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Experimentelle Ansätze zur Anwendung von
Granulocyten-Kolonie stimulierendem Faktor
als Therapie bei Intrazerebraler Blutung an der Ratte
Der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. med.
vorgelegt von Kristin Machold
aus Rudolstadt
Als Dissertation genehmigt
von der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 20.11.2013
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Jürgen Schüttler
Gutachter: Prof. Dr. med. Rainer Kollmar
Prof. Dr. med. Hajo Hamer
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung / Summary……..…………….……………………….......1
2. Einleitung………………………………………………………………………….5
2.1 Epidemiologie und Ätiologie des Schlaganfalls………………………………...5
2.2 Pathophysiologie der intrazerebralen Blutung……………………………........7
2.3 Diagnose……………………………………………………………………………9
2.4 Therapie der Intrazerebralen Blutung……………………………………….....10
2.4.1 Konservative Therapie……………………………………………………….10
2.4.2 Chirurgische Therapie…………………………………………………........11
2.4.3 Minimalinvasive Therapie……………………………………………………11
2.5 Experimentelle Therapieansätze…………….…...………………………........12
2.5.1 Experimentelle Blutungsmodelle………………………….………………..12
2.5.1.1 Kollagenase-Modell………………………………………….……….13
2.5.1.2 Injektion autologen Blutes…………………………………………...14
2.5.2 Experimentelle Therapieansätze mit Wachstumsfaktoren………………14
2.5.2.1 Erythropoietin (EPO)…………………………………………………14
2.5.2.2 Darbepoetin alfa………………………………………………….…..15
2.5.2.3 Brain derived neurotrophic factor (BDNF)…………………………15
2.5.2.4 Insulin-like growth factor I (IGF-I)…………………………………...15
2.5.2.5 Granulocyten-Colony Stimulierender Faktor (G-CSF)….....…..…16
2.5.2.5.1 Struktur, Exprimierung und Signalwege des Granulocyten-
Colony Stimulierenden Faktors (G-CSF) und seines
Rezeptors (G-CSFR)…………………………………………………16
2.5.2.5.2 G-CSF bei ischämischen Schlaganfall…………..…………...………..18
2.5.2.5.3 G-CSF bei intrazerebraler Blutung………………………..……...…….20
2.5.2.5.4 Dosierung und Zeitfenster von G-CSF…………….….…………….....21
2.5.2.5.5 Klinische Schlaganfallstudien…..……..………………………….........22
2.5.2.5.6 Bisherige klinische Anwendung………………………..............………22
2.6 Ziele der Arbeit…………………………………………………………………..23
3. Material und Methoden………………………………………………………...24
3.1 Tierexperiment……………..……………………………………………………..24
3.1.1 Versuchstiere.…………………………………………………………..........24
3.1.2 Vollblutinjektion…………………………………………………………........24
3.1.3 BrdU Enzym- und Immunhistochemie...…………………………………...26
3.1.4 Perfusion und Entnahme der Gehirne………..……………………………27
3.2 Neurologic deficit score…………………………………………………..……...27
3.3 Histologische Verfahren...……………………………………..…………….….29
3.3.1 Nissl Färbung…………..……………………………………………………..30
3.3.2 BrdU-DAB-Färbung……………………………………………………….....31
3.4 Methode zur Erfassung der Läsionsvolumetrie...…………………………….33
3.5 Methode zur Quantifizierung des Hippocampus…………………………..….33
3.6 Statistische Methoden….………………………………………………………..33
4. Ergebnisse…………………………………..…………………………………...35
4.1 Funktionelle Daten…………………………………………………………........35
4.1.1 Mortalität………………………………………………………………..……..35
4.1.2 Gewicht………………………………………………………………..………35
4.1.3 Funktionelle Testung……………………..………………………………….39
4.2 Ergebnisse der Läsionsvolumetrie ……………………………..………….…..40
4.2.1 Läsionsvolumina.……………………………………………… ….………...40
4.2.2 Hirnatrophie….…………………………………………………………..……41
4.3 Ergebnisse der Neurogenese…….…………………………………………….42
5. Diskussion………………………………………………………………..……...47
5.1 Funktionelle Daten…………………………………………………………..…...48
5.1.1 Gewichtsentwicklung…………………………………………………….…..48
5.1.2 Funktionelles Langzeitergebnis………………………………………...…..49
5.2 Volumetrie…………………………………………………………………….…..53
5.3 Neurogenese………………………………………………………………….….55
6. Literaturverzeichnis…………………………………………………………….60
7. Danksagung……………………………………………………………………..77
8. Lebenslauf………………………………………………..……………………...78
1
1. Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele
Der hämatopoetische Granulocyten-Colony Stimulierende Faktor (G-CSF) ist
ein endogener Wachstumsfaktor, der im experimentellen ischämischen
Schlaganfall Neurogenese aktiviert und Apoptose entgegenwirkt. G-CSF wird
zurzeit in klinischen Studien als Therapie bei Patienten mit möglichst akutem
ischämischem Schlaganfall untersucht. Die Langzeitwirkungen nach
intrazerebraler Blutung (ICB) sind bislang nicht ausreichend untersucht. In der
vorliegenden Arbeit wird der Einfluss intrazerebraler und intraperitonealer G-
CSF-Gabe auf funktionelle Genesung, Läsionsvolumetrie sowie Neurogenese
untersucht.
Methoden
Alle Untersuchungen wurden an n=45 männlichen Wistar-Ratten durchgeführt.
Die intrazerebrale Blutung wurde durch Injektion von 70µl autologen Blutes in
das rechte Striatum herbeigeführt. Die Tiere wurden in folgende Gruppen
randomisiert: als (0) unbehandelte Kontrolle oder für (1) einmalige lokale bzw.
(2) tägliche systemische Injektion über 5d (je Gabe 60µg/kg Körpergewicht)
oder für eine Sham-Operation (3) mit oder (4) ohne anschließender
systemischer Behandlung. Die Überlebenszeit betrug 42 Tage. Im Verlauf
wurden Gewicht sowie Neurologic deficit score gemessen. Die
Läsionsvolumetrie erfolgte an 42 Nissl-gefärbten Schnitten pro Tier, die
Quantifizierung der Neurogenese ab dem 14. postoperativen Tag an Hand
BrdU-DAB-positiver Zellen im Gyrus dentatus aus 5 Schnitten.
Ergebnisse und Beobachtungen
Die Sterblichkeitsrate während der Studie betrug 4,4%. Im ersten Teil der Arbeit
zeigten sich bei der Messung der Gewichtszunahme die größte und schnellste
Erholung bei intrazerebraler G-CSF-Behandlung sowie eine Verschlechterung
durch systemische Gabe. Im Neurologic deficit score ergab sich ein
signifikanter Vorteil der lokal G-CSF-behandelten Gruppe (Tag 7 und 14 nach
der ICB, p<0,05) wohingegen die Wirkung bei systemisch behandelten Tieren
weniger ausgeprägt war. Im zweiten Teil der Arbeit wurde bei der Messung der
Läsionsvolumina und Atrophie ein nicht signifikanter Trend zur Verbesserung
2
hin durch lokale Therapie und somit eine Bestätigung der Ergebnisse aus dem
ersten Abschnitt beobachtet. Die systemische Behandlung führte bei größerer
Hirnatrophie zur Verkleinerung der Läsionsgröße. Im letzten Abschnitt wurde
immunhistochemisch eine signifikante Abnahme der Zellzahl durch lokale und
im Gegensatz hierzu eine geringe Zunahme durch systemische Behandlung
gezeigt.
Praktische Schlussfolgerungen
G-CSF fördert die funktionelle Wiederherstellung nach experimenteller
intrazerebraler Blutung. Die lokale Therapie mit G-CSF war in dieser Studie der
systemischen überlegen. Dies ist von Bedeutung, da durch Kraniektomie sowie
interventionelle Verfahren ein Zugang zum Ort der Blutung ermöglicht wird und
daher eine lokale Applikation denkbar ist. Der für die funktionelle Genesung
verantwortliche Mechanismus sowie die Bedeutung der BrdU-positiven Zellen
sollten in weiteren Studien geklärt werden.
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1. Summary
Background and purposes
The hematopoietic Granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) is an
endogenous growth factor that activates neurogenesis and counteracts
apoptosis in experimental stroke. G-CSF is currently evaluated in patients
preferably with an ischemic stroke. To date, its long-term effects after
intracerebral hemorrhage (ICH) have not been investigated sufficiently. In the
present study the influence of intracerebral and intraperitoneal given G-CSF
was therefore examined for three major issues: functional recovery, lesion
volume and neurogenesis.
Methods
All investigations were performed on n= 45 male wistar rats. Intracerebral
bleeding was brought about by injection of 70µl autologous blood into the right
striatum. Animals were randomly divided into following groups: rats received
either (0) G-CSF (60µg/kg) or (1) vehicle intraperitoneal from the first day till the
fifth day after ICH or (2) one single 60µg/kg dose intracerebral on the day of
surgery or a sham operation (3) with or (4) without following five-day
intraperitoneal administration of G-CSF (60µg/kg).
During the course of the survival time of 42 days weight and Neurologic deficit
score were ascertained. Volumetry was based on 42 Nissl stained sections per
animal, quantification of neurogenesis after the 14th day after ICH was based on
BrdU-DAB-positive cells in the hippocampal gyrus dentatus of 5 sections.
Results and observations
The mortality rate during the study was 4,4%. In the first part of the study
intracerebral treatment led to better and faster neurological recovery based on
weight development compared to intraperitoneal treatment. The evaluation of
the Neurologic deficit score showed a significant success of the locally treated
group (day 7 and 14 after ICH, p<0,05) while effects were less pronounced in
the systemically treated animals. The second part of the study showed a trend
towards reducing both lesion and atrophy in locally treated animals.
Systemically treatment induced larger brain atrophy and reduced size of the
lesion at the same time. Immunhistochemistry detected a significant decrease
4
of the number of cells after a local treatment with G-CSF whereas a
systemically treatment led to a slight increase of cells.
Operational conclusions
G-CSF promotes functional recovery after experimental intracerebral
hemorrhage in rats. In the present study, intracerebral administration of G-CSF
was superior to intraperitoneal administration. This is of importance because of
the possibility of the application within the context of surgical or minimally
invasive intervention. Further studies need to be undertaken to clarify the
mechanism of functional recovery and the significance of BrdU-DAB-positive
cells.
5
2. Einleitung
2.1 Epidemiologie und Ätiologie der Intrazerebralen Blutung
Der Schlaganfall stellt insbesondere auf Grund des demographischen Wandels
in den Industrieländern eines der dringlichsten medizinischen Probleme unserer
Zeit dar.[214] Die Inzidenz beträgt 15 Fälle pro 100.000 Personen pro Jahr.[24,
129] Der Anteil intrazerebraler Blutungen bei Patienten mit erstmaligem
Schlaganfall beträgt 10% bis 15%. [6, 22, 25]
Bei Patienten unter 40 Jahren ist die häufigste einzelne Ursache intrazerebraler
Blutungen, vor allem in lobärer Lokalisation, die intrakranielle
Gefäßmalformation. Bei Patienten über 70 Jahren ist die häufigste Ursache die
zerebrale Amyloidangiopathie, welche ebenfalls vor allem intrazerebrale
Blutungen lobärer Lokalisation hervorruft. [109, 255] Arterielle Hypertonie ist
der Hauptrisikofaktor für intrazerebrale Blutungen.[1, 109, 116, 141, 206, 226,
236, 260]
Das klinische Bild besteht aus fokal-neurologischen Defiziten wie Hemiplegie,
Schwäche in Arm oder Bein sowie herabhängendem Mundwinkel oder
Augenlid. [217] Weitere Symptome können durch bestehende Komplikationen
hervorgerufen werden. Zu diesen zählen Hämatomausdehnung, Bildung eines
perihämorrhagischen Ödems mit gesteigertem intrakraniellen Druck,
intraventrikuläre Ausbreitung der Blutung mit Hydrocephalus, epileptische
Anfälle, venöse thrombotische Ereignisse, Hyperglykämie, gesteigerter
Blutdruck, Fieber und Infektionen.[10]
Intrazerebrale Blutungen haben eine schwerere initiale neurologische
Ausfallsymptomatik, eine höhere Mortalität und eine schlechtere
Langzeitprognose im Vergleich zum ischämischen Schlaganfall.[12, 40, 74,
179] Prädiktive Prognosefaktoren für ein schlechtes funktionelles Ergebnis und
erhöhte Mortalität sind die Glasgow Coma Scale [188, 241], das
Hämatomvolumen [99, 139], das Vorhandensein einer intraventrikulären
Blutung und deren Ausdehnung [231, 242], eine infratentorielle Lokalisation
6
[100, 231] sowie ein hohes Alter des Patienten [47, 69]. [26, 40, 100, 164, 244]
Die Mortalität im ersten Jahr beträgt 50%.[26, 164, 244] Die Hälfte der
Todesfälle tritt in den ersten beiden Tagen nach Symptombeginn ein.[100, 164]
Die meisten Todesfälle, welche nach dem ersten Monat auftreten, sind
verursacht durch sekundäre medizinische Komplikationen.[164]
Intrazerebrale Blutungen lassen sich nach ihrer Genese in primäre und
sekundäre einteilen:
„Primäre“ intrazerebrale Blutung
Arterielle Hypertonie ist für 60-70% der Fälle direkt verantwortlich und somit die
Hauptursache sowie weit verbreitetester Risikofaktor für spontane
intrazerebrale Blutungen. [27, 164, 237, 263] Hypertonie kann
Mikroaneurysmen an der Bifurkation von Arteriolen hervorrufen.[263]
Persistierender gesteigerter intraluminaler arterieller Druck schädigt die Wände
kleiner Gefäße.[65, 66, 263] Zusätzlich zu Hypertonie ist eine weitere häufige
Ursache einer primären intrazerebralen Blutung die Amyloidangiopathie. [192,
263] Beide führen zu einer Schädigungen an kleinen Arterien oder Arteriolen,
die zu deren Ruptur führen können. [2] Intrazerebrale Blutungen hypertensiver
Ursache liegen loco typico in den Basalganglien, Pons, Zerebellum oder tief-
hemisphärisch in der weißen Substanz.[164, 192]
Sekundäre intrazerebrale Blutung
Intrazerebrale Blutungen in Folge von Hirntumoren, Aneurysmen, arteriovenöse
Malformationen, kavernöse Angiome und arteriovenöse Fisteln [192, 263],
sowie Mikroaneurysmen mit fibrinoider Degeneration, Traumata,
Koagulopathien, hämorrhagischem Umbau zerebraler Infarkte, ZNS-Vaskulitis
sowie Drogenkonsum werden als sekundäre intrazerebrale Blutungen
bezeichnet. [67, 164, 192, 202, 263]
Lokalisation intrazerebraler Blutungen
Die Hälfte spontaner intrazerebraler Blutungen treten in den Basalganglien, ein
Drittel in den zerebralen Hemisphären, ein Zehntel in Zerebellum und sechs
Prozent im Hirnstamm auf. [22, 68, 164] In 40% der Fälle kommt es zur
intraventrikulären Einblutung.[164]
Die Lokalisation ist wichtig für das funktionelle Ergebnis des Patienten,
potentielle chirurgische Intervention sowie die zugrundeliegende Ursache.
7
Pontine Blutungen haben eine höhere Mortalität. Lobäre Blutungen sind im
Allgemeinen seltener hypertensiver Herkunft. [263]
Durch eine intrazerebraler Blutung wird sowohl die weiße als auch die graue
Substanz geschädigt. Rattenhirne weisen jedoch eine Knappheit an weißer
Substanz auf, sodass die Ergebnisse nur begrenzt auf den Menschen
übertragen werden können. [263]
2.2 Pathophysiologie der intrazerebralen Blutung
Hämatomausdehnung und Volumeneffekt
Ein Teil der Schädigung nach intrazerebraler Blutung ist die Folge der
organischen Disruption angrenzenden Gewebes und des Masseneffektes. Die
primäre Hirnschädigung, die während der Blutung auftritt, scheint nicht
behandelbar zu sein. Bei mehr als zwei Dritteln der Patienten kommt die
Blutung kurz nach dem Symptombeginn zum Stillstand [183], bei einem Drittel
dehnt sie sich weiter aus.[23, 28, 71, 72, 121, 122, 263] Bei 38% aller Patienten
vergrößert sich das Hämatom innerhalb von 20 Stunden[28].[263] Eine
Hämatomvergrößerung führt zu Mittelinienverlagerung und Beschleunigung
neurologischer Verschlechterung. [23, 263, 267] Mechanische Kräfte bei der
Formation des Hämatoms oder Chemischer Toxizität des Gerinnsels könnten
ursächlich für Nekrose sein.[263]
Abbildung 1 Pathophysiologische Vorgänge nach ICB [263] Die intrazerebrale
Blutung führt durch ihre raumfordernde Wirkung, Komplementaktivierung und
Intrazerebrale Blutung
Rückgang
des
Gerinnsels
Thrombin
Komplementaktivierung
Erythrozytenlyse
Raumforderung/
Ischämie
Entzündung
Hämoglobin/Eisen
Gehirnödem
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Bildung von Thrombin sowie bei Auflösung des Gerinnsels zur Entstehung
eines Gehirnödems. Die Größe des Ödems hat ebenso wie die der Blutung
Einfluss auf das funktionelle Ergebnis des Patienten.
Perihämorrhagisches Ödem
Direkt nach einer intrazerebralen Blutung und deren Gewebsschädigung auf
Grund mechanischer Effekte und Massenwirkungen kommt es zu einer zweiten
Kaskade von Pathomechanismen, hervorgerufen durch Produkte aus
Gerinnung sowie Hämatomabbau, welche zur Entwickelung eines
perihämorrhagischen Ödems führt.[230, 263] Bereits einen Tag nach der
intrazerebralen Blutung beginnt eine signifikante Vergrößerung des
perihämorrhagischen Ödems. Dieses vergrößert sich an den ersten sieben bis
elf Tagen nach der intrazerebralen Blutung kontinuierlich bis zu einer
Verdopplung des Ausgangsvolumens. Ab diesem Zeitpunkt beginnt die
kontinuierliche Abnahme des durchschnittlichen perihämorrhagischen
Ödems.[230] Die Ödemformation nach intrazerebraler Blutung steigert den
intrakraniellen Druck und kann mit erheblicher Mittellinienverlagerung
verbunden sein und in Herniationen resultieren.[200, 263, 267] Der Grad des
perihämorrhagischen Ödems ist mit einem schlechten funktionellen Ergebnis
des Patienten assoziiert.[199, 200, 263, 267] Ein in den ersten Stunden
verhältnismäßig kleines Ödem prognostiziert ein gutes funktionelles Ergebnis
des Patienten. [75, 263]
Schädigung der Blut-Hirn-Schranke
Nach der intrazerebralen Blutung kommt es zunächst zu einem vasogenen
Hirnödem. Die Blut-Hirn-Schranke ist eine organische und physiologische
Barriere für die Bewegung vieler Moleküle zwischen Blut und Hirn.[18, 263]
Nach einer intrazerebralen Blutung kommt es zur Disruption der Blut-Hirn-
Schranke, dies wirkt bei der Bildung des Hirnödems mit.[263] Intakt bleibt die
Blut-Hirn-Schranke innerhalb der ersten Stunden jedoch für große
Moleküle.[247, 263] Acht bis zwölf Stunden später steigt die Permeabilität der
Barriere um das Hämatom.[263, 265]
9
Apoptose
Eine intrazerebrale Blutung induziert apoptotische Vorgänge in angrenzenden
Gehirnarealen. [2, 23, 28, 61, 71, 72, 79, 102, 121, 122, 162, 163, 180, 183,
191, 263, 264, 267] Der programmierte Zelltod um das geschädigte Gewebe
herum ist auf mehrere Mechanismen zurückzuführen. Zu diesen gehören: der
Masseneffekt [180], die Toxizität von Hämoglobin und Hämin [140], Anstieg von
TNF-α [166, 167] sowie von Cytochrom C [61], Aktivierung von NF-κB [102,
263] und Kaspasen [162] sowie Expression und Aktivierung von Matrix-
Metalloproteinasen [189].[148] Gleiche Ergebnisse zeigten sich für den
Kaspase-3-Inhibitor benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluor-methylketone, welcher
die Farbdichte TUNEL-positiver Zellen um das Gerinnsel im Tierexperiment
reduziert und belegt, dass Apoptose eine Rolle spielt.[162, 263] Der
programmierte Zelltod kann mit einer zeitlichen Latenz von mehreren Tagen
nach intrazerebraler Blutung auftreten.[252] Auch in Untersuchungen bei
Patienten wurden apoptotische Zellen in der Zone um das Hämatom
gefunden.[193, 263]
Hirnatrophie
Nach Resorption der intrazerebralen Blutung kommt es zu einer
Hirnatrophie.[224, 263] Hirnatrophie tritt auch bei Ratten nach intrazerebraler
Blutung auf.[61, 262, 263] Neben einer Reduktion des Volumens des
ipsilateralen Striatum um 20% kommt es zu einem Anstieg der ipsilateralen
Ventrikelgröße drei Monate nach experimenteller Blutung in der Ratte. [61, 262,
263]
2.3 Diagnose
Eine schnelle Diagnosestellung ist bei der intrazerebralen Blutung auf Grund
ihrer schnellen Größenzunahme während der ersten Stunden essentiell. Die
Ausbildung eines fokal neurologischen Defizits beim aktiven Patienten, welches
sich über Minuten oder Stunden verstärkt, unterscheidet die intrazerebrale von
der subarachnoidalen Blutung und dem ischämischen Schlaganfall.
Desweiteren sind Kopfschmerzen häufiger mit einer intrazerebralen Blutung als
mit einem ischämischen Schlaganfall verbunden. Ein erhöhter Blutdruck sowie
Bewusstseinsstörungen sind unspezifisch und können sowohl Zeichen einer
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Blutung als auch einer Ischämie sein. [22, 78] Die Klinik kann für die
Diagnosestellung daher nur hinweisend sein.[22] Bei Aufnahme des Patienten
in die Klinik müssen bestehende Symptome erfasst, deren Zeitdauer sowie
mögliche Risikofaktoren wie Trauma, Alter, Hypertonie, bereits stattgehabte
ischämische Schlaganfälle, Diabetes mellitus, Rauchen, Alkoholkonsum,
Medikamente (verschreibungspflichtige und –freie), insbesondere Warfarin,
Phenprocoumon, ASS oder andere antithrombotisch wirksame Medikamente,
Drogen wie Cocain, hämatologische oder andere, die Blutgerinnung
beeinflussende Erkrankungen, zum Beispiel der Leber, erfragt werden.
Entscheidend für die Diagnosestellung sind Computer- und
Magnetresonanztomographie. Die CT ist überlegen zur Darstellung einer
assoziierten Ventrikelerweiterung, die MRT zur Darstellung zugrundeliegender
struktureller Läsionen, auch vaskulärer Malformationen, insbesondere
Kavernome sowie des Umfanges des perihämorrhagischen Ödems und
Herniationen. [22] Eine MRT kann chronische Blutungen sicherer darstellen.
[22, 124] Eine CT-Angiographie identifiziert Aneurysmata, arteriovenöse
Malformationen sowie Tumoren.[22]
2.4 Therapie
Patienten mit intrazerebraler Blutung müssen klinisch sowie apparativ
engmaschig überwacht werden, da ein hohes Risiko für frühe neurologische
Verschlechterung und kardiopulmonale Instabilität besteht.[22] Die Mortalität
nach einer intrazerebralen Blutung ist bei Patienten, die in einer spezialisierten
neurologischen Intensivstation behandelt wurden, reduziert.[54, 164, 173]
2.4.1 Konservative Therapie
Die konservative Therapie besteht aus der Einstellung des Blutdruckes auf
einen Zielwert von <160/90mmHg [22, 194], wobei der CPP bei >60mmHg
erhalten werden sollte [22, 37, 62, 197, 245] sowie der ICP-Einstellung zum
einen durch Verbesserung des venösen Rückstromes durch Anheben des
Kopfes um 30° von der Betthöhe, einer osmotischen Therapie mittels Mannitol
oder Hyperventilation zur raschen Senkung. [22, 132] Desweiteren gehören zur
Therapie der intrazerebralen Blutung die Blutzuckereinstellung, antikonvulsive
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Therapie sowie Normalisierung der Körpertemperatur. In Studien wird die
Hypothermie untersucht. [22]
2.4.2 Chirurgische Therapie
Kraniotomie (mit Hämatomevakuation)
Das Sterberisiko von im Bewusstsein nur leicht oder moderat beeinträchtigen
Patienten wird durch eine Kraniotomie verringert ohne das funktionelle Ergebnis
des Patienten zu verbessern. [22, 115] Die STICH (Surgical trial in intracerebral
hemorrhage) [170] Studie zeigte bei Patienten, die innerhalb von 72 Stunden
nach der intrazerebralen Blutung randomisiert und innerhalb von 96 Stunden
operiert wurden bei einem GCS-Wert <4 und einem Gerinnsel >2cm im
Durchmesser in Morbidität und Mortalität nach 6 Monaten einen statistisch nicht
signifikanten Benefit. Im Gegensatz hierzu profitierten Patienten mit einem
Glasgow Coma Scale Werte zwischen 5 und 8 von konservativer Therapie. Für
die meisten supratentoriellen intrazerebralen Blutungen scheint die Kraniotomie
keine hilfreiche Therapie zu sein. Lobäre Gerinnsel <1cm bei Patienten mit
einem Wert ≥9 auf der Glasgow Coma Scale sind chirurgisch gut behandelbar
und somit ist die Kraniotomie bei oberflächlicher Lokalisation mit einem Benefit
für das funktionellem Ergebnis im Gegensatz zu konservativer Behandlung
verbunden. [22, 170] Eine operative Blutungsausräumung innerhalb der ersten
12 Stunden hat die beste unterstützende Wirkung [177, 274]. [22]
2.4.3 Minimalinvasive Therapie
Vorliegende Daten zeigen, dass minimalinvasive Chirurgie eine sichere
Methode zur Behandlung von intrazerebralen Blutungen darstellt. [104, 118,
144, 160, 172, 174, 175, 213]
Minimalinvasive Therapie mit rekombinant tissue plasminogen activator rtPA
RtPA wurde in vielen Studien als sicher und effektiv was die Auflösung von
Gerinnseln angeht, befunden. [4, 63, 64, 165, 175, 198, 219, 239] Patienten der
minimally-invasive surgery plus rtPA for intracerebral hemmorrhage evacuation-
(MISTIE-) Studie [175] wurden nach stereotaktischer Positionierung mittels rtPA
durch einen Katherter behandelt. Die Patienten der zweiten Gruppe erhielten
eine konservative Therapie. Zunächst wird eine Kanüle stereotaktisch in das
Zentrum des Gerinnsels positioniert und dieses bis zum Spüren eines
Widerstandes aspiriert. Nach der Gerinnselabsaugung folgt unter
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Durchleuchtung mittels CT die rtPA-Gabe. Daraufhin wird der Katheter
zunächst verschlossen, später erfolgt hierüber die Drainierung des gelösten
Gerinnsels. Die Gabe von 0,3mg, 1mg oder 3mg rtPA wurde nach maximal 9
Behandlungen im Abstand von 8 Stunden bzw. bei Auflösung von 80% des
Gerinnsels oder einer Rezidivblutung beendet. [3, 22, 142, 175] Die geringfügig
unvollständige Entfernung des Hämatoms vermindert den Masseneffekt der
Blutung, hinterlässt jedoch ausreichend thrombotisches Material, welches als
Verschluss der Blutungsquelle dient und somit eine Rezidivblutung
verhindert.[3] Es gibt erste Hinweise darauf, dass minimalinvasive Chirurgie in
Verbindung mit rtPA-Gabe eine bessere Gerinnselauflösung erzielt als die
bisher angewendete medikamentöse Therapie. [3, 22, 142, 175] Dabei ist die
korrekte Position des Katheters im Gerinnsel eine große Rolle. [3, 142, 175] Die
Mortalität betrug an Tag 7 0%, an Tag 30 10,5%, die Rate für Rezidivblutungen
ebenso 10,5%. [3, 142] Es traten keine zerebralen Infektionen auf. Es wurden
keine systemischen Nebenwirkungen, inklusive intrakranieller Blutungen
beobachtet. [22, 246] Werden Ultraschall-aussendende Katheter verwendet und
für 24 Stunden eine Frequenz von 2MHz und eine Spannung von 0,45W
verwendet, konnte in der SLEUTH-Studie eine schnellere Gerinnselauflösung
gezeigt werden als bei MISTIE.[3, 181]
Sowohl die chirurgische als auch die minimalinvasive Therapie bieten durch
ihren Zugang zum Ort der intrazerebralen Blutung bzw. des Hämatoms die
Möglichkeit der lokalen medikamentösen Therapie. Für diese Therapie eignen
sich die neuroprotektiv und –regenerativ wirksamen Wachstumsfaktoren. Zu
diesen zählt auch G-CSF.
2.5 Experimentelle Therapieansätze
2.5.1 Experimentelle Blutungsmodelle
Etablierte Modelle zur Induktion intrazerebraler Blutungen sind Modelle
entweder mit Injektion von bakterieller Kollagenase [201] oder autologen Blutes
[32].[157]
13
2.5.1.1 Kollagenase Modell
Die enzymatische Aktivität der Kollagenase lässt die Basallamina von
Blutgefäßen einreißen und führt zu Eindringen von Blut in das umliegende, aber
auch weiter entfernte Hirngewebe.[155, 157] Ein geläufiges Modell [201] von
Rosenberg, G.A. wurde mehrfach, durch Del Bigio et al [50], De Bow et al [49]
und MacLellan et al [151] modifiziert. Die anästhesierten, in einem
Stereotaxierahmen fixierten Ratten erhalten mittels Bohrer unter aseptischen
Bedingungen ein Loch in der Kalotte 3,0mm lateral des Bregmas. Mit einer 26-
gauge Hamilton Nadel wird nun, von der Kalottenoberfläche aus gemessen
6,0mm tief, 1,0µl sterile Kochsalzlösung mit einer bestimmten Menge
bakterieller Kollagenase (Type IV-S) innerhalb von zehn Minuten in das
Striatum infundiert. Mittels variierender Kollagenase-Dosen kann die
Läsionsgröße variiert werden. [157] Um einen Rückfluss zu verhindern wird die
Nadel erst nach weiteren zehn Minuten entfernt. Das Loch wird mittels einer
kleinen Metallschraube oder Knochenwachs verschlossen und die Wunde
vernäht. [152, 155]
Das Kollagenase Modell [159] zeigt ebenso wie eine intrazerebrale Blutung
beim Menschen [218] eine Verbesserung der Neurogenese. [157] Auch der
Schlüsselfaktor der Wiederherstellung, die dendritische Plastizität, konnte nach
striataler Kollagenase-Infusion gezeigt werden.[157, 182] Um das Hämatom
kam es zur Atrophie der Dendriten, welche sich jedoch normalisieren kann.
[157, 182] Im kontralateralen Striatum wurde eine anhaltend gesteigerte Zahl an
Verzweigungen nachgewiesen. [157, 182] Auch rehabilitative Maßnahmen
steigern das dendritische Wachstum im kontralateralen Striatum und
reduzierten den Gewebsverlust. [157]
Durch die proteolytische Wirkung der injizierten Kollagenase kommt es aus
mehreren gerissenen Gefäßen zu über Stunden fortwährenden Blutungen, wie
sie nur bei einem Drittel der Patienten auftritt sowie zu einer erhöhten
Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke. [28, 155, 157, 201] Die Ursache der
intrazerebralen Blutung durch dieses Modell - die Auflösung der endothelialen
Basalmembran - unterscheidet sich von der natürlichen. Das Enzym hat
desweiteren toxische Effekte auf Parenchymzellen des Gehirns.[2, 263] Die
Matrixmetalloproteinase wird nach intrazerebraler Kollagenase-Injektion
14
heraufreguliert und kann so eine Entzündungsreaktion verstärken.[50, 136, 235,
248, 263, 264]
2.5.1.2 Injektion autologen Blutes
Wir verwendeten das das durch MacLellan et al [153, 154] modifizierte Modell
nach Bullock et al [32].[155] Die intraparenchymale Injektion autologen Blutes
[32] erfolgt für gewöhnlich in das Striatum. [155, 157] Diese häufige
angewandte und allgemein übliche Modellen für intrazerebrale Blutungen findet
normalerweise bei der Ratte Anwendung.[157] 70µl Blut entsprechen bei
langsamer Injektion einem Volumen von 42ml beim Menschen.[125, 169, 261,
264]
Das Modell imitiert eine einzelne große spontane Blutung [101] Es reproduziert
keine Blutung auf Grund eines rupturierten Gefäßes [155, 263], keine
Fortsetzung der Blutung, Nachblutung oder erneute Blutung [71, 157]. Es dient
daher der Untersuchung der Folgen der Blutung und deren Mechanismen. [263]
2.5.2 Experimentelle Therapieansätze mit Wachstumsfaktoren
Wachstumsfaktoren spielen für die Regeneration sowie Protektion neuronalen
Gewebes nach Ischämie und Blutung eine große Rolle. Bei einer Reihe von
Faktoren, wie Erythropoietin, Brain-derived neurotrophic factor sowie Insulin-like
growth factor wurden diese Effekte bereits bei Schädigung des ZNS
nachgewiesen.
2.5.2.1 Erythropoietin (EPO)
Antiapoptotische, -inflammatorische und –oxidative sowie angiogene und
neurotrophe Effekte wirken im Tiermodell neuroprotektiv sowie –regenerativ.
[138, 216] Die Behandlung mit rekombinantem humanen Erythropoietin zeigte
eine Reihe von verbesserten Zielgrößen bei ischämischem Schlaganfall [17, 21,
59, 250], Subarachnoidalblutung [30, 31, 35, 83-85, 227], intrazerebraler
Blutung [84, 138, 227, 228],Rückenmarksschädigung [36, 81, 86], Schädel-
Hirn-Trauma [88, 149] sowie neonataler Hirnschädigung, periphere
Nervenschädigung [87], Retinaschädigung [114] sowie Herzschädigung [35,
45].[13, 89, 216, 268] Bei der Ratte konnte nach ICB eine signifikante
15
Verbesserung im funktionellen Ergebnis sowie eine gesteigerte Expression
unreifer neuronaler Phänotypen und eine signifikante Verringerung des
Gewebsverlustes gezeigt werden.[216]
2.5.2.2 Darbepoetin alfa
Darbepoetin alfa ist das langwirksame Analogon von Erythropoietin mit
gesteigerter Wirkung in vivo, welches effektiv bei der Reduktion neurologischer
Schädigung, Verbesserung der Funktion sowie Erhöhung der Zahl NeuN-
positiver Neurone wirkt.[58, 89]
2.5.2.3 Brain derived neurotrophic factor (BDNF)
BDNF ist ein neurotropher Faktor, welcher auch von Mikroglia und
Makrophagen selbst nach einer intrazerebralen Blutung abgegeben wird [108]
und das Überleben und die Differenzierung der Neurone sowie die
Synaptogenese im ZNS fördern [9, 19, 205, 207].[94] Die Behandlung reduziert
das Infarktvolumen [208] und wirkt neuroprotektiv und -regenerativ [11].[94] Die
intrazerebrale Gabe ist auf Grund der hohen Dosis, welche für einen
neuroprotektiven Effekt notwendig ist, mit dem Risiko einer Übererregbarkeit
hippokampaler und entorhinaler Neurone, welche zu einem epileptischen
Krampfanfall führen kann, verbunden.[44, 94] Unter Herstellung eines
Fusionsproteins mit einer fibrinbindenden Domäne (FBD-BDNF) ist es möglich,
dass BDNF zielgerichtet am fibrinreichen Hämatom wirkt und somit
Nebenwirkungen vermieden werden können.[92, 93, 204, 232-234, 269, 273]
2.5.2.4 Insulin-like growth factor I (IGF-I)
BDNF und die Expression des BDNF-Rezeptors Trk-B werden unter anderem
durch IGF-I gesteigert.[168] Der endogene Wachstumsfaktor sorgt für das
Überleben von sensiblen und motorischen Neuronen, Gliazellen und
Endothelzellen, regt die Expression des Myelins an und hat Einfluss auf das
Neuritenwachstum, die Synaptogenese, die neuronale Erregbarkeit sowie die
Ausschüttung von Neurotransmittern. Nach ischämischem Schlaganfall bei der
Ratte kommt es zu Reduktion der Infarktgröße sowie eine neuroprotektiven,
antiinflammatorischen sowie regenerativen Wirkung. [48, 53, 60, 91, 133, 146,
147, 196, 203, 209, 240, 249]
16
2.5.2.5 Granulocyten-Colony Stimulierender Faktor (G-CSF)
2.5.2.5.1 Struktur, Exprimierung und Signalwege des Granulocyten-Colony
Stimulierenden Faktors (G-CSF) seines Rezeptors (G-CSFR)
Struktur
Der potente hämatopoetische Faktor G-CSF ist ein 19.6-kDa Glycoprotein,
bestehend aus vier antiparallelen α Helices. [33, 70, 214, 225, 256] G-CSF
gehört zur Zytokinfamilie der Wachstumsfaktoren [210, 222] und kommt in
Monozyten, Mesothelialen Zellen, Fibroblasten und Endothelialen Zellen
vor.[33, 70, 214] Der Rezeptor des Faktors hat eine zusammengesetzte
Struktur bestehend aus einer Immunglobulin-like-Domäne, einer Cytokin-
Rezeptor-homologen Domäne und drei Fibronectin-Typ-III-Domänen in der
extrazellulären Region. Eine intrazelluläre Kinase-Domäne besitzt der Rezeptor
jedoch nicht. Die zytoplasmatische Domäne besteht aus drei
Aminosäuresequenzen, welche von entscheidender Bedeutung für die
Signaltransduktion des G-CSF-Rezeptors sind.[73, 225] Der G-CSF-Rezeptor
wird von Vorläufern sowie reifen Neutrophilen Granulocyten, Monozyten,
Thrombozyten, Endothelzellen, Neurone und Gliazellen exprimiert.[210, 214]
Neuronale Exprimierung
G-CSF-Rezeptor und Ligand werden neuronal sowie durch Ischämie exprimiert.
[214] Dies legt einen autokrinen Schutzmechanismus nahe. [214] Der G-CSF-
Rezeptor wird außerdem durch adulte neurale Stammzellen exprimiert [214]
und zeigt eine breite prädominante Expression durch das Rattenhirn, mit hoher
Immunpositivität in Cortex (ausgeprägt in Schicht II und V), Hippocampus,
Subventrikulärzone (SVZ), Zerebellum (besonders Purkinjezellen sowie im
tiefgelegenen Cerebellum), in Kernen des Hirnstammes und Mitralzellen des
Bulbus olfaktorius. Ein entsprechendes Färbemuster konnte für menschliches
Hirngewebe bestätigt werden. In all diesen Regionen wird ebenfalls G-CSF
exprimiert. Im Hippocampus wurde dies für die Zone CA3, Hilus und die
Subgranuläre Zone des Gyrus dentatus gezeigt. [214]
17
Signalwege von G-CSF und seinem Rezeptor
G-CSF vermittelt, wie in Abbildung 2 [225] dargestellt, Proliferation,
Differenzierung und Überleben von hämatopoetischen Zellen hauptsächlich
über die Aktivierung der Januskinase (JAK), signal transducer and activator of
transcription (STAT), Ras/mitogen-activated protein- (MAP-) Kinase und
phosphatidylinisitol-3-Kinase (PI3K) und Proteinkinase B (Akt). [56, 107, 131,
190, 210, 220, 225, 238, 253] G-CSF führt ebenfalls zu einem
langandauernden, jedoch insgesamt moderaten Anstieg des potenten
antiapoptotischen Faktors in Neuronen Bcl-XL. [82, 214] In der Penumbra der
G-CSF-behandelten Tiere war die STAT3-Protein-Expresion signifikant erhöht.
[210]
Abbildung 2 [225] Die Abbildung zeigt den über die JAK2 vermittelten
antiapoptotischen Signalweg von G-CSF.
Die von G-CSF induzierte JAK-STAT-Signalisierung reduziert in Modellen mit
peripheren Infektionen weitere Wachstumsfaktoren der Zytokinfamilie wie TNF-
α sowie Interleukin (IL)-1β, IL-2, IL-6 und IL-8. Der Faktor erhöht IL-1β-
Rezeptor-Antagonisten.[80, 96-98, 150, 210, 229] G-CSF vermindert TNF-α-
Freisetzung und erhöht den Antikörperspiegel gegen TNF, IL-6, IL-8 und IL-
1β.[46, 80, 97, 210] Dies könnte die Zytokintoxizität, Aktivierung und Infiltration
Neutrophiler Granulocyten reduzieren. So konnte trotz des Anstieges der
18
Neutrophilen im peripheren Blut nach G-CSF-Behandlung kein Anstieg ihrer
Infiltration in der ischämischen Hemisphäre beobachtet werden.[210]
Reduzierte Zytokintoxizität dürfte die Interaktionen zwischen Neutrophilen und
dem mikrovaskulärem Endothel, also die Entzündungsreaktion, limitieren sowie
den mikrovaskulären Blutfluss in der Penumbra verbessern.[110, 210]
2.5.2.5.2 G-CSF bei ischämischem Schlaganfall
G-CSF wird durch zerebrale Ischämie in Neuronen heraufreguliert [126, 211,
214], zeigt also einen autokrinen Schutzmechanismus des geschädigten
Gehirns.[211] Der potente neuronale Wachstumsfaktor wirkt antiapoptotisch auf
Neurone, stimuliert Neurogenese, verbessert die Gefäßbildung im
ischämischem Hirngewebe, was die Restrukturierung des infarzierten Gehirns
verbessert, wirkt neuroprotektiv, antientzündlich und fördert Mobilisation von
Stammzellen aus dem Knochenmark ins periphere Blut [128, 137, 210-212,
214, 221-223, 258] Diese Effekte zeigt die Abbildung 3 [211].
Abbildung 3 [211] Die Abbildung gibt einen Überblick über die beschriebenen
Wirkungen von G-CSF.
Antiapoptotische Wirkung
Der PI3K/Akt Weg ist ein antiapoptotischer Übertragungsweg in allen Zelltypen
sowie ein entscheidender Mechanismus für die starke akute Reduzierung des
Infarktvolumens bei Neuronen. [57, 214] Die Hauptursache neuronalen
Zelltodes nach Ischämie sind Glucosemangel und Exotoxizität mit
Neurogenese
antiapoptotisch Angiogenese
Immunmodulation
Mobilisation von
Stammzellen aus
dem Knochenmark
19
anschließender Ca2+-Überlast in den Zellen ebenso wie Apoptose und
verminderte Energiereserve gegenüber dem erhöhten Bedarf.[135, 210]
Ein weiterer Stimulus der Apoptose, welchem durch G-CSF-Aktivität
entgegengewirkt wird ist Stickstoffmonoxid. NO hat hohe Relevanz bei der
Pathophysiologie des Schlaganfalles und induziert außerdem poly-ADP-
Ribosepolymerase- (PARP) und Caspase-3-Spaltung in primären Neuronen
von Nagetieren und fördert menschliche SHSY-5Y-Neuroblastomzellen, die
ebenfalls den G-CSF-Rezeptor exprimieren. [214]
Einfluss auf das funktionelle Langzeitergebnis
G-CSF verbesserte das Langzeitergebnis des Verhaltens nach kortikaler
Ischämie deutlich indem es Antworten neuraler Vorläuferzellen in vivo
stimuliert.[214] Es schützt akut und verbessert die funktionelle
Wiederherstellung. [212, 215]
Einfluss auf die Läsionsgröße
G-CSF verringert die Infarktgröße des ischämischen Schlaganfalls. [137, 211,
212, 214, 215, 221]
Stimulation neuronaler Vorläuferzellen und Neurogenese
Die Neurogenese wird durch Initiation einer kompensatorischen Antwort
neuraler Vorläuferzellen des adulten Hirns auf globale und fokale ischämische
Ereignisse heraufreguliert. [7, 38, 90, 103, 111, 112, 123, 145, 214, 222] Die
Entwicklung zu neuen Neuronen aus Vorläuferzellen wird mittels der
Zweifachfärbung DCX-NeuN erkannt.[29, 77, 178, 214] Die Koexpression von
NeuN (neuronal nuclei) in Zellen um die Läsion ist ein Zeichen nachhaltiger
neuronaler Differenzierung. [214]
Neuroprotektiver Effekt
G-CSF ist durchgängig für die intakte Blut-Hirn-Schranke und wirkt als
endogener Ligand des ZNS akuter neuronaler Degeneration entgegen,
ermöglicht Neuronen der Penumbra zu überleben und trägt zur
Langzeitplastizität nach zerebraler Ischämie bei.[214, 222] Mobilisierung von
Stammzellen aus dem Knochenmark und deren anschließendes Einwandern in
die ischämische Hirnregion wird über Sekretion von Neutrophinen und anderen
20
trophischen Faktoren bewirkt und fördert möglicherweise die Neuro- und
Angiogenese. [41, 143, 211, 222] Ein direkt protektiver Effekt wurde für
Neurone bei der Ratte nach fokaler zerebraler Ischämie, welche G-CSF-
Rezeptoren exprimieren, erkannt. [210, 211, 214]
Mobilisierung hämatopoetischer Stammzellen
G-CSF mobilisiert hämatopoetische Stammzellen des Knochenmarks in das
periphere Blut. [52, 222] Die G-CSF-stimulierten Neutrophilen Granulocyten,
welche die erste körpereigene Verteidigungslinie gegen jede Art von
Entzündung bilden, wandern nicht notwendiger Weise in das geschädigte
Gewebe ein.[184] Sie können jedoch Mikrogefäße verschließen [51, 110, 119,
161, 210, 251] und die Freisetzung proteolytischer Enzyme, Oxygen-
abgeleiteter freier Radikale, Interleukine und TNF-α triggern. Dies sind
bekannte Effekte für eine Verschlechterung der Infarktgröße und des
funktionelle Ergebnis des Patienten nach zerebraler Ischämie.[51, 110, 161,
210, 251].
2.5.2.5.3 G-CSF bei intrazerebraler Blutung
Einfluss auf das funktionelle Langzeitergebnis
Nach intrazerebraler Blutung zeigten systemisch behandelte Tiere bessere
Ergebnisse bei motorischen und Verhaltenstests. [184, 270]
Einfluss auf die Läsionsgröße
Studien mit dem Kollagenase-Modell und einer intraperitonealen G-CSF-
Behandlung zeigten nach sechs Wochen eine signifikant geringere Atrophie der
Hemisphäre, des Striatums und des Cortex gegenüber der Kontrollgruppe.
[184]
Neurogenese
Der auffällig vermehrte Nachweis des neuronalen Stammzellmarkers Nestin in
der Randzone des nekrotisierten Bereichs nach systemischer G-CSF-
Behandlung legt die Vermutung nahe, dass hier die Neurogenese angeregt
wird. [270] Da die Neurogenese bereits mehrfach als Mechanismus von
systemisch verabreichtem G-CSF suggeriert wurde [120, 214, 221, 270], eine
lokale Wirkung jedoch nie untersucht wurde, soll in der vorliegenden Arbeit
21
durch die vergleichende systemische und lokale G-CSF-Gabe eine mögliche
direkte Wirkung nachgewiesen werden. In diesem Zusammenhang soll auch ein
möglicher Zusammenhang zwischen Neurogenese und verbessertem
funktionellen Ergebnis untersucht werden.
2.5.2.5.4 Dosierung und Zeitfenster von G-CSF
G-CSF erfüllt die STAIR-Kriterien in hohem Maße: Die Wirkung ist über einen
Dosisbereich von 10-300µg/kg Körpergewicht in verschiedenen Spezies und
Schlaganfall-Modellen vorhanden. Das robusteste Ergebnis zeigten Dosen von
50µg/kg bis 60µg/kg. [211, 215] Die minimal wirksame Dosis wurde nicht
bestimmt. Die natürliche Obergrenze wurde durch den Anstieg der Zahl der
weißen Blutkörperchen (WBC) bestimmt. Würde die Dosis auf das menschliche
Körpergewicht hochgerechnet, zeigte sich eine Wirksamkeit nur oberhalb des
praktisch durchführbaren Dosisbereiches. [211] Die Plasmahalbwertszeit von
G-CSF beträgt beim Menschen ca. vier Stunden. [211]
Das Zeitfenster für eine wirksame Behandlung lässt sich möglicherweise nicht
von präklinischen Daten übertragen. Es scheint geraum zu sein: für Effekte auf
die Infarktgröße 4h [215] bzw. bei weniger schweren Schlaganfallmodellen 24h
[221, 223], für Effekte auf funktionelle Ergebnis des Patienten zwischen drei
[215] und elf Tagen [120] nach Krankheitsbeginn.[211] Obwohl einige Forscher
eine Abnahme des funktionellen neurologischen Ergebnisses des Patienten mit
zunehmender Verzögerung der Therapie beobachteten [137], berichteten
andere einen besonders guten Effekt bei Verzögerung der Behandlung zum
elften Tag [120].[211] Sowohl bei bleibender als auch vorübergehender
Ischämie bei Ratte und Maus zeigte sich eine Reduktion des Infarktvolumens.
Eine funktionelle Verbesserung wurde für Zeiträume zwischen einer und sechs
Wochen gezeigt. Es fanden sich bei Ratten und Mäusen in verschiedenen
Schlaganfall-Modellen keine Nebenwirkungen.[211, 215] Physiologisches
Monitoring konnte keine Effekte auf für die Schlaganfallbehandlung wichtige
systemische Parameter wie Blutdruck und Sauerstoffsättigung feststellen [130,
210, 214].[211] Die Behandlungseffekte konnten in mehreren unabhängigen
Laboren reproduziert werden. [211, 215]
22
2.5.2.5.5 Klinische Schlaganfallstudien
In der Phase-II Studie AXIS 2 wurde nach intravenöser Gabe von 135µg/kg G-
CSF (Filgrastim®) bei 328 Patienten nach akutem (Zeitfenster <9 Stunden)
ischämischen Schlaganfall (NIHSS 6 bis 22) keine Verbesserung in klinischem
Ergebnis nach 90 Tagen oder Bildgebung nach 30 Tagen beobachtet. [195]
Bekannte unerwünschte Ereignisse von G-CSF sind Leukozytosen, Knochen-
und Kopfschmerzen sowie gastrointestinale Symptome. Die Phase IIa-Studie
AXIS 1 zeigte bei Patienten mit einem NIHSS zwischen 4 und 22 eine mit der
Placebo-Gruppe vergleichbare Zahl thrombembolischer und anderer ernster
Ereignisse. [212] Es scheint, dass G-CSF-induzierte Leukozytose nicht
schädigend, eine Erhöhung der zellulären Immunkompetenz für
Schlaganfallpatienten sogar förderlich ist.[55, 212] G-CSF könnte den
systemischen Entzündungszustand nach einem Schlaganfall positiv
verändern.[212]
Eine randomisierte kontrollierte Studie untersuchte die Wirkung fünftägiger
subkutaner G-CSF-Behandlung mit 15 µg/kg G-CSF (Filgrastim®) bei Patienten
mit Infarkt der A. cerebri media (detektiert innerhalb von 7 Tagen, NIHSS 9 bis
20). Die signifikante (p<0,05) Verbesserung von NIHSS-, EMS-, ESS- und BI-
score nach zwölf Monaten wurde mittels FDG-PET Bildgebungsstudien
bestätigt. Unter Therapie innerhalb der ersten 24 Stunden wurde die größte
klinische Verbesserung beobachtet. Von den sieben, mit G-CSF behandelten
Patienten berichteten drei bis zum Ende der Therapie über Kopfschmerz,
Knochenschmerz und vorübergehende Einschränkung der Leberfunktion. G-
CSF-Therapie führt weder zu Verschlimmerung von Entzündung oder Ischämie
noch zu dauerhafter oder klinisch signifikanter Veränderung in Blut- oder
Urinwerten.[222]
2.5.2.5.6 Bisherige klinische Anwendung von G-CSF
Bereits 1991 wurde r-met-HuG-CSF (Filgrastim®), ein gentechnisch
verändertes Medikament, in den USA für Patienten mit nonmyeloiden malignen
Tumoren, welche myelosuppressive Chemotherapie erhalten, zugelassen. Die
Indikation ist die Senkung der Inzidenz von Infektionen, welche sich auf
Grundlage febriler Neutropenie entstanden ist.
Ein weiteres klinisches Anwendungsgebiet ist die Förderung hämatopoetischer
Wiederherstellung nach Knochenmarktransplantation. Es dient hier der
23
Mobilisierung von Vorläuferzellen im peripheren Blut gesunder Spender und
kann zur Behandlung kongenitaler Neutropenie eingesetzt werden.[16, 34, 127,
225, 257]
Mit dieser Erfahrung konnte die Sicherheit des Medikamentes zusätzlich beim
Menschen erwiesen werden.[225]
2.6 Ziele der Arbeit
In der vorliegenden Arbeit soll untersucht werden, ob eine Bestätigung des
bereits beim ischämischen Schlaganfall beschriebenen neuroprotektiven Effekts
der G-CSF-Behandlung in einem bisher nicht untersuchten Tiermodell für die
intrazerebrale Blutung möglich ist. Zusätzlich zur der systemischen
Behandlung, welche intraperitoneal erfolgt, soll auch die lokale, also
intrazerebrale Behandlung auf ihre direkte Wirkung hin untersucht werden. Da
bei Patienten mit intrazerebraler Blutung eine chirurgische bzw. minimalinvasive
Therapie [175] zur Hämatomevakuation bereits untersucht wird, wäre eine
Kombination der Therapie mit Gabe von neuroprotektive oder –regenerativen
Substanzen, zu denen auch G-CSF zählt, denkbar. Desweiteren soll gezeigt
werden, ob die bereits mehrfach nachgewiesene Verbesserung des
funktionellen Langzeitergebnisses in Zusammenhang mit histologischen
Veränderungen wie geringerer Atrophie, geringerer Läsionsgröße oder
Neurogenese im Gyrus dentatus des Hippocampus steht. Nach autologer
Blutinjektion in das Striatum der Ratten wurde die funktionelle Genesung mittels
Neurologic deficit score und ein mögliches histologisches Korrelat mittels Nissl-
Färbung zur Läsionsvolumetrie sowie mittels BrdU-Färbung zur Zählung neu
geborener Zellen ausgewertet.
24
3. Material und Methode
3.1 Tierexperiment
Vor Beginn der Versuchsdurchführung lag die behördliche Genehmigung des
Tierversuchsvorhabens (Antrag Nr. 54-2532.1-09/08) vor.
3.1.1 Versuchstiere
Die Versuche wurden bei n=43 männlichen, 10 Wochen alten Wistar-Ratten
durchgeführt. Dies ist die kleinstmögliche Tierart, welche eine dem Menschen
ähnlichen zerebral-kortikaler Gefäßfunktion aufweist und somit ähnliche
Mechanismen zu erwarten sind, an der die Versuche durchführbar sind. Die
Mehrzahl der publizierten Arbeiten zur experimentellen ICB ist am Versuchstier
der Ratte publiziert. Die Tiere mit einem Ausgangsgewicht von 321g bis 397g
wurden in einem mit entstaubtem Holzgranulat ausgelegten Typ-IVC-Käfig
(Polysulfon-Käfig, Firma Techniplast Deutschland GmbH, Hohenpeißenberg)
gehalten. Ein natürlicher Tag-Nacht-Rhythmus wurde durch einen 12-stündigen
Hell-Dunkel-Wechsel gewährleistet. Die Raumtemperatur betrug stets zwischen
20°C und 24°C. Die Tiere wurden mit frei zugänglichem Wasser sowie
Alleinfutter für Ratten- und Mäuse-Haltung für Versuchstiere (ssniff R/M-H,
V1534-000) der Größe 10mm und der Firma ssniff Spezialdiäten GmbH, D-
59494 Soest, versorgt. Dieses beinhaltet 19,00% Rohprotein, 3,30% Rohfett,
4,90% Rohfaser, 6,40% Rohasche, 1,00% Calcium, 0,70% Phosphor, 0,24%
Natrium sowie die Zusatzstoffe Vitamin A (15000 IE/kg), Vitamin D3 (1000
IE/kg), Vitamin E (100mg/kg) und Kupfer, Kupfer-(II)-Sulfat Pentahydrat
(5mg/kg).
3.1.2 Vollblutinjektion
Die 45 männlichen Wistar Ratten wurden in 5 Behandlungsgruppen
randomisiert:
Gruppe 0: Kontrolle
N=11 Tieren wurde mit einer Nadel (26G) in 6,0mm Tiefe 70µl autologes Blut
aus einer Schwanzvene intrazerebral in das Striatum injiziert. Die Dauer der
25
Narkose betrug zwischen 40 und 65 Minuten. An den darauf folgenden Tagen
eins bis fünf erhielten die Versuchstiere 1ml NaCl (0,9%) intraperitoneal.
Gruppe 1: G-CSF intraperitoneal
N=12 Tiere erhielten ebenfalls eine 70µl große Blutung. Die Tiere waren
zwischen 45 und 57 Minuten narkotisiert. Bei fehlender Datenlage erhielten die
Tiere in Anlehnung an die intravenöse Gabe [210] an den darauf folgenden eins
bis fünf Tagen 60µg/kg/d G-CSF gelöst in 5ml 0,9%igem NaCl über 90 Minuten
intraperitoneal.
Gruppe 2: G-CSF intrazerebral
N=11 Tiere erhielten 30 Minuten nach der Blut-Injektion einmalig in Anlehnung
an die intravenöse Gabe [210] intrazerebral 60µg/kg G-CSF über 90 Minuten.
Die Tiere waren zwischen 35 und 45 Minuten narkotisiert.
Gruppe 3 und 4: Sham
N=11 Tiere erhielten ausschließlich ein Bohrloch und einen Einstich ohne
Injektion. Die Dauer der Narkose betrug 45 Minuten. Fünf Tiere erhielten
zusätzlich an den fünf darauf folgenden Tagen G-CSF intraperitoneal.
Alle Tiere wurden mit Forene® 100% (Isofluran, Abbott GmbH & Co. KG,
Wiesbaden) in der Gaskammer mit Narkosegerät (Sigma delta Vaporizer,
Intermed Penlon, Abingdon, England) mit einer Laufrate von 4, einer
Sauerstofflaufrate von 3 und Luftlaufrate von 7 mittels Flowmeter (UNO,
Zevemaar, Niederlande) voll narkotisiert. Nach Erlöschen der Schmerzreaktion
wurde der Stereotaxierahmen (TSE Systems, Bad Homburg) angepasst und die
Isofluranlaufrate auf 2 – 3 reduzieren. Während der OP wurde die rektale
Temperatur überwacht und durch eine Wärmeplatte (Temperatur-Kontrollmodul
TKM-0902 der Firma Föhr Medical Instruments GmbH, Seeheim-Ober-
Beerbach) bei 37°C mittels elektrischen Temperaturreglers der Rektalsonde für
die Dauer des Eingriffes konstant gehalten. Der Kopf wird fest eingespannt und
nach Rasur und Desinfektion mit Betaseptic (Mundipharma GmbH, 65549
Limburg (Lahn)), der Operationsbereich mit dem Lokalanästhetikum Xylokain
1% (Astrazeneca GmbH, 22876 Wedel) betäubt. Die Haut wurde eröffnet und
die Schädelkalotte freipräpariert. Sie erhielten mittels Handbohrer eine im
Durchmesser 1mm betragende Bohrlochtrepanation 3,5mm rechts des
26
Bregmas. Läsion und Blutung wurden durch Injektion autologen Blutes mittels
Hamilton Spritze (Hamilton Bonaduz AG, Via Crusch 8, CH-7402 Bonaduz, GR,
Switzerland) erzielt. Die Kanüle wurde mit Schliff nach medial, von der
Kalottenoberfläche aus gemessen, 6,0mm tief eingeführt, sodass die Blutung im
Striatum, jedoch ohne Ventrikeleinbruch positioniert wird. Die Applikation des
Blutes erfolgt innerhalb von 10min.
10min nach Applikation des Blutes wird die bis dahin in situ belassene Kanüle
schonend entfernt, der Kalottendefekt mittels Knochenwachs (Johnson &
Johnson MEDICAL GmbH, Norderstedt) verschlossen, die Wundränder mit dem
Lokalanästhetikum Xylokain 1% (Astrazeneca GmbH, Wedel) infiltriert und die
Hautwunde durch Klammern (Reflex Wound Clips) mit dem Klammergerät (Fine
Science Tools, Heidelberg) verschlossen.
Nach Entfernung der Rektalsonde wurden die Tiere in ihren Käfig zurückgelegt
und erwachten unter Beobachtung. Anschließend wurden den Tieren Wasser
und Futter im Käfig zur Verfügung gestellt.
3.1.3. BrdU Enzym- und Immunhistochemie
Herstellung von BrdU
Für die Fertigung von BrdU werden 2mg BrdU (Sigma, Gelenau, BRD, Cat.-Nr.
D5002) und 1ml 0,9% NaCl mit einem Magnetrührer gemischt sowie für 30
Minuten bei 37°C auf einem Schüttler fertiggestellt.
Verabreichung von BrdU
An den Tagen 14 bis 18 wurde den Tieren 50mg/kg/d BRDU (Sigma, Gelenau,
BRD, Cat.-Nr. D5002) intraperitoneal verabreicht. Hierzu wird die BrdU-Lösung
in eine Spritze aufgezogen und die Region um die Einstichstelle am Bauch des
Tieres desinfiziert. Nach einstechen der Spritze wird zur Kontrolle eine
Aspiration durchgeführt und anschließend das BrdU injiziert. Dieses
Thyminanalogon dient der Darstellung von S-Phase-Zellen [266] zur Bewertung
deren Langzeitüberlebens und Elimination. [259] Da es für die intrazerebrale
Blutung bisher keine Untersuchungen zum Zeitpunkt der stärksten
Neurogenese vorliegen, wählten wir, nachdem bereits im Kurzzeitversuch die
für Ischämie [214] untersuchten Tage eins bis fünf untersucht wurden, die Tage
14 bis 18 nach dem Ereignis.
27
3.1.4. Perfusion und Entnahme der Gehirne
Vorbereitung
Herstellung von Paraformaldehyd (1000ml, 4%):
In 500ml 150°C-200°C heißem Wasser werden 40g PFA (Sigma-Aldrich
Chemie GmbH, Steinheim) aufgelöst. Nach Zugabe von 1ml 10M Natronlauge
(NaOH) (Merck, Darmstadt) wird die Lösung steril filtriert und mit 500ml 0,2M
Phosphatpuffer auf 1l aufgefüllt. Die 4%ige Flüssigkeit wird bei 4°C gelagert
und kann bis zu 1 Monat verwendet werden.
Herstellung von Sucrose:
Zu 150g Sucrose (Firma Merck, Darmstadt) werden 500ml 0,1M PO4
(Phosphatpuffer) hinzugegeben.
42 Tage nach experimenteller Hirnblutung wurden die Tiere mit 100mg/kg Kg
Esketaminhydrochlorid(Ketanest®, Pfizer Deutschland GmbH, 10785 Berlin)
und 4mg/kg KG 2%igem Xylazin (Rompun®, Bayer AG, 51368 Leverkusen)
intraperitoneal prämediziert und unmittelbar vor der Perfusion mit 1ml
Narkoren® (16g Pentobarbital-Natrium/100ml, Firma Merial, Halbermoos)
intraperitoneal tief narkotisiert. Nach Erlöschen der Schutzreflexe erfolgte die
transkardiale Perfusion. Durch den eröffneten Herzapex wird die
Perfusionsspritze in den linksventrikulären Ausflusstrakt unter Sicht eingeführt
und der große Kreislauf zunächst mit isotoner Kochsalzlösung und
anschließend mit PFA 4% perfundiert.
Nach Präparation der Schädelhöhlen wurden die Gehirne entnommen und für
24 Stunden in 5ml Paraformaldehyd/Phosphatpuffer (4%) fixiert und bis zur
weiteren Verarbeitung, jedoch mindestens 48 Stunden, in 30%
Sucrose/Phosphatpuffer-Lösung bei 4°C gelagert. Diese wurde hergestellt aus
500ml 0,1M Phosphatpuffer sowie 150g Sucrose (Merck, Darmstadt, BRD).
3.2 Methode zur Messung der funktionellen Erholung der Tiere: Neurologic
Deficit Score
Zur Beurteilung der Verbesserung des funktionellen Status der Tiere wurde der
Neurologic deficit score an den Tagen 1, 7, 14, 28, 42 nach der Operation, wie
im folgenden aufgeführt, erhoben. Bereits 2006 zeigten MacLellan et al. den
Vorteil der Anwendung einer Reihe von Tests, welche nicht nur die subkortikale
28
Schädigung zeigt, sondern auch mit deren Ausmaß bzw. Rückgang durch die
neuroprotektive Behandlung korreliert. [152]
Neurologic deficit scale (NDS) [152, 156, 186]
1. Spontanes im Kreis laufen
Die Ratte befindet sich für 5 Minuten in einer kleinen Box.
Grad 0: kein im Kreis laufen
Grad 1: wenig im Kreis laufen; Richtung = zur betroffenen Seite,
am meisten in den ersten paar Minuten
Grad 2: meist ipsilaterales im Kreis laufen, wenig Bewegung in
kontralaterale Richtung, größer werdende Kreise
Grad 3: kontinuierlich zur betroffenen Seite vor allem eng im Kreis laufen,
nur wenig Bewegung zur kontralateralen Seite
2. Kontralaterales Rückziehen der Hintergliedmaßen
Die Rate befindet sich auf einem Tisch. Die hinteren Gliedmaßen werden
behutsam 1 - 2cm nach außen bewegt, es folgt:
Grad 0 promptes Zurücksetzen
Grad 1 Zurücksetzen innerhalb 1 Minute
Grad 2 Zurücksetzen nach über 1 aber unter 2 Minuten
Grad 3 Zurücksetzen nach über 2 Minuten oder gar nicht
3. Bilaterales Greifen der Vorderpfoten
Die Ratte wird mit ausgestreckten Armen an der angehobenen Stange gehalten
(2mm dick, 30cm oberhalb des Tisches)
Grad 0 greift vollständig mit beiden Pfoten (mit allen Fingern)
Grad 1 greift normal mit ipsilateraler Pfote, nutzt einige Finger der
kontralateralen Pfote
Grad 2 greift normal mit ipsilateraler Pfote, nutzt kontralaterales
Handgelenk oder Arm
Grad 3 kein Greifen mit den Vorderpfoten möglich
29
4. Balkenlauf
die Ratte muss Zunächst in dieser Übung trainiert werden.
Grad 0 problemloses Überqueren ohne oder mit wenigen Ausrutschern
Grad 1 Überqueren möglich, weniger als 50% der Schritte rutschen ab
Grad 2 Überqueren möglich, mehr als 50% der Schritte rutschen ab oder
kein Überqueren oder Herunterfallen nach mehr als 10s
Grad 3 Herunterfallen nach maximal 10s
5. Beugung der kontralateralen vorderen Extremität
Grad 0 beide vorderen Extremitäten werden beim Anheben gerade
ausgestreckt (als ob nach dem Tisch gegriffen wird)
Grad 1 Schulteradduktion der kontralateralen vorderen Extremität
Grad 2 Schulteradduktion mit Flexion der Vorderpfote
3.3 Histologische Verfahren
Vorbereitung:
Herstellung von Phosphatpuffer (1000ml, 0,2M, pH 7,4)
In destilliertes Wasser werden 46,02mM NaH2PO4 * H2O sowie 154,27mM
Na2HPO4 * 7H2O mit Hilfe eines Magnetrührers gelöst und die Lösung mittels
5M NaOH auf einen pH von 7,4 eingestellt. Der Phosphatpuffer kann in einer
lichtdurchlässigen Flasche für 2 Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden,
Die verwendeten Chemikalien wurden von der Firma Merck, Darmstadt, BRD,
bezogen.
Herstellung Cryoprotectsolution (CPS, 1000ml)
Zu 250ml 85%igem Glycerol werden 250ml Ethylene Glycol (HOCH2CH2OH)
sowie 500ml 0,1M Phosphatpuffer hinzu gegeben.
Anfertigen der Schnitte
Die Hirne wurden aus der Sucrose entnommen, Zerebellum und Bulbi entfernt
und das Hirn vor dem auffrieren in Phosphatpuffer gespült.
Die auf dem durch Trockeneis gekühlten Objekttisch des Schlittenmikrotoms
Leica SM 2010 R (Leica Microsystems GmbH, Ernst-Leitz-Straße 17-37, D -
30
35578 Wetzlar, Deutschland) mittels Tissue-Tek® O.C.TTM Compund (Sakura
Finetek Germany GmbH, Saufen, BRD) aufgefrorenen Gehirne. Es wurden
Koronarschnitte mit einer Dicke von 40µm angefertigt. Auf das Schneiden der
Bulbi und des Zerebellums wurde verzichtet. Die Schnitte wurden bis zum
Aufbringen auf die Objektträger bzw. Färben in mit 1,8ml CPS gefüllten 2ml
Eppendorf-Cups (Eppendorf AG, Hamburg, BRD) bei 4°C aufbewahrt.
3.3.1 Nissl-Färbung
Vorbereitung:
Herstellung von Trizma Base Solution 10x TBS (1000ml, pH 7,4):
In 800ml zweifach destilliertes Wasser werden mittels Magnetrührer 80g NaCl
sowie 2g KCl (beides Firma Merck) und 30g TrisBase (Firma Sigma).
Anschließend wird der pH der Lösung mittels tropfenweiser Zugabe 10M HCl
bei 7,4 eingestellt und anschließend mit destilliertem H2O auf 1l aufgefüllt. TBS
kann anschließend in einer lichtdurchlässigen Flasche bei Raumtemperatur
Die Nissl-Färbung wurde zur Bestimmung von Läsions- und Atrophiegröße
sowie zur Ausmessung der Hemisphären genutzt.
Es wurden jeweils 40µm dicke Schnitte im Abstand von 200µm [152, 254]
einzeln aus dem TBS-Bad mit 20µl TritonX (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim)
auf Objektträger (Name, Firma) aufgezogen und mindestens 5 Stunden auf
einer Wärmeplatte getrocknet. Danach wurden sie bis zum Färben in
Objektträgerkästen luftdicht bei -20°C aufbewahrt. Das verwendete Thionin
bindet an basophile Verbindungen (RNA, DANN), Nucleoli und Ribosomen und
stellt somit die Zellkörper, jedoch nicht Zellfortsätze der Nervenzellen dar.
Durchführung der Färbung:
Die Objektträger mit den getrockneten Schnitten werden 5 min in destilliertem
Wasser belassen. Darauf folgt die Inkubation mit Thionin für 2min30sek,
woraufhin die Objektträger je 3 mal in 2 Behältern in destilliertes Wasser
getaucht und anschließend mittels einer aufsteigenden Alkoholreihe (je 2min in
50% und 70%Ethanol (hergestellt aus 96% V/V Ethanol vergällt in
Ethylmethylketon), 1min30 in 96% sowie1min30 in100% Ethanol (Firma Merck,
Darmstadt, Cat.-Nr.: 1.00983.2500) dehydriert. Nach 20 Eintauchvorgänge in
31
Neo-Clear (Firma Merck) wurden die Schnitte unter Deckgläsern mittels Neo-
Mount (Firma Merck) luftdicht verschlossen.
Zusammensetzung des Thionins (500ml)
Zu 18ml 1M NaOH werden 100ml 1M Essigsäure (CH3COOH) (6ml acetic acid
per 100ml H20) sowie mit H20 auf 500ml aufgefüllt und vermischt. Die
Flüssigkeit wird erhitzt bis das Glasgefäß beschlägt. Zu diesem Zeitpunkt
werden 1,25g Thionin hinzugegeben und das Färbemittel nun bei 100°C für 45
min fertiggestellt, Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird es durch einen
Papierfilter hindurch in eine lichtgeschützte Flasche gefüllt, in der es drei
Monate verwendbar bleibt.
3.3.2 5-Bromo-2'-deoxyuridine-5'-monophosphate - Diaminobenzidin - Färbung
(BrdU-DAB)
Vorbereitung:
Zur Herstellung des 0,1M Boratpuffers (pH 8,5) wird zu 450ml 110,69M
Borsäure (Firma Merck, Darmstadt) hinzugegeben. Zur Einstellung des pH-
Wertes wird 5M NaOH (Firma Merck, Darmstadt) verwendet.
Zur Herstellung der Blockierungslösung werden zu 30µl 3% donkey serum
(PAN-Biotech, Aidenbach) 10µl 0,1% Triton-X sowie 1ml 10x TBS
hinzugegeben.
Zur Herstellung der Avidin-Biotin-Peroxidase werden der Vektor, 10µl A/ml TBS,
10µl B/ml TBS gemischt und 30 Minuten im Dunkel gelagert.
Zur Herstellung des Diaminobenzidins werden zu 10ml destilliertem Wasser
jeweils 4 Tropfen DAB, H2O2, TBS sowie NiCl2 gegeben.
Färbung
Alle Zellen, welche sich im Zeitraum der Anwesenheit von BrdU im zellulären
Thymidin-Pool nach der ersten BrdU-Injektion in der Zellteilung befanden sowie
deren Tochterzellen wurden angefärbt.[42]
32
Jeder 10. Schnitt (Abstand 400µm) wurde free-floating gefärbt. Nach
dreimaligem, je fünfminütigem Waschen in TBS wurden die Schnitte in
0,6%igem H2O2 für 30 Minuten inkubiert um die endogenen Peroxidasen zu
blockieren. Nach erneutem dreimaligem fünfminütigem Waschen wurden die
Schnitte bei 37°C im Schüttelwasserbad (SW 22, Julabo Labortechnik GmbH,
Seelbach, BRD) in 2M HCl für 30 Minuten inkubiert. Weiterhin wurden die
Schnitte in 0,1M Boratpuffer (pH 8,5) für 10 Minuten inkubiert. Nach einem
weiteren viermaligem Waschvorgang folgt eine einstündige Inkubation mit
Blocklösung und eine mehrstündige (über Nacht) gekühlte (4°C) Inkubation mit
in Blocklösung angesetztem primärem Antikörper (Rat-anti-BrdU-Antikörper,
Firma AbD Serotec, Düsseldorf) in einer Verdünnung von 1:2000. Nach
erneutem Waschen folgt die einstündige Inkubation mit dem
Sekundärantikörper (Donkey-anti-rat-biotin, Dianova, Hamburg). Nach
erneutem Waschen folgt die Inkubation mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase für
eine Stunde sowie, nach erneutem Waschen in TBS die Entwicklung in
Diaminobenzidin (DAB) (Linaris, Dossenheim, BRD) bis eine adäquate
Braunfärbung erfolgt war. Abschließend viermaliges Waschen in destilliertem
Wasser und anschließende Aufbewahrung in TBS bis zum Aufbringen auf
Superfrost-Objektträger (Firma, Art). Die Schnitte wurden auf einer Wärmeplatte
(Firma, Art) über Nacht oder mindestens 4 Stunden getrocknet, anschließend in
Neo-Clear eingetaucht und mittels Neo-Mount luftdicht unter Deckgläschen
verschlossen.
Alle Chemikalien wurden auf der Waage Kern EMB500-1 (Kern und Sohn
GmbH, Balingen, BRD) abgewogen.
3.4 Methode zur Erfassung der Läsionsvolumetrie
Die Schnitte wurden in 2,5facher Vergrößerung mit dem Mikroskop Axio Imager
M2 (Carl Zeiss, Jena, BRD) und dem Programm Stereo Investigator (Version 9,
mbf Bioscience, Micro bright field, inc., Williston, USA) wie in Abbildung 5
dargestellt, umfahren und die Fläche gemessen.
33
Abbildung 5 [117] zeigt die Methode zur Erfassung der volumetrischen Daten.
Mittels des Programms Stereo Investigator wurde zunächst durch einzelnes
Umranden der beiden Hemisphären deren Fläche berechnet. Daraufhin erfolgte
die Ausmessung der Ventrikel sowie der Läsion.
Die Volumenberechnung des intakten Parenchyms einer Hemisphäre erfolgten
aus: (durchschnittlicher Fläche einer Hemisphäre auf n Schnitten –
Läsionsfläche – Ventrikelfläche) x Intervall zwischen den Schnitten x Anzahl der
Schnitte. [152, 153, 155]
Bei jedem Tier wurden dazu, beginnend bei erstem sichtbaren Lumen der
Seitenventrikel 42 Schnitte mit einer Dicke von 40µ und einem Abstand von je
200µm einbezogen.
3.5 Methode zur Quantifizierung Hippocampus
Unter dem Olympus BX51 Mikroskop (Olympus Deutschland GmbH, Hamburg,
BRD) wurde in 10facher Vergrößerung die BrdU-gefärbten Zellen beider Gyri
dentatus quantifiziert. Es wurden die gefärbten Zellen aus je 5 Schnitten mit
einer Dicke von 40µm und einem Abstand von 400µm gezählt. Es wurden nur
Zellen der granulären Zellschicht, definiert an Hand von “The rat brain in
stereotaxic coordinates“ [185], gezählt.
3.6 Statistische Methoden
Die statistische Analyse wurde mittels SPSS sowie Microsoft Office Excel 2007
durchgeführt.
2mm
34
Die Gewichtsentwicklung wurde mittels Mehrfachvergleich Tamhane
ausgewertet. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angenommen. Mediane
und IQR wurden mittels Microsoft Office Excel errechnet. Die Werte wurden als
Mediane mit Interquartilsabstände (IQR) abgegeben.
Die statistische Auswertung der Volumetrie erfolgte wie durch MacLellan
beschrieben.[152, 153, 155]
Die Normalverteilung der Läsionsgröße wurde mittels Kolmogorov-Smirnov,
Shapiro-Wilk, Q-Q-Diagrammen sowie Normalverteilungsplots überprüft. 0,200
ist bei Kolmogorov-Smirnov die Untergrenze der echten Signifikanz. Weiterhin
ergab die explorative Datenanalyse eine Gültigkeit bei 100% der Fälle. Die
Werte wurden als Mediane mit Interquartilsabstände (IQR) abgegeben.
Die deskriptive Statistik des Volumens der Hirnatrophie erfolgte mittels
einfachem ANOVA. Mittels Post-Hoc-Tests (Tamhane Mehrfachvergleiche
wurde die Signifikanz untersucht. Die explorative Datenanalyse ergab eine
Gültigkeit von 100% der Werte. Die Werte wurden als Mittelwerte mit
Standardabweichung angegeben.
Die deskriptive Statistik der Volumina der kranken Hemisphäre wurde mittels
einfachem ANOVA durchgeführt. Es wurden Tamhane Mehrfachvergleiche
(Post-Hoc-Tests) - P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angenommen - und
die explorative Datenanalyse angefertigt. 100% der Fälle waren gültig. Die
Werte wurden als Mittelwerte mit Standardabweichung angegeben.
Der einfache ANOVA wurde zur Messung der statistischen Signifikanz der
Differenz der Neurogenese verwendet. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant
angenommen. Die statistische Analyse wurde mittels SPSS durchgeführt. Es
wurden Tamhane Mehrfachvergleiche (Post-Hoc-Tests) und die explorative
Datenanalyse angefertigt. 100% der Fälle waren gültig. Die Werte wurden als
Mittelwerte mit Standardabweichung angegeben.
35
4. Ergebnisse
4.1 Funktionelle Daten
4.1.1 Mortalität
Die Mortalität betrug postoperativ kumuliert 4,44% (2 Tiere). Dabei entfielen auf
Gruppe 2 mit einem verstorbenen Tier 2,33%. Desweiteren verstarb ein Tier der
Sham-Gruppe. Beide Tiere verstarben intraoperativ wahrscheinlich durch
zentrales Kreislaufversagen. Im weiteren Verlauf verstarb kein weiteres Tier.
Die Mortalität innerhalb der 42 Tage betrug somit 0%.
4.1.2 Gewichtentwicklung
Das durchschnittliche Ausgangsgewicht aller Gruppen beträgt 351g (IQR 16).
Wiedererlangung des Ausgangsgewichtes
Die Tiere der Kontrollgruppe wiesen bereits am ersten postoperativen Tag ihr
Ausgangsgewicht von 346g (Medianwert, IQR 16g) im Durchschnitt bereits
zwischen erstem (Median 349g, IQR 19,5) und zweitem (Median 353g, IQR 20)
postoperativen Tag wieder auf. Zwei Tiere zeigten keinen Gewichtsverlust. Am
dritten postoperativen Tag zeigte sich jedoch eine (erneute) Gewichtsabnahme.
Die intraperitoneal mit G-CSF behandelten Tiere, welche eine Blutung erhielten,
benötigten im Schnitt zwischen vier (Median 352g, IQR 30g) und 14 Tagen
(Median 393g, IQR 20,5g) um ihr Gewicht von zu Beginn 355,5g (IQR 27,75g)
wieder zu stabilisieren.
Die intrazerebral behandelten Tiere mit Blutung benötigten im Durchschnitt zwei
Tage (Median 364,5g, IQR 8g) um ihr Ausgangsgewicht von 356g (IQR 11g)
wieder zu erlangen. Zwei Tiere verloren kein Gewicht.
Die Tiere, welche einer Sham-Operation jedoch keiner weiteren Behandlung
unterzogen wurden, wogen zu Beginn 348g (IQR 5g). Alle fünf Tiere behielten
oder übertrafen dieses Gewicht am ersten postoperativen Tag (Median 350g,
IQR 2g), zeigte jedoch am dritten und fünften postoperativen Tag eine
Gewichtsabnahme.
Die zweite Sham-Gruppe, welche mit intraperitoneal verabreichtem G-CSF
behandelt wurde, zeigte am ersten postoperativen Tag eine Gewichtszunahme
von ihrem Ausgangsgewicht von 359g (IQR 10g) um mindestens 5g (Median
36
365g, IQR 11g). Auch diese Gruppe entwickelte jedoch ebenfalls am zweiten
und dritten sowie am fünften Tag eine Gewichtsabnahme.
Gruppe 2 zeigt die schnellste und stärkste Gewichtszunahme
Im Verlauf kam es zur Herausbildung eines signifikanten (p<0,05)
Unterschiedes in der Gewichtsentwicklung mit der schnellsten
Gewichtszunahme bei den Tieren, welche eine Blutung erhielten und
anschließend mit intrazerebral verabreichtem G-CSF behandelt wurden.
Von den Tieren, denen autologes Blut injiziert wurde, zeigten die intrazerebral
behandelten Tiere bereits am zweiten postoperativen Tag einen nicht signifikant
höheren Median (364,5g, IQR 8g) als die bessere (die mit G-CSF behandelte)
von beiden Sham-Gruppen (362g, IQR 7g) bei im Median 3g geringerem
Ausgangsgewicht.: Ab dem ersten postoperativen Tag nahmen die G-CSF i.c.
behandelten Tiere bis zum 14. Tag täglich durchschnittlich 2,28% ihres
Ausgangsgewichtes zu. Diese Gruppe zeigte damit die früheste und stärkste
Gewichtszunahme bis Tag 14. Zu diesem Zeitpunkt war der
Gewichtsunterschied zu den anderen Gruppen noch nicht signifikant. Die Tiere
wogen 427g (IQR 11,5g).
Die Gruppe der systemisch behandelten Tiere zeigte eine Stagnation des
medianen Gewichtes bis mindestens Tag fünf (352g, IQR 40,75g) unterhalb des
Ausgangsgewichtes. Ausgehend davon, dass die Gewichtszunahme an Tag
fünf begann (die Tiere wurde zwischen Tag fünf und 14 nicht gewogen), betrug
die Gewichtszunahme bis Tag 14 nur 1,28% des Ausgangsgewichtes und somit
1% weniger als bei intrazerebral behandelten Tieren. Das Gewicht an Tag 14
betrug 393g (IQR 20,5g).
Die Kontrollgruppe zeigte zwischen drittem und 14. postoperativem Tag eine
Gewichtszunahme von 1,13% des Ausgangsgewichtes hin zu einem Gewicht
von 394g (IQR 15,5g). In Anbetracht des um 9,5g geringeren
Ausgangsgewichtes ist dies jedoch ein besseres, wenn auch statistisch nicht
signifikantes, Ergebnis als das der systemisch behandelten Tiere.
Die unbehandelte Sham-Gruppe nahm zwischen drittem und 14. Tag 1,18%,
die behandelte Sham-Gruppe zwischen fünftem und 14. postoperativen Tag
1,39% ihres Ausgangsgewichtes auf 398g (IQR 3g) bzw. 414g (IQR 5g) zu.
37
Unter Einbezug des Unterschiedes im Ausgangsgewicht von 11g, erreichten
beide Sham-Gruppen die gleiche Gewichtssteigerung.
Gewichtsentwicklung im Zeitraum der BRDU-Injektion
An den Tagen 14 bis 18, also während der BrdU-Injektion kommt es in allen, mit
einer Blutung versehenen Gruppen zu einer geringen Gewichtszunahme als in
den Zeiträumen zuvor und danach. Die Sham-Tiere hingegen nahmen unter
BrdU-Injektion weiter gleichviel zu. Tiere, die eine Blutung erhielten, waren also
durch die BrdU-Injektion im Gegensatz zu den Sham-Tieren in ihrer
Gewichtszunahme beeinträchtigt.
Gewichtsentwicklung Tag 19 bis 42
Die intrazerebral behandelten Tiere zeigen weiterhin eine gegenüber der
intraperitoneal behandelten Gruppe 1 eine signifikante (p<0,05) sowie allen
anderen Gruppen überlegene Steigerung um täglich 1,06% ihres
Ausgangsgewichtes und erreichen ein Endgewicht von 518,5g (IQR 15,25g).
Die Kontrollgruppe weist mit täglich durchschnittlich 0,9% Gewichtszunahme
ihres Ausgangsgewichtes den zweitbesten Wert auf. Die Gruppe erreicht ein
Endgewicht von 471g (IQR 20g).
Die intraperitoneal mit G-CSF behandelten Tiere, denen autologes Blut injiziert
wurde, nehmen täglich durchschnittlich 0,76% ihres Ausgangsgewichtes zu und
erreichen ein Endgewicht von 462g (IQR 27g).
Trotz größerer Gewichtszunahme der Kontrollgruppe erreichen die beiden
Sham-Gruppen, welche nur 0,8% (unbehandelt) bzw. 0,78% (behandelt) ihres
Ausgangsgewichtes zunahmen, ein höheres und erneut, dem Ausgangsgewicht
angepasst, gleiches, Endgewicht. Die Tiere der unbehandelten Sham-Gruppe
wogen 484g (IQR 10g), die der behandelten Gruppe 500g (IQR 22g)
Die intraperitoneal behandelten Tiere nehmen erneut am wenigsten, nur 0,76%
ihres Ausgangsgewichtes zu und bleiben, auch auf Grund des anfänglich
eingebüßtes Gewichtes, mit ihrem Endgewicht von 462g (IQR 27g) unter dem
der Kontrollgruppe.
Zwischen anderen Gruppen als oben genannter gibt es keinen signifikanten
Unterschied.
38
Gewichtsentwicklung
Abbildung 6 [117] Das Diagramm zeigt die Gewichtsentwicklung über die Zeit
von 42 Tagen. Statistisch signifikante (p<0,05) Unterschiede sind mit (*)
gekennzeichnet.
Gewichtszunahme vor und nach BrdU-Injektion
Die lokal behandelten Tiere zeigten die früheste und über den gesamten
Verlauf stärkste Gewichtszunahme und erreichten ein der systemisch
behandelten Gruppe signifikant und den anderen Gruppen stark überlegenes
Endgewicht von 518,5g (IQR 15,25g).
Bei den Sham-operierten Tieren nahmen, berücksichtigt man das um 11g
verschiedene Ausgangsgewicht, beide Gruppen in gleichem Maße zu und
erreichten ein ebenfalls der Kontrollgruppe überlegenes Endgewicht von 484g
(IQR 10g) bei den unbehandelten und 500g (IQR 22g) bei den behandelten
Tieren. Statistisch signifikante Unterschiede sind mit (*) gekennzeichnet.
Die mit einer Läsion versehenen, jedoch systemisch behandelten Tiere
hingegen waren der Kontrollgruppe in der Gewichtsentwicklung unterlegen. Die
systemisch behandelten Tiere begannen am spätesten mit einer
kontinuierlichen postoperativen Gewichtszunahme und konnten diesen
Rückstand auf Grund der zudem geringsten Gewichtszunahme aller Gruppen
300
350
400
450
500
550
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
days after ICH
weig
h/ g
Control GCSF i.p. GCSF i.c.
*
Tage nach ICB
Gewicht
(g)
Kontrolle G-CSF i.p. G-CSF i.c.
39
zwischen 18. Und 42. Tag nicht aufholen. Das Gewicht am 42. Tag betrug 462g
(IQR 27g) und war das Geringste aller Gruppen. Die Tiere der Kontrollgruppe
erreichten am 42. Tag ein Gewicht von 471g (IQR 20g).
Die Differenz der Mittelwerte der Gruppe intrazerebral behandelter Tiere ist
jeweils zu Kontrollgruppe und der Gruppe systemisch behandelter Tiere auf
dem Niveau 0,05 signifikant. Zwischen anderen Gruppen als oben genannter
gibt es keinen signifikanten Unterschied.
4.1.3 Funktionelle Testung
Vor allem während der ersten Woche nach der intrazerebralen Blutung wird der
NDS, da dieser die Gruppen der verschiedenen Schädigungsgrade
auseinander zu halten vermag, empfohlen.[152] Dieser ist außerdem einfach
durchzuführen und auszuwerten. [152] Die kumulierten Testergebnisse der
einzelnen Gruppen an Tag 1, 7, 14 und 42 sind in Abbildung 7 dargestellt.
Erholung am ersten postoperativen Tag
Alle Tiere zeigten am ersten postoperativen Tag Einschränkungen im gleichen
Maße von 4 Punkten (IQR jeweils 1,5) des Neurologic deficit scores bei einem
möglichen Maximalwert von 14 Punkten.
Erholung am Ende der ersten Woche
Die mit G-CSF behandelten Tiere verbesserten sich bis zum Ende der ersten
Woche signifikant (p<0,05) stärker auf einen Wert von 1 (IQR 1 in der Gruppe
i.p., 0,75 in der Gruppe i.c. behandelter Tiere) im Vergleich zu Tieren der
Kontrollgruppe, welche nur einen Medianwert von 2 (IQR 2) erreichten.
Erholung am Ende der zweiten Woche
Am 14. Tag verbessern sich erneut die Gruppen mit G-CSF-Behandlung
signifikant, wobei die intrazerebral behandelten gegenüber den systemisch
behandelten Tieren einen nicht signifikant besseren Medianwert von 0,1 (IQR 1)
erreichten, die intraperitoneal behandelten Tiere jedoch noch einen Wert von 1
(IQR 1) aufwiesen. Die Kontrollgruppe erreicht einen Medianwert von 2 (IQR 1).
40
Erholung am Ende der sechsten Woche
Das funktionelle Langzeitergebnis am 42. Tag ist bei allen Tieren gleich gut.
Der Medianwert beträgt 0,1 (IQR Kontrollgruppe: 0,5, I.p. behandelte Tiere
0,25, i.c. behandelte Tiere 0,75).
Zu keinem Zeitpunkt konnte eine signifikante Verbesserung eines einzelnen
Verhaltenselementes des Neurologic deficit Score festgestellt werden.
Abbildung 7 [117] Das Diagramm zeigt die NDS-Werte am 1., 7., 14. oder 42.
postoperativen Tag. Am 7. postoperativen Tag zeigen beide
Behandlungsgruppen eine signifikante Verbesserung. Die intrazerebral
behandelten Tiere zeigten am 14. Tag einen schnelleren Erholungseffekt. Am
42. Tag waren bei allen Tieren keine Defizite mehr zu beobachten. Die
Signifikanz beträgt p<0,05.
4.2. Ergebnisse der Läsionsvolumetrie
4.2.1 Läsionsvolumina
Die Läsionsvolumen der Kontroll- und Behandlungsgruppen zeigten keinen
signifikanten Unterschied.
Die Kontrollgruppe wies 9 Werte zwischen 0,9mm3 und 3,6mm3 auf, zeigte
jedoch 2 Extremwerte ≥7,2mm3 (Median 3,37, IQR 1,84).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
Ne
uro
logi
c d
efi
cit
sco
re
Tage
Funktionelle Testung nach experimenteller ICB
Kontrolle
G-CSF i.p.
G-CSF i.c.
1 7 14 42
* *
*
*
* p<0,05
41
Die Gruppe mit intraperitonealer G-CSF-Behandlung zeigte 11 Werte zwischen
0,8mm3 und 3,5mm3 sowie einen Wert von 5,8mm3 (Median 2,39, IQR 2,1).
Die Tiere, welche intrazerebral mit G-CSF behandelt wurden, zeigten Werte
zwischen 0,5mm3 und 3,6mm3 (Median 2,26, IQR 1,36).
Die Läsionsvolumina sind in Abbildung 8 dargestellt.
Abbildung 8 [117] Der Boxplot zeigt die Größen der Läsionen für die drei
Gruppen bei welchen mittels Injektion von 70µl autologen Blutes eine Läsion
hervorgerufen wurde. Die Volumina unterschieden sich nicht signifikant, Die
Werte in der Gruppe mit intrazerebraler G-CSF-Behandlung lagen am engsten
zusammen und zeigten einen leichten Trend hin zu kleineren Volumina.
4.2.2 Hirnatrophie
Dieser Wert wurde aus der Differenz von gesunder und kranker Hemisphäre
berechnet. Die Ergebnisse wurden in Abbildung 9 graphisch dargestellt.
Wie erwartet, wiesen die einer Sham OP unterzogenen Tiere eine geringere
Atrophie als die Tiere nach Blutinjektion auf. Der Mittelwert der Shamtiere
beträgt 15,54mm3 (SD 12,38mm3) bei den unbehandelten Tieren bzw.
18,12mm3 (SD 15,39mm3) bei den behandelten Tieren.
Diese Werte liegen unter denen der Kontrollgruppe (Mittelwert 31,83mm3, SD
12,37mm3).
Kontrolle G-CSF i.p. G-CSF i.c.
75% 3,61 3,4725 2,9
Hoch 3,6 5,8 3,6
Niedrig 0,9 0,8 0,5
25% 1,77 1,37 1,545
0
1
2
3
4
5
6
7
L
äsio
nsg
röß
e m
m³
Gruppe
Läsionsvolumen
42
Eine ebenfalls geringere Atrophie als die Kontrollgruppe weisen die Tiere mit
systemischer G-CSF-Behandlung (Mittelwert 26,13mm3, SD 10,59mm3) auf.
Die größte Atrophie, größer als die der Kontrollgruppe, zeigten die intrazerebral
behandelten, mit einer Blutung versehenen Tiere (Mittelwert 41,32mm3, SD
14,54mm3).
Zwischen den Behandlungsgruppen gibt keinen signifikanten Unterschied. Das
95%-Konfidenzintervall der Mittelwerte der schlechtesten Gruppe (der
intrazerebral behandelten, mit einer Blutung versehenen) überschneidet sich
nicht mit dem der besten (unbehandelten Sham-operierten) Tiere.
Abbildung 9 [117] Der Boxplot zeigt die Werte der Hirnatrophie. Im Vergleich
zur Kontrollgruppe schneidet auf Grund der Behandlung allein die intrazerebral
behandelte Gruppe geringfügig besser ab. Auch bei den Sham-behandelten
Tieren zeigte sich eine jedoch operationsbedingt geringere Atrophie.
4.3. Ergebnisse der Neurogenese
Wie bereits bekannt, führt Blutinjektion im Vergleich zur Sham-Prozedur zu
einem signifikanten Anstieg BRDU-DAB-positiver Zellen. [266] Die
Kontrollgruppe zeigte gegenüber den Sham-operierten Tieren signifikant mehr
BRDU-DAB-positive Zellen, sowohl ipsilateral (Mittelwert 101, SD 50,05) als
auch kontralateral (Mittelwert 85,91, SD 38,31. Unbehandelte Sham-Tiere
zeigten demgegenüber ipsilateral einen Mittelwert von 8,2 (SD 5,85) und somit
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
Kontrolle G-CSF i.p. G-CSF i.c. Sham Sham mit G-CSF
Hir
natr
op
hie
[m
m3]
Gruppe
Hirnatrophie
Maximum Obergrenze des 95%- Konfidenz-intervalles Untergrenze Minimum
43
92,8 weniger Zellen und kontralateral einen Mittelwert von11,8 (SD 12,26) und
somit 74,11 weniger Zellen. Bei behandelten Sham-operierten Tieren fanden
wir ipsilateral einen Mittelwert von 18,4 (SD 9,74) und kontralateral einen
Mittelwert von 15,2 (SD 9,88) und somit im Mittel 82,6 bzw. 70,71 weniger
Zellen. Die Werte sind in Abbildung 10 und 13 graphisch dargestellt.
Die Intrazerebrale Gabe von G-CSF bewirkt eine signifikante Abnahme der
Zellzahl
Die intrazerebral behandelten Tiere zeigten signifikant weniger BRDU-DAB-
positive Zellen als die Kontrollgruppe. Ein ebenso signifikanter Unterschied
findet sich beim Vergleich mit systemisch behandelten Tieren. Dies ist bei den
gegenübergestellten mikroskopischen Abbildungen 11 und 12 sowie 14 und 15
deutlich zu sehen. Der Mittelwert BRDU-DAB-positiver Zellen intrazerebral
behandelter Tiere betrug ipsilateral 29,6 (SD 17,68) und kontralateral 32,6 (SD
21,78). Die mittlere Differenz betrug somit ipsilateral 71,4 Zellen und
kontralateral 53,31 Zellen.
Die systemische G-CSF-Gabe hat keinen signifikanten Effekt, zeigt jedoch
einen Trend zu höheren Zellzahlen.
Ipsilateral zeigte sich ein Mittelwert von 100,08 (SD 51,04) BRDU-DAB-
positiven Zellen, kontralateral 109,67 (SD 61,1). Dies sind ipsilateral im Mittel
0,91 positive Zellen und kontralateral 23,76 Zellen mehr als bei der
Kontrollgruppe.
44
Abbildung 10 [117] Der Boxplot zeigt die Anzahl BrdU-positiver Zeller in der
granulären Zone des rechten Gyrus dentatus in den fünf Gruppen. Eine
signifikant niedrigere Zellzahl im Vergleich zu Kontrollgruppe und systemischer
Gabe zeigte sich für die intrazerebral behandelten Tiere sowie, auf Grund der
fehlenden Blutung, auch bei den Sham-operierten Tieren. Signifikante Werte
wurden mit (*) markiert.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Kontrolle G-CSF i.p. G-CSF i.c. Sham Sham mit G-CSF
Zellzah
l
Gruppe
BrdU positive Zellen im ipsilateralen Hippocampus
Maximum Obergrenze des 95%- Konfidenz- Intervalls Untergrenze Minimum
*
*
*
45
Ipsilateraler Gyrus dentatus behandelter Tiere
Abbildung 11 [117] i.p.-Behandlung Abbildung 12 [117] i.c.-Behandlung
Die Abbildungen 11 und 12 zeigen die lichtmikroskopischen Aufnahmen aus
dem rechten Gyrus dentatus der intraperitoneal (Abb. 11) und der intrazerebral
(Abb. 12) behandelten Tiere. Eine deutlich reduzierte Zellzahl konnte bei
intrazerebraler G-CSF-Behandlung und 42 Überlebenstagen beobachtet
werden.
100µm 100µm
46
Abbildung 13 [117] Der Boxplot zeigt die Anzahl BrdU-positiver Zeller in der
granulären Zone des linken Gyrus dentatus in den fünf Gruppen. Eine
signifikant niedrigere Zellzahl im Vergleich zu Kontrollgruppe und systemischer
Gabe zeigte sich für die intrazerebral behandelten Tiere sowie, auf Grund der
fehlenden Blutung, auch bei den Sham-operierten Tieren. Signifikante Werte
wurden mit (*) markiert.
Kontralateraler Gyrus dentatus behandelter Tiere
Abbildung 14 [117] i.p.-Behandlung Abbildung 15 [117] i.c.-Behandlung
Die Abbildungen 14 und 15 zeigen die lichtmikroskopischen Aufnahmen aus
dem linken Gyrus dentatus der intraperitoneal (Abb. 14) und der intrazerebral
(Abb. 15) behandelten Tiere. Eine deutlich reduzierte Zellzahl konnte bei
intrazerebraler G-CSF-Behandlung und 42 Überlebenstagen beobachtet
werden.
Die Auswertung der Subventrikulärzone ergab ein eben solches Ergebnis.
-50
0
50
100
150
200
250
Kontrolle G-CSF i.p. G-CSF i.c. Sham Sham mit G-CSF
Zellzah
l
Gruppe
BrdU-positive Zellen im kontralateralen Hippocampus
Maximum Obergrenze des 95%- Konfidenz- Intervalls Untergrenze Minimum
100µm 100µm
*
* *
47
5. Diskussion
Mehrere Studien zeigten signifikante [95, 105] oder nicht-signifikante Vorteile
für chirurgische Interventionen wie der stereotaktischen und endoskopischen
Hämatomevakuation sowie der offenen Kraniotomie bei der intrazerebralen
Blutung. [8, 14, 39, 176, 274].[171]
Die Kraniotomie verringert bei wachen und somnolenten Patienten das
Sterberisiko ohne Einfluss auf das funktionelle Ergebnis. [22, 115] Für Patienten
mit einem GCS-Wert <4 und einem Gerinnsel >2cm im Durchmesser, die
innerhalb von 96 Stunden operiert wurden, konnte die STICH (Surgical trial in
intracerebral hemorrhage) –Studie einen nicht signifikanten Benefit für die GCS-
Werte nach 6 Monaten, die Sterblichkeit, die Werte der modifizierten Ranking
Skala sowie des Barthel Index [170] zeigen. Lobäre Gerinnsel kleiner 1cm bei
Patienten mit einem Wert ≥9 auf der Glasgow Coma Scale sind chirurgisch gut
behandelbar und somit ist die Kraniotomie bei oberflächlicher Lokalisation mit
einem Benefit für das funktionelle Ergebnis verbunden. Eine operative
Blutungsausräumung innerhalb der ersten 12 Stunden hat die beste
unterstützende Wirkung [177, 274]. [22]
Minimalinvasive Chirurgie scheint eine sichere Behandlungsmethode für die
intrazerebrale Blutung zu sein.[3, 104, 118, 144, 160, 172, 174, 175, 181, 213,
243] Die Ergebnisse der MISTIE-Studie zeigten bei minimalinvasivem Eingriff
plus rtPA eine signifikant größere Auflösung des Blutgerinnsels.[3, 181]
Möglicherweise profitieren Patienten von gleichzeitiger Gabe neuroprotektiver
oder –regenerativer Substanzen. Hierfür eignen sich insbesondere
Wachstumsfaktoren wie EPO, BDNF und das von uns untersuchte G-CSF.
In der vorliegenden Arbeit wurde für die intrazerebrale Blutung, hervorgerufen
durch Vollblutinjektion, eine Verbesserung durch lokale G-CSF-Therapie bei der
Ratte gezeigt: Erstmals wurde eine signifikante funktionelle Erholung im
Langzeitergebnis präsentiert. Die sinkenden Werte des Neurologic Deficit
Scores korrelierten mit einer signifikant schnelleren und stärkeren
Gewichtszunahme.
Die Injektion autologen Blutes führt zu Zelltod, Infiltration von
Entzündungszellen und Reaktion von Mikrogliazellen. Im angrenzenden
48
Gewebe kommt es zu einer Schädigung von Gliazellen sowie Neurone der
Penumbra [5].[264] Bei nur minimaler Gewebsdeformierung kommt es zu
geringer raumfordernder Wirkung und Ischämie. [264] Form und Ausdehnung
der Blutung kann schwer zu steuern sein, da sich das Blut schneller entlang von
Bahnen der weißen Substanz, also den Wegen geringeren Widerstandes
ausbreitet. [157] In den histologischen Untersuchungen konnte keine
Korrelation mit der klinischen Verbesserung gefunden werden.: Die
Läsionsgröße sowie das Ausmaß der Hirnatrophie zeigten allenfalls einen
leichten Trend hin zur Verbesserung. Immunhistochemisch war ein signifikanter
Abfall BrdU-DAB-positiver Zellen im ipsilateralen sowie kontralateralen Gyrus
dentatus der Hippocampi bei lokal behandelten Tieren zu beobachten.
Da wir als erste Gruppe für die Untersuchung der Wirkung von G-CSF bei
intrazerebraler Blutung das durch MacLellan et al [153, 154] modifizierte Modell
nach Bullock et al [32] verwendeten, fehlen direkte Vergleichsdaten.
Gewebsverlust, finale Läsionsgröße, Zellverlust, Schädigung des Corpus
callosum, Verschmälerung des Cortex sowie entfernte Schädigungen sind im
Gegensatz zum bereits mehrfach verwendeten Kollagenasemodell
geringer.[157] Positive Effekte systemischer G-CSF-Behandlung bei
Kollagenase-induzierter, experimenteller Blutung [184, 270] konnten nun für das
Whole-Blood-Injektion Modell bestätigt werden.
Eine durch systemische G-CSF-Gabe vermittelte Neurogenese wurde mehrfach
als mögliche Erklärung für die funktionelle Verbesserung der Tiere in Erwägung
gezogen. [120, 214, 221, 270] In unserer histologischen Analyse zeigte sich bei
lokaler Gabe jedoch eine Reduktion der Zellzahl im ipsilateralen sowie
kontralateralen Hippocampus, sodass keine direkte neurogenetische Wirkung
des Wachstumsfaktors nachgewiesen werden konnte. Da wir die erste Gruppe
waren, die die lokale G-CSF-Gabe bei intrazerebraler Blutung untersuchten,
fehlen uns hierzu Vergleichsdaten.
5.1. Funktionelle Daten
5.1.1.Gewichtsentwicklung
Es zeigt sich, dass eine systemische G-CSF-Gabe zu einer geringeren
Gewichtszunahme als sie physiologischer Weise stattfindet, führt. Dies kann
sowohl auf eine systemische Wirkung von G-CSF als auch auf eine stress- und
49
schmerzbedingte verminderte Nahrungsaufnahme oder erhöhten
Kalorienverbrauch zurück zu führen sein. Auch operierte, jedoch unbehandelt
gebliebene Tiere zeigen eine stärkere Gewichtszunahme als die intraperitoneal
behandelten Tiere. Die Blutung als alleinige Ursache für die unzureichende
Gewichtszunahme kann somit ausgeschlossen werden. Wir können damit das
Ergebnis einer experimentellen Studie mit subkutaner Therapie bestätigen.
[272] Bei Ratten mit Hypertonie und kortikaler Ischämie kam es unter
subkutaner G-CSF-Gabe (50µg/kg KG) für 7 postoperative Tage verglichen mit
der Kontrollgruppe, der Gruppe mit SCF-Therapie sowie der Gruppe mit G-
CSF- und SCF-Therapie zu einer signifikanten Gewichtsreduktion in der ersten
Woche.[272] In anderen Studien mit fokaler zerebraler Ischämie durch
Okklusion der A. cerebri media bei Ratten mit intravenöser G-CSF-Gabe wurde
kein Unterschied in der Gewichtsentwicklung zur Kontrollgruppe gezeigt.[210,
214, 215] Weitere Studien bei Mäusen wiederum zeigten bei subkutaner Gabe
von G-CSF nach fokaler zerebraler Ischämie eine signifikant stärkere
Gewichtszunahme als bei der Kontrollgruppe.[76]
Während der BrdU-Injektion von Tag 14 bis 18 trat ebenfalls eine Verminderung
der physiologischen Gewichtszunahme auf. Dies kann ebenso wie bei der
systemischen G-CSF-Behandlung auf Stress, z.B. durch das Einfangen und
Festhalten bei der Injektion oder Schmerzen durch die Injektion selbst
hervorgerufen werden. Auffällig ist jedoch, dass nur Tiere mit intrazerebraler
Blutung, jedoch keine Sham-Tiere betroffen sind. Möglicherweise ist dies auf
eine erhöhte Schmerzempfindlichkeit der durch intrazerebrale Blutung
betroffenen Tiere zurück zu führen.
Die ungenügende Gewichtszunahme unserer systemisch behandelten Tiere
geht jedoch nicht mit einer verzögerten neurologischen Genesung einher.
5.1.2. Funktionelles Langzeitergebnis
Angelehnt an das bereits durchgeführte Kurzzeitprojekt mit einer
Überlebenszeit von sieben Tage verwendeten wir das Whole Blood Injection
Modell. MacLellan et al zeigte jedoch, dass Ratten nach einem Eingriff nach
dem Whole Blood Injection Modell zwar zu Beginn signifikante neurologische
Defizite aufwiesen, sich jedoch schnell wieder erholten, sodass die Werte, zum
Beispiel des von uns durchgeführten Neurologic deficit score sich trotz
50
erheblicher Schädigung nach 21 Tagen nicht mehr von den Ausgangswerten
unterschieden.[43, 151, 155]
In zwei vorangegangenen Studien mit experimenteller, durch Kollagenase-
Injektion hervorgerufener intrazerebraler Blutung wurde die Wirkung der
systemischen G-CSF-Behandlung bei Ratten gezeigt. Sowohl viermalige Gabe
von 50µg/kg Körpergewicht G-CSF an den Tagen null bis drei [184] als auch
fünfmalige Gabe von 15µg/kg Körpergewicht an den Tagen eins bis fünf [270]
verbesserten die neurologische Wiederherstellung sowohl für motorische als
auch für Verhaltenstests. [184, 270]
In der Studie von Park et al erhielten die Ratten ab zwei Stunden nach
Induktion der Hirnblutung 50µg/kg Kg G-CSF für drei Tage. Sowohl im
Drehzylinder-Test als auch verschiedenen Formen des Tests auf Bewegung der
Extremitäten zeigten die G-CSF-behandelten Tiere ein besseres, ab der ersten
bzw. zweiten bis zur letzten Woche sogar signifikant besseres Langzeitergebnis
als die Kontrollgruppe. Die Überlebenszeit betrug 5 Wochen. Wie bei unserer
Studie zeigten Sham-operierte Tiere nur am ersten postoperativen Tag geringe
Defizite, welche weitgehend am siebenten Tag verschwanden. Bei Gabe von G-
CSF bei gesunden Tieren zeigte sich kein Effekt.[184]
Auch in der Studie von Zhang et al [270] zeigte sich für die intraperitoneale G-
CSF-Behandlung eine Verbesserung neurologischer Beeinträchtigungen im
Verlauf von 4 Wochen.
Auch bei der Behandlung des ischämischen Schlaganfalles konnte G-CSF das
Langzeitergebnis des Verhaltens deutlich verbessern, indem es Antworten
neuraler Vorläuferzellen stimuliert.[113, 211, 214] Sechs Wochen nach einem
Schlaganfall zeigten G-CSF-behandelte Ratten in Rotarod-Test, dem Test über
die Fähigkeit des Loslösens von einem Klebestreifen, dem Neurologischen
Schweregrad (NSS) einschließlich des Schwebebalkentests signifikant bessere
Ergebnisse. G-CSF induziert eine Verbesserung der Leistung sowohl an der
kontralateralen, paretischen Vorderpfote als auch an der ipsilateralen Extremität
und reduziert die Mortalität nach fokaler zerebraler Ischämie bei der Ratte
signifikant. [210, 214] In Studien mit ischämischem Schlaganfall zeigte sich bei
älteren Ratten ebenfalls ein früherer Beginn der Genesung G-CSF-behandelter
Tiere (Tag 3) im Vergleich zur Kontrollgruppe (Tag 9). Der Test auf Motorik und
51
Gleichgewicht auf dem rotierenden Stab ergab außerdem ein signifikant
besseres Langzeitergebnis nach 28 Tagen.[187] Auch intravenös G-CSF-
behandelte Ratten (1 Stunde postoperativ) mit ischämischem Schlaganfall
zeigten nach sechs Wochen verglichen mit der Sham- und der Kontrollgruppe
signifikant bessere funktionelle Ergebnisse. G-CSF induzierte auch hier sowohl
bei der ipsi- als auch der kontralateralen Extremität eine Verbesserung der
Leistung. Sham- und Kontrollgruppe zeigten keine Unterschiede. [214]
Mit einer intravenösen Behandlung mit 10µg/kg Körpergewicht nach 24 oder 72
Stunden für zehn Tage, hiermit wurde ein akuter Effekt von G-CSF auf die
Infarktgröße ausgeschlossen, konnte ein signifikant besseres Ergebnis nach
sechs Wochen im Vergleich zur Kontrollgruppe gezeigt werden. Zwischen
einem Behandlungsbeginn nach 24 oder 72 Stunden besteht kein signifikanter
Unterschied. Auch der erste gemessene Wert war in allen, mit einer Blutung
versehenen Tieren gleich und somit konnte ein initialer, für die
sensomotorischen Fähigkeiten entscheidender Unterschied bei der
Hirnschädigung ausgeschlossen werden. Erst ab der zweiten Woche
unterscheidet sich die funktionelle Genesung. Der Effekt auf die funktionelle
Genesung ist unabhängig von dem neuroprotektiven Potential. [215]
Mit einer subkutanen G-CSF-Gabe von 50µg/kg an den ersten fünf Tagen nach
experimenteller Ischämie wurde in einem Zeitraum von 28 Tagen eine
signifikant bessere Erholung neurologischer Ausfälle erreicht. [221]
In unserer Studie unterschied sich die Verbesserung der leicht- bis
mittelgradigen funktionellen Einschränkung zwischen den 3 Gruppen kurz nach
dem Ereignis (Tag 1 und 7), wie in den bereits beschriebenen Studien auch
[184, 215, 270], nicht signifikant. Jedoch zeigte sich bei der Untersuchung an
Tag 14 ein Vorsprung in der funktionellen Verbesserung für Tiere, welche lokal
mit G-CSF behandelt wurden. Daher ist ein direkter Effekt von G-CSF auf
Neurone möglich. Die funktionelle Verbesserung findet jedoch wie bei einer
vorangegangenen Studie auch [158], kein Korrelat im Läsionsvolumen, sodass
davon auszugehen ist, dass die Größe der Gewebsschädigung keine Prognose
hinsichtlich der funktionellen Beeinträchtigung zulässt. Wie erwartet, erreichten
fast alle Tiere bis zum 42. Tag eine vollständige funktionelle Genesung.
MacLellan et al zeigte, dass Ratten nach einem Eingriff nach dem Whole Blood
Injection Modell zwar zu Beginn signifikante neurologische Defizite aufwiesen,
52
sich jedoch schnell wieder erholten, sodass die Werte, zum Beispiel des von
uns durchgeführten Neurologic deficit score sich trotz erheblicher Schädigung
nach 21 Tagen nicht mehr von den Ausgangswerten unterschieden.[43, 151,
155] Dies stellt ein Problem für Studien dar, die zytoprotektive Medikamente auf
ihre Langzeitwirkung untersuchen wollen. [155] In weiteren Studien sollten
Untersuchungen mit neuropsychologischen Testbatterien angeschlossen
werden. Obwohl der von uns verwendete NDS sehr sensitiv hinsichtlich der
funktionellen Verbesserung nach einer intrazerebralen Blutung ist, könnte durch
eine größere Zahl verschiedener oder komplexerer Funktions- und
Verhaltenstests die auf Grund der milden Gewebsschädigung bei diesem
Blutungsmodell eintretenden subtileren Funktionsdefizite, insbesondere im
Langzeitverlauf, möglicher Weise besser erfassen.[106, 153, 154, 157] Hier
sollten anstelle oder zusätzlich zu einfachen neurologischen Defizitskalen
sensitivere Tests wie die Überprüfung auf symmetrischen Einsatz der vorderen
Extremität [106] sowie dem Single pellet test [154] um die Effektivität der
Behandlung genau überprüfen zu können.[155] Bei Testung mit dem NDS
könnte der Erfolg beim funktionellen Langzeitergebnis überschätzt werden, da
zwar initial Defizite auftreten, diese im Verlauf jedoch spontan rückläufig sind.
Bei trainierten Techniken wie dem ergreifen einer Futterkugel mit der
nichtdominanten Pfote und dem exakten führen dieser zur Schnauze (Single
pellet test) blieben messbare Defizite, zum Beispiel bei der Supination,
bestehen, an dessen Ausmaß die Effektivität der Behandlung überprüfbar ist.
[154]
In mehreren Fällen experimenteller Studien mit zytoprotektiven Medikamenten
traten ohne histologisches Korrelat Verbesserungen im Verhalten auf. [15, 152,
186] Diese Verbesserung könnte von der Wirkung der Behandlung auf
gesundes Restgewebe herrühren. [152]
RhEPO (5000 bzw. 10000 U/kg KG/d für fünf Tage i.p.) nach der ICB,
hervorgerufen durch intrastriatale Injektion autologen Blutes, bei der
männlichen Wistar-Ratte führt zu einer Verbesserung im funktionellen Ergebnis.
[216] Diese war signifikant für die mit 5000 U/kg KG/d behandelte Gruppe am 7.
Behandlungstag, wohingegen die höher behandelte Gruppe nur in einem der
beiden funktionellen Tests ein signifikant besseres Ergebnis zeigte. 7 Tage
53
nach Ende der Behandlung zeigten beide Gruppen bei beiden Tests signifikante
Ergebnisse im Vergleich zur Kontrollgruppe. [216]
Die intraperitoneale ICB-Behandlung mit Darbepoetin alfa einmal wöchentlich
mit 10µg/kg bei der Ratte, hervorgerufen durch Injektion autologen Blutes in das
Striatum, hat die selbe Wirkung was das funktionelle Ergebnis ab dem siebten
Überlebenstag betrifft, wie die tägliche RhEPO-Gabe 1000IU/kg für 2 Wochen.
[89]
Auch für den Brain derived neurotrophic factor mit fibrinbindender Domäne
(FBD-BDNF) konnte bei dreitägiger intrazerebraler Injektion bei der Ratte nach
intrazerebraler Blutung, hervorgerufen durch die Injektion von Kollagenase, ein
im Vergleich zur Behandlung mit nativen BDNF erhöhtes Überleben und
verbesserte sensorimotorische Regeneration beobachtet werden. [94]
Bei experimenteller intrazerebraler Blutung (sowohl bei dem Whole Blood
Injection Modell als auch bei dem Kollagenase Injektionsmodell) und
Behandlung mittels therapeutischer Hypothermie trat trotz Reduktion der
Entzündungsreaktion, der Ödeme sowie der Zerstörung der Blut-Hirn-Schranke
nur eine geringe Verbesserung des funktionellen Ergebnisses vorhanden. Eine
geringere Ausprägung der pathophysiologischen Schädigung kann somit nicht
auf eine funktionelle und histologische Besserung übertragen werden. [153,
157] Auch das Infarktvolumen zeigte sich als unabhängig vom neurologisch-
funktionellen Zustand bei ischämischen Schlaganfallmodellen. [20]
5.2 Volumetrie
Studien mit dem Kollagenase-Modell und einer intraperitonealen G-CSF-
Behandlung sechs Stunden nach dem Eintritt der Blutung fanden sich am
dritten Tag keine signifikanten Unterschiede zu der Kontrollgruppe. Histologisch
zeigte sich nach sechs Wochen eine signifikant geringere Atrophie der
Hemisphäre, des Striatums und des Cortex gegenüber der Kontrollgruppe.
[184]
Bei ischämischen Schlaganfallmodellen verringert G-CSF die Infarktgröße [137,
211, 212, 214, 215, 221] und wirkt direkt protektiv auf Neurone, die den G-CSF-
Rezeptor exprimieren [210, 211, 214]. 50µg/kg G-CSF subkutan für fünf Tage
reduzieren das Infarktvolumen bereits nach sieben Tagen signifikant im
54
Vergleich zur Kontrollgruppe. [221] Subkutane G-CSF-Injektion von 10µg/kg für
fünf Tage rief eine nicht-signifikante Verkleinerung des Infarktvolumens an Tag
7, 14 und 21 hervor. Das durchschnittliche Infarktvolumen bei nach 30 Minuten
nach Beginn der Ischämie mit 60 µg/kg i.v.-behandelten Tieren wird auf 47%
dessen des Volumens bei der Kontrollgruppe reduziert.[210] Bei Beginn
derselben Behandlung zwei Stunden nach Beginn der Ischämie konnte
ebenfalls eine stabile Reduktion um 37% verglichen mit den Placebo-
behandelten Tieren beobachtet werden. [214] Bei Behandlung mit 50 µg/kg i.v.
eine Stunde nach Beginn der Ischämie resultiert in einer Reduktion des
Infarktvolumens um 42%. Diese Infarktreduktion korrelierte mit
Verhaltensbesserung. [214]
In unserer Studie zeigten die intrazerebral behandelten Tiere die kleinste
Streuung und eine Tendenz zu einer kleineren Läsionsgröße. Da die lokale G-
CSF Therapie bei intrazerebraler Blutung bisher in keiner anderen Studie
untersucht wurde, können wir keinen Vergleich zu anderen Modellen oder
Behandlungsdauern anstellen. Die Volumina der Läsionen von Kontrollgruppe
und intraperitoneal behandelten Tieren wiesen eine hohe Standardabweichung
auf. Signifikante Werte, wie bei den voran beschriebenen Studien mit
ischämischem Schlaganfall [221] zeigten sich für die systemische Behandlung
nicht. Diese Ergebnisse bestätigen die bereits bei Studien mit dem
Kollagenase-Modell [184] fehlenden Unterschiede in der Läsionsgröße zur
Kontrollgruppe.
Bei der Beurteilung dieser Ergebnisse ist die anfänglich zusätzlich zu der 70µl
großen Blutung die median 21,36µg (60µg/kg bei 356g medianem
Körpergewicht) größere Volumenbelastung durch die intrazerebrale G-CSF-
Gabe im Vergleich zu den anderen Gruppen zusätzlich zu berücksichtigen. Die
Untersuchung der Atrophie bestätigte Ergebnisse mit dem Kollagenase-Modell,
welche ebenfalls bei den systemisch behandelten Tieren nach sechs Wochen
eine signifikant geringere Atrophie der Hemisphäre, des Striatums und des
Cortex gegenüber der Kontrollgruppe gezeigt hatte. [184] Die lokal behandelte
Gruppe zeigte in unserer Studie die größte Atrophie.
Für andere Wachstumsfaktoren konnte ebenfalls ein Einfluss auf die Atrophie
gezeigt werden.:
55
Die Gabe von 5000 U/kg KG/d RhEPO für fünf Tage i.p führte zu einer
signifikanten Verringerung des Gewebsverlustes bei intrazerebraler Blutung
hervorgerufen durch die Injektion autologen Blutes bei der Ratte im Vergleich
zur Kontrollgruppe. Bei der höher dosiert behandelten (10000 U/kg KG/d)
Gruppe zeigte sich auch ein Trend zu geringerer Atrophie im Vergleich zur
Kontrollgruppe. Dieses Ergebnis korrelierte mit einer ebenfalls signifikanten
funktionellen Verbesserung der niedrig dosiert behandelten Gruppe in beiden
funktionellen Tests an Tag 7. Die höher dosiert behandelten Tiere zeigten nur in
einem der Tests eine signifikante Verbesserung. [216]
Auch bei Verwendung des Whole-blood-injection Modells wies die systemische
Gabe von 1000U7kg KG RHuEPO (täglich für 14 Tage), aber auch 10µg/kg KG
Darbepoetin alfa (einmal wöchentlich), eine limitierte Zerstörung der Zellstruktur
und Ödembildung sowie eine Reduktion der Größe der entstehenden
Pseudozyste auf. [89]
Bei dreitägiger intrazerebraler Injektion von Brain derived neurotrophic factor
mit fibrinbindender Domäne (FBD-BDNF) nach intrazerebraler Blutung bei der
Ratte wurde mittels MRT und Histologie im Vergleich zum nativen BDNF ein
verminderter Gewebsverlust und eine geringere Blutungsgröße gefunden. [94]
5.3 Neurogenese
In vorangegangenen Studien mit systemischer G-CSF-Behandlung bei
intrazerebraler Blutung fiel der auffällig vermehrte Nachweis des neuronalen
Stammzellmarkers Nestin in der Randzone des nekrotisierten Bereichs auf.
Dieser legt die Vermutung nahe, dass hier die Neurogenese angeregt wird.
[270] Da die Neurogenese bereits mehrfach als Mechanismus von systemisch
verabreichtem G-CSF suggeriert wurde [120, 214, 221, 270], eine lokale
Wirkung jedoch nie untersucht wurde, soll in der vorliegenden Arbeit durch eine
vergleichende systemische und lokale G-CSF-Gabe eine mögliche direkte
Wirkung nachgewiesen werden. In diesem Zusammenhang soll auch ein
möglicher Zusammenhang zwischen Neurogenese und verbessertem
funktionellen Langzeitergebnis untersucht werden.
Bei ischämischem Schlaganfall konnte für G-CSF die Stimulation neuronaler
Vorläuferzellen und Neurogenese nachgewiesen werden. Die Neurogenese
56
wird durch Initiation einer kompensatorischen Antwort neuraler Vorläuferzellen
des adulten Hirns auf globale und fokale ischämische Ereignisse
heraufreguliert. [7, 38, 90, 103, 111, 112, 123, 145, 214, 222] Die Entwicklung
zu neuen Neuronen aus Vorläuferzellen wird mittels der Zweifachfärbung DCX-
NeuN erkannt.[29, 77, 178, 214] Die Koexpression von NeuN in Zellen um die
Läsion ist ein Zeichen nachhaltiger neuronaler Differenzierung. [214] DCX, ein
mikrotubuliassoziiertes Protein, wird spezifisch von neuralen Vorläuferzellen
sowie unreifen Neuronen exprimiert. [29, 77, 214] Die rostrale Migrationsbahn
zeigt bei Tieren mit sechs Wochen alter Ischämie eine deutlich vergrößerte Zahl
DCX-positiver Zellen, welche läsionsnah unter fünftägiger intravenöser G-CSF-
Behandlung gesteigert wurde. Es fand sich jedoch kein Hinweis auf eine
Reifung dieser Zellen zu Neuronen. [214]
Die Gesamtzahl angefärbter Zellen im Gyrus dentatus wurde durch G-CSF
nicht über das bereits durch Ischämie hervorgerufene Maß hinaus gesteigert.
Diese Daten (Abbildung 4a [214]) deuten auf eine prädominante Rolle von G-
CSF auf postischämisches Überleben und Differenzierung von Vorläuferzellen
hin. [214] Werden nur die zusätzlich NeuN-positiven Zellen erfasst, so zeigt sich
bei ischämischen, G-CSF-behandelten Tieren ein signifikanter Anstieg neu
erzeugten granulären Zellen im Vergleich zu nichtischämischen, nicht-
behandelten Tieren. (Abbildung 4b [214]) Ein höherer Anteil BrdU-positiver
Zellen hat sich zu Körnerzellen entwickelt. Dieser ist ipsilateral für P<0,01
signifikant, kontralateral nicht signifikant. [214]
BrdU+ Zellen im Gyrus dentatus BrdU+/NeuN+ Zellen im Gyrus dentatus
Abbildung 4a [214] Abbildung 4b [214]
Die Abbildungen zeigen die BrdU+ bzw. BrdU+/NeuN+ Zellen im Gyrus dentatus
bei Tieren ohne Infarkt (grün) und mit Infarkt (unterteilt in Zellzahl der
Läsionsseite = rot, bzw. der kontralateralen Seite = blau).
NS = nicht signifikant
* = signifikant
57
Ein photothrombotisches ischämisches Schlaganfallmodell mit ebenfalls
fünftägiger intravenöser G-CSF-Gabe (15µg/kg KG) und sechswöchigem
Überleben bei der Ratte zeigte nur bei Sham-operierten Tieren ein signifikanter
Anstieg BrdU-positiver Zellen durch G-CSF-Behandlung. Bei den Tieren mit
Ischämie kam es im kontralateralen Gyrus dentatus zu einer leichten Abnahme
der Zellzahl nach G-CSF-Behandlung, im ipsilateralen zu einer leichten
Zunahme. Die Gesamtzahl bei ischämischen Tieren stieg im Gyrus dentatus
durch G-CSF-Behandlung nicht über das durch die Ischämie hervorgerufene
Maß hinaus. Dies weist auf eine neuronale Differenzierung und Überleben von
Vorläuferzellen durch G-CSF nach Ischämie hin. Dies wurde mittels NeuN
bestätigt. Ipsilateral wurde eine signifikante neuronale Differenzierung
gefunden. Kontralateral war diese nicht signifikant. Auch Sham-Tiere zeigten
eine signifikante neuronale Differenzierung.[214] Eine darüber hinausgehende,
signifikante Steigerung der Zahl BrdU-positiver Zellen im ipsilateralen Gyrus
dentatus wurde bei einem weiteren Ischämie-Modell mit subkutaner G-CSF-
Behandlung (15µg/kg KG für 15 Tage) von Ratten festgestellt. Die Zahl BrdU-
positiver Zellen war sowohl gegenüber der Kontrollgruppe als auch der
kontralateralen Hemisphäre signifikant.[187]
In unserer Studie konnten wir zunächst für die Injektion autologen Blutes aus
der Schwanzvene des Tieres eine Erhöhung der Zahl neu gebildeter Zellen im
ipsi- sowie im kontralateralen Hippocampus durch den Vergleich zwischen
unbehandelten Sham-operierten und unbehandelten geschädigten Tieren
feststellen. Die Zellzahl war im ipsilateralen Hippocampus der Kontrollgruppe
deutlich größer und zeigte eine breitere Streuung als kontralateral.
Auch die systemisch behandelten Tiere mit Blutung wiesen eine wesentlich
größere Zellzahl auf als die behandelten Tiere der Sham-Gruppe auf. Hierbei
gab es keine Unterschiede in der Zellzahl zwischen ipsi- und kontralateral.
Durch die systemische G-CSF-Behandlung wird also die Zellzahl ipsilateral
allenfalls leicht, kontralateral jedoch stärker erhöht.
Die intrazerebrale G-CSF-Behandlung bewirkte im Gegensatz hierzu eine
signifikante Abnahme der durch die Blutung gesteigerten Zahl BrdU-DAB-
positiver Zellen sowohl im ipsilateralen als auch im kontralateralen Gyrus
58
dentatus. Dies lässt sich sowohl für den Vergleich mit der Kontrollgruppe als
auch mit den systemisch behandelten Tieren feststellen.
Somit konnte erstmals für die lokale Anwendung bewiesen werden, dass die
Entzündungsreaktion im ZNS nach intrazerebraler Blutung nicht verschlimmert
wird. Jedoch konnte für die lokale Gabe keine direkte Wirkung im Sinne von
Neurogenese nachgewiesen werden.
Da auch bei systemisch behandelten Tieren eine funktionelle Verbesserung,
jedoch keine größere Zellzahl festgestellt wurde und umgekehrt eine geringe
Zellzahl mit schnellerer Genese bei lokal behandelten Tieren verbunden ist, ist
erstens eine neuronale Differenzierung der BrdU-DAB-positiven Zellen bei
systemisch behandelten Tieren nur gering ausgeprägt und zweitens die
stattgehabte Neurogenese wahrscheinlich nicht verantwortlich für die
funktionelle Verbesserung.
Zum einen könnten die Zellen entzündlicher Genese sein, sodass eine lokale
Therapie die Entzündungsreaktion verkürzt und/oder insgesamt verringert und
eine systemische Gabe diese vor allem auf der kontralateralen Seite verstärkt.
Jedoch wurde auch gezeigt, dass auch apoptotische Zellen durch BrdU
angefärbt werden können. [134, 266] Somit könnte die signifikant geringere
Zellzahl bestätigen, dass eine lokale G-CSF-Therapie antiapoptotisch wirkt.
Die Bedeutung BrdU-positiver Zellen ist daher noch nicht endgültig geklärt.
Diese Daten im Vergleich zu den beschrieben Daten aus ischämischen
Schlaganfallmodellen deuten auf einen unterschiedlichen Mechanismus bei der
Neurogenese bei der Blutung im Vergleich zum ischämischen Schlaganfall hin.
In der vorliegenden Studie zeigte sich immunhistochemisch eine signifikante
Abnahme der Zellzahl durch lokale und im Gegensatz hierzu geringe Zunahme
durch systemische Behandlung. Im Gegensatz zum experimentellen
ischämischen Schlaganfall führte G-CSF bei der intrazerebralen Blutung nicht
zur Aktivierung der Neurogenese. Der für die funktionelle Genesung
verantwortliche Mechanismus sowie die Bedeutung der BrdU-positiven Zellen
sollten in weiteren Studien untersucht werden.
Für andere Wachstumsfaktoren konnte eine Zunahme der Neurogenese nach
intrazerebraler Blutung gezeigt werden:
59
RhEPO (5000 bzw. 10000 U/kg KG/d für fünf Tage i.p.) zeigte nach
dreizehntägiger BrdU-Injektion nach der durch intrastriatale Injektion autologen
Blutes hervorgerufene ICB bei der Ratte mit einem Überleben von 14 Tagen
eine gesteigerte Expression proliferierender und synaptogener unreifer
neuronaler Phänotypen. [216] Immunhistochemisch wurde eine signifikant
verbesserte Zellproliferation um das geschädigte Gewebe aus der SVZ bei
beiden Gruppen nachgewiesen. [216, 271] Desweiteren legt eine verstärkte
Expression von Synaptophysin im Striatum nach Behandlung mit EPO eine
Verbesserung der Neubildung oder des Schutzes vor Degeneration von
Nervenendigungen nahe. [216] Desweiteren ist die Zahl NeuN-positiver Zellen
nach RhEPO-Therapie erhöht. [89]
Auch unter 10µg/kg KG Darbepoetin (1x wöchentlich für 2 Wochen
intraperitoneal) steigt die Zahl NeuN-positiver Neurone. [89]
Auch für die intrazerebrale Gabe eines Wachstumsfaktors, dem Brain derived
neurotrophic factor mit fibrinbindender Domäne (FBD-BDNF) konnte im
Vergleich zum nativen BDNF, welcher innerhalb von zwölf Stunden in den
Liquor diffundiert und somit keine wirksamen Effekte erzielen kann,
perihämorrhagisch eine reduzierte Entzündungsreaktion und neuronale
Degeneration gezeigt werden. [94]
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Danksagung
Ich danke meinem Doktorvater Prof. Dr. med. Rainer Kollmar für die
Überlassung des Themas und Übernahme des Referats sowie die stetige
konstruktive Unterstützung bei allen fachlichen Fragen und dem Anfertigen der
vorliegenden Arbeit.
Besonders möchte ich mich bei meinem Betreuer Dr. med. Bernd Kallmünzer
für seinen unermesslichen Einsatz und die stets zuverlässige und motivierende
Unterstützung beim experimentellen Arbeiten und Erstellen der Doktorarbeit
bedanken.
Für das Erlernen der experimentellen Fertigkeiten sowie die gute
Zusammenarbeit und Mithilfe danke ich besonders Frau Ulrike Weinzierl und
allen Mitarbeitern der neurovaskulären Forschungsgruppe, insbesondere Frau
Dr. Miyuki Tauchi.
Prof. Dr. med. Jürgen Winkler danke ich für die Bereitstellung der
Räumlichkeiten sowie der Arbeitsgeräte und Mikroskope.
Ich danke ebenfalls für die freundliche Zusammenarbeit und Unterstützung den
Mitarbeitern der Molekular-Neurologischen Abteilung der Universität Erlangen.
Besonders möchte ich mich bei meinen Eltern und meinen „Doktorschwestern“
Ariana Schmidt und Katharina Köferl für die beharrliche und herzliche
Unterstützung bedanken.
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