PROFESOR: Ing. ROBERTO Mendoza Rendn

Universidad Nacional de PiuraFACULTAD DE CIENCIASESCUELA PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICASPROFESOR: Ing. ROBERTO Mendoza Rendn ALUMNOS: ARANDA ALVARADO JONATHANEXPERIMENTO DE KORNBERG REFERENTE A LA COMPOSICION DE LAS BASES DEL ADN SEMINARIO N* 7 : AO DE LA DIVERSIFICACION PRODUCTIVA Y DEL FORTALECIMIENTO DE LA EDUCACION

Fue un bioqumico estadounidense.

Nacido en Brooklyn el 3 de marzo de 1918, estudi en el City College de Nueva York y obtuvo el ttulo de graduado en Medicina por la Universidad de Rochester en 1941, siendo despus alumno interno en el Strong Memorial Hospital en Rochester.

Desde 1942 hasta 1952 trabaj en los laboratorios de los Nacional Institute of Health (NIH), haciendo algunas estancias en otros centros de investigacin. Una de ellas fue en la Universidad de Nueva York para trabajar con Severo Ochoa, con quien compartira, posteriormente, el Premio Nobel de Fisiologa o Medicina (1959).

Arthur Kornberg (Brooklyn, Nueva York, 3 de marzo de 1918 - 26 de octubre de 2007)BREVE INTRODUCCION AL EXPERIMENTO DE ARTUR KORNBERG :

Objetivo del experimento :Su objetivo fue lograr la sntesis de cidos nuclicos fuera de la clula viva, utilizando como patrn ADN natural, generando asi un ADN completamente sinttico que posea las mismas propiedades que el material nativo.

Hiptesis de la investigacin : Hiptesis sobre la aplicacin de los tomos radiactivos:

Esta hiptesis se basa en el uso de tomos radiactivos para marcar el nucletido, de modo que incluso en pequeas cantidades, pudiramos detectar su incorporacin en el cido nuclico. Lamentablemente los sistemas enzimticos para la sntesis del acido nucleico, encontrados en extractos de timo, mdula sea y clulas bacterianas, poseen una potente actividad para degradar los cidos nucleicos, y por esta razn agregaron los nucletidos marcados a un conjunto de cidos nucleicos, porque aunque en la mezcla hubiera destruccin neta de cidos nucleicos, podra detectarse la sntesis de unas pocas molculas atrapadas en el conjunto.

Hiptesis de la precipitacin de cidos nucledos:

La precipitacin de los cidos nucleicos permite su purificacin y concentracin. Se basa en la simultnea neutralizacin de las cargas negativas (mediante el aadido de sales), y deshidratacin de la molcula (mediada por el agregado de alcoholes, tpicamente etanol o isopropanol ), lo cual lleva a su precipitacin.

La precipitacin es un fenmeno reversible (mediante la disolucin en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con la desnaturalizacin (potencialmente reversible) ni con la degradacin (irreversible) de los mismos.

Hiptesis del Anlisis del vecino ms prximo:

Esta determina la frecuencia relativa con que dos nucletidos resultan unidos lateralmente en una molcula de ADN sinttico. Hay en total 16 combinaciones posibles y, de ellas, cuatro secuencias posibles de vecinos ms prximos de Adenina (Adenina Adenina, Adenina Guanina, Adenina Timina y Adenina Citocina ), cuatro de Guanina ( Guanina Adenina, Guanina Guanina, Guanina Timina, Citocina Guanina) y, anlogamente, cuatro de Timina y cuatro de Citocina.

Este anlisis consiste en utilizar primero, durante la sntesis, un trifosfato marcado con un atomo de fosforo radiactivo y tratar despus el ADN sintetizado con una enzima especifica que rompa el ADN, dejando el tomo de fosforo radioactivo unido a su vecino ms inmediato.

Hiptesis del Broche:

Dado el problema en el cual el ADN polimerasa no se sabia si podra ser posible que se orientase a si misma e iniciara la replicacin sobre un moldede ADN que no tenia extremos, como el del virus bacteriano de lazo cerrado X174.

Por su apariencia en las imagines obtenidas por el microscopio electrnico del virus X174 si preguntaban si solo era realmente un simple lazo, con el hecho de que pareca un collar con broche, en el que cuya composicin intervenan sustancias no relacionadas con los nucletidos. Por el trabajo de Sinsheimer, en el que el ADN del X174 tenia que constituir un lazo completamente cerrado para ser infeccioso, y conocan tambin que su polimerasa solo poda catalizar la sntesis de molculas lineales de ADN.

Investigando mas sobre el problema, pudieron encontrar una enzima unidora de polinucleotidos que tiene la capacidad de reparar mellas en la cadena de ADN. Las mellas ocurren donde hay rotura en la columna vertebral azcar-fosfato de un filamento de la molcula de ADN. La enzima solo puede reparar una rotura cuando todos lo que falta es el enlace covalente entre un azcar y su fosfato vecino en el espinazo del ADN.

Metodologa del experimento :a.- Materiales:

* El virus X174: que posee una cadena sencilla en forma de lazo cerrado.

* Bacteria Escherichia coli: que al ser infectada por el virus QX174 el lazo de la cadena sencilla de ADN acta de molde dirigiendo la sntesis enzimtica de un segundo lazo de ADN sinttico. Los dos lazos forman una doble hlice anular, similar a las hlices de ADN que se encuentran en las clulas bacterianas y en los organismos superiores.

* Enzimas celulares: con la ayuda deesta Kornberg pudo realizar sus experimentos, estas son usadas como catalizadores.

* Enzimas purificadas: ayudan en la sintetizacin de grandes molculas en sistemas libres de clulas, junto con las coenzimas.

* Coenzimas: ayudan en la sintetizacin de grandes molculas en sistemas libres de clulas.

* Bromouracilo: se necesito cambiar la timina por 5 bromouracilo, que contiene un tomo de bromo (Br) en el lugar de la timina que lleva un grupo de CH3 siendo mas ligero, para as marcar el ADN sintetico.

* tomos radiactivos, para marcar el nucletido.

* Desoxitimidina: compuesto radiactivamente marcado q fue incorporado al ADN por clulas de medula osea y otras clulas animales, en los primeros ensayos de Kornberg.

* Tubo de ensayo: contenedor de vidrio para realizar mezclas.

b.- Experimentacin:

* La sntesis del ADN del virus X174, se consigui a travs de los siguientes pasos:

1.- Se utiliz como molde el ADN circular de cadena sencilla, marcado con tritio del X174.

2.- Se le aadieron junto con ADN polimerasa, nucletidos activados de Adenina, Guanina, Citocina y, en lugar de Timina, 5 bromouracilo. Uno de los nucletidos activados se marco con fosforo radioactivo. El ADN sintetizado sobre molde era completo, pero todava no constitua un lazo cerrado.

3.- La unin de los extremos del lazo se efectuo aadiendo la enzima de cierre.

4.- Ahora se aadi suficiente nucleasa para conseguir la rotura de una de las cadenas en aproximadamente la mitad detodas las cadenas dobles.

5.- Esto dio lugar a una mezcla de lazos dobles completos, lazos del molde, lazos sinteticos, cadenas lineares del molde y cadenas lineares sinteticas. Puesto que las cadenas sintticas contenan 5 bromouracilo eran ms pesadas que las cadenas del molde y pudieron ser separadas que las cadenas molde y pudieron ser separadas por centrifugacin.

6.- Los lazos sintticos fueron ahora aislados y utilizados como moldes para hacer lazos dobles completamente sintticos.

* Para poder marcar el ADN sinttico se puede sustituir la timina por 5 bromouracilo, que contiene un tomo de bromo (Br) en el lugar en que la timina lleva un grupo de CH3, haciendo mas ligero el ADN.

Resultados de la investigacin :En las experimentaciones de Kornberg y sus colegas tuvieron hallazgos importantes para lograr su objetivo que luego revolucionara la ingeniera gentica.

Se demostr que el ADN sinttico era una molcula con la estructura qumica tpica del ADN y con la misma proporcin de pares Adenina- Timina y Guanina-Citocina que el ADN utilizado como patrn para dirigir la reaccin..

Al examinar las propiedades fsicas del ADN sinttico, observ que tena la alta viscosidad, la comparativamente lenta velocidad de sedimentacin y otras propiedades fsicas tpicas del ADN natural. El ADN nuevo era por tanto como el natural, una molcula polimrica larga y fibrosa. Adems, cuanto mas tiempo se dejaba incubar la mezcla de los ingredientes activos mayor era la viscosidad del producto, lo cual era unaprueba directa de que el ADN sinttico continuaba creciendo en longitud y en cantidad.

Se realizaron tambin varias tcnicas para comprobar la funcionabilidad del ADN sinttico; una de ellas se le llama Anlisis del vecino mas prximo. De este anlisis se dedujo, entre otras cosas, el reconocimiento de un hecho bsico sobre la estructura de la doble hlice, La direccin de la cadena de ADN sintetizada durante la replicacin era opuesta a la de su molde. Por inferencia podemos concluir que las cadenas de la doble hlice del ADN natural tienen que discurrir en direcciones contrarios, como propusieron Watson Y Crick.

Sin embargo la exactitud del anlisis de la frecuencia de vecinos ms prximos no puede ser, aunque este se efectu con el mismo cuidado, superior al 98 por ciento. Consecuentemente, continuaron desconfiados respecto a la precisin de la copia de cadenas conteniendo, segn la longitud de los genes 1.000 o ms nucletidos

Antecedentes de la investigacion :El Doctor Arthur Kornberg: bas su trabajo sobre un estudio anterior realizado por l mismo, en el cual ,a partir de 60 Kg de Escherichia coli, logr obtener miligramos de una enzima que l denomin ADN polimerasa; sta era capaz de sintetizar una nueva cadena de ADN a partir de una cadena existente empleando nucletidos trifosfato. Esta enzima cataliza la produccin de nuevas cadenas de ADN, adems mostr cmo una sola hebra de ADN forma nuevas cadenas de nucletidos, y demostr la estructura de doble hlice del ADN.

Podemos concluir con que Kornberg descubri una enzima en la bacteria intestinal Escherichia coli, la ADN polimerasa, con la cual sintetiz por primera vez cido desoxirribonucleico (ADN ) en el tubo de ensayo, lo que le vali el Nobel que comparti con su maestro y amigo el cientfico Severo Ochoa.

Datos Curiosos :Algo curioso que descubrimos mientras realizbamos el trabajo fue la longevidad del Dr. Kornberg, ya que muri a la edad de 89 aos, y que al igual su hijo llamado Roger David Kornberg obtuvo un Premio Nobel, Kornberg lo obtuvo en Medicina en 1959 mientras que su hijo en el rea de Qumica en el 2006.

Roger David Kornberg(St. Louis,Missouri,USA,24 de abrilde1947)