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Edition 2018

EXEMPLES DE PROTOCOLES DE VALIDATION DE MÉTHODES

MICROBIOLOGIQUES ALTERNATIVES SELON LE

CHAPITRE 5.1.6 “Méthodes alternatives pour le contrôle

de la qualité microbiologique”

Pharmacopée Européenne

EXEMPLES DE PROTOCOLES DE VALIDATION DE MÉTHODES MICROBIOLOGIQUES ALTERNATIVES SELON LE CHAPITRE 5.1.6 “Méthodes alternatives pour

le contrôle de la qualité microbiologique”Pharmacopée Européenne

Edition 2018

Direction européenne de la qualité du médicament & soins de santé

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Table des matières

1. EXEMPLE DE PROTOCOLE DE VALIDATION D’UN ESSAI DE STERILITE RAPIDE ..................................................................................................................................... 4

1.1 PRINCIPE DE LA METHODE ALTERNATIVE ..................................................... 4

1.2 VALIDATION DE LA METHODE ALTERNATIVE .............................................. 4

1.2.1 Spécificité ............................................................................................................. 4

1.2.2 Limite de détection ............................................................................................... 5

1.2.3 Robustesse ............................................................................................................ 5

1.2.4 Applicabilité ......................................................................................................... 6

1.2.5 Equivalence .......................................................................................................... 6

2. EXEMPLE DE PROTOCOLE DE VALIDATION D’UNE METHODE QUANTITATIVE (DENOMBREMENT DES MICROORGANISMES) ................................ 6

2.1 PRINCIPE DE LA METHODE ALTERNATIVE ..................................................... 6

2.2 VALIDATION DE LA MÉTHODE ALTERNATIVE .............................................. 7

2.2.1 Exactitude, fidélité, limite de quantification, linéarité, intervalle de mesure ....... 7

2.2.2 Spécificité ............................................................................................................. 7

2.2.3 Robustesse ............................................................................................................ 8

2.2.4 Applicabilité ......................................................................................................... 8

2.2.5 Equivalence .......................................................................................................... 8

3. EXEMPLE DE PROTOCOLE DE VALIDATION D’UNE METHODE MOLECULAIRE D’IDENTIFICATION MICROBIENNE .................................................... 8

3.1 PRINCIPE DE LA METHODE ALTERNATIVE ..................................................... 8

3.2 VALIDATION DE LA METHODE ALTERNATIVE .............................................. 9

3.2.1 Exactitude ............................................................................................................. 9

3.2.2 Spécificité ............................................................................................................. 9

3.2.3 Robustesse ............................................................................................................ 9

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EXEMPLES DE PROTOCOLES DE VALIDATION DE MÉTHODES MICROBIOLOGIQUES ALTERNATIVES SELON LE CHAPITRE 5.1.6

“Méthodes alternatives pour le contrôle de la qualité microbiologique” Les protocoles décrits ci-après sont des exemples de validation de méthodes alternatives développées et appliquées par différents laboratoires. Ils sont liés aux équipements et méthodes utilisés dans ces laboratoires et sont publiés ici pour information, non comme modèles d’application générale. Ils ne constituent en aucun cas des recommandations de la Pharmacopée et les exemples décrits n’ont pas valeur de référence.

Les dénominations commerciales des instruments ne sont pas mentionnées, mais certains sont si spécifiques qu’ils restent identifiables. L’objectif n’est pas ici de promouvoir l’utilisation d’une technologie spécifique ou de donner la préférence à un fabricant plutôt qu’à un autre. Il s’agit simplement d’aider les utilisateurs à apprécier le niveau d’information attendu dans le cadre de l’évaluation réglementaire.

1 EXEMPLE DE PROTOCOLE DE VALIDATION D’UN ESSAI DE STERILITE RAPIDE

1.1 PRINCIPE DE LA METHODE ALTERNATIVE

Cet essai de stérilité alternatif utilise la filtration sur membrane. L’échantillon à examiner est constitué par mélange, puis filtré sur membrane. Les membranes filtrantes sont ensuite transférées sur des cassettes contenant des milieux nutritifs solides appropriés, puis placées en incubation. Les conditions d’incubation sont choisies de façon à reproduire celles spécifiées pour l’essai de stérilité de la Pharmacopée. La durée d’incubation est définie sur la base du temps nécessaire pour assurer la détection d’un microorganisme stressé, dans le cas le plus défavorable, en prévoyant une marge de sécurité adéquate. Après incubation, les réactifs adéquats sont pulvérisés sur les membranes, qui sont alors examinées au moyen d’un système détectant les (micro-)colonies par ATPmétrie par bioluminescence.

1.2 VALIDATION DE LA METHODE ALTERNATIVE

1.2.1 Spécificité La spécificité d’une méthode microbiologique qualitative est définie comme sa capacité à détecter exclusivement les microorganismes recherchés, c’est à dire qu’elle ne génère pas de résultats faussement positifs. Appliquée à un essai de stérilité, cette définition signifie que la méthode doit être capable de détecter tous les types de microorganismes, sans donner de résultat positif lorsqu’aucun microorganisme n’est présent.

Pour le démontrer, on met à l’épreuve les 2 méthodes (alternative et Pharmacopée), en parallèle, avec un inoculum contenant moins de 100 UFC d’un ensemble représentatif de microorganismes, comprenant les souches de référence de la Pharmacopée (voir chapitre 2.6.1, tableau 2.6.1.-1) et des isolats environnementaux locaux.

Les isolats choisis sont représentatifs de la flore détectée dans le cadre de la surveillance de l’environnement, et comprennent des microorganismes à croissance lente.

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Si nécessaire, ils peuvent être soumis, avant utilisation à des conditions de stress spécifiques, par exemple un stress thermique (pour les microorganismes non sporulés), ou un stress nutritif (pour les microorganismes sporulés)1.

Critère d’acceptation: une croissance est observée pour tous les microorganismes, lors de tous les essais.

Pour démontrer qu’aucun faux-positif n’est obtenu en l’absence de microorganismes, le bruit de fond (bioluminescence de fond) est évalué par examen d’au moins 3 membranes stériles sur lesquelles le produit à examiner a été filtré. Une analyse de risque préalable doit avoir démontré que la présence d’ATP provenant d’autres sources peut être exclue comme possible cause de faux-positifs.

Critère d’acceptation : le bruit de fond n’entraîne pas de faux-positifs.

1.2.2 Limite de détection

L’évaluation de la limite de détection est réalisée avec les souches de référence de la Pharmacopée dont l’emploi est recommandé dans le chapitre 2.6.1, ainsi qu’avec des isolats environnementaux stressés représentant une large gamme de contaminants potentiels (dont des endospores et des microorganismes à croissance très lente). 3 dilutions au 1/10 sont préparées pour chaque microorganisme à partir d’une population de départ de 50 UFC (soit un intervalle d’environ 50 UFC à 0,05 UFC). L’essai est effectué par les 2 méthodes (alternative et Pharmacopée) sur un nombre significatif de réplicats (par exemple au moins 10 réplicats de chaque dilution). Pour chaque méthode, on déduit du tableau du nombre le plus probable (NPP) les limites de confiance à 95% du NPP par gramme. On procède également à une estimation des limites de confiance à 95% du rapport entre les proportions de microorganismes respectivement détectés par les deux méthodes.

Critère d’acceptation : la valeur de la limite de détection obtenue pour la méthode alternative n’est pas supérieure à celle de la méthode de la Pharmacopée.

L’évaluation de la limite de détection repose sur la réalisation d’au moins 2 essais indépendants par microorganisme.

1.2.3 Robustesse

Deux paramètres susceptibles à la fois d’exercer une forte influence sur le résultat de l’essai et de varier significativement ont été identifiés : la durée d’incubation et le temps de transfert de la membrane filtrante du poste de pulvérisation jusqu’au système de détection. Pour la robustesse en rapport avec le matériel et à l’environnement, les sources de variation étudiées sont les suivantes : lots de filtres, lots de réactifs, lots de milieux, lots de liquide de rinçage, systèmes d’incubation anaérobies, analystes, laboratoires. Les expériences de robustesse sont conduites sur un microorganisme à croissance rapide et un microorganisme à croissance lente, avec un inoculum de 10-100 UFC. 3 essais avec 3 réplicats sont effectués pour chaque microorganisme et chaque paramètre de robustesse.

1 Gray, J.C., Staerk, A., Berchtold, M., Hecker, W., Neuhaus, G., Wirth, A. Growth-promoting Properties of

Different Solid Nutrient Media Evaluated with Stressed and Unstressed Micro-organisms: Prestudy for the Validation of a Rapid Sterility Test. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 2010 ; 64 : 249-63

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Critère d’acceptation : pour un recouvrement prédéfini par microorganisme, après 14 jours d’incubation il n’est pas observé de différence statistiquement significative en fonction des conditions appliquées (par exemple, lots de réactif A et B).

1.2.4 Applicabilité

L’étude d’applicabilité à un produit spécifique répond à un double objectif : identifier un protocole de filtration (rinçage) adéquat et démontrer la non-interférence du produit à examiner avec la méthode alternative par induction d’une importante bioluminescence de fond ou par inhibition de la réaction de bioluminescence. Pour démontrer l’absence d’effet d’inhibition résiduel après rinçage de la membrane, on procède à 3 essais avec les souches de référence de la Pharmacopée recommandées dans le chapitre 2.6.1, ainsi qu’avec des isolats environnementaux locaux. Un témoin est préparé (membrane ensemencée avec le microorganisme mais sans filtration du produit) pour comparaison. Pour exclure l’éventualité d’une inhibition de la réaction de bioluminescence, on ensemence 3 membranes ayant servi à filtrer le produit à examiner avec 10-100 UFC d’un microorganisme stressé, à croissance lente.

Critère d’acceptation : le recouvrement d’un nombre équivalent de (micro-)colonies bioluminescentes est obtenu par comparaison au témoin.

1.2.5 Equivalence

Des échantillons contaminés sont préparés par inoculation de moins de 5 UFC de 3 microorganismes d’essai différents. Pour chacun des 3 échantillons contaminés, 3 essais avec 10 réplications chacun sont alors effectués en parallèle par les 2 méthodes (alternative et Pharmacopée), les conditions de routine de l’essai étant reproduites autant que possible (par exemple en appliquant également un protocole de rinçage standard). Les résultats font l’objet d’une évaluation statistique.

Critère d’acceptation : l’analyse statistique montre que les résultats obtenus par la méthode alternative permettent de décider sans équivoque si les exigences des monographies seraient satisfaites au cas où l’on appliquerait la méthode de la Pharmacopée.

2 EXEMPLE DE PROTOCOLE DE VALIDATION D’UNE METHODE QUANTITATIVE (DENOMBREMENT DES MICROORGANISMES)

2.1 PRINCIPE DE LA METHODE ALTERNATIVE

La méthode alternative repose sur la cytométrie en phase solide et combine 3 technologies bien connues : filtration sur membrane, marquage fluorescent des cellules et détection par balayage laser. Après filtration sur membrane classique, les microorganismes viables retenus sur la membrane font l’objet d’un marquage fluorescent qui repose sur le clivage enzymatique d’un substrat non fluorescent et la libération d’un fluorochrome libre dans le cytoplasme. Seules les cellules ayant une activité métabolique (donc viables) et les spores possédant une membrane intacte apparaissent comme fluorescentes. Une fois ce marquage de viabilité effectué, un rayon laser balaye toute la surface de la membrane filtrante pour détecter individuellement les cellules viables, qui sont dénombrées de façon automatique. Comme la cytométrie en phase solide effectue un décompte individuel des cellules viables, le résultat est exprimé en nombre de cellules viables par unité de volume et non en UFC par unité de volume.

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2.2 VALIDATION DE LA MÉTHODE ALTERNATIVE

2.2.1 Exactitude, fidélité, limite de quantification, linéarité, intervalle de mesure

Pour valider la méthode alternative, on utilise un ensemble de microorganismes représentatif, comprenant des souches de référence de la Pharmacopée (voir chapitre 2.6.12, tableau 2.6.12.-1) et des isolats environnementaux locaux.

L’exactitude, la fidélité, la limite de quantification, la linéarité et l’intervalle de mesure de la méthode alternative et de la méthode de la Pharmacopée (filtration sur membrane) sont déterminés au moyen de séries de dilutions indépendantes – 300 UFC/mL, 100 UFC/mL, 50 UFC/mL, 10 UFC/mL, 5 UFC/mL et 1 UFC/mL – préparées individuellement pour chaque microorganisme par 3 analystes différents. Ceux-ci testent en parallèle, par les 2 méthodes, 5 réplicats de chaque concentration de la série (6 pour la dilution à 100 UFC/mL, qui sert à déterminer la fidélité). Les essais sont effectués avec des équipements et des lots de réactifs différents.

2.2.1.1 Critères d’acceptation

(i) Exactitude : il doit être démontré par des méthodes d’analyse statistiques appropriées que le recouvrement (en nombre de microorganismes) obtenu avec la méthode alternative est au moins égal à celui de la méthode de la Pharmacopée.

(ii) Fidélité : le coefficient de variation est calculé ; la méthode alternative présente une fidélité comparable à celle de la méthode de la Pharmacopée.

(iii) Linéarité : la droite de régression est calculée ; la linéarité est établie si la pente estimée est significative et l’écart de linéarité non significatif (voir chapitre général 5.3).

(iv) L’intervalle de mesure : celle de la méthode alternative est égale ou supérieure à celle de la méthode de la Pharmacopée.

(v) Limite de quantification : la plus faible concentration de l’intervalle de linéarité est considérée comme limite de quantification de la méthode ; la valeur obtenue pour cette limite avec la méthode alternative n’est pas supérieure à celle de la méthode de la Pharmacopée.

2.2.2 Spécificité

La spécificité des 2 méthodes est déterminée à l’aide d’une suspension de S. aureus à 100 UFC/mL environ, qui est divisée en 2 fractions. L’une des 2 fait l’objet d’un traitement visant à inactiver/tuer tous les microorganismes viables, dans des conditions qui permettent d’éviter la lyse des cellules non viables (par exemple, traitement par l’éthanol à 100 pour cent). Pour chacune des 2 méthodes (alternative et Pharmacopée), 3 réplicats de 1 mL de la suspension traitée, représentant chacun environ 100 cellules non viables font l’objet d’une filtration sur membranes séparées. Une fois cette filtration effectuée, 3 réplicats de 1 mL de la suspension non traitée, représentant chacun environ 100 cellules viables / UFC, sont filtrés sur les mêmes membranes. Sur chaque membrane sont donc retenues environ 100 cellules non viables et 100 cellules viables / UFC.

Critère d’acceptation : indépendamment des principes sur lesquels repose le dénombrement, le résultat final obtenu avec la méthode alternative et avec la méthode de Pharmacopée est d’environ 100 cellules viables / UFC par membrane avec les 2 méthodes.

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2.2.3 Robustesse

La répétabilité, la fidélité intermédiaire et la reproductibilité de la méthode alternative et de la méthode de la Pharmacopée sont déterminées en introduisant des variations délibérées de certains paramètres clés : les expériences de validation peuvent par exemple être réalisées à des jours différents, par des analystes différents, avec des systèmes différents ou des lots de réactifs différents, dans des laboratoires différents.

Critère d’acceptation : les variations délibérées introduites dans l’exécution de la méthode n’ont pas d’effet significatif sur les résultats des essais.

2.2.4 Applicabilité

L’applicabilité des 2 méthodes de dénombrement (alternative et Pharmacopée) est vérifiée selon les indications de la section 4-5 du chapitre 2.6.12. Il s’agit de démontrer que le produit n’inhibe pas la croissance ou la détection des microorganismes viables dans les conditions de l’essai. L’approche utilisée consiste à ajouter séparément des suspensions des microorganismes de référence, contenant au maximum 100 UFC, au liquide de rinçage utilisé lors de l’étape de filtration sur membrane de chacune des 2 méthodes (à la même étape de rinçage et de la même manière pour les 2 méthodes).

Critère d’acceptation : un recouvrement de 50-200 pour cent est obtenu conformément au chapitre général 2.6.12.

2.2.5 Equivalence

Pour établir l’équivalence des 2 méthodes de dénombrement, on utilise une stratégie directe qui consiste à réaliser les 2 essais en parallèle pendant une durée prédéfinie (ou sur un nombre d’échantillons prédéfini), puis à effectuer une analyse statistique pour comparer les résultats des 2 méthodes.

Critère d’acceptation : l’analyse statistique montre que les résultats obtenus par la méthode alternative permettent de décider sans équivoque si les exigences des monographies seraient satisfaites au cas où l’on appliquerait la méthode de la Pharmacopée.

3 EXEMPLE DE PROTOCOLE DE VALIDATION D’UNE METHODE MOLECULAIRE D’IDENTIFICATION MICROBIENNE

3.1 PRINCIPE DE LA METHODE ALTERNATIVE

Le gène codant pour l’ARNr (ADNr) est le mieux conservé dans l’ensemble des cellules vivantes, et il est largement utilisé pour identifier les microorganismes et en déterminer la taxonomie et la phylogénie. La séquence ADNr 16S possède des régions hypervariables, qui ont divergé au cours de l’évolution, flanquées de régions fortement conservées. Les amorces utilisées pour l’identification des microorganismes sont conçues pour se lier à ces régions conservées et amplifier les régions variables situées entre elles. Les amplicons issus de la réaction PCR sont purifiés puis séquencés. A partir des séquences sens et anti-sens obtenues, une séquence consensus est assemblée et comparée à des bases de données.

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3.2 VALIDATION DE LA METHODE ALTERNATIVE

3.2.1 Exactitude

Pour étudier l’exactitude de la méthode, on utilise plusieurs souches bien caractérisées de bactéries, moisissures et levures se trouvant dans la base de données.

Différentes sous-cultures (au moins 3 colonies individuelles) de microorganismes bien caractérisés sont récoltées et préparées, puis font l’objet d’une identification ; toutes les souches sont séquencées 3 fois sur 3 jours successifs par le même analyste.

Critère d’acceptation : les microorganismes sont correctement identifiés jusqu’au niveau de l’espèce et au-dessus du pourcentage d’homologie de séquence correspondant au seuil prédéfini (exemple, voir Tableau 1).

3.2.2 Spécificité

Dans le cas d’une méthode d’identification, la spécificité est la capacité de la méthode à opérer une discrimination entre les microorganismes effectivement présents et les facteurs d’interférence entraînant de fausses identifications (par exemple des mélanges de microorganismes conduisant à l’identification de microorganismes en réalité non présents dans l’échantillon). Des mélanges de microorganismes appropriés peuvent être utilisés pour établir la capacité de l’essai à mettre en évidence la validité d’un résultat pour un microorganisme, qu’il soit présent ou absent dans le mélange. L’essai doit permettre de différencier les résultats valides des résultats non valides dans le cas de mélanges de cultures ou d’ADN.

Critère d’acceptation : les résultats de l’étude de spécificité réalisée avec des cultures mixtes (quantifiées et titrées sur la base du nombre d’UFC ou par une méthode analytique permettant de standardiser le titre en ADN) conduisent à des identifications valides. Ces résultats montrent clairement que l’analyse des cultures mixtes ne produit pas d’identifications erronées (voir Tableau 2).

3.2.3 Robustesse

La robustesse peut être évaluée en même temps que l’exactitude et la fidélité ; on peut faire varier plusieurs paramètres critiques pour l’identification lors de la réalisation d’identifications multiples d’un même microorganisme.

Il est possible de réaliser une étude intra-laboratoire en apportant des modifications aux paramètres d’identification critiques. Ces modifications comprennent la réalisation de l’identification à des jours différents, par des analystes différents au sein du même laboratoire, avec des lots différents de kits d’essai et de réactifs, avec des cultures d’âge différent (par exemple, cultures de souches de référence âgées de 3 jours et 7 jours).

Différentes sous-cultures (au moins 3 colonies individuelles) de microorganismes bien caractérisés sont récoltées et préparées, puis font l’objet d’une identification ; pour chaque souche, 3 séquençages sont réalisés sur 3 jours successifs par le même analyste (exactitude, robustesse intra-laboratoire) et sur 3 jours successifs par 2 analystes (robustesse intra-laboratoire). La préparation des échantillons et le réglage des instruments sont effectués selon les procédures internes du laboratoire.

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Il est également possible de procéder à une étude inter-laboratoires, l’identification microbiologique étant dans ce cas réalisée sur les mêmes souches par différents laboratoires avec :

– des types d’équipement différents, si disponibles,

– des procédures légèrement différentes de purification des cibles ADN,

– des kits et lots de kits différents (tant pour la purification des amplicons issus de la PCR que pour celle des produits de séquençage),

– des versions différentes du logiciel de traitement des données, si applicable.

Critère d’acceptation : les microorganismes sont correctement identifiés jusqu’au niveau de l’espèce, avec le degré de concordance prédéfini entre la base de données et les souches d’essai de référence (voir Tableau 1).

Dans le cas d’une étude collaborative, tous les laboratoires participants appliquent si possible des critères d’acceptation identiques pour l’exactitude et la robustesse.

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Tableau 1 - Résumé des études de validation de l’exactitude et de la robustesse d’une méthode d’identification moléculaire

Espèce

Répétabilité Reproductibilité Homologie de séquence [% correspondance]

Diff

éren

ce m

ax.

hom

olog

ie d

e sé

quen

ce

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hom

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Moy

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ce

[%]

Eca

rt ty

pe

Essai 1 Essai 2 Essai 3

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145 T/DSM 50071T) 100,0 99,8 99,7 0,3 99,8 0,15 99,68 100,00 0,32 99,94 0,12 Stenotrophomonas maltophilia (ATCC 13637 T/ DSM 50170 T) 100,0 99,8 100,0 0,2 99,9 0,12 99,79 100,00 0,21 99,98 0,07

Escherichia coli (ATCC 11775 T/ DSM 30083T) 99,6 99,9 99,8 0,3 99,8 0,15 99,58 99,90 0,32 99,80 0,11 Salmonella choleraesuis (ATCC 13312 T/DSM 14846 T) 99,8 100,0 100,0 0,2 99,9 0,12 99,79 100,00 0,21 99,98 0,07 Staphylococcus aureus (ATCC 12600 T/DSM 20231T) 99,8 100,0 100,0 0,2 99,9 0,12 99,79 100,00 0,21 99,98 0,07 Staphylococcus epidermidis (ATCC 14990 T/ DSM 20044T) 100,0 100,0 100,0 0 100,0 0 99,70 100,00 0,30 99,91 0,13

Streptococcus agalactiae (ATCC 13813 T/DSM 2134 T) 100,0 100,0 99,9 0,1 100,0 0,06 99,38 100,00 0,62 99,85 0,20 Enterococcus faecalis (ATCC 19433 T/ DSM 20478 T) 100,0 99,9 99,9 0,1 99,9 0,06 99,80 100,00 0,20 99,88 0,06 Bacillus cereus (ATCC 14579 T/ DSM 31T) 100,0 100,0 100,0 0 100,00 0 99,60 100,00 0,40 99,93 0,14 Bacillus subtilis subsp, subtilis (ATCC 6051 T/ DSM 10T) 99,8 99,8 99,8 0,2 99,8 0 99,60 99,80 0,20 99,77 0,07 Corynebacterium bovis (ATCC 7715 T/DSM 20582T) 100,0 100,0 100,0 0 100,0 0 100,00 100,00 0 100,00 0 Carnobacterium gallinarum (ATCC 49517 T/ DSM 4847 T) 99,9 99,9 99,9 0,1 99,0 0 99,70 99,90 0,20 99,81 0,11

Clostridium perfringens (ATCC 13124 T/DSM 756 T) 99,7 99,7 99,7 0,3 99,7 0 99,67 99,78 0,11 99,71 0,05 Candida albicans (ATCC 18804 T/ CBS 562T) or (ATCC 10231/CBS6431) 100,0 100,0 100,0 0 100 0 100,00 100,00 0 100,00 0

Aspergillus brasiliensis (ATCC 16404/CBS 733,88) 100,0 100,0 100,0 0 100 0 100,00 100,00 0 100,00 0

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Tableau 2 – Résumé des études de validation de la spécificité (quantification et titrage de cultures mixtes par quantification de l’ADN)

Expérience Micro-organisme(s) Rapport Résultat ID

Culture pure 1 S. aureus S. aureus

Culture pure 2 M. luteus M. luteus

Culture pure 3 R. pickettii R. pickettii

Culture pure 4 P. aeruginosa P. aeruginosa

Culture mixte 1 S. aureus + M. luteus 1:1 S. aureus

Culture mixte 2 S. aureus + M. luteus 1:9 S. aureus

Culture mixte 3 S. aureus + M. luteus 9:1 S. aureus

Culture mixte 4 R. pickettii + P. aeruginosa 1:1 R. pickettii

Culture mixte 5 R. pickettii + P. aeruginosa 1:9 P. aeruginosa

Culture mixte 6 R. pickettii + P. aeruginosa 9:1 R. pickettii

Culture mixte 7 S. aureus + R. pickettii 1:1 R. pickettii

Culture mixte 8 S. aureus + R. pickettii 1:9 R. pickettii

Culture mixte 9 S. aureus + R. pickettii 9:1 B. gladioli*

Culture mixte 10 S. aureus + P. aeruginosa 1:1 P. aeruginosa

Culture mixte 11 S. aureus + P. aeruginosa 1:9 P. aeruginosa

Culture mixte 12 S. aureus + P. aeruginosa 9:1 P. aeruginosa

Culture mixte 13 M. luteus + R. pickettii 1:1 R. pickettii

Culture mixte 14 M. luteus + R. pickettii 1:9 R. pickettii

Culture mixte 15 M. luteus + R. pickettii 9:1 R. pickettii

Culture mixte 16 M. luteus + P. aeruginosa 1:1 P. aeruginosa

Culture mixte 17 M. luteus + P. aeruginosa 1:9 P. aeruginosa

Culture mixte 18 M. luteus + P. aeruginosa 9:1 P. aeruginosa

Culture mixte 19 S. aureus + M. luteus + R. pickettii + P. aeruginosa 1:1:1:1 R. pickettii

* ID non conforme aux critères d’acceptation – séquence consensus de 188 bp seulement → résultat non valide

Le Conseil de l’Europe est la principale organisation de défense des droits de l’homme du continent. Sur ses 47 États membres, 28 sont aussi membres de l’Union européenne. La Direction européenne de la qualité du médicament et soins de santé (EDQM) est une direction du Conseil de l’Europe qui a pour mission de contribuer au droit essentiel des êtres humains d’avoir accès à des médicaments et des soins de santé de bonne qualité, ainsi que de promouvoir et de protéger la santé publique.

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