EXPLORAREA HEMOSTAZEI

2009-2010

DEFINITIE

Proces de formare a coagulului sanguin la locul de injurie a unui vas de sange pt a stopa pierderile de sange

Proces rapid, localizat si foarte bine reglat

Sangerari anormale sau tromboze pot sa apara cand elemente specifice ale acestui proces lipsesc sau sunt disfunctionale

Elemente cheie

• Sistemul vascular – endoteliu

• Plachete

• Factori ai coagularii

• Sistemul fibrinolitic

FAZE PROCES HEMOSTATIC

DIDACTIC: HEMOSTAZA PRIMARA dop plachetar instabil HEMOSTAZA SECUNDARA coagul fibrino-plachetar stabil

FIZIOLOGIC – 4 faze: Initierea si formarea dopului plachetar

Propagarea procesului de coagulare de catre cascada coagularii

Finalizarea coagularii prin interventia mecanismelor de control antitrombotice

Inlaturarea coagulului prin fibrinoliza

Formarea dopului plachetar

Plachetele sunt activate la locul injuriei pt a forma dopul plachetar initial ce asigura efectul hemostatic si stopeaza sangerarile mici si moderate

Raspuns functional plachete: ADEZIUNE – depunere plachete pe matrixul subendotelial AGREGARE – coeziune plachete-plachete SECRETIE – eliberare continut granule ACTIVITATE PROCOAGULANTA – amplificarea formarii de trombina

Activare plachete – de catre numerosi stimuli fiziologici: ADP, epinefrina – activatori slabi trombina, colagen – activatori puternici

Secvente normale hemostaza(4 pasi)

1. Vasoconstrictie arteriolara Reflex neurogenic

Reducere sangerare

2. Expunere subendoteliu – formare dop plachetar

ECM, in special colagen

Plachetele adera si devin active

▪ Modificari forma▪ Eliberare continut granule

Agregare plachete pt formare dop plachetar

Secretie – eliberare continut plachetar

= hemostaza primara

3. Factorul tisular eliberat la locul injureiei de catre celulele endoteliale Interactioneaza cu factorii eliberati de plachete Activeaza cascada coagularii pornind de la nivelul

plachetelor activate

• Este activata trombina• Sunt recrutate si activate alte plachete

In final – depunere fibrina = hemostaza secundara

4. Formarea dopului fibrinoplachetar stabil

Previne hemoragia

Interventie mecanisme de control (t-PA) limiteaza formarea dopului fibrinoplachetar doar la nivelul injuriei

Cascada coagularii

Conversia in cascada a unor serii de proenzime inactive in enzime active formare trombina

Trombina converteste fibrinogenul plasmatic solubil in fibrina insolubila

FACTORII COAGULARII

1. Zimogeni sintetizati hepatic, vitamina K dependenti: F II – protrombina F VII - proconvertina F IX- Christmas (hemofilia B) F X – Stuart Prower Proteina C – anticoagulant, cofactor proteina S

! Formele activate ale fact VII, IX, X, asociaza cofactori specifici pt indeplinirea rolului in cascada coagularii: VIIa – factor tisular, IXa – VIIIa, Xa – Va.

! Trombina actioneaza direct asupra fibrinogenului ca fact procoagulant; in asociere cu trombomodulina anticoagulant prin activarea proteinei C.

13

procoagulanti

FACTORII COAGULARII2. Cofactori solubili: F V – proaccelerina F VIII – antihemofilic A F von Willebrand – molecula carrier pt FVIII Proteina S – anticoagulant, cofactor clivare si inactivare Va, VIIIa

3. Factori de contact: F XI – activat in vitro de F XII, in vivo nu necesita obligatoriu factorii de

contact, poate fi activat de trombina de pe supraf plachetara F XII - Hageman HMWK(kininogen) - Fitzgerald Prekalikreina- Fletcher

4. Cofactori celular asociati: Factorul tisular – TF (III, tromboplastina tisulara) factor major de initiere

coagulare in asociere cu VIIa

5. Fibrinogenul (F I)6. F XIII – stabilizator fibrina

14

procoagulanti

Responsabili de activarea de contact a coagularii

FACTORI INHIBITORI / REGLATORI

Inhibitorul caii factorului tisular- rol inhibitor pt fact Xa si VIIa/TF

Antitrombina III – ATIII- blocheaza situsurile active ale trombinei, fact Xa si IXa

Proteina C – sinteza hepatica, activata de complexul trombina-trombomodulina, actioneaza ca si cofactor pt proteina S in inactivarea factorilor Va, VIIIa

Proteina S – sintetizata hepatic, asociaza proteina C si Ca in reglarea coagularii

Trombomodulina- gp sintetizata de celula endoteliala, leaga -trombina schimbandu-I specificitatea de substrat

15

MODEL CELULAR HEMOSTAZA

16

CELULA TF+

VIITF, receptor pt F VII

VIIa/TF cx

Activare X trombinaActivare TrActivare VActivare VIIIActivare XI

Activare IX

Tr activat

VIIIa

XIa

IXa

X

Xa

Va

II

IIa

ADP

Tromboplastina intrinseca

adrenalina

Caile coagularii

Doua cai de formare a fibrinei

• Intrinseca• Initiata de suprafete incarcate negativ

• Extrinseca• Initiata de injuria tisulara

Ambele converg catre cale finala comuna

• Protrombin a Trombina

• Fibrinogen Fibrina coagul

Activarea in cascada a sistemului coagularii

18

19

Controlul coagularii Antitrombine (e.g., antitrombina III)

Proteina C and S Sistemul fibrinoltic

• Plasminogen plasmina produsi de dgradare ai fibrinei (PDF) – D-dimer reprezentant major al PDF

Anticoagulanti naturali

Sistemul fibrinolitic

Fibrinoliza

http://www.si.mahidol.ac.th/department/biochemistry/home/md/courseware_202/lec/hemostasis_lec.pdf

Reglarea fibrinolizei

http://www.si.mahidol.ac.th/department/biochemistry/home/md/courseware_202/lec/hemostasis_lec.pdf

Dezechilibru hemostaza

coagulare

antifibrinoliza

defect

Hemoragii

fibrinoliza

anticoagulare

defect

Tromboze

Bleeding disorders

Vascular abnormalities

Platelet disordersClotting factorabnormalities

DIC

Plasma Componenta non-

celulara a sangelui

Ser Plasma fara fibrinogen si Alti factori ai coagularii

Evaluare de laborator

Timp vasculo-plachetar- numar trombocite

- teste functionale

agregare plachetara

activitatea ristocetinei

- timp de sangerare

- testul garoului (Rumpel-Leede)

NUMAR TROMBOCITE Numarare manuala – imprecisa, consumatoare de timp Metode automate - rapid, precis

Metode optice   Flow cytometrie

N = 150,000 - 450,000 /mcL - trombocitopenia – risc crescut de sangerare - trombocitoza- tromboze

TESTE FUNCTIONALE PLACHETARE Raportul numarului de plachete pt evaliuare functionala – raportul

intre numarul de plachete dintr-o proba de sange, inainte si dupa stimularea cu un agonist (ADP, epinefrina) evalueaza capacitatea de agregare corelat bine cu agregometria

Agregometria plachetara implica o serie de teste efectuate pe sange integral sau plasma imbogatita in plachete , utilizand cativa agonisti.

Acid arahidonic. Trombina ADP Epinephrine Collagen Ristocetin- necesita FWv si receptori membranari integrii

EVALUARE FUNCTIONALA PLACHETARA

Agregometria plachetara Clasica – plasma imbogatita in plachete (obtinuta prin

centrifugare) stimulata cu ADP, epinefrina, ristocetina – evaluare agregate prin turbidimetrie

Depinde de functia normala a plachetelor, de concentratia de agonisti

nu poate detecta agregate formate din mai putin de 100 Tr

Agregometrie sange integral Prin impedanta electrica

Light scattering methods  Analiza flow-citometrica a marimii particulelor

Platelet function analyzer  (PFA-100®)

Expunere plachete sange integral la un flux rapid (5000 to 6000/sec) prin tuburi capilare si monitorizarea scaderii fluxului pe masura formarii dopului hemostatic in centrul unei membrane acoperite cu ADP si colagen

Rezultatul testului exprimat ca timp de inchidere

Poate inlucui timpul de sangerare in vivo

Test screening pt evaluare functionala

Nu este speific unei anomalii

EVALUAREA ACTIVARII PLACHETARE

MARKERI SOLUBILI AI ACTIVARII – factorul 4 plachetar, beta tromboglobulina, TX B2

Flow citometrie - CD62p, CD63, LAMP-1, CD40L, GpIIb/IIIa complex

Agregarea Ristocetin indusa

Masoara afinitatea de legare a factorului vW la receptorul plachetar GP Ib

Plasare plachete pacient intr-o serie de eprubete in care se adauga concentratii joase de risatocetina (0.4 - 1.2 mg/mL)

Se urmareste formarea sau nu a agregatelor in fiecare tub

Ristocetina adaugata la sangele normal determina aglutinare

In boala von Willebrand, unde factorul von Willebrand este defect sau absent apare aglutinatinare anormala

VWF antigen - ELISA

VWF activitate Activitatea cofactorului ristocetinic (VWF:RCo), "gold

standard" pt activitatea VWF

Activitatea cofactorului ristocetinic si nivelul FvW in hemostaza primara

37

Boala in cauza Activitatea CoF Ristocetinic

FvW

B von W tip III

B von W tipIIB prin consum

B von W tip I, IIA dg dificil, nivel FvWn

Pseudo-B von W prin consum

Sd. Bernard Soulier

N

TIMPUL DE SANGERARE Metoda Duke (lobul urechii) Metoda Ivy (antebrat) Test de sange ce urmareste cat de repede se opreste sangerarea de

vase mici Islab reproductibil, invaziv, consumator de timp Cu toate acestea - screening test de prima intentia in clinica

Normal 2-10 minute (Ivy) Valori crescute - thrombocytopenia, disseminated intravascular coagulation

(DIC), Bernard-Soulier disease, Glanzmann's thrombasthenia, Aspirin

EXPLORAREA GLOBALA A HEMOSTAZEI

1. TIMPUL DE SANGERARE TS METODA DUKE

Tehnica: dezinfectare lob ureche sau pulpa deget inelar, intepatura de 3-4 mm adancime, tamponare cu hartie de filtru din 30 in 30 de secunde pana la oprirea sangerarii.

Normal = 2-4 minute METODA IVY

Tehnica: incizie pe fata anterioara a antebratului sub o presiune constanta de 40 mm Hg obtinuta cu manson tensiometru, cronometrare timp necesar hemostazei; incizie standard greu de obtinut.

Normal = 4 – 10 minute

39

TS:

•reproductibilitate dificila, standardizare dificila•este inconstant modificat in anomalii de vas•scade usor odata cu inaintarea in varsta•nu exista corelatii intre TS si pierderile de sange intravisceral•test primar de screening de ale carui limite trebuie sa tinem cont

• Testul de toleranta a aspirinei – prelungeste TS la cei la limita; discutabil

Semnificatie: TS alungit orienteaza catre o vasculopatie, trombocitopenie, alterare fct Tr (aspirina) si mai rar catre o coagulopatie.2. NUMAR SI FUNCTIE TROMBOCITARA

1. EXPLORAREA REZISTENTEI VASCULARE PROBA VENTUZEI

• Tehnica: decompresiune a unei suprafete cutanate cu ajutorul unei palnii de sticla sau ventuze conectate la o pompa aspiratoare si manometru cu mercur - se determina momentul de aparitie si numarul de petesii aparute ca rezultat al decompresiunii.

• Rezistenta capilara normala nu apar petesii pana la o decompresiune de 20-25 mm Hg la adult, 30 mm Hg copil.

PROBA RUMPELL-LEEDE • Tehnica: tensiometru aplicat deasupra cotului si se ridica presiunea la o valoare intre

presiunea sistolica si cea diastolica timp de 5 minute.• Rezistenta capilara normala nu apar petesii. Fragilitate capilara cu atat mai mare cu

cat numarul si intinderea petesiilor sunt mai mari.

Intrucat rezistenta si permeabilitatea capilara depind de integritatea morfologica si functionala a vasului dar si de numarul si calitatea trombocitelor, proba ventuzei si Rumpell-Leede sunt pozitive atat in vasculopatii cat si in afectiuni plachetare.

40

PT, INR PTT, aPTT

TT

ACT

Cascada coagularii

EXPLORAREA TIMPULUI PLASMATICTIMPUL DE COAGULARE (TC)-Lee-White: timp coagulare sange venos in eprubeta hemostaza, la 370; n=8 – 12 min. Evalueaza calea intrinseca, sensibilitate scazuta.

TIMPUL HOWELL (TH) timp coagulare plasma decalcificata (recoltare pe sodiu citrat) dupa recalcificare, la 370 cronometrare timp formare cheag fibrinaEvalueaza calea intrinseca, punct de pornire FXII activat de supraf electronegativa a eprubetei (1,10-2,10 min) nu deceleaza tulburari minore coagulare

43

Timpul de cefalina sau de tromboplastina partiala (PTT)

exploreaza coagularea intrinseca + comuna

timp recalcificare plasma saraca in trombocite cu suspensie cefalina (tromboplastina partiala ) n=70-110 s

valori normale in diateze hemoragice de natura plachetara (Tr este exclus din test, plasma saraca)

prelungire in deficit factori tromboplastinici sau al complexului protrombinic

PTTaPTT

44

APTT – deficit factori coagulare IX, XI, VIII, XII, PK, HMWK, sau prezenta inhibitori

-aPTT descopera inhibitorii obisnuiti: anticoagulanti lupici, Ac anti-fosfolipid care interfera cu reactivul fosfolipidic folosit in reactie diluarea plasmei scade concentratia inhibitorilor si aPTT tinde sa scada

-aPTT folosit pt monitorizarea terapiei cu heparina: aPTT=1,5-2,5x timp referinta

Timpul de tromboplastina partiala activata (aPTT)

cefalina (tromboplastina partiala) + plasma cercetata expusa la suprafete incarcate negativ (activata) , aceasta fiind diferenta fata de PTTn=40-60 s

EXPLORAREA ETAPELOR COAGULARII

I. TROMBOPLASTINOFORMAREA

Timp de consum de protrombina (TCP)= ser cercetat+tromboplastina calcica +plasma adsorbita (VIII, XI, V) sau fibrinogen n= 30 sec

investigheaza formarea protrombinazei pe cale intrinseca

este singurul test care se lucreaza pe ser si singurul la care valorile scazute sunt patologice

evidentiaza indirect deficite factori coagulare XI, IX, VIII

Mecanism: protrombina reziduala din ser se transf in trombina in prezenta tromboplastinei calcice. Deficit al formarii protrombinazei (IX, XI, VIII) face sa ramana cant mare de protrombina care in prezenta tromboplastinei calcice formeaza cheagul mai rapid.

CALE INTRINSECA CALE EXTRINSECASuprafata incarcata negativ (in vitro-sticla, caolin, dextransulfat)

Factorul tisular

XII

XIa

XIIa

IX

XI

VIIIa

X

VaVVIII

I

II

XaIXa

IIa

VIIa-VII Ca2+

PK, HMWK

Ca2+

Ca2+

PL membranar

Ia

PL membranar

Ca2+

T. TrombinaT. Reptilaza(15 -20”)

TENAZA

PTT, aPTT (40-60 “)

TQ/TP(11-15 “)

TCP (30”)

PROTROMBINAZA

T Howell=1,1-2,1 min

Teste de corectie

47

• constau in refacerea timpului Howell si aPTT cu reactivi ce contin factorul considerat deficitar•Reactivii folositi sunt:

•plasma normala proaspata – contine toti factorii (PN) •plasma normala proaspata adsorbita pe sulfat de bariu – contine F VIII si XI (PAD)•ser vechi – contine F XI si IX (SV)•cefalina in suspensie (C) – daca se lucreaza T Howell, aici participa si Tr

eprubeta E1 E2 E3 E4

Reactiv PN PAD SV C Deficit de factor

Corectia testului

+ + - - VIIIHemofilia A

+ - + - IXHemofilia B

+ + + - XIHemofilia C

+/- - - + Fp3

- - - - Inhibitoriprotrombinaza

48

II. TROMBINOFORMAREA

timpul Quick / timp protrombina = plasma de cercetat (citratata, fara Tr post centrifugare la 2500 g, 15 min) + tromboplastina calcica n= 11-15 sec.

evalueaza factorii II, V, VII, X, trombino, fibrinoformarea cale extrinseca

- deficit II, V, VII, X, deficit vit K, hipo/afibrinogenemii

INR= International Normalized Ratio protrombine time ratio (PTR)=timp protrombina pacient/timp martor (PTR =1 la n, =1,5-2,5 la cei cu anticoagulante orale)

INR = PTRISI = 0,5-1,5 (ISI – index international de sensibilitate)

T QUICKVII

X

II

V

FIBRINOGEN> 1,5 - hiopcoagulabilitateINR=2-3 la subiecti sub anticoagulant< 2 – risc tromboza>3 – risc hemoragie

49

Testul Koller = vitamina K parenteral la subiecti TQ + determinare TQ

TQ normal deficit aport sau absorbtie vitamina K

TQ alungit defect de utilizare

Timp Quick si timp partial tromboplastina in paralel = cale extrinseca + intrinseca

F II – protrombinaF VII - proconvertina F IX- Christmas (hemofilia

B)F X – Stuart Prower

Vit K

Testul generarii de tromboplastina:

plasma normala adsorbita (V, VIII, XI, XII)

ser normal (IX, X, XI, XII)

plachete (factorul III lipoproteic)

2 din reactivii de mai sus + 1 componenta pacient identificare defect in ser, plasma, trombocit

+ Ca tromboplastina

Algoritm de diagnostic utilizand teste de coagulabilitate globala

50

aPTT TQ (timp protrombina)

Deficit de factori

N CALE INTRINSECAXII, XI, IX, VIII

N CALE EXTRINSECAVII (parahemofilia Alexander)

CALE COMUNAX, V, II, IDEFICIT MULTIPLU (coagulopatie dobandita)

51

dozare fibrinogen plasmatic (gravimetric, colorimetric)

- hepatopatii severe, leucoze, fibrinolize primare, secundare

- infectii, hemopatii maligne, colagenoze, etc

activitate factor XIII- dizolvare cheag cu acid monocloracetic

cheag>2 ore – normal, < 5-15 min-lipsa factor XIII

III. FIBRINOFORMAREA

timpul de trombina = timp coagulare plasma oxalatata + exces trombina= timp de conversie fibrinogen fibrina

- deficit sau exces (inhiba activitatea trombinica) de fibrinogen; fibrinogen n cu anomalii fct.; inhibitori fmare fibrina: substante heparin-like (neoplazii), exces PDF

plasma normala corecteaza TT in hipo si afibrinogenemii, partial in fibrinoliza acuta

timpul de reptilaza

reptilaza coaguleaza fibrinogenul si este insensibila la anticoagulanti

in prezenta inhibitori polimerizare fibrina, normal in caz anticoagulanti antitrombinici

Algoritm de diagnostic in investigarea fibrino-formarii

52

FIBRINOGENEMIA TIMP TROMBINA

TIMP REPTILAZA

DIAGNOSTIC

HIPOFIBRINOGENEMIE

N DISFIBRINOGENEMIE

N N ANTICOAGULANTI CIRCULANTI

Retractia cheagului

53

• metoda de explorare a timpului trombodinamic• investigheaza indirect si hemostaza primara, depinde de activarea trombocitara, se desfasoara normal in functie de numarul si functia trombocitelor• recoltare 5 ml sange, eprubeta in baie de apa la 37 grade, se apreciaza retractia cheagului la 2 si la 24 ore prin cantitatea de ser expulzat• n= 30% ser expulzat la 2 ore si 45% dupa 24 ore

• varianta: apreciere retractie pe lama timpul necesar pt aparitia unei picaturi de ser pe lama cu o pic sange• n=30 min

EVALUAREA FIBRINOLIZEI

54

Plasminogen

Plasmina

Extrinsec: t-PA, urokinaza

Intrinsec: factor XIIa, HMWK, kallikrein

Exogeni: streptokinaza

Fibrina, fibrinogen

Fibrina, fibrinogen, produsi degradare

1. Timpul de liza a cheagului euglobulinic2. Evidentierea produsilor de degradare fibrina

1. Timpul de liza a cheagului euglobulinic- TLCE

55

• plasma de cercetat citratata, fara plachete (inlaturare prin centrifugare la viteza inalta, deoarece contin inhibitor-1 al plasminogenului) diluata cu apa distilata pt a scadea puterea inhibitorilor fibrinolizei + acid acetic precipitare fractiune euglobuline (factori ai coagularii, t-PA, complex activator tisular plasminogen-inhibitor1 al activatorului tisular al plasminogenului)• dizolvare precipitat in mediu tamponat• coagulare prin adaos de trombina cheag euglobulinic• liza cheagului euglobulinic in 60 minute• interpretare:

• TLCE - sindrom fibrinolitic – supraacut < 15 min, acut 15-30 min, subacut 30-60 min• nu poate face diferenta intre un sindrom fibrinolitic primar (crestere t-PA, scadere inhibitor t_PA) si unul secundar (CID)

2. Evidentierea produsilor de degradare fibrina-PDF

56

• PDF exista in ser in cant foarte mici, nedecelabili prin metode obisnuite• cresterea concentratiei se face fie prin cresterea productiei, fie prin scaderea degradarii si eliminarii lor

• reactie de hemaglutinare: aglutinare particule de latex acoperite cu Ac anti-fibrinogen

• daca testul foloseste Ac policlonali, nu se face diferenta intre monomeri si D-dimeri fibrina• test cu Ac monoclonali metoda dozare D-dimeri

• n: PDF – monomeri <10 mcg/ml; D-dimeri <250 mcg/ml

•Nivele crescute PDF:•CID, fibrinoliza primara, ciroza hepatica (asociaza un grad de CID dar si scaderea eliminare PDF), tumori solide, tromboza venoasa periferica, TEP

Algoritm de interpretare valori PDF

57

CID FIBRINOLIZA PRIMARA

CIROZA HEPATICA, TUMORI SOLIDE, LEUCEMII

TROMBOZA VENOASA PERIFERICA

PDF D-dimeri

PDFD-dimeri --

PDFD-dimeri

D-dimeri (nivele detectabile)

Diagnostic diferential CID – fibrinoliza primara

TLCE TQ aPTT Tr T. TROMBINA

FIBRINOGEN

PDF D dimeri

CID

FIBRINOLIZA PRIMARA

n n

Cauze ce determina anomalii ale testelor de hemostaza

Partial Thromboplastin

Time (aPTT)

Prothrombin Time (PT)

Thrombin Time (TT)

Bleeding Time (BT)

Factor deficiency (except VII)

VII, X, V, II, fibrinogen deficiency

Low or absent fibrinogen

Thrombocytopenia

Antibodies to clotting factors

Antibodies Dysfibrinogenemia, hypofibrinogenemia

Von Willebrand’s disease

Heparin Warfarin; Vit K defficiency (mild to severe)

Heparin Drugs (Aspirin, NSAIDs, high dose penicillins, etc.)

Excessive Warfarin Excessive Heparin Cirrhosis, Uremia, PLTs dysfunction

58

59

TESTE SCREENING:

Numar trombocite

Timp partial tromboplastina activata / PTT, aPTT

INR, timp protrombina/TQ

Timp trombina

Timp sangerare

Fibrinogen, dimeri

Retractia cheagului

Test Purpose

Formation of initial platelet plugs