experimento 2 - isomerase imobilizada (final) 2

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

Laboratório de Engenharia das Reações

Prof.ª Dr.ª Raquel de Lima Camargo Giordano

Experimento 2

Cinética de Reação Heterogênea em Reator de Batelada

Christian Carlos Cândido da Silva RA: 389234

Mariana Stefani Machado RA: 389340

Milton Quaresma Gomes Junior RA: 389480

Patrícia Metolina RA: 388998

Rodrigo Toscano Santos RA: 389498

Thaís Sousa de Sateles RA: 389366

SÃO CARLOS – SP

2013

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO................................................................................................................ 3

1.1 Enzimas ................................................................................................................... 3

1.2 Mecanismo geral de catálise enzimática .................................................................. 3

1.3 Imobilização da enzima ........................................................................................... 5

1.4 Efeitos difusivos ....................................................................................................... 6

2 OBJETIVOS ................................................................................................................... 7

3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL .............................................................................. 8

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 9

4.1 Determinação dos parâmetros cinéticos .................................................................. 9

4.2 Cálculo da energia de ativação .............................................................................. 13

4.3 Cálculo da efetividade ........................................................................................... 16

5 CONCLUSÃO ............................................................................................................... 25

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 26

3

1 INTRODUÇÃO

1.1 Enzimas

As enzimas são proteínas especializadas na catálise de reações biológicas.

São catalisadores biológicos extremamente eficientes e aceleram em média 109 a

1012 vezes a velocidade da reação, transformando de 100 a 1000 moléculas de

substrato em produto por minuto de reação, sem participar dela como reagente ou

produto. A especificidade das enzimas se deve à existência, na superfície da

enzima, de um local denominado sítio de ligação do substrato. O sítio de ligação do

substrato de uma enzima é pelo arranjo tridimensional especial dos aminoácidos de

uma determinada região da molécula, geralmente complementar à molécula do

substrato, configurada espacial e eletricamente para a ligação do mesmo.(1)

Alguns modelos procuram explicar a especificidade substrato/enzima. O

Modelo Chave/Fechadura prevê um encaixe perfeito do substrato no sítio de ligação,

que seria rígido como uma fechadura. Por outro lado, o Modelo do Ajuste Induzido

prevê um sítio de ligação não totalmente pré-formado, mas sim moldável à molécula

do substrato.(1)

1.2 Mecanismo geral de catálise enzimática

As enzimas aceleram a velocidade de uma reação por diminuir a energia livre

de ativação da mesma, sem alterar a termodinâmica da reação. Uma reação

enzimática pode ser expressa pela seguinte Equação (1), onde E é a enzima, S, o

substrato, ES, o Estado de Transição e P, o produto formado:

E + S <=> [ES] => E + P (1)

Para superar a energia de ativação de uma reação, há a formação de um

estado intermediário, o "Estado de Transição" (ES), um composto instável e de alta

energia, representado por ES, ligado com altíssima afinidade ao sítio catalítico, mas

não é considerado um intermediário e é rapidamente convertido em produto. A

Figura 1 mostra a comparação entre a reação com catalisador e a reação sem

catalisador e a diminuição da energia de ativação proporcionada pela enzima.(2)

4

Figura 1 – Energia de ativação da reação com catalisador e da reação sem

catalisador

Fonte: Biociência (2011).

A atividade das enzimas é condicionada pelos seguintes fatores:

Temperatura: à medida que se eleva a temperatura, a taxa de reação

aumenta. No entanto, estabilidade da proteína decresce devido à desnaturação

térmica, ocorrendo a perda da atividade biológica da enzima. Dessa forma, toda

enzima tem uma temperatura ótima para que atinja sua atividade máxima.

pH: as enzimas têm um pH ótimo de atuação, acima e abaixo do qual a sua

atividade diminui e se inativam. O pH do meio influencia a conformação do centro

ativo da enzima e, consequentemente, a sua interação com o substrato.

Concentração do substrato: o aumento da concentração de substrato

corresponde o aumento da atividade enzimática até que todos os centros ativos

fiquem ocupados e a atividade enzimática estabiliza.

Concentração de enzima: aumentando a concentração da enzima, aumenta

a velocidade da reação desde que haja substrato disponível.

Inibidores: a presença de inibidores diminui a atividade enzimática.

A catálise enzimática pode ser homogênea e heterogênea. Na catálise

homogênea, reagentes e catalisador encontram-se na mesma fase, proporcionando

melhor interação entre esses componentes e, consequentemente, resultando em

melhor rendimento de reação. No entanto, a aplicação industrial da catálise

homogênea normalmente é limitada, devido às dificuldades de separação do

catalisador do meio de reação.(3)

A catálise heterogênea envolve mais de uma fase, sendo que o catalisador

é, geralmente, um sólido e os reagentes e produtos líquidos ou gasosos. Nesse

5

caso, o catalisador fornece uma superfície onde os reagentes irão reagir mais

facilmente, e com menor energia de ativação. As principais vantagens da utilização

de catalisadores heterogêneos são a sua grande estabilidade térmica (suportam

temperaturas elevadas) e a sua facilidade de recuperá-los no fim da reação. A

principal desvantagem é a falta de seletividade.

1.3 Imobilização da enzima

Os vários métodos de imobilização empregados baseiam-se nas ligações

físicas e químicas entre a biomolécula e o suporte. Os mais utilizados são: adsorção

física e química, imobilização por confinamento em matriz ou microcápsula e ligação

cruzada.

Na imobilização em matriz de gel, a enzima está livre em solução, mas com

seu movimento restrito por uma rede de gel ou polímero. A enzima é misturada aos

componentes que formarão o gel e, quando esse é formado, a enzima fica presa à

matriz. A porosidade da matriz deve evitar a perda de enzima e, ao mesmo tempo,

permitir o livre movimento do substrato e do produto.(5)

Após a imobilização, as propriedades físicas e químicas da enzima podem

sofrer modificações. Devem ser considerados os efeitos da imobilização sobre a

estabilidade, as propriedades cinéticas e especificidade, além da produtividade da

enzima. As diferenças no comportamento da enzima imobilizada, quando

comparada à sua forma em solução, devem-se aos seguintes fatores: efeitos

conformacionais – modificação conformacional da molécula de enzima devido à

alteração na estrutura terciária do sítio ativo; efeitos estereoquímicos – uma parte da

molécula da enzima é imobilizada numa posição tal que o sítio ativo é relativamente

inacessível; efeitos difusionais – têm origem na resistência de difusão do substrato

até o sítio catalítico da enzima, e do produto da reação; efeitos microambientais –

resultantes do método de imobilização utilizado ou da presença do suporte na

vizinhança da enzima.(5)

6

1.4 Efeitos difusivos

Para promover uma determinada reação química com catalisador, a condição

desejada é que a etapa controladora seja a cinética química. Mas em reações

heterogêneas ocorrem diversos outros fenômenos, como efeitos difusivos externos e

internos. Para uma molécula reagente alcançar o sítio ativo onde a reação de fato

ocorre, há várias etapas:

1) Difusão da molécula reagente do seio do fluido para a superfície da partícula;

2) Difusão da molécula reagente da superfície da partícula pelo interior do poro;

3) Reação química no sítio ativo;

4) Difusão da molécula do produto formado do interior do poro para a superfície

da partícula;

5) Difusão da molécula do produto da superfície da partícula para o seio do

fluido.

Há duas possibilidades de ocorrência do fenômeno externo ao catalisador. A

primeira é quando a transferência de massa através do filme é rápida. Neste caso a

taxa global da reação será determinada pela velocidade da reação química na

superfície do catalisador e a reação química será a etapa limitante do processo. E a

segunda é quando a transferência de massa através do filme é lenta e, portanto, é a

etapa limitante. Neste caso, há uma barreira difusional provocada pelo filme ao redor

da superfície do catalisador.

Os fenômenos difusivos internos devem ser levados em conta quando se

emprega catalisadores porosos, os quais contêm sítios ativos localizados no interior

dos poros. Portanto, as moléculas reagentes devem difundir pelos poros até atingir

o sitio ativo, onde ocorrerá a reação química.

7

2 OBJETIVOS

O experimento teve como objetivo estudar a isomerização de frutose a glicose

catalisada por glicose isomerase imobilizada em gel de quitosana ativado com

glutaraldeído. Através da estimativa dos parâmetros cinéticos e da determinação da

efetividade experimental e comparação com a teórica, analisaram-se os efeitos

provocados ao empregar diferentes temperaturas e diâmetros de partículas de

catalisador na reação heterogênea, operada em reator batelada.

8

3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Inicialmente, cada tubo Falcon contendo 10 mL de solução de frutose em

cinco diferentes concentrações molares de 1,5, 0,8, 0,3, 0,2 e 0,1 M permaneceram

imersos em um banho termostático para o controle da temperatura.

Foram estudadas a enzima solúvel (livre) e a enzima glicose isomerase,

imobilizada em gel de quitosana ativada com glutaraldeído, em três diferentes

tamanhos de diâmetros. A Tabela 1 demonstra os diâmetros, as atividades teóricas

e as massas de gel empregadas. Para o experimento desse grupo, as reações

foram realizadas com enzima imobilizada de diâmetro P, à temperatura de 50°C.

Tabela 1 – Características da enzima glicose isomerase empregadas.

Tamanho Diâmetro (mm) Atividade Teórica (UI/ggel) Massa de gel (mg)

P 0,05-0,3 1000 28,7

M 1,70-0,85 757 37,9

G 3,36-2,36 782 36,7

Livre - 287 -

Cada uma das diferentes configurações da enzima empregadas foi utilizada

por um grupo experimental e em cada uma delas havia cinco frascos contendo as

enzimas a serem adicionadas num reator para a determinação da velocidade inicial

da reação, correspondente a cada concentração inicial de substrato. Foi empregado

um reator em batelada encamisado para manter o controle da temperatura, sob

agitação de aproximadamente 300 rpm.

Após adição das partículas de enzima imobilizada ao reator, para cada uma

das cinco concentrações iniciais Cs, retirou-se 100 µL de amostra do reator nos

tempos de 10, 20 e 30 minutos.

Cada amostra foi recolhida em frascos do tipo Eppendorf, já contendo 100 µL

solução de HCl 20% (vol/vol). Em seguida, fechou-se o frasco e o agitou

imediatamente para acelerar a mistura com o ácido e interromper a reação. Em

seguida, adicionaram-se 800 µL de água destilada e agitou-se novamente o frasco,

mantendo-o reservado e devidamente identificado.

9

Para a análise colorimétrica, foram utilizados 50 µL de cada amostra inativada

para reagir com 1mL de reagente GOD-PAP, por 10min, a 37°C, mantida em banho

termostático. Nesse método analítico enzimático, a glicose oxidase (GOD) oxida a

glicose presente na amostra e produz peróxido de hidrogênio. Por sua vez, a

peroxidase catalisa a oxidação de fenol e aminofenazona (PAP) na presença de

peróxido, gerando um complexo colorido. Coloração esta que pode ser medida em

espectrofotômetro e relacionada com a concentração de glicose inicialmente

presente na amostra.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Determinação dos parâmetros cinéticos

Neste experimento, trabalhou-se com a reação de isomerização de frutose a

glicose, catalisada pela enzima glicose isomerase imobilizada.

Com os valores de absorbância (Abs) medidos em diferentes instantes para

cada solução de frutose, foram calculadas as concentrações de glicose (Cp) através

da curva de calibração do espectrofotômetro fornecida, expressa pela Equação (1):

(1)

Uma vez que foi realizada uma diluição 1:2, a concentração real de produto

foi obtida pela relação:

(2)

Na Tabela 1, estão dispostas as absorbâncias em função do tempo para as

diferentes soluções de frutose e as concentrações de glicose obtidas.

10

Tabela 1 – Valores de absorbância e concentração de glicose.

Amostra Cs0 (mol/L) Cs0 (g/L) Tempo (min) Abs Cp,dil (g/L) Cp (g/L)

S1

1,5 270

10,133 0,137 0,601 1,202

S2 19,983 0,252 1,095 2,191

S3 29,850 0,347 1,503 3,007

S4

0,8 144

9,967 0,079 0,352 0,704

S5 19,917 0,179 0,782 1,563

S6 29,817 0,274 1,190 2,380

S7

0,3 54

10,000 0,039 0,180 0,360

S8 19,933 0,067 0,300 0,601

S9 30,000 0,130 0,571 1,142

S10

0,2 36

10,233 0,022 0,107 0,214

S11 19,917 0,051 0,232 0,463

S12 29,967 0,098 0,434 0,867

S13

0,1 18

10,233 0,021 0,103 0,206

S14 20,000 0,048 0,219 0,438

S15 30,083 0,080 0,356 0,713

Na isomerização da frutose, 1 mol de frutose é convertida a 1 mol de glicose,

ambas com massa molar de 180 g/mol. Assim, as concentrações de substrato

(frutose), Cs, e de produto (glicose), Cp, em unidades molar e mássica, estão

relacionadas numa proporção de 1 para 1 e a velocidade de consumo de substrato, -

rs, pode ser calculada por:

(3)

Com os dados da Tabela 1, foi realizada regressão linear através da origem

dos dados de concentração de produto em função do tempo, sendo as velocidades

de consumo de substrato equivalentes aos coeficientes angulares de cada reta

ajustada.

A Figura 1 apresenta os dados da concentração de produto em função do

tempo para cada uma das concentrações iniciais de substrato para obtenção de -rs.

Os valores encontrados estão dispostos na Tabela 2.

11

Figura 1 – Concentração de produto em função do tempo para cada uma das

concentrações iniciais de substrato.

Tabela 2 – Valores de –rs para as diferentes soluções de frutose.

Cs0 (g/L) -rs (g/L.min)

270 0,1046

144 0,0788

54 0,0357

36 0,0267

18 0,0229

Para determinar os parâmetros cinéticos aparentes foi utilizado o modelo

cinético de Michaelis-Menten, o qual relaciona a concentração de substrato com a

sua velocidade de consumo em uma reação enzimática, conforme a Equação (4).

(4)

onde vmáx e Km são os parâmetros cinéticos do modelo de Michaelis-Menten para a

reação enzimática. A constante Km representa a afinidade da enzima pelo substrato

(reagente) e vmáx expressa a velocidade máxima da reação.

A equação de Michaelis-Menten pode ser aproximada por uma hipérbole

descrita pela Equação (5).

y = 0.1046x R² = 0.9733

y = 0.0788x R² = 0.9946

y = 0.0357x R² = 0.9459

y = 0.0267x R² = 0.9417

y = 0.0229x R² = 0.9860

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0

Cp

(g

/L)

Tempo (min)

1,5 M

0,8 M

0,3 M

0,2 M

0,1 M

12

(5)

em que y = -rs, x = Cs, P1 = vmáx e P2 = Km.

Dessa forma, foi realizado um ajuste de hipérbole com os dados de –rs em

função de Cs (Tabela 2), por meio do software Scidavis, conforme apresentado na

Figura 2, de onde foram obtidos vmáx = 0,179 g/(L min) e Km = 190,14 g/L.

Figura 2 – Ajuste hiperbólico dos valores de –rs em função de Cs0.

Rearranjando a Equação (4), obtém-se a Equação (6), que representa a

linearização de Lineweaver-Burk da equação de Michaelis-Menten.

(6)

Assim, construindo-se um gráfico com os dados de 1/-rs versus 1/Cs, pode-se

obter os parâmetros Km e vmáx por meio de um ajuste linear. Na Tabela 3 estão

dispostos os valores de 1/-rs e 1/Cs0 e a Figura 3 apresenta o ajuste linear realizado.

Os valores tachados na Tabela 3 foram desprezados na regressão, pois se

distanciaram significativamente da tendência linear.

13

Tabela 3 – Valores de 1/-rs e 1/Cs0 para linearização da equação de Michaelis-

Menten.

1/Cs0 (L/g) 1/-rs (L.min/g)

0,00370 9,560

0,00694 12,695

0,01852 28,032

0,02778 37,405

0,05556 43,652

Figura 3 – Valores de 1/-rs em função de 1/Cs0.

Pela Figura 3, tem-se:

4.2 Cálculo da energia de ativação

Dados experimentais obtidos pelos grupos de cada turma, em três

temperaturas e três diferentes tamanhos de diâmetros de gel foram utilizados para

calcular a energia de ativação da reação para a enzima imobilizada e para a livre,

conforme apresentado na Tabela 4.

y = 1184.5x + 5.0601 R² = 0.9966

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0.00 0.01 0.01 0.02 0.02 0.03 0.03

1/-

rs (

L.m

in/g

)

1/Cs0 (L/g)

14

Tabela 4 – Dados cinéticos para temperaturas e diâmetros de partícula diferentes.

Diâmetro da partícula Temperatura (°C) vmáx (g/L.min) Km (g/L)

Enzima livre

60 0,711 150,6

50 0,256 268,6

40 0,109 100,5

P

60 0,675 151,5

50 0,198 234,1

40 0,104 108,3

M

60 0,509 287,6

50 0,146 119,8

40 0,063 82,3

G

60 0,211 253,2

50 0,108 207,0

40 0,047 78,9

A equação de Arrhenius permite calcular a variação da constante de

velocidade de uma reação química com a temperatura, conforme a Equação (7).

(7)

em que k = constante de velocidade, A = constante pré-exponencial, Ea = Energia de

ativação (kcal/mol), R = constante dos gases (kcal/mol.K) e T = Temperatura (K).

A Equação (7) pode ser linearizada utilizando o logaritmo natural, de modo a

se obter a Equação (8).

( ) ( )

(8)

Na prática, usa-se ln (k) = ln (vmáx), uma vez que vmáx é proporcional a k.

Assim, obtém-se a Equação (9).

( ) ( )

(9)

Logo, a partir dos dados da Tabela 4, pode-se construir o gráfico de ln (vmáx)

em função de 1/T, como ilustra a Figura 4. Os valores utilizados para a construção

das retas encontram-se na Tabela 5.

15

Tabela 5 – Valores de ln (vmáx) em função de 1/T.

Diâmetro da partícula 1/T (1/K) ln (vmáx)

Enzima livre

0,00300 -4,435

0,00309 -5,457

0,00319 -6,311

P

0,00300 -4,487

0,00309 -5,714

0,00319 -6,358

M

0,00300 -4,770

0,00309 -6,018

0,00319 -6,859

G

0,00300 -5,650

0,00309 -6,320

0,00319 -7,152

Figura 4 – ln (vmáx) em função de 1/T para cada diâmetro.

y = -9770.1x + 24.852 R² = 0.9952

-7.000

-6.500

-6.000

-5.500

-5.000

-4.500

-4.000

-3.500

0.00280 0.00300 0.00320 0.00340

ln(v

má

x)

1/T (1/K)

Livre

y = -9721.7x + 24.584 R² = 0.9622

-7.000

-6.500

-6.000

-5.500

-5.000

-4.500

-4.000

0.00280 0.00300 0.00320 0.00340

ln(v

má

x)

1/T (1/K)

Pequeno

y = -10873x + 27.786 R² = 0.9831

-7.500

-7.000

-6.500

-6.000

-5.500

-5.000

-4.500

-4.000

0.00280 0.00300 0.00320 0.00340

ln(v

má

x)

1/T (1/K)

Médio

y = -7839.6x + 17.901 R² = 0.998

-7.500

-7.000

-6.500

-6.000

-5.500

-5.000

-4.500

-4.000

0.00280 0.00300 0.00320 0.00340

ln(v

má

x)

1/T (1/K)

Grande

16

Os valores obtidos para a Ea (kJ/mol) através da linearização da equação de

Arrhenius foram calculados de acordo com a Equação (10):

(10)

onde a (K) é o coeficiente angular da reta obtida a partir do ajuste linear dos dados

da Tabela 5 e R = 8,314 J/(mol.K). A Tabela 6 apresenta os valores da energia de

ativação em função do diâmetro da partícula.

Tabela 6 – Energia de ativação em função do diâmetro da partícula.

Diâmetro da partícula Ea (kJ/mol) Ea (kcal/mol)

Enzima livre 81,2 19,4

P 80,8 19,3

M 90,4 21,6

G 65,2 15,6

4.3 Cálculo da efetividade

A relação existente entre a velocidade de reação com a enzima imobilizada e

a velocidade que deveria ser obtida na ausência de difusão, considerando a enzima

totalmente livre, é dada pela efetividade experimental (ηexp):

(11)

onde vimobilizada é a velocidade aparente da reação com enzima imobilizada e vlivre, a

velocidade da reação considerando a enzima livre. A efetividade experimental (ηexp)

varia entre 0 e 1. Os dados de velocidade obtidos com a enzima livre e a enzima

imobilizada, juntamente com a efetividade experimental, para cada uma das

concentrações de substrato, diâmetro de enzima e temperatura estão mostrados nas

Tabelas de 7 a 9.

17

Tabela 7 – Valores de efetividade experimental em função da concentração de

substrato e diâmetro da partícula (a 60°C).

Cs0

(g/L)

Enzima livre Enzima ImP Enzima ImM Enzima ImG

-rs (g/L.min) -rs

(g/L.min) exp

-rs

(g/L.min) exp

-rs

(g/L.min) exp

270 0,508 0,453 0,893 0,225 0,443 0,087 0,170

144 0,356 0,343 0,964 0,191 0,536 0,076 0,213

54 0,191 0,202 1,059 0,074 0,389 0,036 0,190

36 0,126 0,110 0,876 0,060 0,475 0,031 0,245

18 0,078 0,074 0,953 0,030 0,385 0,014 0,175



Cs0

(g/L)


-rs (g/L.min) -rs

(g/L.min) exp

-rs

(g/L.min) exp

-rs

(g/L.min) exp

270 0,143 0,105 0,734 0,119 0,831 0,082 0,577

144 0,083 0,079 0,945 0,073 0,879 0,065 0,783

54 0,053 0,036 0,671 0,043 0,806 0,020 0,373

36 0,039 0,027 0,689 0,035 0,898 0,013 0,340

18 0,016 0,023 1,421 0,026 1,632 0,009 0,571



Cs0

(g/L)


-rs (g/L.min) -rs

(g/L.min) exp

-rs

(g/L.min) exp

-rs

(g/L.min) exp

270 0,073 0,060 0,830 0,052 0,719 0,041 0,567

144 0,063 0,080 1,275 0,050 0,794 0,028 0,443

54 0,040 0,034 0,849 0,023 0,591 0,026 0,652

36 0,029 0,026 0,870 0,016 0,552 0,011 0,388

18 0,016 0,015 0,916 0,012 0,727 0,009 0,561

18

Para determinar a efetividade teórica, os cálculos seguintes foram realizados

para a comparação de condições reacionais e unidades equivalentes. Inicialmente

foi necessário corrigir a unidade em que se expressa a velocidade máxima de

reação através da Equação (12).

(12)

Em seguida, converteu-se v’máx, que estava em unidade de volume do reator

para v”máx, em unidade de volume de catalisador, conforme Equação (13).

(13)

onde v”máx é a velocidade máxima de reação em função da massa de substrato

(gfrutose/(min.cm³cat), Cgel, a concentração de catalisador por volume de reator (ggel/L)

e gel, a densidade do catalisador (ggel/cm³cat).

A partir das concentrações iniciais de substrato (Cs*) e da constante de

Michaelis-Menten (Km), foi calculado o adimensional () pela Equação (14):

(14)

onde Cs* corresponde à concentração de substrato na película de fluido ao redor da

partícula. Na presença de alta agitação, considera-se que Cs* apresenta o mesmo

valor que a concentração no meio, ou seja, Cs* = Cs0.

Através do ábaco que relaciona a efetividade em função do módulo de Thiele,

, para diferentes valores de (Figura 5), foi possível encontrar os valores de para

cada concentração, diâmetro de catalisador e temperatura.

Figura 5 – Efetividade interna em função de , para diferentes valores de .

Fonte: Roteiro Experimental

19

Com o módulo de Thiele, estimou-se a difusividade efetiva, Deff, a partir da

Equação (15).

(15)

onde Rp é o raio da partícula de gel.

As Tabelas de 10 a 12 apresentam os valores de e obtidos para cada

concentração de substrato, diâmetro de partícula e temperatura, bem como os

dados das respectivas difusividades. Para os casos em que a efetividade calculada

foi maior que 1, não foi possível estimar o Módulo de Thiele.

Tabela 10 – Valores estimados de , e Deff (a 60°C).

Diâmetro do catalisador Cs0 (g/L) Deff (m2/min)

P

270 1,782 3,0 1,49·10-8

144 0,950 1,5 5,94·10-8

54 0,356 - -

36 0,238 2,0 3,34·10-8

18 0,119 0,8 1,85·10-7

M

270 0,939 6,5 5,05·10-8

144 0,501 5,0 8,54·10-8

54 0,188 4,5 1,05·10-7

36 0,125 4,0 1,33·10-7

18 0,063 4,0 1,33·10-7

G

270 1,066 10,0 5,24·10-8

144 0,569 8,5 7,25·10-8

54 0,213 8,0 8,18·10-8

36 0,142 7,5 9,31·10-8

18 0,071 7,0 1,07·10-7

20



P

270 1,153 6,0 7,04·10-10

144 0,615 2,0 6,34·10-9

54 0,231 4,0 1,58·10-9

36 0,154 3,0 2,82·10-9

18 0,077 - -

M

270 2,253 4,0 9,19·10-8

144 1,202 3,0 1,63·10-7

54 0,451 2,0 3,68·10-7

36 0,300 1,5 6,53·10-7

18 0,150 - -

G

270 1,304 6,0 9,07·10-8

144 0,696 3,0 3,63·10-7

54 0,261 7,0 6,67·10-8

36 0,174 8,0 5,10·10-8

18 0,087 3,0 3,63·10-7



P

270 2,494 5,0 1,16·10-9

144 1,330 - -

54 0,499 2,0 7,23·10-9

36 0,332 1,5 1,29·10-8

18 0,166 1,0 2,89·10-8

M

270 3,282 6,0 2,55·10-8

144 1,751 4,5 4,54·10-8

54 0,656 5,5 3,04·10-8

36 0,438 5,0 3,67·10-8

18 0,219 4,0 5,74·10-8

G

270 3,420 8,0 5,83·10-8

144 1,824 7,5 6,63·10-8

54 0,684 5,0 1,49·10-7

36 0,456 7,0 7,61·10-8

18 0,228 4,5 1,84·10-7

A partir de Deff, calculou-se Ds, pela seguinte relação:

(16)

21

onde p é a porosidade do gel (p = 7), é a tortuosidade do gel ( = 0,98) e H é o

coeficiente de restrição. H pode ser obtido pela Equação de Renkin (17):

( )( ) (17)

sendo y dado por:

(18)

em que raioS é o raio do soluto e raioP é o raio do poro de catalisador.

Com o valor de y, foi obtido H = 0,9814, a partir do qual se calcularam as

diferentes difusividades Ds. As Tabelas de 13 a 15 apresentam os valores calculados

de Ds para cada uma das condições estudadas durante o experimento.

Tabela 13 – Valores estimados de Ds (a 60°C).

Diâmetro do catalisador Cs0 (g/L) Ds (cm2/s)

P

270 1,08·10-7

144 4,32·10-7

54 -

36 2,43·10-7

18 1,35·10-6

M

270 3,68·10-7

144 6,22·10-7

54 7,68·10-7

36 9,71·10-7

18 9,71·10-7

G

270 3,81·10-7

144 5,28·10-7

54 5,96·10-7

36 6,78·10-7

18 7,78·10-7

22



P

270 8,54·10-7

144 7,69·10-6

54 1,92·10-6

36 3,42·10-6

18 -

M

270 6,69·10-7

144 1,19·10-6

54 2,67·10-6

36 4,76·10-6

18 -

G

270 6,60·10-7

144 2,64·10-6

54 4,85·10-7

36 3,71·10-7

18 2,64·10-6



P

270 8,42·10-9

144

54 5,26·10-8

36 9,36·10-8

18 2,11·10-7

M

270 1,86·10-7

144 3,30·10-7

54 2,21·10-7

36 2,67·10-7

18 4,18·10-7

G

270 4,24·10-7

144 4,83·10-7

54 1,09·10-6

36 5,54·10-7

18 1,34·10-6

23

4.4 Discussão

O experimento realizado utilizou o modelo cinético de Michaelis-Menten. Para

isso, foi necessário estabelecer algumas condições e hipóteses para a validade do

modelo. Assim, trabalhou-se com concentrações de frutose muito maiores que a

concentração de enzima, e considerou-se a hipótese de Briggs e Haldane do estado

pseudo-estacionário, ou seja, a velocidade de formação do complexo enzima-

substrato é igual a sua velocidade de decomposição, considerada de primeira

ordem. Além disso, o modelo de Michaelis-Menten pressupõe apenas um substrato,

que é o caso da isomerização da frutose.

A partir dos dados experimentais, construiu-se o gráfico de velocidade de

consumo do substrato em função de sua concentração inicial. A linearização da

equação de Michaelis-Menten realizada foi considerada satisfatória, obtendo-se um

valor de R² igual a 0,9966.

Comparando-se os valores obtidos de velocidade máxima de consumo de

substrato, é possível afirmar que o aumento da concentração inicial de frutose

promoveu o aumento da velocidade da reação. De fato, o crescimento na

concentração de substrato promove a maior ocupação dos sítios ativos da enzima,

aumentando, assim, a interação substrato-catalisador.

Pôde-se perceber também que o aumento do diâmetro da partícula acarretou

na diminuição da velocidade de reação, já que, quanto maior a partícula, maior o

efeito difusivo, dificultando ainda mais a transferência de substrato ao interior do

catalisador, onde se encontram alojados os sítios ativos da enzima.

O aumento da temperatura também ocasionou o aumento da velocidade de

formação de produto, pois a enzima atua melhor a temperaturas entre 60°C e

80°C(6). Não foi possível verificar, durante o experimento realizado, a desnaturação

térmica do catalisador, que ocorre com o crescimento da temperatura.

Os parâmetros vmáx e Km determinados para a enzima livre são intrínsecos a

enzima, enquanto que os parâmetros obtidos para a enzima imobilizada são

aparentes, pois refletem o que ocorrem na superfície ou interior do catalisador,

sendo estimados na presença de efeitos difusionais internos e externos.

O experimento realizado trabalhou com o gel quitosana ativado com

glutaraldeído. Por ser um suporte poroso, os efeitos difusivos internos e externos

24

não são levados em conta separadamente, ou seja, a efetividade encontrada foi

determinada experimentalmente e representa, principalmente, aquela interna.

Em virtude da inconsistência dos dados experimentais, não foi possível

avaliar a difusividade do catalisador. Como cada grupo empregou condições

operacionais diferentes, o erro de cada experimentador promoveu uma série de

propagação de erros que influenciaram de forma significativa nos dados

experimentais. Além disso, o emprego de diferentes soluções de GOD-PAP, a perda

de massa de catalisador durante a sua transferência até o reator encamisado,

problemas no momento da pipetagem também contribuíram para a obtenção de

dados experimentais inadequados.

A alta agitação no reator (por volta de 300 rpm, considerando a sensibilidade

da enzima) permite que se faça uma aproximação da concentração de substrato

próximo a superfície do catalisador como igual a concentração do meio. Assim,

subentende-se que os efeitos difusivos internos são mais relevantes que os

externos, efeitos estes expressos a partir da efetividade experimental.

Por fim, também não foi possível realizar uma análise da influência do

diâmetro de catalisador na energia de ativação, devido à variação dos valores

medidos, os quais não apresentaram uma tendência definida. Contudo, espera-se

que a energia de ativação aumente com o diâmetro do catalisador, pois o aumento

difusivo diminui a velocidade de reação, desacelerando a catálise.

25

5 CONCLUSÃO

Os parâmetros cinéticos obtidos para todos os grupos apresentaram-se

condizentes com o esperado, já que de forma geral, os valores de vmax aumentaram

com a temperatura e diminuíram com o tamanho de partícula de catalisador.

Os valores de difusividade molecular (Ds) calculados se apresentaram da

mesma ordem de grandeza dos valores disponíveis na literatura (7), apesar da

inconsistência de tais valores entre as diferentes temperaturas e diâmetros, devidos

principalmente aos erros referentes à leitura do ábaco de Thiele e erros

experimentais propagados.

Por fim, o experimento se mostrou adequado no que se propõe ao estudo dos

efeitos difusivos na cinética de uma reação catalisada por enzima imobilizada,

processo de grande importância econômica e tecnológica.

26

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] GALLO, L.,A.. Enzimas. Bioquímica. Escola Superior de Agricultura "Luiz de

Queiroz" - ESALQ – USP. Disponível em: <http://docentes.esalq.usp.br/luagallo/

enzimas.html>. Acesso em 25 de outubro de 2013.

[2] MARIOTTO, J.R. Cinética Enzimática. Estágio de Docência. Julho de 2006.

30p. Disponível em: <http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/apostilas/

Apostila_cinetica_enzimatica_ju.pdf>. Acesso em 07 de outubro de 2013.

[3] BIOCIÊNCIA. Actividade enzimática. Abril de 2011. Disponível em:

<http://bio12-ciencia.blogspot.com.br/2011/04/actividade-enzimatica.html>. Acesso

em 07 de outubro de 2013.

[4] DIAS, F.R.F.; FERREIRA, V.F.; CUNHA, A.C. Uma Visão Geral dos

Diferentes Tipos de Catálise em Síntese. Rev. Virtual de Química. 2012, 4 (6),

840-871.

[5] CARDOSO, C. L.; MORAES, M. C.; CASS, Q.B.. Imobilização de enzimas

em suportes cromatográficos: uma ferramenta na busca por substâncias

bioativas. Quím. Nova [online]. 2009, vol.32, n.1, pp. 175-187.

[6] FABER, M. O. Isomerização Enzimática de Glicose a Frutose em

Biorreator de Leito Fixo Alimentado Continuamente. Dissertação de Mestrado.

Rio de Janeiro: UFRJ, 2011. Disponível em: <http://tpqb.eq.ufrj.br/download/

isomerizacao-enzimatica-de-glicose-e-frutose.pdf>. Acesso em 07 de outubro de

2013.

[7] GIORDANO, R. L. C.; GIORDANO, R. C.; COONEY, C. L. A study on intra-

particle diffusion effects in enzymatic reactions: glucose-fructose

isomerization. Bioprocess Engineering, v. 23, p. 159-166, 2000.

experimento 2 - isomerase imobilizada (final) 2

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