productores y exportadores de Maracuyá de

Suramérica, teniendo en cuenta además que esta provee el 90% de la producción

a nivel mundial (CCI, 2007).

2.3 DESCRIPCIÓN TAXONÓMICA DEL MARACUYÁ

• División: Espermatofita

• Clase: Dicotiledonea

• Orden: Parietales

• Familia: Passifloraceae

• Género: Passiflora

• Subgénero: Passiflora

• Especie: Passiflora edulis Sims var flavicarpa Degener

• Nombre común Maracuyá, parchita,

Fuente: Kilip, 1938 y Cronquist, 1978; Escobar y Forero, 1993.

  

‐ 28 ‐  

2.4 Passiflora edulis sims var flavicarpa Degner (Maracuyá)

El maracuyá, es una planta de la región del Amazonas. Este es considerado el

centro de origen de unas 150-200 especies del género Passiflora (García, 2002).

Esta planta cuenta con 550 especies que en estado silvestre se desarrollan en Sur

América, Asia y en el Pacífico Sur (Agostini, et al. 2002). De las especies del

género Passiflora se destacan entre 50 a 60 especies que producen frutos

comestibles, de interés comercial (Araújo, et al., 2002) de las cuales en Colombia,

prácticamente el área cultivada está dominada por una sola especie, el maracuyá

amarillo Passiflora edulis Sims var flavicarpa Degener, la cual según García,

(2002) es una mutación del maracuyá morado Passiflora edulis. El rango óptimo

de altitud para siembra, oscila entre los 900 y 1500 msnm, con temperaturas

promedio de 24ºC y mínimo 5 horas/luz/día, requerimientos de agua entre 800-

1500 mm/año, además de riego en la época seca. Tiene fácil adaptación a

diferentes tipos de suelos si estos son profundos, fértiles, con pH cercano a la

neutralidad y buen drenaje interno y externo.

Se puede propagar por semilla, estaca, acodo e injerto; comercialmente se hace

por semilla, la cual, previa elección se siembra en germinadores en donde dura 30

días, luego se lleva a almácigos por 30 días, transcurridos los cuales se traslada a

los sitios definitivos en el campo. Desde que se traslada a campo hasta la floración

transcurren 180 días. Presentan tres cosechas grandes, cada una de dos meses,

intercaladas con dos “mitacas o traviesas”, de cuatro meses cada una. Las

cosechas coinciden con los periodos de verano en la zona; los periodos lluviosos

inducen las floraciones (Paredes, 1996).

La fruta puede alcanzar un peso promedio mínimo de 130 g, el rendimiento de

jugo puede alcanzar el 36% y el contenido de ácidos solubles entre 13 - 18 º Brix,

y se utiliza directamente en refrescos, o ser industrializada para la elaboración de

cremas alimenticias, dulces cristalizados, sorbetes, licores, confites, néctares,

jaleas, refrescos y concentrados. La cáscara es utilizada en Brasil para preparar

  

‐ 29 ‐  

raciones alimenticias de ganado bovino, pues es rica en aminoácidos, proteínas,

carbohidratos y pectina. Este último elemento hace que se emplee en la industria

de la confitería para darle consistencia a jaleas y gelatinas (García, 2002).

Se considera la maracuyá, una fruta de especial importancia a nivel industrial no

solo por su sabor intenso, alta acidez, agradable aroma y elevado contenido de

vitamina C (Knigth & Sauls, 2005), sino también por las propiedades medicinales

de su follaje y frutos, atribuidas a la presencia de alcaloides (Gupta, 1995) por lo

que son utilizadas en América y algunos países Europeos en la medicina

tradicional. En el follaje del maracuyá se encuentran alcaloides indólicos como

harmana, harmina y harmol y compuestos como la Passiflorina, que le confieren

efecto tranquilizante, antiespasmódico, anticonvulsivo y regulador de la presión

arterial, además, es usado en la elaboración de perfumes y esencias (Gupta,

1995). La semilla contiene un 20-25 % de aceite, que según el Instituto de

Tecnología y Alimentos de Brasil se puede usar en la fabricación de aceites, tintas

y barnices. Este aceite puede ser refinado para otros fines como el alimenticio, ya

que su calidad se asemeja al de la semilla de algodón en cuanto a valor

alimenticio y a la digestibilidad; además contiene un 10% de proteína. Otro

subproducto que se extrae es la maracuyina, un tranquilizante muy apreciado en

Brasil (García, 2002).

  

‐ 30 ‐  

2.4.1 Condiciones y requerimientos agroecológicos del Maracuyá

CONDICIONES AGROECOLÓGICAS PLAGAS Y ENFERMEDADES

ALTITUD m.s.n.m <1200 PLAGAS Gusano cosechero

(Agroulis sp). Arañita roja (Tetraichus sp). Mosca sonsa (Dasiops sp). Encrespador cogollo (Trips

sp). Lorito verde (Diabrótica sp). Tortuguilla (Ceroplastes

sp).

RADIACIÓN H/día >4 TEMPERATURA ºC 20-30 PRECIPITACIÓN mm 1000-2000

HUMEDAD % PENDIENTE %

ZONA DE VIDA

Bosque espinoso subtropical Bosque muy seco tropical.

Bosque seco tropical.

NIVEL DE NUTRIENTES DEL

SUELO.

N Kg/ha 150 ENFERMEDADES Mancha parda

(Alternaria sp) Pudrición del fruto

(Phytophthora nicotianae var. Parasíticas)

Mancha por septoria (Septoria passiflorae.

Roña (Cladosporium herbarum).

Secadera (Fusarium sp.) Antracnosis

(Colletrotrichum gleosporoides penzingi)

P2O5 Kg/ha 45 K2O Kg/ha 160 PH Kg/ha 5.5-6.5

PROFUNDIDAD cm 50

TEXTURA Clase Franca, Franco-arenoso, franco-

arcilloso

DISTANCIA DE SIEMBRA 3*3, 3*4, 2.5*6

DENSIDAD DE SIEMBRA (Plantas/Ha) 1111, 833, 666

VIDA UTIL ±17 meses

COSECHA: inicia de los 8 después de la siembra y es continua durante mínimo 14 meses.

LABORES CULTURALES DESYERBAS: 4 por año

incluida 1 aplicación de herbicidas.

PODAS: de formación. TUTORADO: espaldera o

emparrado. Control sanitario: insectos

y hongos.

Fuente: fundación sonrisas de colores (2004). Secretaria agricultura del Huila. Acuerdo de productividad codena frutícola. 2006

2.5 Importancia Económica

En Colombia el cultivo comercial se inició en los años 60, por medio de la

importación de plantas procedentes de Hawaii, Brasil y Venezuela (Chacon, 1988).

Solo hasta los 80 se lanzó al mercado internacional (como jugo y concentrado),

  

‐ 31 ‐  

contribuyendo al desarrollo del cultivo en zonas del Valle del Cauca y la zona

marginal baja cafetera de los departamentos de Caldas, Quindío, Risaralda y

Tolima, así como Huila. La superficie dedicada varía entre 2.500 y 7.000 hectáreas

y el 70% de la producción se exporta, dejando el 30% para el mercado interno. El

rendimiento medio alcanza las 20 t/ha, y su costo medio de producción, es de US$

180/t. Colombia participa en el mercado mundial de manera variable; en 1993

aportó del 60 al 70%, aunque en el 1994 contribuyó sólo el 7.3%. En Colombia, el

ICA promovió ampliamente el cultivo al tiempo que se dio un fuerte soporte técnico

y créditos accesibles a los productores por parte de la Caja de Crédito Agrario y de

la Federación Nacional de Cafeteros. En la actualidad, el maracuyá, representa un

reglón importante en la fruticultura, por su aceptación en el mercado nacional y por

su potencial de exportación. (UDEA, 2008). De acuerdo con las estadísticas del

2005, la producción mundial de maracuyá fue de 640.000 toneladas, la cual el

70% de la producción fue Brasil seguido por Ecuador y Colombia. Para el 2007,

Colombia ocupo el segundo lugar en producción a nivel mundial, los frutos

presentan un sabor particular intenso y una alta acidez, es buena fuente de

proteínas, minerales, carbohidratos, grasas, vitamina A y niacina, constituyéndose

en una base importante para la elaboración de bebidas industrializadas (Carvajal,

2007 y Gómez, et al., 1995), el cual es exportado de Colombia hacia Puerto rico y

Estados Unidos principalmente, con participaciones del 35% y 40 %

respectivamente, con un valor total de US$1'862.956. También se exportan

mezclas de jugos que incluyen el maracuyá, cuyo principal destino es Puerto Rico,

país al cual se destina el 84% de la producción nacional con un valor aproximado

de US$ 678.244 (MADR, 2006 & CCI, 2007). La producción de Maracuyá en

Colombia es de cerca de 80.000 Tn/año, en un área de 4800 hectáreas. El Huila y

Valle del Cauca, son los departamentos con mayor área y volumen en producción,

este valor corresponde al 22.2 Y 24.3% de la producción de frutas a nivel nacional.

Los municipios con mayor producción en el país se muestran en la tabla 1.

  

‐ 32 ‐  

Tabla 1. Departamentos con mayor producción de maracuyá en Colombia.

Departamento Participación (%) Departamento Participación (%)

Valle del Cauca 24.3 Córdoba 10.3

Huila 22.2 Santander 6.4

Meta 14.0 Otros 22.8

Fuente: MADR. 2008

Fuente: ministerio de agricultura y desarrollo rural, 2008

De acuerdo con el Anuario estadístico (MADR, 2009), en Colombia se sembraron

en el 2008, 6372 ha, con una producción de 109.486 ton y un rendimiento

promedio de 17.182 ton/ha. (CCI, 2007).

 

 

  

‐ 33 ‐  

2.6 Enfermedades del Maracuyá

En 1982, Bedoya y Medina encontraron que el cultivo difícilmente alcanzaba los 3

años como consecuencia del ataque de fitoparasitos, especialmente por la

presencia en las zonas donde su siembra era intensiva. En 1997, el periodo de

producción en la Unión (Valle) se había reducido a 17 meses, a pesar del intenso

programa de manejo del problema. Esto es debido al uso indiscriminado de

agroquímicos, los cuales han originado una disminución de la población de

insectos polinizadores y por ende afectando el ciclo normal del maracuyá. Esta

especie de uso comercial como muchas otras, se encuentra expuesta al ataque de

diversas enfermedades, las cuales son causadas por bacterias, hongos,

nematodos y virus; algunos de ellos causan pérdidas considerables en la

producción.

2.6.1 Muerte descendente en ramas, enfermedad de la parte aérea de la planta,

causado por el hongo del género Colletotrichum sp., su sintomatología se

caracteriza por necrosis total o parcial de brotes y zarcillos el cual se extiende

rápidamente por las ramas en forma descendente; puede formar chancros de color

castaño.

2.6.2 Enfermedades foliares: Mancha parda: causada por un hongo del género

Alternaria sp, su sintomatología se da en las hojas, las cuales presentan manchas

redondeadas de color castaño uniforme y halo clorótico. Bacteriosis: causada por

la bacteria Xanthomonas campestris pv passiflorae, su sintomatología se observan

en las hojas, presentando manchas irregulares, acuosas, que se inician

generalmente en el borde de ellas.

  

‐ 34 ‐  

2.6.3. Enfermedades en frutos: Mancha aceitosa: causada por el Oomiceto

Phytophthora su sintomatología comienza, cuando en el fruto aparecen manchas

muy pequeñas (< a 1mm), se extienden y se une a otras hasta formar una gran

mancha castaño-rojizo con bordes de apariencia aceitosa. Roña: causado por el

hongo del género Colletotrichum sp, su sintomatología se caracteriza por

presentar lesiones circulares, pequeñas y de color café, las cuales al avanzar, se

tornan corchosas, que se distribuyen por todo el fruto. Chancro del fruto o

antracnosis: causado por el hongo del género Colletotrichum sp, su

sintomatología se da en frutos que han iniciado la maduración, se observan

pequeñas manchas de color café claro, las cuales crecen lentamente, forman

chancros, reblandecen el tejido y en estados avanzados, deterioran

completamente el endocarpio. (Torres et al., 1999).

El cultivo del Maracuyá, no solo se ve afectado en frutos y aéreas foliares,

también ocurre afecciones en la raíz, los cuales dan origen a pudriciones en los

tallos y ramas, causan muerte de tejidos y defoliaciones. La enfermedad de raíz

más importante es la secadera del maracuyá.

2.6.4 LA SECADERA DEL MARACUYÁ

Esta enfermedad es conocida como pudrición seca, marchitez, fusariosis o

secadera (James, 2000; Espinoza y Mendoza, 2001). Como principal agente

causal de la secadera se ha registrado a Fusarium oxysporum f. sp. passiflorae

(Díaz, 1998; Rico et al., 2001; Gómez, 2008), se caracteriza por penetrar las

diferentes capas de la corteza de la raíz hasta alcanzar el sistema vascular. La

muerte de la planta se debe a la impermeabilización y taponamiento de los haces

vasculares inducido por Fusarium (Díaz et al., 1998). Una vez establecido, la

colonización, el hongo es transportado rápidamente a través del xilema,

desarrollando la sintomatología característica de marchitez, esta sintomatología se

  

‐ 35 ‐  

presentan desde semillero, en plántulas estrangula el hipocotilo ocasionando

volcamiento y muerte (Torres et al., 2000). Cuando se presenta su ataque en

campo, la sintomatología se caracteriza por marchitez de toda la planta, clorosis

en las hojas, seguidas de necrosis y fuerte defoliación. (Roncero et al., 2000; Rico

et al., 2001; Agrios, 2005 La enfermedad presenta una distribución en focos y en

casos extremos puede llegar a producir la muerte del 90 a 100% de una plantación

en estados tempranos en campo (Torres et. al, 2000).

Rodríguez, 1997, citando a diversos autores, los cuales sugieren en sus estudios

presencia de un complejo fungoso, compuesto por Fusarium, se encontrarían

Phytophthora, Rhizoctonia y posiblemente Phytium.

En Colombia existen registros de que esta enfermedad ocasionó, en el norte del

Valle del Cauca, entre el 90 y el 100% de muerte a plantas en el periodo de 1997-

1999 (Torres et al., 2000).

La diseminación de este patógeno se relaciona con el material vegetal de

propagación porque la selección de semillas no es la adecuada y no cumple con

los estandares mínimos de calidad, lo que lleva a una alta infección de

microorganismos fungosos, uno de ellos Fusarium. También inciden factores como

el agua de riego, las lluvias fuertes o el viento, que son considerados agentes de

diseminación de conidios y estructuras reproductivas del hongo. (Alexopoulos y

Mins, 1985 y Agrios, 2005). Esta enfermedad se ve favorecida por el mal drenaje,

bajo contenido de materia orgánica de los suelos y periodos lluviosos continuos

(Bedoya y Medina, 1982; Torres et al., 2000 y Sánchez de P., 2003).

Fusarium es un hongo cosmopolita que afecta muchas especies vegetales y es

difícil de controlar. Existe una gran diversidad de razas o formas especiales de

Fusarium spp., de las cuales algunas son patogénicas y su gran mayoría son

saprofitas, pueden ser utilizadas como controladores biológicos. Según Cook y

Baker (1989) existen más de 76 cepas de Fusarium oxysporum reportadas que

  

‐ 36 ‐  

causan enfermedad. La mayoría de los hongos del género Fusarium están

relacionados con enfermedades del sistema vascular en plantas.

2.7 Género Fusarium sp.

Especies pertenecientes a este género presentan macroconidios fusoides,

ligeramente curvados, septados y con una célula basal pedicelada. Con

microconidios y clamidosporas terminales o intercalares, que pueden estar

ausentes o presentes (Nelson et al., 1994).

El género Fusarium comprenden 70 especies descritas, que a su vez están

agrupadas en 12 secciones. Cada sección es en realidad un conjunto de especies

relacionadas entre sí. Más de la mitad de las especies son parásitos de plantas y

entre ellos se encuentran algunos de los más serios patógenos del mundo agrícola

(Leslie and Summerell, 2006).

2.7.1 Clasificación taxonómica del Género Fusarium sp.

División: Ascomycota

Subdivisión: Pezizomycotina

Clase: Sordariomycetes

Subclase: Hypocreomycetidae

Orden: Hypocreales

Familia: Hypocreaceae

Género: Fusarium

Especies: F. oxysporum, F. solani, F. verticillioides, F. brachygibbosum, etc.

  

‐ 37 ‐  

Algunas especies tienen un estado sexual reconocido dentro de la familia

Nectriaceae y pertenecen al género Gibberella o Nectria.

Fuente: De Hoog et al., 2000 y Leslies and Summerell, 2006.

2.8 Alternativa de control de la secadera en maracuyá

Está comprobado que el uso indiscriminado e intensivo de agroquímicos en los

cultivos, crean resistencia de los patógenos a ellos, además ocasionan deterioro

ambiental, incrementos en los costos de producción y efectos negativos en la

calidad de los productos los cuales afectan la salud humana y el ambiente.

(Sánchez, 2003).

En este sentido, en el tercer milenio, la competitividad se dará en términos de

precios sociales y ambientales, además de los propios a la actividad productiva.

La mejor alternativa para el control seria la utilización de variedades o genotipos

que ofrezcan resistencia a estos patógenos del suelo y conserven las

características agronómicas y de calidad exigida por el mercado nacional e

internacional.

El uso de cultivares resistentes, asociado al manejo integrado de enfermedades,

es la medida más eficaz, económica y ecológica de control (Vilela et al., 2002). Sin

embargo, aún no existen cultivares de maracuyá amarillo que cumplan con esta

característica, lo que es uno de los grandes desafíos para el mejoramiento

genético. Una solución, a corto plazo identificada por varios investigadores como

Sharma et al., (2002), sería el uso de portainjertos resistentes para controlar los

hongos del suelo y prevenir pérdidas en el maracuyá, para lo cual se debe buscar

en especies del género Passiflora que sean resistentes o tolerantes.

En Venezuela y Brasil, se han realizado estudios sobre patrones para el manejo

de la secadera del maracuya, no obstante en Colombia los avances en este tema

  

‐ 38 ‐  

no han sido significativos, afortunadamente se cuenta con una colección nacional

de germoplasma de Passifloras en Corpoica C.I La Selva, las cuales se puede

utiizar como nueva alternativa de manejo de la secadera, enfermedad limitante en

el cultivo de maracuyá amarillo, mediante la utilización de portainjertos resistentes,

a los principales patógenos de origen fúngico, contribuyendo al incremento en la

rentabilidad del cultivo. (Proyecto Corpoica Palmira, 2011).

Varios autores, entre los cuales se destaca Ferreira & Oliveira, 1991, describen

una amplia variabilidad genética existente en el género Passiflora. Tamayo, 1999,

destaca que, gran parte de esta variabilidad genética se encuentra en Colombia la

cual puede ser utilizada en la búsqueda de especies tolerantes a enfermedades.

Meletti et al., (2005) describe que ya han sido identificada algunas especies con

resistencia a Fusarium oxysporum como Passiflora giberti, P. alata y P. caerulea,

además esta última, mostró resistencia a Phytophthora sp. Así mismo Tadeu, et

al., 2002, reportó que se ha encontrado resistencia a la muerte precoz por

Fusarium en P. nitida, P. Laurifolia y algunas accesiones de P. suberosa, P.

coccinea y P. setacea. Estas resistencias no solo son importantes para el uso de

estos materiales como portainjertos, sino también para su uso posterior dentro de

los programas de mejoramiento genético, dado que se ha encontrado en estudios

realizados en Brasil de compatibilidad genética, entre especies silvestres de

Passiflora y las comerciales (Lage, et al. 2004).

  

‐ 39 ‐  

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 LOCALIZACIÓN GEOGRÁFICA

La presente investigación se realizó en el laboratorio de fitopatología y en el

invernadero de CORPOICA Palmira; y el laboratorio de biología molecular de la

Universidad Nacional de Colombia, municipio de Palmira; Valle del Cauca (1050

msnm; 23º C y 70% de Humedad Relativa; 3º 30’ 45.6’’N y 76º 18’ 29.91’’W).

3.2 Estandarización de una metodología eficiente de inoculación para hongos del género Fusarium spp agente causal de la secadera.

Se establecieron dos pruebas de patogenicidad. Se inocularon plantas de

maracuyá (P. flavicarpa) y badea (P. quadrangularis) obtenidas a partir de semilla

y sembradas en sustrato estéril y conservadas en condiciones controladas. Se

seleccionaron 5 plántulas por método y se evaluó el aislado con mayor virulencia

encontrados en las pruebas previas a este estudio de resistencia.

3.2.1 Método de inmersión de raíces: A partir de un cultivo monospórico del

aislado del hongo mas patogénico (Fusarium sp), se le adiciona agua destilada

estéril, se recoge cuidadosamente con una espátula, después la solución se filtra a

través de un embudo, el cual se le coloca una gasa estéril, con el fin de recolectar

la solución conidial sin residuos de PDA. De esta solución, se toma 1µl, mezclado

con azul de algodón y se coloca en la cámara de Neubauer para realizar el conteo

de esporas. Después de obtener el número de esporas, se procede a preparar la

solución inoculo a una concentración de 1* 106 UFC. La concentración de esporas

fue calculada mediante la siguiente fórmula:

  

‐ 40 ‐  

Concentración de esporas = N/5* 1 /0.004

Donde, N = Número de esporas contadas en un cuadrante.

Luego, para realizar la poda de las raíces se sacan las plántulas cuidadosamente

del vaso donde están sembradas, se hace un lavado de las raíces con el fin de

limpiarles el sustrato (turba) y luego con unas tijeras estériles se cortan las puntas

de las raíces. Posteriormente, las plántulas se sumergen en los recipientes que

contienen el inoculo durante 24 horas. Finalizado este proceso, las plántulas se se

sembraran en bolsas con suelo estéril. (Figura 1).

 

Figura 1. Proceso de inoculación del hongo Fusarium sp. a las especies de Passifloras.

3.2.2 Método de incisión de tallo: Se toma un cultivo puro del mismo aislado del

hongo patógenico de origen monosporico (Fusarium sp), con un sacabocado se

toma una porción del aislado de diámetro 0.5 mm, y se coloca en la base del tallo

de la planta, el cual se le hace una incisión con un bisturí de cuchilla fina y estéril.

Después de colocar el hongo se envuelve con parafim, para fijar el hongo con la

herida del tallo. (Figura 2).

  

‐ 41 ‐  

 

Figura 2. Proceso de inoculación del hongo Fusarium sp. a las especies de Passifloras, a través del método incisión de tallo.

3.3 Evaluación de la respuesta de la inoculación del hongo Fusarium sp. a las diferentes especies de Passifloras.

3.3.1 Diseño experimental

 

El diseño que se utilizó fue completamente al azar donde se evaluaron 28

introducciones de 17 especies de Passifloras como tratamientos. La unidad

experimental la conformarón 520 plantas sembradas en bolsas plásticas. Se

  

‐ 42 ‐  

incluyó un testigo de maracuyá comercial. La variable de respuesta fue porcentaje

(%) de plantas enfermas.

De los 13 aislamientos de Fusarium que se utilizaron en este estudio, se usó para

la prueba de resistencia el hongo que presentó más patogénicidad, MUC5 (sus

siglas provienen de Maracuyá - Universidad Nacional - Corpoica Palmira), este

hongo se seleccionó en pruebas de patogenicidad exploratorias.

Se realizó un análisis de varianza y prueba de promedio de Duncan p (0.05)

utilizando el paquete estadístico SAS versión 9.1.

Las introducciones y especies de Passifloras se evaluaron semanalmente en la

casa de malla, a partir de la semana siguiente de la inoculación, mediante la

escala de evaluación utilizada por Rodriguez et al., 1999 (Tabla 2). La escala se

modificó de acuerdo a los síntomas que se observaron. Se llevo registro

fotográfico.

  

‐ 43 ‐  

Tabla 2. Escala de evaluación de daño en tallos y raíces en maracuyá propuesta por Rodríguez et al., 1999.

Grado de daño

% de daño

síntoma

1

0 - 10

Plantas sanas o base del tallo sano.

3

11-20

Base del tallo ligeramente necrosado, Clorosis leve de las hojas

5

21-50

Base del tallo necrosadas puede presentar un color violeta,

marchitamiento de las hojas

7

50-75

Tercio inferior del tallo necrosado. Marchitamiento y defoliación severa

de las hojas

9

76-100

Tallos necrosados o muertos

  

‐ 44 ‐  

3.4 Identificación morfológica y molecular de las especies del género Fusarium aislados de Passifloras con síntomas de secadera en el Valle del Cauca, Colombia.

Un total de 13 hongos (MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC6, MUC7,

MUC8, MUC9, MUC10, MUC11, MUC12 y MUC13) pertenecientes al género

Fusarium y provenientes del departamento del Valle del Cauca, localizados en los

municipios Roldanillo, Palmira, La Victoria, Bolívar y Limites La Unión-Toro, fueron

aislados en CORPOICA Palmira, del hospedero Passiflora edulis Sims var

flavicarpa Degener (maracuyá comercial), de tejidos del tallo y de raíces, para ello

se desinfestaron previamente, siguiendo la metodología descrita por Seel et al.,

(1973). Estos hongos fueron aislados por Bonilla et al., (2008),

Para su identificación morfológica se utilizó el manual de Nelson et al., (1983);

Leslie et al., (2006). Además se registraba el sitio geográfico donde se tomó la

muestra (raíz-tallo), edad de cultivo aislado y tejido de donde fue aislado (tabla 3).

Tabla 3. Aislamientos obtenidos de cultivo de maracuyá en el Valle del Cauca, presentando síntomas de marchitamiento (Secadera).

CODIGO FECHA LATITUD LONGITUD ALTITUD EN M

MUNICIPIO FINCA EDAD DEL

CULTIVO

TEJIDO COLECTADO

MUC1 01.14.10 4° 32.82” 76° 38,06” 938 Roldanillo La esperanza

4 Meses Raíz

MUC2 01.14.09 4° 56’ 56” 76° 3’ 29,48” 927 Limites la Unión-Toro

Veragua 10 Meses Raíz

MUC3 10.28.10 4° 30’ 33,7”

76° 3’ 07,6” 933 La victoria Primavera 10 Meses Tallo-Raíz

MUC4 01.03.11 3°31´48”  76°81´13” 1000 Palmira CORPOICA 10 Meses Tallo-Raíz

MUC5 10.27.09 4° 30’ 33,7”

76° 3’ 07,6” 933 La victoria Primavera 4 Meses Tallo-Raíz

MUC6 01.14.10 4° 34.01” 76° 11’ 20,54”

965 Bolivar La Argentina 4 Meses Raíz

MUC7 01.14.10 4° 32,82” 76° 38,06” 938 Roldanillo La esperanza

4 Meses Raíz

MUC8 01.14.10 4° 34,01” 76° 11’ 20,54”

965 Bolivar La Argentina 4 Meses Raíz

MUC9 01.14.10 4° 32.82” 76° 38,06” 938 Roldanillo La esperanza

4 Meses Raíz

MUC10 01.14.10 4° 34.01” 76° 11’ 20,54”

965 Bolivar Veragua 4 Meses Raíz

  

‐ 45 ‐  

MUC11 01.14.10 4° 56’ 56” 76° 3’ 29,48” 927 Limites la Unión-Toro

La Argentina 4 Meses Raíz

MUC12 01.14.10 4° 32.82” 76° 38,06” 938 Roldanillo La esperanza

4 Meses Raíz

MUC13 10.27.09 4° 30’ 33,7”

76° 3’ 07,6” 933 La victoria Primavera 10 Meses Tallo-Raíz

MUC (Maracuyá Universidad Nacional – Corpoica)

3.4.1 Caracterización morfológica.

Teniendo en cuenta los criterios de muchos autores (Gerlach y Nirenberg (1982);

Singh et al. (1991); Nelson et al. (1993); López (2003), López y López, (2004) y

Leslie et al., (2006)) relacionados con las características de las especies del

género Fusarium sobre diferentes medios de cultivos, se seleccionó el medio PDA

(papa, dextrosa, agar) y medio CLA (Carnation Leaf Agar; (Singleton, Mihail y

Rush, 1992)) para realizar la caracterización morfológica de las especies aisladas.

La mayoría de estas clasificaciones se basan en características macro y

microscópicas del aislado y se considera un género anamorfico dentro de los

ascomicetes. (de Hoog et al., 1998; 2000).

Cuatro pequeñas fracciones de la estructura vegetativa de los aislados, se

dispusieron en placas de petri de 9cm de diámetro y fueron incubadas a una

temperatura de 28°C.

La caracterización de los aislados fue establecida teniendo en cuenta el tipo de

pigmento de la colonia, así como su hábito de crecimiento. Para la caracterización

de los parámetros morfológicos (esporodoquios, clamidospora, forma y tamaño de

los conidios) se realizó a través del microscopio, en un aumento de 10, 40 y 100x.,

el color que desarrollan depende de la especie y el medio de cultivo donde se

siembra, el cual puede ser blanquecino, crema, purpura etc. El micelio aéreo suele

ser abundante y de aspecto algodonoso (de Hoog, 1998; Samson et al., Leslie and

Summerell, 2006).

  

‐ 46 ‐  

3.4.2 Caracterización molecular.

Las características morfológicas que a nivel de género y especies distinguen a un

hongo se limitan con frecuencia a permitir su identificación; a ello también se

aplican las técnicas fisiológicas y bioquímicas. Avances técnicos importantes han

estimulado el uso de técnicas moleculares que son universalmente aplicables,

como la reacción de cadena de la polimerasa (PCR) ha permitido el análisis

molecular de las células fúngicas o aún esporas, material seco, u organismos

extintos, como también a la selección de oligonucleótidos específicos para

hongos, almacenado en bancos de genes (Olive and Bean, 1999; Wassenaar and

Newell, 2000; Leslie and Summerell, 2006).

3.4.3 EXTRACCIÓN DE ADN DE Fusarium

3.4.3.1 Preparación de los aislados para la extracción de ADN.

 

Todos los aislados seleccionados provienen de cultivos monosporicos y

sembrados en medio de cultivo PDA en una cámara de flujo laminar vertical e

incubados a una temperatura de 28ºC durante 7 a 10 días, tiempo suficiente para

el desarrollo del hongo.

3.4.3.2 Procedimiento de la extracción de ADN.

 

El procedimiento utilizado para el ADN cromosómico fue descrito por Wilson

(1987), con modificaciones realizadas por Gómez (2008), como se explica a

continuación.

Se recoge el micelio del aislado de Fusarium sp., con una espátula metálica

estéril, depositándolo en un microtubo Eppendorf de 2 mL esterilizado,

  

‐ 47 ‐  

inmediatamente se muele con un punzón hasta deshacer gran parte del micelio.

Posteriormente se añade 750 L de la solución tampón (250 mL Tris- HCl 100mM

pH 7.2; 250 mL EDTA 100mM y 250 mL dodecil sulfato sódico (SDS) al 10%, se

agita y se mantiene todo en frío. Después, se añadió 3 L de una solución de

proteinasa K (20 mg/mL), se agitó y se incubó a 37 ºC durante 1 h.

A continuación se añade 100 L de NaCl 5M con el fin de proporcionar la

concentración salina necesaria para que el Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

(CTAB) no se acompleje con el ADN. Se adiciona 80 L de solución CTAB/NaCl

(CTAB al 10% en NaCl 0.7 M), de nuevo se agitó en homogenizador vortex y se

incubó a 65 ºC durante 10 min.

Para la purificación del ADN se añade 700 L de cloroformo/alcohol isoamílico

(24:1), se agita y se centrifuga a 12000 rpm durante 10 min., para eliminar los

complejos formados por el CTAB. El sobrenadante se transfiere a un nuevo

microtubo, al que se le añadió un volumen equivalente (entre 600-700 L) de

fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1), agitándolo después. El fenol

desnaturaliza las proteínas y las precipita, separándose del ADN que se mantiene

disuelto. Posteriormente la mezcla se centrifuga a 12000 rpm durante 5 min., para

eliminar los restos del complejo CTAB; se repite el proceso si es necesario. Las

proteínas quedan en la interfase y los ácidos nucleícos en la fase superior acuosa.

El sobrenadante (500-700 L), que contiene los ácidos nucleídos, se transfieren a

otro microtubo al que se le añade entre 500-600 L de isopropanol para precipitar

el ADN; se agita suavemente y se centrífuga a 12000 rpm durante 10 min. Se

elimina el isopropanol y se añadió 500 L de etanol frío al 70%; se agita y se

centrifuga durante 5 min. Transcurrido este tiempo, se elimina el etanol y se seca

la muestra al vacío.

  

‐ 48 ‐  

Finalmente, se resuspende el ADN en 50 L de tampón TE (Tris 10 mM, EDTA

1mM, pH 8) y se añaden 3 L de RNAsa (25 mg/mL) para eliminar los restos de

RNA, dejando el ADN extraído a 5 ºC durante 24 h.

Para comprobar si la extracción fue correcta se visualizó en gel de agarosa, al

1.2% (p/v). Para la conservación del DNA extraído se conserva en microtubos a -

20ºC.

3.4.3.3 PCR para amplificación de la región ITS1 – ITS4 y posterior secuenciación de los aislados del género Fusarium que manifiestan síntomas de secadera en plantas de maracuyá

La región ITS del ADNr fue amplificado utilizando los cebadores universales ITS1

(5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´) y ITS4 (5´TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´)

White et al., (1990). La mezcla para la amplificación se realizó en un volumen 50

µL que contenía 5µL de 10x PCR tampón (500 mM KCl, 100mM Tris HCl (pH 9),

1% Tritón X-100), 3µL de 50 mM MgCl2, 3µL de ADN a una concentración entre

100 y 180 ng., 0.4 µL de cada dNTP´s a una concentración de 100 mM en total,

2,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Eppendorf) y 1 µL de 20 µM de cada

cebador ITS1 / ITS4. La amplificación fue realizada en un termociclador PTC-

100TM programmable thermal controller siguiendo los ciclos de temperatura que

se describen a continuación: Iniciadores ITS1/ITS4, desnaturalización inicial 95ºC

por 60seg, ciclos 35, segunda desnaturalización 95ºC a 30seg, primer

alineamiento 55ºC a 60seg, extracción ADN 72ºc a 60seg, extensión final ADN

72ºC a 6 min.

El producto fue visualizado por electroforesis en gel de agarosa, donde se obtuvo

fragmentos entre 500 a 700 pares de bases (pb). Luego fueron enviados a

secuenciar al instituto de Biotecnología de Corea. Una vez obtenida estas

secuencias se ensamblaron manualmente con los programas informáticos

  

‐ 49 ‐  

CHROMAS y PHYDIT. Una vez producidas las secuencias completas de cada una

de los aislados, se determinó la identidad a nivel de especies de cada uno de ellos

mediante el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) obtenida a

través de NCBI (National Center for Biotecnology information, 2008).

3.4.3.4 Purificación y secuenciación del fragmento amplificado de la región ITS1-ITS4

 

Los productos amplificados de la región ITS1-ITS4 de los aislados de los hongos

proveniente del cultivo de maracuyá se purificaron utilizando el kit Gen Elude TM

PCR clean-Up (SIGMA); se conservó el ADN purificado a -20ºC hasta su uso.

Aproximadamente 2µl del producto de la PCR purificada fueron requeridos en

cada secuenciación. La secuenciación fue llevada a cabo en Korea por Macrogen.

3.5 Cepas de referencias.

 

En este trabajo se utilizaron tres (3) cepas de referencias del Genbank, y dos (2)

cepas suministradas por la Colección Española de Cultivos (CECT) y utilizadas en

el trabajo doctoral de E, D. Gómez y Tabla 4.

  

‐ 50 ‐  

Tabla 4. Cepas de referencia.

Referencia Especie

CECT2715 F. oxysporum

CECT20232 F. solani

JN664959 F. verticillioides

JN232128 F. verticillioides

GQ505450 F. brachygibbosum

 

 

3.6 Caracterización molecular de las especies de Passifloras seleccionadas para la evaluación de resistencia a Fusarium sp.

3.6.1 Colecta del material vegetal

 

Teniendo en cuenta la información de la distribución de las especies, se

identificaron sitios de muestreo en 5 departamentos; Antioquia, Quindío, Risaralda,

Huila y Valle del Cauca. En Corpoica Palmira se conserva un banco de trabajo con

139 introducciones de 32 especies de Passifloras de las cuales se evaluaron 28

introducciones de 17 especies. El 52% fue material donado por las instituciones

Corpoica La Selva y Cenicafé. Tabla 5.

  

‐ 51 ‐  

Tabla 5. Introducciones y especies de Passifloras seleccionada para la evaluación de resistencia.

especie

N° de introducción

Fuente del material Departamento Municipio latitud longitud msnm

1 P. edulis var edulis 36 Donada Cenicafe Desconocido - - - -

2 P. maliformis 30 Colecta Huila La Argentina 2.216 759.480 1820

3 P. incarnata 116 Donada Cenicafe Desconocido - - - -

4 P. adenopoda 82 Donada Cenicafe Desconocido - - - -

5 P. maliformis 93 Donada Cenicafe Desconocido - - - -

6 P. alata 80 Donada Cenicafe Quindio La tebaida - - -

7 P. quadrangularis 119 Donada Cenicafe Roca fuerte - - - -

8 P. flavicarpa 81 Colecta Quindio Monte negro - - -

9 P. ligularis 40 Colecta Valle del Cauca Tenerife 3.728 760.736 2600

10 P. maliformis 107 Donada Cenicafe

La romelia (paraguacito) Paraguacito - - -

11 P. cincinata 99 Donada Cenicafe

Brasil (Jabotijaba) - - - -

12 P. mollisima 43 Colecta Valle del Cauca Tenerife 3.728 760.736 2600

13 P. edulis 133 Donada Cenicafe Risaralda Marsella - - -

14 P. maliformis 121 Donada Cenicafe Desconocido - - - -

15 P. maliformis 125 Donada Cenicafe Union Valle - - - -

16 P. quadrangularis 117 Donada Cenicafe Antioquia Bolivar - - -

17 P. quadrangularis 114 Donada Cenicafe Quindio Genova - - -

18 P. apoda 58 Donada C. I. la

selva Antioquia Rionegro - - -

19 P. tarminiana 45 Donada Cenicafe Valle del Cauca Tenerife 3.728 760.736 2600

20 P. caerulea 57 Donada C. I. la

selva la selva

21 P. ambigua 56 Donada C. I. la

selva Quindio Buenavista 4.395 75.733 1202

22 P. gracilis 59 Donada C. I. la

selva Quindio Buenavista 4.395 75.733 1202

23 P. mollissima 70 Donada C. I. la

selva Quindio Buenavista 4.395 75.733 1202

24 P. tarminiana 73 Donada C. I. la

selva Quindio Buenavista 4.395 75.733 1202

25 P. rubra 85 Donada Cenicafe Caldas Manizales - - -

26 P. foetida 47 Donada C. I. la

selva Quindio Buenavista 4.395 75.733 1202

27 P. capsularis 112 Donada Cenicafe Risaralda Marsella - - -

28 P. alata 49 Colecta Quindio Buenavista 4.395 75.733 1202

  

‐ 52 ‐  

3.6.2 Material vegetal

Se colectaron hojas jóvenes de 28 accesiones de 17 especies de Passifloras. Las

colectas se realizaron utilizando cortes del tejido vegetal, envuelto en bolsa de

plástico y conservado en cajas de icopor con hielo para su transporte hasta el

momento de su procesamiento en el Laboratorio de Biología Molecular de la

Universidad Nacional de Colombia sede Palmira.

3.6.3 Extracción de ADN

Las muestras fueron maceradas utilizando la misma bolsa donde se colecto la

muestra. Para la extracción de ADN se utilizó la metodología descrita por

Dellaporta et al (1983) con algunas modificaciones.

3.6.4 Evaluación de cantidad y calidad de ADN

Para la evaluación de la calidad y cantidad del ADN obtenido se realizaron geles

de agarosa al 0,8% corridos en tampón TBE 0.5X (Tris-borato 0045M; EDTA

0.001M) a 100 voltios durante una hora. Estos fueron teñidos con bromuro de

etidio a una concentración final de 0.5 ug/ml. Las concentraciones de ADN se

determinaron mediante comparación con concentraciones conocidas de ADN del

bacteriófago lambda. Se realizaron diluciones de todas las muestras extraídas a

una concentración final de 5 ng/ul en tubos nuevos, las cuales fueron utilizadas

como ADN de trabajo para las reacciones de PCR.

  

‐ 53 ‐  

3.6.5 Marcadores moleculares RAMs

Se evaluaron 5 cebadores para RAMs (tabla 6) con las condiciones de

amplificación por PCR descritas por Bonilla et al (2008) para uchuva Physallis

peruviana.

Tabla 6. Cebadores RAMs utilizados en la caracterización molecular.

Cebador Secuencia CGA DHBCGACGACGACGACGA CT DBDCTCTCTCTCTCTCTC TG HVHTGTGTGTGTGTGTGT

CCA DDBCCACCACCACCA GT VHV GTG TGT GTG TG

La amplificación fue realizada en un termociclador PTC-100TM programmable

thermal controller siguiendo los ciclos de temperatura que se describe a

continuación. Desnaturalización inicial 95°C por 5min, desnaturalización 95°C por

30seg, hibridación para el cebador CCA 50°C por 45seg, para los cebadores TG y

CT 55°C por 45seg y el cebador 58°C por 45seg, extensión 72°C por 2min, ciclos

de 37 desde el paso 2, extensión final 72°C por 7min.

Las condiciones de amplificación para RAMs utilizados en la investigación fue:

Buffer TAQ, dNTPs, Cebador, MgCl2, ADN, Taq polimerasa, con una

concentración inicial de 10X, 1.25mM, 50μm, 25mM, 5 ng /μl, 5 U/μl, y una

concentración final de 1X, 0.2mM, 2μM, 1.5mM, 10 ng, 0.625 U, para un volumen

total de 25 μl por muestra.

Los productos amplificados se visualizaron en geles de poliacrilamida al 8% (37:1

acrilamida – bisacrilamida) corridos a 140 voltios por una hora y teñidos bromuro

de etidio.

  

‐ 54 ‐  

3.6.6 Análisis de la información

La información de los patrones de bandas obtenidos se registró en una matriz

binaria de presencia (1) o ausencia (0). Para la selección de bandas polimórficas

se consideró como locus polimórfico aquel en el cual la frecuencia del alelo más

común fue menor al 95%. A partir de esta matriz y usando los programas

SIMQUAL del paquete NTSYS- pc (Numerical Taxonomy System for Personal

Computer) y el programa TFPGA (Tools for Population Genetic Analisys) se

realizaron los análisis estadísticos.

La similitud genética se calculó mediante el coeficiente de Dice Nei- Li (1978)

)2(

2

cba

aS

donde a = bandas compartidas por ambos individuos, b = bandas

presentes en el individuo (1) pero no en (2), y c = bandas presentes en el individuo

(2) pero no en (1). El análisis de agrupamiento se realizó con el programa SAHN

de NTSYS –pc (versión 2.02g, 1998) utilizando el método UPGMA, método

gráfico de agrupamiento por parejas, que usa el promedio aritmético no

ponderado. El dendrograma se construyó con el programa TREE de NTSYS –pc

(versión 2.02g, 1998). Se realizó un análisis de correspondencia múltiple (ACM)

para asociar columnas y filas de la matriz binaria determinando el nivel de

asociación o determinar proximidad (Joseph et al. 1992). Para estimar la

diversidad genética se utilizaron los parámetros de heterocigosidad promedio

esperada (He) y el porcentaje de loci polimórficos (P), los cuales se estimarán

sobre todos los loci y el promedio de los mismos de acuerdo con la fórmula no

sesgada de Nei (1973) así:

H= 1-f (i)2

f(i): Frecuencia del alelo i en la población.

 

 

  

‐ 55 ‐  

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Estandarización de inoculación para hongos del género Fusarium spp agente causal de la secadera.

La evaluación de los dos métodos para la inoculación del hongo del género

Fusarium, se realizó durante un mes con dos especies, P. flavicarpa 81 y P.

quadrangularis 119, la variable de respuesta fue en porcentaje. (Figuras 3).

 

Figura 3. Evaluación del método de inmersión de raíces e incisión de tallo.

Se observó la aparición de síntomas en la prueba de inoculación mediante

inmersión de raíces, a partir del séptimo día. En la especie P. flavicarpa 81

(maracuyá comercial) la severidad por el hongo fue del 15%, siendo progresiva

cada semana. La evaluación de la semana 4, arroja una incidencia del 89%, en

comparación con P. quadrangularis 119, su afección a la cuarta semana fué del

20%.

En la figura 3, muestra que en el método de incisión de tallos, no hubo efecto del

hongo, en ninguna de las dos especies (P. flavicarpa 81 y P. quadrangularis 119),

  

‐ 56 ‐  

durante las cuatro semanas no se observó síntomas del hongo, y la incisión en la

base del tallo se cicatrizó.

4.2 Evaluación de la respuesta de la inoculación del hongo Fusarium sp. a las diferentes especies de Passifloras.

La variable de respuesta fue por porcentaje (%) de plantas enfermas (incidencia).

Se realizó un análisis de varianza y prueba de promedio Duncan (Tabla 7 y Figura

4), el cual muestra que hay diferencias significativas a nivel de especies (0.05%).

Especies o introducciones que presenten un porcentaje de plantas enfermas

superior al 10% se considerarán susceptibles al patógeno inoculado.

Tabla 7. Análisis de varianza

Variable dependiente: ABCURVA

Fuente DF Suma de

cuadrados

Cuadrado de la

media F-Valor Pr > F

Modelo 28 12308683.33 455877.16 34.32 0.0001

Error 308 4090836.05 13281.94

Total correcto

336 16399519.38

R-

cuadradoCoef Var Raíz MSE

ABCURVA Media

0.750551 89.96989 115.2473 128.0954

Fuente DF Tipo III SS Cuadrado

de la media

F-Valor Pr > F

Tratamiento 28 12308683.33 455877.16 34.32 0.0001

En la Figura 4 se observa que a través de la aplicación del método de Duncan se

forman cinco grupos entre los tratamientos, los cuales el promedio de las

poblaciones dentro de los grupos no difieren. Se observa que la especie más

susceptible al hongo del genero Fusarium, fue P. tarminiana 45, con una media de

656.33.

  

‐ 57 ‐  

Figura 4. Prueba de promedio Duncan P (0.005)

Las figuras 5 y 6 muestran el progreso de la enfermedad de las 28 introducciones

evaluadas, de las cuales 15 tienen un área bajo la curva menor al 10%, indicando

que existen niveles de resistencia en estas introducciones (Figura 5). Trece (13)

de las quince (15) especies (P. cincinata 99, P. maliformis 121, P. capsularis 112,

P. foetida 47, p. edulis purpura 133, P. rubra 85, P. maliformis 125, P. maliformis

30, P. alata 49, P. quadrangularis 117) no presentaron ningún grado de afección.

En la Figura 6, se observa que 10 de las introducciones de Passifloras evaluadas

(P. tarminiana 45, P. flavicarpa 81, P. gracilis 59, P. quadrangularis 119, P.

tarminiana 73, P. maliformis 93, P. apoda 58, P. ambigua 56, P. mollissima 70, P.

alata 80), son susceptibles al hongo del género Fusarium sp., agente causal de la

secadera, los síntomas de la infección a estas introducciones, superan el 50%.

Tres de las trece llegan hasta el 30% de la afección.

EE E E E E E E E E E E E E E E E E

D

A

CC C C

C D

B B A B

Introducciones

Media

  

‐ 58 ‐  

 

Figura 5. Evaluación de la resistencia de Passifloras resistentes al hongo del género Fusarium sp. agente causal de la secadera del maracuyá.

 

Figura 6. Evaluación de la resistencia de especies de Passifloras susceptibles al hongo del género

Fusarium sp. agente causal de la secadera del maracuyá.

  

‐ 59 ‐  

También se observó que dentro de las mismas especies, hubo introducciones

resistentes y susceptibles, como es el caso de la especie P. maliformis, las

introducciones 121, 125 y 30 muestran resistencia al hongo fitopatógeno, en

comparación con P. maliformis 93 que se muestra susceptible, llegando a un 90%

de incidencia. Lo mismo sucedió con las especie P. quadrangularis y P. alata.

Las especies P. edulis var edulis, P. alata y P. maliformis y, han sido reportadas

por Meletti et al., (2005), Holguin y Posada (1990) como resistentes, lo cual se

corrobora con los resultados obtenidos en el presente estudio. Sin embargo, se

observó que en las introducciones pertenecientes a las especies P. maliformis y

P. alata, se presentaron diferencias en la respuesta a la resistencia, posiblemente

a la diversidad genética existente por la naturaleza alógama de la especie.

4.3 Identificación morfológica y molecular de las especies del género Fusarium aislados de Passifloras con síntomas de secadera en el Valle del Cauca Colombia.

 

Morfológica y molecularmente se identificaron 13 aislados de Fusarium, los cuales

6 pertenecen a Fusarium solani (MUC1, MUC2, MUC4, MUC7, MUC12 y MUC13),

4 a Fusarium oxysporum (MUC3, MUC5, MUC9 y MUC10), dos a Fusarium

verticillioides (MUC6 y MUC8) y uno a Fusarium brachygibbosum (MUC11).

4.3.1 Caracterización morfológica de las especies encontradas en este estudio

Esta caracterización se basó en la descripción de la colonia (macroscópica) en

medio PDA, así como de las estructuras del hongo (microscópica) en medio CLA.

En las figuras 7 a la 32 Se puede observar las características morfológicas de

cada especie.

  

‐ 60 ‐  

4.3.2 Fusarium solani

 

Su estado sexual corresponde a Haemanectria haematococca (Berkeley &

Broome) Samuels &Nirenberg. Con un sinónimo común de Nectria haematococca.

Las características encontradas en el medio de Cultivo PDA, fueron de color

blanco y crema, abundante micelio. Las estructuras observadas en el medio CLA a

través del microscopio fue: los Macroconidios son relativamente amplios, rectos o

ligeramente curvos, con dos o más septas, con los extremos redondeados.

Microconidios: su forma es oval, fusiforme y reniforme, con 0 a 2 septas.

Clamidosporas: son abundantes, se forman a la tercera semana de su siembra, y

se encuentran en pares o individuales.

Características en medio de cultivo CLA.

 

Figura 7. MUC1. A. Abundantes clamidosporas individuales y en parejas y B. micro y mesoconidos.

100X 100X

  

‐ 61 ‐  

Características en PDA

 

Figura 8. MUC1. Colonia blanca con micelio aéreo.

Características en medio de cultivo CLA.

 

Figura 9. MUC2. A – C. microconidos B - D. clamidosporas.

100X

100X

40X

40X

  

‐ 62 ‐  

Características en PDA

 

Figura 10. MUC 2. Colonia blanca con escaso micelio aéreo.

 

Características en medio de cultivo CLA.

 

Figura 11. MUC 4. A, B - C. micro, meso y macroconidios.

40x

40x

100x

  

‐ 63 ‐  

Características en PDA

 

Figura 42. MUC 4. Colonia crema con escaso micelio aéreo.

 

Características en medio de cultivo CLA.

 

Figura 53. MUC7. A - B. micro y macroconidios. C – D. Clamidosporas en cadena.

100x

100x

100x

100x

  

‐ 64 ‐  

Características en PDA

 

Figura 14. MUC7. Colonia blanca con micelio aéreo de estructura algodonosa.

 

Características en medio de cultivo CLA.

 

Figura 15. MUC12. A. microconidios. C – D. Clamidosporas en cadenas e individuales.

100x

100x

40x

  

‐ 65 ‐  

Características en PDA

 

Figura 66. MUC12. Colonia blanca con escaso micelio aéreo.

 

Características en medio de cultivo CLA.

 

Figura 77. MUC13. A. Clamidosporas individuales B. micro y macroconidios.

 

 

 

100x100x

  

‐ 66 ‐  

Características en PDA

 

Figura 18. MUC13. Colonia blanca con escaso micelio aéreo.

4.3.3 Fusarium oxysporum

 

Su estado sexual es desconocido. Las características encontradas en el medio de

Cultivo PDA, fueron: colonias de color blanco, purpura y rosado pálido, algunas

con abundante micelio. Las estructuras observadas a través del medio CLA

fueron: Macroconidio: relativamente amplio, recto y generalmente con tres septas.

Microconidio: su forma es oval, fusiforme y no posee septas. Clamidosporas: se

forman en la tercera semana de su siembra. Se encuentra en parejas.

  

‐ 67 ‐  

Características en medio de cultivo CLA.

 

Figura 19. MUC3. A - B. clamidosporas en pareja e individuales, C. macro y microconidios.

Características en medio de cultivo PDA

 

Figura 20. MUC3. Colonia violeta, escaso micelio aéreo.

100x100x

100x

  

‐ 68 ‐  

Características en medio de cultivo CLA.

 

Figura 21. MUC5. A - B. meso y microconidios.

Características en medio de cultivo PDA

 

Figura 22. MUC5. Colonia violeta, escaso micelio aéreo.

 

40x 40x

  

‐ 69 ‐  

Características en medio de cultivo CLA.

 

Figura 23. MUC9. A - B. micro, meso y macroconidio C – D. Clamidosporas individuales y en cadena.

 

Características en medio de cultivo PDA

 

Figura 24. MUC9. Colonia blanca-violeta, escaso micelio aéreo.

100x

100x 100x

100x

  

‐ 70 ‐  

Características en medio de cultivo CLA.

 

Figura 25. MUC10. A - B. abundantes clamidosporas en cadena, pareja e individuales. C - D micro, meso y macroconidio.

 

Características en medio de cultivo PDA

 

Figura 26. MUC10. Colonia violeta, escaso micelio aéreo.

100x

100x 100x

100x

  

‐ 71 ‐  

4.3.4 Fusarium verticillioides

 

Su estado sexual corresponde a Gibberella moniliformis. Las características

encontradas en el medio de Cultivo PDA, fueron: colonias de color blanco y rosado

pálido, con abundante micelio. Las estructuras observadas a través del medio CLA

fueron: Macroconidio: relativamente amplio, recto y generalmente con tres septas.

Microconidio: su forma es oval, fusiforme y contiene de cero a una septa; no forma

clamidosporas.

Características en medio de cultivo CLA.

 

Figura 27. MUC6. A. Células agrandadas. B. microconidios.

100x100x

  

‐ 72 ‐  

Características en medio de cultivo PDA

 

Figura 28. MUC6. Colonia blanca - violeta, con micelio aéreo de estructura algodonosa.

 

Características en medio de cultivo CLA.

 

Figura 29. MUC8. A. micro, meso y macroconidios. B. Célula agrandada.

100x100x

  

‐ 73 ‐  

Características en medio de cultivo PDA

 

Figura 30. MUC8. Colonia blanca – rosado, con micelio aéreo.

 

4.3.5 Fusarium brachygibbosum

 

Su estado sexual no está descrito, Las características encontradas en el medio de

Cultivo PDA, fueron de color blanco y rosado pálido, abundante micelio. Las

estructuras observadas a través del medio CLA fueron: Microconidio: su forma es

oval y contiene entre 2 y 3 septas.

  

‐ 74 ‐  

Características en medio de cultivo CLA.

 

Figura 81. MUC11. A – B. Estructuras desconocidas. C. microconidios.

 

 

 

 

 

 

100x 100x

100x

  

‐ 75 ‐  

Características en medio de cultivo PDA

 

Figura 32. MUC11. Colonia blanca – violeta con escaso micelio aéreo.

 

4.4 Identificación de los aislados por secuenciación

 

Los productos se analizaron mediante la secuenciación de cadena simple. La

reacción de cada secuenciación consistió en aproximadamente 500 a 600

nucleótidos (Figura 33). La secuencia de datos fue proporcionado como formato

alfabetico como archivo ABI, mostrando la secuencia completa y como

electroferograma que es legible mediante el programa informático CHROMAS

VERSION 1.5 (C. McCarthy School o Health Science, Griffith Universiyty.

Queensland. Australia), para obtener la secuencia del fragmento completo se

ensamblaron manualmente los fragmentos continuos generados por los cebadores

“forward” y “reverse”, usando el programa PHYDIT. La identificación más próxima

fue determinada en la base de datos (National Center for Biotecnology information,

utilizando el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool;

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Tabla 8. Las secuencias fueron alineados para

generar arboles filogenéticos y matrices de similitud de nucleótidos usando el

programa PHYDIT (http://plaza.snu.ac.kr/~jchun//phydit/).

  

‐ 76 ‐  

 

Figura 93. Amplificación en gel agarosa de los hongos del género Fusarium.

Tabla 8. Análisis del programa BLAST para comparar la máxima identidad de las 13 especie de Fusarium sp.

AISLADO DEL

HONGO

IDENTIFICACIÓN MACRO Y

MICROSCOPICA

ACCESIÓN GENBANK

ESPECIE MAS CERCANA PORCENTAJE

DE SIMILARIDAD

MUC1 Fusarium sp. JN127379.1 Fusarium solani 99%

MUC 2 Fusarium sp. GU066713.1 Fusarium solani 100%

MUC 3 Fusarium sp. EU727455.1 Fusarium oxysporum 100%

MUC 4 Fusarium sp. AB258993.1 Fusarium solani 100%

MUC 5 Fusarium sp. GU205817.1 Fusarium oxysporum 100%

MUC 6 Fusarium sp. HM210092.1 Fusarium verticillioides 99%

MUC 7 Fusarium sp. EU625405.1 Fusarium solani 100%

MUC 8 Fusarium sp. HM210092.1 Fusarium verticillioides 99%

MUC 9 Fusarium sp. HQ451888.1 Fusarium oxysporum 99%

MUC 10 Fusarium sp. JF429684.1 Fusarium oxysporum 99% MUC 11 Fusarium sp. JF300441.1 Fusarium brachygibbosum 100% MUC 12 Fusarium sp. GU066713.1 Fusarium solani 99%

MUC 13 Fusarium sp. GU066713.1 Fusarium solani 100%

Los resultados de la identificación por secuenciación se muestra en la tabla 9. Se

confirmó por esta técnica que los aislados MUC1, MUC2, MUC4, MUC7, MUC12

  1        2          3          4          5          6          7       M 

500PB

  

‐ 77 ‐  

y MUC13 pertenecen a la especie F. solani, para los aislados MUC3, MUC5,

MUC9 y MUC10, pertenece a la especie F. oxysporum, los aislamientos MUC6 y

MUC8 a la especie Fusarium verticillioides. Uno de los 13 aislados, resultó ser

identificado como F. brachygibbosum, Estas especies obtuvieron una homología

del 99 al 100%, Mediante BLAST.

Con las secuencias de nucleótidos generadas, se construyó un árbol filogenético

(Figura 34) cuya raíz es Acremonium del Genbank accesión N° DQ914675 donde

se agrupan los 13 aislados de Fusarium sp. asociado con la secadera en

maracuyá, en cuatro grupos: El grupo I incluye dos aislamientos MUC6 y MUC8,

estos dos aislamientos se agruparon con las cepas de referencia JN664959 y

JN232128 (Fusarium verticillioides); el Grupo II, con el aislamiento MUC11, y la

cepa de referencia GQ505450 (Fusarium brachygibbosum), siendo el primer

reporte que se da en esta especie en Colombia.; el Grupo III, incluye 4

aislamientos MUC3, MUC5, MUC9 y MUC10, junto con la cepa de referencia

CECT2715 (Fusarium oxysporum); y el Grupo IV con 6 aislamientos, que

corresponden a MUC1, MUC2, MUC4, MUC7, MUC12 y MUC13, junto con la cepa

de referencia CECT20232 (Fusarium solani). Se demuestra que no solo F.

oxysporum y F. solani afectan a este cultivo, como indica las referencia

bibliográficas, si no también especies de Fusarium como verticillioides y

brachygibbosum; que no habían sido reportadas como patógenos en especies de

Passifloras. Además se observa una alta variabilidad de especies de Fusarium en

el departamento del Valle del Cauca.

  

‐ 78 ‐  

0.1

Acremonium

MUC4

CECT20232

MUC3

MUC12

MUC5

MUC13

MUC7

MUC10

JN664959

MUC8

JN232128

MUC6

gq5054-ITS

MUC11

MUC9

CECT2715

MUC2

MUC1

100

100

97

99

93

100

93

 

Figura 104. Árbol filogenético, la raíz es Acremonium, donde muestra la agrupación de las 13 especies de Fusarium sp. aislados del cultivo de maracuyá con síntomas de secadera, colectadas en seis municipios del Valle del Cauca y amplificado por PCR-ITS, con los iniciadores ITS 1 e ITS 4. Y cuatro cepas de referencias. 0.1 indica la distancia genética. El árbol filogenético se construyó con el progama Treecom. Los porcentajes se calcularon con 1000 réplicas.

I

II

III

IV

  

‐ 79 ‐  

También se observó, que dentro del grupo de F. oxysporum, se forman otros

grupos, lo cual demuestra que hay una variabilidad intraespecie. En el grupo II (F.

brachygibbosum) se puede observar que tiene una homología del 100% con el

aislamiento MUC11; esta especie se ha reportado en los Estados Unidos como

patógeno micotico, pero no atacando plantas (O’Donnell, 2009). Con las cepas de

referencia de F. verticilliodes, se agrupa MUC6 Y MUC8, el cual MUC6 se agrupa

con JN232128 y MUC8 con JN664959; ambos con una homología del 100%. En la

Figura 35 se observa que dentro de la especie solani, se conforman 2 grupos; de

los 6 aislamientos, cinco tienen una homología del 100%, que corresponden a

MUC1, MUC2, MUC7, MUC12 y MUC13. Dentro del grupo de F. oxysporum

(Figura 36) se puede analizar que a pesar de que hay una alta homología de que

son oxysporum, se forman tres grupos, lo que indica que hay una variabilidad

intraespecie. Los aislamientos MUC3 y MUC5 tiene una homología del 100%, esto

puede ser, porque provienen del mismo municipio (La Victoria), pero atacando al

cultivo en edades diferentes. El análisis filogenético de las secuencias de ADN ha

sido utilizado para distinguir y evaluar la relación genética entre las especies de

Fusarium estrechamente relacionados (Yli-Matilla, 2002; Harrow, 2010).

  

‐ 80 ‐  

0.1

Acremonium

MUC4

CECT20232

MUC12

MUC7

MUC13

MUC1

MUC2

100

100

 

Figura 115. Árbol filogenético relacionando las secuencias ITS de los diferentes aislados de F. solani, mediante el programa Treecom versión 1.3b., se indica valores de “bootstrap” > 98%.

Acremonium

MUC9

CECT2715

MUC10

MUC3

MUC5

100

97

97

100

 

Figura 126. Árbol filogenético relacionando las secuencias ITS de los diferentes aislados de F. oxysporum, mediante el programa Treecom versión 1.3b., se indica valores de “bootstrap” > 96%.

 

  

‐ 81 ‐  

4.5 Caracterización molecular de las especies de Passifloras seleccionadas.

 

A las especies utilizadas en la evaluación de la resistencia, se le realizó un estudio

de diversidad, ya que en algunas accesiones de la misma especie, hubo respuesta

diferente frente al patógeno Fusarium, causante de la secadera.

4.5.1 Extracción de ADN

La maceración del material vegetal como proceso mecánico inicial utilizado para

romper la pared celular y exponer los constituyentes celulares permitió la

liberación del ADN en el tampón de extracción, el cual contiene detergentes y

soluciones que aseguran que una cantidad significativa de ADN no sea atrapada

en los desechos o restos celulares, y/o que el ADN esté completamente disociado

de proteínas y otros contaminantes que pueda interferir en procesos posteriores

(Howell, 1973).

Mediante la metodología de Dellaporta et al (1983) se obtuvieron concentraciones

de ADN entre 50 y 100 ng/ul), de buena calidad para la amplificación por PCR de

los RAMs (Figura 37). Se realizaron algunas modificaciones adicionales a la

metodología consistentes en la realización de una precipitación con fenol:

cloroformo: alcohol isoamílico en proporción 24:24:1 y la dilución final del ADN en

100 ul de tampón TE 1X para asegurar una buena concentración y la eliminación

de otras sustancias que pudieran interferir en las amplificaciones.

  

‐ 82 ‐  

Figura 137. ADN de las accesiones de las especies de Passiflloras, extraído mediante la metodología de Dellaporta et al (1983) con modificaciones.

La cuantificación del ADN mediante comparación con concentraciones conocidas

del bacteriófago Lambda permitió determinar de manera adecuada las

concentraciones de ADN obtenidas mediante las dos metodologías. Esta técnica

permite realizar la cuantificación de manera rápida y menos costosa ya que no

requiere de la utilización de equipos especializados como espectrofotómetros o

fluorómetros ni la utilización de reactivos tóxicos y peligrosos, lo que la propone

como una metodología de fácil y rápida implementación para la cuantificación de

ADN total.

4.5.2 Características de los cebadores

Para la evaluación de la diversidad genética de la colección se seleccionaron

cuatro de los cinco cebadores RAMs utilizados por presentar algún grado de

polimorfismo. El cebador GT no amplificó para ninguna de las muestras

posiblemente por condiciones no apropiadas de PCR, como la temperatura. Los

cuatro cebadores utilizados generaron un patrón de 71 bandas y el número de

bandas por cebador estuvo entre 15 para CCA y 20 para CT (Tabla 9).

M   5     22   23   25   27   30  31   32   33   34  35          36   37   39   40  41   43   44   45   46   48  54 

  

‐ 83 ‐  

Tabla 9. Bandas totales y polimórficas obtenida con los cebadores RAMs utilizados para la evaluación de la diversidad genética.

En uchuva utilizando la técnica RAMs se obtuvo un patrón de 50 bandas con siete

cebadores para la evaluación de la diversidad genética de 43 accesiones del

banco de germoplasma de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira

(Bonilla et al. 2008). En mora, se obtuvo un patrón de 58 bandas al utilizar seis

cebadores RAMs en la evaluación de la diversidad genética de 38 accesiones

(Morillo et al. 2005). En guayaba Psidium sp se obtuvieron 72 bandas con 5

cebadores RAMs para la evaluación de la diversidad genética de árboles nativos

de guayaba (Sanabria et al. 2006), En un estudio de la diversidad genética de la

colección nacional de nacedero de la Fundación Centro para la Investigación en

Sistemas Sostenibles de Producción Agropecuaria (CIPAV) se obtuvo un patrón

de 71 bandas con pesos moleculares entre 1500 y 120 pb con cinco cebadores

RAMs (Posso 2010). Al comparar el número de locus RAMs generados por los

cuatro cebadores en este estudio (71 en total) se propone que fue un número

adecuado para estimar parámetros genéticos para evaluar la diversidad de las 28

introducciones de 17 especies de Passifloras y es confiable para el análisis

estadístico (Nybom y Bartish 2000).

Se ha considerando que la máxima diversidad genética se conseguirá en una

población que tienda hacia el equilibrio génico, con valores de He cercanos a 0.5.;

los valores de heterocigosidad esperada (He) calculados mediante el programa

TFPGA considerando todas las accesiones del banco como un solo grupo y para

Cebador Nº bandas totales Nº bandas polimórficas

CT 20 18

CGA 19 15

TG 17 15

CCA 15 9

TOTAL 71 57

  

‐ 84 ‐  

cada uno de los cebadores, mostraron que el valor más alto fue para el cebador

CGA (0,32) y el más bajo para el cebador CCA (0,24). El valor de porcentaje de

locus polimórfico más alto se encontró con el cebador CGA (79%) y el más bajo

con el cebador CCA (60%) (Tabla 10).

Tabla 10. Valores de Heterocigosidad y porcentaje de lous polimórficos (95%) para los cebadores RAMs utilizados.

Posiblemente el alto polimorfismo encontrado con el cebador CGA (79%) y He

(0,32) y el cebador CT con (76%) y He (0,26) se deba a una mayor frecuencia

entre los sitios de hibridación y las cadenas de ADN complementarias de esa

secuencia, lo que evidencia la presencia de dos regiones microsatélites CGA y

CT.

El valor alto de polimorfismo y de Heterocigosidad encontrados con los

cebadores CGA y TG permiten concluir que estos cebadores fueron los que

hicieron el mayor numero de cortes a la diversidad y resultan apropiados para su

utilización en futuras investigaciones sobre la evaluación de la diversidad genética

y estructura poblacional de accesiones de Passifloras. Sin embargo, los otros

cebadores también mostraron un número elevado de cortes. De manera general

hubo correlación entre Heterocigosidad y polimorfismo en los cebadores

evaluados (Figura 38).

Cebador Heterocigosidad

esperada (He)

% locus polimórficos (95%)

CT 0,30 70

CGA 0,32 79

TG 0,26 76

CCA 0,24 60

  

‐ 85 ‐  

Figura 38. Heterocigocidad y porcentaje de loci polimórficos (95%) para cada uno de los cebadores RAMs utilizados.

El dendograma resultante del análisis numérico de los perfiles de las 28

introducciones de Passifloras (Figura 38) da como resultado 8 grupos principales

a un nivel de similitud del 86%. Donde el primer grupo comprende solo una

especie, P. adenopoda, el segundo grupo abarca dos especies, P. alata y P.

maliformis. En la especie P. alata se encuentra dos introducciones 49 y 80 con

una homología del 100%. En la especie P. maliformis se observa 6 introducciones,

en las cuales hay variabilidad intraespecie. En el grupo tres se encuentran las

especies P. incarnata y P. ligularis. En el grupo cuatro abarca 8 especies: P.

quadrangularis, P rubra, P. capsularis, P. apoda, P. caerulea, P. foetida, P.

tarminiana y P. edulis. En el grupo cinco se encuentra la especie P. gracilis, en el

grupo seis se agrupa las especies P. ambigua y P. cincinata con una homología

del 100%, en el grupo siete solo con una especie P. mollisima y el grupo ocho la

especie P. flavicarpa.

4.5.3 Análisis descriptivo

El análisis del dendrograma generado, fue analizado mediante el coeficiente de

Dice Nei-Li (1978) y mediante el método de clasificación UPGMA (Figura 39)

mostró una tendencia de agrupamiento de introducciones pertenecientes a la

  

‐ 86 ‐  

misma especie, revelando un nivel aproximado de similitud de 0,96, la formación

de 16 grupos donde se observa la separación de las diferentes especies.

La introducción perteneciente a la especie P. flavicarpa 81 fue las más distanciada

genéticamente del resto de las introducciones a un nivel de similitud del 0,67. Esta

introducción fue una especie colectada en estado silvestre en el municipio de

Montenegro Quindío.

El grupo VII con las introducciones de las especies P. caerulea 57 y P. foétida 47

pertenecen al subgénero Passiflora supersección Passiflora, y el grupo IX con las

especies P. rubra 85 y P. capsularis 112 pertenecen al subgénero Decaloba,

supersección Decaloba, sección Xerogona (Figura 39).

  

‐ 87 ‐  

 

Figura 39. Dendrograma de distancia genética de 28 introducciones de Passifloras, basado en el coeficiente de similitud de Dice Nei-Li (1978) y calculado con los datos combinados de los cuatro cebadores RAMs.

Coefficient0.00 0.06 0.13 0.19 0.25 0.31 0.38 0.44 0.50 0.56 0.63 0.69 0.75 0.81 0.88 0.94 1.00

82P.adenopoda

49P.alata

80P.alata

30P.maliformis

121P.maliformis

93P.maliformis

107P.maliformis

125P.maliformis

70P.maliformis

116P.incarnata

40P.ligularis

58P.apoda

57P.caerulea

47P.foetida

45P.tarminiana

76P.tarminiana

112P.capsularis

85P.rubra

36P.edulisvared

133P.edulisvare

119P.quadrangul

117P.quadrangul

114P.quadrangul

59P.gracilis

56P.ambigua

99P.cincinata

43P.mollissima

81P.flavicarpa

XIV

I

II

III

IVV

VI

VII

VIII

IX

X

XI

XII

XVXVI

XIII

  

‐ 88 ‐  

4.5.4 Heterocigosidad esperada (He) y porcentaje de loci polimórficos

La He para la colección total fue de 0,2853 lo que revela un alto grado de

diversidad en las introducciones evaluadas. Se escogió la heterocigosidad

insesgada de Nei (1978), pues esta presenta una corrección por el número de

muestras el cual en este estudio es bajo, (28 introducciones de Passifloras),

teniendo en cuenta que en Colombia cuenta con 165 especies (Morillo et al. 2005).

La He se interpreta como la probabilidad de colectar dos genes diferentes en un

muestreo con reemplazamiento del total de genes en una población. También se

le denomina como diversidad genética, aunque esta denominación no es

aconsejable ya que puede confundirse con variación genética “en general” y no

solo al valor de He (Caujapé 2006). El valor encontrado en este análisis es alto ya

que se ha estimado que 0 ≤ He ≤ 0,3 (Nei 1975; Selander 1979; citado por

Caujapé 2006). En un estudio de caracterización molecular de materiales

cultivados de gulupa (Passiflora edulis var. edulis) también se reportó alta

diversidad genética (0,291), probablemente producto del método de propagación,

de su procedencia diversa y el poco tiempo de establecimiento de los cultivos en

el país.

En accesiones de mora Rubus sp (Morillo et al. 2005) y uchuva Physallis

peruviana (Bonilla et al. 2008) del banco de germoplasma de la Universidad

Nacional de Colombia sede Palmira y utilizando RAMs se reportaron valores de

He de 0,31 y 0,25 respectivamente; valores altos comparados con resultados

obtenidos en cultivares comerciales de tomate Solanum lycopersicum en donde la

He fue de 0,18 (Restrepo 2003).

El porcentaje de locus polimórficos encontrado para la colección de Passifloras fue

de 71,83%, lo que nuevamente confirma que las introducciones incluyen una

buena diversidad y heterogeneidad genéticas.

  

‐ 89 ‐  

Estas introducciones analizadas en este estudio, también fueron evaluadas en su

nivel de resistencia a la enfermedad secadera del maracuyá encontrándose

diferentes niveles de resistencia incluso entre introducciones de la misma especie,

lo cual puede ser explicado por la alta diversidad genética que se confirmó en este

estudio, y posiblemente a que en algunos casos corresponden a especies

colectadas en estado silvestre que como es conocido, pueden representar una

fuente de genes valiosos de resistencia.

Los resultados obtenidos sugieren la necesidad de continuar la caracterización del

todo el banco de trabajo de Passifloras de Corpoica Palmira e incluso trabajos

encaminados a recolectar nuevas introducciones que representen de una manera

más amplia la diversidad que puede existir en este género, y que fortalecerán

futuros trabajos de mejoramiento genético.

  

‐ 90 ‐  

5 CONCLUSIONES

La metodología de inoculación de inmersión de raíces fue práctica y

eficiente para inocular al hongo del género Fusarium a 420 plantas

inoculadas, pertenecientes a especies de Passifloras.

De las 28 introducciones evaluadas, 15 son resistentes o tolerantes al

hongo patógeno Fusarium sp. agente causal de la secadera del maracuyá.

Se identificaron 13 aislados del género Fusarium que afectan el cultivo de

maracuyá en 5 municipios del Valle del Cauca, de los cuales cuatro

especies diferentes atacan al cultivo de maracuyá: Fusarium oxysporum,

Fusarium brachygibbosum, Fusarium verticilliodes y Fusarium solani.

Se encontró que hay diferencias inter e intraespecies dentro de las especies

perteneciente al género Fusarium identificas en este estudio.

Nuevamente se confirma que la técnica de la PCR unida a la amplificación

de la región ITS1_ITS4, es una herramienta adecuada para la identificación

de especies pertenecientes al género Fusarium. Se comprueba que la

región ITS es apta en la identificación de especies pertenecientes al

género Fusarium.

  

‐ 91 ‐  

EL valor de He obtenido en el análisis molecular indica que existe una alta

diversidad genética entre las 28 introducciones de Passifloras analizadas

en este estudio.

 

 

Los marcadores moleculares RAMs utilizados en este estudio demostraron

ser adecuados para la evaluación de la diversidad genética de Passifloras.

La técnica molecular utilizada en este estudio permite evidenciar un alto

grado de polimorfismo y sensibilidad para la discriminación de las

introducciones y de las especies de Passifloras.

La diversidad y variabilidad encontradas en el género Passifloras puede

deberse al hecho de que las especies son alógamas, auto-incompatibles y

se cruzan con facilidad.

Las diferencias observadas a nivel molecular sirven de apoyo al estudio de

la variabilidad en Passiflora, monitorear hibridaciones interespecíficas, y el

ingreso de genes de las especies silvestres para las cultivadas a través de

programas de mejoramiento genético.

  

‐ 92 ‐  

6 RECOMENDACIONES

Evaluar en campo las especies que salieron resistentes al hongo Fusarium

oxysporum (MUC5).

Evaluar la patogenicidad de las otras especies de Fusarium en las especies de Passifloras resistentes.

Realizar los portainjertos con las especies resistentes y evaluar la compatibilidad de los tallos.

Probar los portainjertos en campo.

  

‐ 93 ‐  

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‐ 102 ‐  

ANEXOS

ANEXO A. MEDIOS DE CULTIVO

Composición de los medios de cultivo referida a un litro de agua destilada

AGAR PATATA DEXTROSA (PDA)

39 g de bacto -.patata dextrosa agar

1000 ml de agua destilada

Se esteriliza en el autoclave durante 15 minutos a 121°C y se reparte en caja de

petri.

CARNATION LEAF AGAR (CLA)

20 g de agar

1000 ml de agua destilada

Hojas de Clavel

Las hojas de clavel se deben desinfectar con hipoclorito de sodio 5% (solución

comercial) durante 5 minutos, lavar posteriormente con agua destilada estéril y

luego con alcohol al 70% por 1 minuto, se repite el lavado con agua estéril y

posteriormente se deja secar bajo la cámara de flujo antes de agregarlas al medio

o secarlas en a 70 grados ºC.

Agregar de 3 a 5 hojas de clavel, cuando el medio esté tibio.

Medidas de las hojas: 5-8mm (1cm de largo aprox.) por placa de 9mm de

diámetro.

  

‐ 103 ‐  

ANEXO B. Tabla 1. Aislamiento de ADN genómico

Con este método se obtienen de 50 a 100 ug de ADN por cada 100 mg de tejido liofilizado y molido.

 

Pasos

1 Coloque 50 mg de tejido liofilizado y molido en un tubo de 1,5 o 2 ml.

2 Agregue 800 ul de solución amortiguadora CTAB. Mezcle por inversión, para homogenizar el tejido con la solución amortiguadora.

3 Incube y mueva los tubos con suavidad en un agitador de balance en un baño a 65º C durante 90 min.

4 Retire los tubos los tubos del horno y deje enfriar durante 5 a 10 min.

5 Agregue 500 ul de FCI (Fenol cloroformo isoamilico 25:24:1) agite los tubos por inversión durante 10 min a temperatura ambiente.

6 Centrifugue a 13500 rpm a temperatura ambiente durante 5 min. para formar la parte acuosa (liquido claro de color amarillo) y la fase orgánica (de color verde oscuro)

7 Recupere aproximadamente 750 ul de la fase superior acuosa y vacíela en un tubo nuevo de 1.5 o 2.0 ml.

8 Agregar 500 ul CI (Cloroformo isoamilico 24:1) agitar 5 min. Centrifugar 5 min a 13500 rpm. Recuperar la fase acuosa en un tubo nuevo.

9 Agregue ½ volumen de isopropanol (2-propanol) al 100% previamente enfriado en un refrigerados a -20 ºC. Mezcle por inversiòn para favorecer la precipitación de ADN. Incube las muestras toda la noche a -20ºC.

10 Centrifugue a 13500 rpm a temperatura ambiente durante 10 min. para precipitar y formar la pastilla de ADN en el fondo del tubo. Deseche el isopropanol por decantación.

11

Agregue 1 ml de alcohol al 75% lave suavemente la pastilla de ADN. Centrifugue a 13500 por 1 min. Deseche el alcohol por decantación. Deje q se evapore a temperatura ambiente hasta que la pastilla seque. Si todavía siente olor a alcohol, esto indica que la pastilla no esta completamente seca.

12 Vuelva a suspender la pastilla en 100 ul de TE o agua doble destilada. Guarde las muestras a 4ºC hasta utilizarlas; si no va utilizarlas mucho tiempo, almacénelas a -20ºC.

 

  

‐ 104 ‐  

ANEXO C. Tabla 2. Evaluación de la resistencia de 28 introducciones de 17 especies de Passifloras.

 

Especies e introducciones

evaluadas Evaluaciones Semanales

P. edulis var edulis (36)

1 2 3 4 5 6 7 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,2 0,2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,4 0,4 0,4 0,4 0 0 0 0 0,2 0,2 0,2 0,2 0 0 0 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0 0 0 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0 0 0 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0 0 0 0 0 0 0 0

P. maliformis (30)

0 0 0 0 0,2 0,2 0,5 2 0 0 0 0 0 0,2 0,5 0,5 0 0 0 0 0 0 0 1,5 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0,2 0,2 0,5 1,5 0 0 0 0,2 0,8 1 2 2 0 0 0 0 0,2 0,2 0,5 1,5 0 0 0 0,3 0,4 0,5 0,7 0,7 0 0 0 0 0 0,2 0,5 1 0 0 0 0 0 0,2 0,3 0,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0 0 0 0 0 0 0 0,7 0 0 0 0 0 0 0,2 0,5 0 0 0 0 0 0 0,3 0,3 0 0 0 0 0 0,1 0,1 0,2 0 0 0 0 0 0 0,3 0,3 0 0 0 0 0,3 0,3 0,5 0,5 0 0 0 0 0 0 0,2 0,2 0 0 0 0 0 0 0,2 1

  

‐ 105 ‐  

Continuación de la Tabla 2.

Especies e introducciones evaluadas Evaluaciones Semanales

P. incarnata (116)

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,3 0,3 0,5 0,5 0 0 0 0,3 10 12 100 100 0 0 0 0,2 0,4 0,4 0,6 0,6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,1 0,1 0,1 0,1

0,2 0,2 0,2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0 0 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0,3 0,5 15 25 100 100 100 0 0 0 0 0,1 0,1 0,1 0,1

0,2 0,2 0,2 0,5 0,6 0,6 10 100 0 0 0 0 0 0 0 0

0,4 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,2 0,3 0,3 0,5 0,5 0,5 0,6 0,6 0 0 0,1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

0,2 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,6 0,6 0 0,1 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

P. adenopoda (82)

0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7

0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 7 7 7 7 7 7 7 7

0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 0,9 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51 51

  

‐ 106 ‐  

Continuación Tabla 2.

Especies e introducciones

evaluadas Evaluaciones Semanales

P. maliformis pura (93)

15 15 100 100 100 100 100 100

0 1 1 1 1 15 100 100

0 1 12 20 100 100 100 100

15 15 100 100 100 100 100 100

0,5 0,5 10 15 100 100 100 100

90 90 100 100 100 100 100 100

0 0 0 100 100 100 100 100

15 15 100 100 100 100 100 100

0 0 1 1 15 50 100 100

1 12 12 100 100 100 100 100

0 0 0 0 0 0,2 0,2 0,2

12 12 100 100 100 100 100 100

51 51 100 100 100 100 100 100

0 0,3 1 20 50 50 100 100

1 1 1 15 50 75 100 100

15 15 50 90 100 100 100 100

0 0 1 1 15 15 100 100

0 0 0 100 100 100 100 100

0,5 0,5 10 25 25 50 100 100

0,7 0,7 2 2 5 5 5 5

P. alata (80)

30 50 100 100 100 100 100 100

40 100 100 100 100 100 100 100

60 100 100 100 100 100 100 100

0 15 100 100 100 100 100 100

0,2 0,3 100 100 100 100 100 100

0 0 0 15 100 100 100 100

70 100 100 100 100 100 100 100

0 100 100 100 100 100 100 100

  

‐ 107 ‐  

Continuación Tabla 2.

Especies e introducciones

evaluadas Evaluaciones Semanales

P. quadrangularis (119)

0 10 10 12 12 100 100 100

0 0 0 0,5 0,5 1 1,5 1,5

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0,5 0,5 0,5 10 12 12 12

10 10 15 15 15 15 15 15

0,5 0,6 19 100 100 100 100 100

0,5 0,5 1 2 3 3 5 5

0 0 0,9 100 100 100 100 100

12 12 12 12 12 12 12 12

0 0 0 10 100 100 100 100

0 0 0 0 0 0,5 0,5 1

0 0 0 0 0 0 0 0

0,7 0,7 0,7 1 100 100 100 100

0 0 15 15 100 100 100 100

0 10 100 100 100 100 100 100

10 10 10 20 100 100 100 100

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0,5 0,5 1

0 0 0 0 0 15 100 100

0 0 0 0,5 1 1 1 1

P. ligularis (40)

0,6 0,9 0,9 0,9 1,5 1,5 1,5 1,5

0,5 0,5 0,5 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6

0,5 0,5 0,5 0,5 1 1 1 1

0,2 0,5 0,5 0,6 0,6 0,6 1 1

0,2 7 7 7 7 7 7 7

0,5 0,6 0,6 1 1 1 1 1

0,9 1 1 1 1 1 1 1

0,5 0,5 0,6 0,6 1 1 1 1

P. ambigua (56)

1,5 2 90 100 100 100 100 100

2 2 15 100 100 100 100 100

2 100 100 100 100 100 100 100

1,5 2 70 100 100 100 100 100

2,5 2,5 50 100 100 100 100 100

2 2 5 100 100 100 100 100

  

‐ 108 ‐  

Continuación Tabla 2.

Especies e introducciones

evaluadas Evaluaciones Semanales

P. gracilis(59)

2 2 100 100 100 100 100 100

2 3 3 3 3 3 3 3

10 100 100 100 100 100 100 100

2 2 2 2 2 100 100 100

50 100 100 100 100 100 100 100

2 2 2 2 2 2 2 2

P. falvicarpa 81

0,5 15 50 100 100 100 100 100

2 10 100 100 100 100 100 100

2 20 25 100 100 100 100 100

4 25 35 100 100 100 100 100

2 25 25 100 100 100 100 100

3 15 100 100 100 100 100 100

P. liguralis (21)

0 0 100 100 100 100 100 100

0,9 1 1 100 100 100 100 100

0,1 0,5 0,3 0,3 0,4 1 1 1

0,9 1,5 1,5 1,5 1,5 2 2 2

0 0 0 0 0 0 0 0

P. cincinata Jabotijaba (99)

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

P. mollissima (43)

0,5 0,5 0,5 1 1 1 1 1

0 0 0 0 0 0 0 0

1,5 1,5 2 2 2 2 2 2

0,7 0,9 0,9 1,5 1,5 2 2 2

1,7 1,7 1,7 2 2 2 2 2

0,2 0,2 0,2 0,9 0,9 1 1 1

0,2 0,2 0,9 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5

0 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

0 10 25 100 100 100 100 100

1 1 1 1 1,5 1,5 2 2

  

‐ 109 ‐  

Continuación Tabla 2.

Especies e introducciones

evaluadas Evaluaciones Semanales

P. edulis purpura (133)

0,5 0,5 2 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

0 0 0 0,7 1 1 1 1

0 0 0 0 0,2 0,2 0,2 0,2

0 0 0 0 0 0 0 0

0,6 0,6 1 1 1 1 1 1

0,5 0,5 0,9 0,9 1,5 1,5 1,5 1,5

0 0 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

0,7 0,7 1 1 1,5 1,5 1,5 1,5

0 0 0 0,7 1 1 1 1

0 0,5 0,5 1 1 1,5 1,5 1,5

0,5 0,6 0,9 1 1 1 1 1

0 0 0,5 0,9 1,5 1,5 1,5 1,5

0,5 0,5 0,5 1 1 1 1 1

0,5 0,5 0,5 1 1 1 1 1

0,5 0,5 0,5 1 1 1 1 1

P. tarminiana (73)

7 7 100 100 100 100 100 100

15 15 100 100 100 100 100 100

9 9 100 100 100 100 100 100

8 8 8 50 70 100 100 100

15 15 100 100 100 100 100 100

7 7 100 100 100 100 100 100

P. tarminiana (70)

15 15 20 20 50 60 100 100

10 100 100 100 100 100 100 100

7 8 8 100 100 100 100 100

7 8 8 8 15 25 50 100

8 8 10 10 15 20 50 100

15 15 20 100 100 100 100 100

P. rubra (85)

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

1 1 1 1 1 1 1 1

0 0 0 0 0 0 0 0

  

‐ 110 ‐  

Continuación Tabla 2.

Especies e introducciones

evaluadas Evaluaciones Semanales

P. foetida (47)

0 0 0 0 0 0 0 0

0,1 0,1 0,1 1 1 1 1 1

0,5 0,5 0,5 1 1 1 1 1

0 0 0 0 0 0 0 0

P. vitifolia (87) 1 1 1 1 1 1 1 1

0 0 100 100 100 100 100 100

P. alata (20) 0 0 0,5 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7

0,9 0,9 1 1 1,5 1,5 1,5 1,5

P. alata (79) 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0,5 0,5 1 1 1 1 1

P. capsularis (112) 0 0 0 0,5 0,5 1 1 1

0 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

P. caerulea (57) 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

P. tarminiana (45)

7 100 100 100 100 100 100 100

6 100 100 100 100 100 100 100

5 100 100 100 100 100 100 100

5 100 100 100 100 100 100 100

10 100 100 100 100 100 100 100

5 100 100 100 100 100 100 100

P. quadrangularis (117)

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

0 0 0 0 0 0 0 0

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

0 0 0 0 0 0 0 0

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

0 0 0 0 0 0 0 0

  

‐ 111 ‐  

Continuación Tabla 2.

Especies e introducciones

evaluadas Evaluaciones Semanales

P. alata (49)

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,5 0,5

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

P. quadrangularis (114)

0 0 0 0 0,2 0,2 0,2 0,2

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

10 100 100 100 100 100 100 100

0,2 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

0 0 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0

0,3 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

0 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6

0 0 0 0 0 0 0 0

  

‐ 112 ‐  

Continuación Tabla 2.

Especies e introducciones evaluadas Evaluaciones Semanales

P. malimorfis blanda (121)

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,7 1 1

0,7 0,7 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0

0,6 0,6 0,6 0,6 1 1 1 1 0,7 0,7 0,7 0,7 1 1 1 1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,2 0,2 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,5 0,5 2 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 0,6 0,6 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,2 0,2 0,2 0,2 0 0 0 0 0,2 0,2 0,2 0,2 0 0 0,3 0,4 0,4 0,6 0,6 0,6

0,2 0,2 0,2 0,2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,7 0,9 0,9 1 1 1

P. maliformis (125)

0 0 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0 0 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,5 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,1 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 1 0 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

  

‐ 113 ‐  

Continuación Tabla 2.

Especies e introducciones

evaluadas Evaluaciones Semanales

P. edulis purpura (133)

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0,6 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7

0,2 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,6 0,6 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7

P. apoda (58)

0,5 0,5 2 2 2,5 2,5 2,5 2,5 0 2 2 2 2 2,5 2,5 2,5 2 3 100 100 100 100 100 100 2 2 5 100 100 100 100 100

P. maliformis (107)

0 0 0 0 0 0 0 0 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 0 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0,5 0,5 15 15 15 15 100 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,3 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

  

‐ 114 ‐  

ANEXO D. Tabla 3. Secuencia de los 13 Aislamientos.

AISLADO DEL

HONGO ESPECIE SECUENCIA

MUC1 Fusarium

solani

GGAGGGATCATTACCGAGTTATACAACTCATCAACCCTGTGAACATACCTATAACGTTGCCTCGGCGGGAACAGACGGCCCCGTAACACGGGCCGCCCCCCGCCAGAGGACCCCCTAACTCTGTTTCTATAATGTTTCTTCTGAGTAAACAAGCAAATAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAGGCCCCCGGGCCTGGCGTTGGGGATCGGCGGAAGCCCCCTGCGGGCACAACGCCGTCCCCCAAATACAGTGGCGGTCCCGCCGCAGCTTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTCGCAACTGGAGAGCGGCGCGGCCACGCCGTAAAACACCCAAC

MUC2 Fusarium

solani

GTACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTATACAACTCATCAACCCTGTGAACATACCTATAACGTTGCCTCGGCGGGAACAGACGGCCCCGTAACACGGGCCGCCCCCGCCAGAGGACCCCCTAACTCTGTTTCTATAATGTTTCTTCTGAGTAAACAAGCAAATAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAGGCCCCCGGGCCTGGCGTTGGGGATCGGCGGAAGCCCCCTGCGGGCACAACGCCGTCCCCCAAATACAGTGGCGGTCCCGCCGCAGCTTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTCGCAACTGGAGAGCGGCGCGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAA

  

‐ 115 ‐  

Continuación Tabla 3

AISLADO DEL

HONGO ESPECIE SECUENCIA

MUC3 Fusarium

oxysporum

GCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCACTTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGTTAATTCGCGTTCCTCAAATTGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAGTAAAACCCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCCGTTAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCA

MUC4 Fusarium

solani

GAGGGATCATTACCGAGTCTAAACAACTCATCAACCCTGTGAACATACCTAAAACGTTGCTTCGGCGGGAACAGACGGCCCCGTAAAACGGGCCGCCCCCGCCAGAGGACCCCTAACTCTGTTGCTATATGTATCTTCTGAGTAAACAAGCAAATAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAGGCCCCCGGGCCTGGCGTTGGGGATCGGCGAGGCGCCCCCTGTGGGCACGCGCCGTACCCCCAAATACAGTGGCGGTCCCGCCGCAGCTTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCT

MUC5 Fusarium

oxysporum

TTTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCACTTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGTTAATTCGCGTTCCTCAAATTGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAGTAAAACCCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCA

  

‐ 116 ‐  

Continuación Tabla 3

AISLADO DEL

HONGO ESPECIE SECUENCIA

MUC6 Fusarium

verticillioides

CCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCACTTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCTCGGGTTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGCCCTTGCGGCAAGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGCAGCCTCCATTGCGTAGTAGTAAAACCCTCGCAACTGGAACGCGGCGCGGCCAAGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA

MUC7 Fusarium

solani

GCGGAGGGATCATTACCGAGTTATACAACTCATCAACCCTGTGAACATACCTATAACGTTGCCTCGGCGGGAACAGACGGCCCCGTAACACGGGCCGCCCCCGCCAGAGGACCCCCTAACTCTGTTTCTATAATGTTTCTTCTGAGTAAACAAGCAAATAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAGGCCCCCGGGCCTGGCGTTGGGGATCGGCGGAAGCCCCCTGCGGGCACAACGCCGTCCCCCAAATACAGTGGCGGTCCCGCCGCAGCTTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTCGCAACTGGAGAGCGGCGCGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAG

MUC8 Fusarium

verticillioides

GTCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCACTTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCTCGGGTTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGCCCTTGCGGCAAGCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCT

  

‐ 117 ‐  

Continuación Tabla 3

AISLADO DEL

HONGO ESPECIE SECUENCIA

MUC9 Fusarium

oxysporum

TTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGTTAATTCGCGTTCCTCAAATTGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAGTAAAACCCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCCGTTAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAAC

MUC10 Fusarium

oxysporum

TGACATACCACTTGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGTTAATTCGCGTTCCTCAAATTGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAGTAAAACCCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCCGTTAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA

MUC11 Fusarium

brachygibbosum

CTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCCTGTGAACATACCTTTATGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAACGGGACGGCCCGCCGCAGGAACCACAAAACTCTGATTTTAGTGTAACTTCTGAGTCTAAAAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCCCGGGTTTGGTGTTGGGGATCGGGCTGTACTCCAGCCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGCAGCCTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTCGCAACTGGAACGCGGCGCGGCCAAGCCGTTAAA

  

‐ 118 ‐  

Continuación Tabla 3

AISLADO DEL

HONGO ESPECIE SECUENCIA

MUC12 Fusarium

solani

GCGGAGGGATCATTACCGAGTTATACAACTCATCAACCCTGTGAACATACCTATAACGTTGCCTCGGCGGGAACAGACGGCCCCGTAACACGGGCCGCCCCCGCCAGAGGACCCCCTAACTCTGTTTCTATAATGTTTCTTCTGAGTAAACAAGCAAATAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAGGCCCCCGGGCCTGGCGTTGGGGATCGGCGGAAGCCCCCTGCGGGCACAACGCCGTCCCCCAAATACAGTGGCGGTCCCGCCGCAGCTTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTCGCAACTGGAGAGCGGCGCGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGC

MUC13 Fusarium

solani

TGCGGAGGGATCATTACCGAGTTATACAACTCATCAACCCTGGTGACATACCTATAACGTTGCCTCGGCGGGAACAGACGGCCCCGTAACACGGGCCGCCCCCGCCAGAGGACCCCCTAACTCTGTTTCTATAATGTTTCTTCTGAGTAAACAAGCAAATAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAGGCCCCCGGGCCTGGCGTTGGGGATCGGCGGAAGCCCCCTGCGGGCACAACGCCGTCCCCCAAATACAGTGGCGGTCCCGCCGCAGCTTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTCGCAACTGGAGAGCGGCGCGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGC

  

‐ 119 ‐  

Hay una fuerza motriz más poderosa que el vapor,

la electricidad y la energía atómica: la voluntad.

Albert Einstein