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CO

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A’

DI

FA

RM

AC

IA –

CH

IMIC

A A

NA

LIT

ICA

METODI COLORIMETRICI E SPETTROFOTOMETRICI

• Sono un gruppo di tecniche analitiche che si basano

sulla interazione di una radiazione elettromagnetica

con la materia

• Esistono diversi tipi di metodi, basati sia su

interazioni con specie molecolari che atomiche

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IA –

CH

IMIC

A A

NA

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ICA

MECCANISMO DELL’INTERAZIONE

• Assorbimento: la luce viene assorbita da un atomo,

ione o molecola portandoli ad un più alto stato di energia

• Emissione: rilascio di un fotone da parte di un atomo,

ione o molecola portandoli ad un più basso stato di

energia

In funzione del tipo di interazione utilizzato, possiamo

distinguere metodi di assorbimento e di emissione.

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A’

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CH

IMIC

A A

NA

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ICA

LE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE (I)

Energia del fotone = h

h = costante di Planck (6,626 x 10-34 J s) = frequenza (s-1)

All’aumentare di la frequenza e l’energia del fotone diminuiscono

= cc = velocità della luce

Unità di più comuni:

nm = 10-9 mÅ = 10-10 m

m = 10-6 m

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ICA

LE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE (II)

Tipo Lunghezza d’onda Energia Interazione

< 0,1 nm emissione nucleare

raggi X 0,1-10 nm transizioni elettroniche (elettroni interni)

UV 10-380 nm transizioni elettroniche(elettroni di valenza)

Vis 380-800 nm transizioni elettroniche(elettroni di valenza)

IR 800 nm-100 m transizioni vibrazionali

Microonde 100 m- 1 cm transizioni rotazionali

onde radio 1 cm- metri assorbimento nucleare

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A A

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ICA

LO SPETTRO ELETTROMAGNETICO

= c / = c / E = hE = h

Energia

10-14 10-12 10-10 10-8 10-6 10-4 10-2 1 102 104 106 108 1010

1022 1019 1017 1015 1014 1010 106 103 1 10-3

Ultravioletto Visibile Infrarosso

Ra

gg

i c

os

mic

i

Ra

gg

i g

am

ma

Ra

gg

i X

Ult

rav

iole

tto

Vis

ibil

e

Infr

aro

ss

o

Mic

roo

nd

e

Ra

da

r

Te

lev

isio

ne

NM

R

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dio

Ult

ras

uo

ni

Su

on

i(u

dib

ile

)

Infr

as

uo

ni

Frequenza [Hz]

Lunghezza d’onda [m]

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CH

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A A

NA

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ICA

IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO

Una sostanza assorbe la luce solo quando l’energia della radiazione corrisponde a quella necessaria per far avvenire una transizione

Le transizioni possono essere:

• Elettroniche

• Vibrazionali

• Rotazionali

Le ultime due riguardano solo le molecole

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A A

NA

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ICA

SPETTRO DI ASSORBIMENTO ATOMICO

Anche con atomi, che è il caso più semplice, si ha un processo di assorbimento relativamente complesso.

L’atomo di idrogeno presenta uno spettro di assorbimento “a righe” complesso dovuto a transizioni elettroniche all’interno dei sottolivelli s,p,d,f

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A A

NA

LIT

ICA

Transizioni vibrazionaliCausano modifiche nella lunghezza di un legame e quindi nella separazione media di due nuclei (IR)

A B A B

Transizioni rotazionaliCausano modifiche dell’energia di una molecola quando essa ruota rispetto al suo centro di gravità (microonde)

A----B A----B

IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO

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IA –

CH

IMIC

A A

NA

LIT

ICA

• L’interazione con una molecola e l’assorbimento coinvolgono quindi non solo livelli elettronici, ma anche sotto-livelli vibrazionali e rotazionali.

• Le interazioni con altre molecole avranno anch’esse un effetto, con il risultato che lo spettro di assorbimento sarà a “bande” (ci saranno talmente tante transizioni che sarà impossibile distinguere le une dalle altre).

ASSORBIMENTO MOLECOLARE

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A’

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IA –

CH

IMIC

A A

NA

LIT

ICA

TRANSIZIONI ELETTRONICHE E SPETTRO DI ASSORBIMENTO MOLECOLARE

ASSORBIMENTO MOLECOLARE

E

S0

S1

S2

I

Energia dei livelli elettroniciEnergia dei livelli vibrazionaliEnergia dei livelli rotazionali

Transizioni elettroniche

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A A

NA

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ICA

L’occhio umano vede il colore complementare di quello assorbito

COLORE E TRASMISSIONE DELLA LUCE

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IA –

CH

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A A

NA

LIT

ICA

ASSORBIMENTO E COLORE COMPLEMENTARE

650-780

595-650

560-595

500-560

490-500

480-490

435-480

380-435

rosso

arancio

giallo-verde

verde

verde-bluastro

blu-verdastro

blu

violetto

blu-verde

blu-verdastro

porpora

rosso-porpora

rosso

arancio

giallo

giallo-verde

Lunghezza d’onda (nm) Colore assorbito Colore complementare

800

700

600

500

400

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IA –

CH

IMIC

A A

NA

LIT

ICA

L’analisi quantitativa spettrofotometrica è basata

principalmente sullo studio degli spettri UV/Vis.

La legge fondamentale su cui si basano i metodi di

assorbimento è quella di Lambert e Beer.

Questa legge dice che:

la quantità di luce assorbita da una soluzione è

proporzionale alla concentrazione della sostanza

assorbente e alla lunghezza del cammino ottico.

ANALISI QUANTITATIVA

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CO

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IA –

CH

IMIC

A A

NA

LIT

ICA

P/P0 è anche denominata

Trasmittanza (T)

-logT = A

dove A viene definita

Assorbanza

A = bc

Il rapporto P/P0 è la misura della luce che passa attraverso la soluzione e non viene assorbita

ANALISI QUANTITATIVA

P0

c

bP = assorbività

b = cammino otticoc = concentrazione

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CO

LT

A’

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IA –

CH

IMIC

A A

NA

LIT

ICA

cbP/PlogP/PlogTlogA 00

LA LEGGE DI LAMBERT E BEER

Concentrazione

Ass

orba

nza

1.5

0.0

0.5

1.0

FA

CO

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A’

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IA –

CH

IMIC

A A

NA

LIT

ICA

• Ogni strumento presenta caratteristiche diverse quindi è

meglio determinare l’assorbività utilizzando standard

• E’ possibile utilizzare qualsiasi unità di concentrazione:

Molarità, %, ppm, ecc.

• Se la concentrazione viene espressa in Molarità ed il

cammino ottico in cm, l’assorbività viene definita come

assorbività molare () ed ha unità M-1cm-1

DETERMINAZIONE DELLA ASSORBIVITA’

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CO

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A’

DI

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RM

AC

IA –

CH

IMIC

A A

NA

LIT

ICA

• In genere si cerca di eseguire le misure al valore della lunghezza

d’onda corrispondente al massimo dell’assorbanza (max)

• Questo è il punto di massima risposta corrispondente alla più

alta sensibilità e più basso limite di rivelazione

• Permette inoltre di ridurre il più possibile l’errore associato alla

misura legato ad una eventuale scarsa riproducibilità della

lunghezza d’onda

MISURA DELL’ ASSORBANZA

FA

CO

LT

A’

DI

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RM

AC

IA –

CH

IMIC

A A

NA

LIT

ICA

Se si ha una piccola variazione di durante le misure e non si è al

valore di max si potrebbe ottenere una notevole variazione nella

risposta.

MISURA DELL’ ASSORBANZA

Piccolo errorePiccolo errore

Grande erroreGrande errore

Stessa variazione di lunghezza d’ondaStessa variazione di lunghezza d’onda

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IA –

CH

IMIC

A A

NA

LIT

ICA

Deviazione dalla relazione lineare

Molte sostanze danno una risposta lineare solo in un certo ambito

di concentrazione.

MISURA DELL’ ASSORBANZA

Il metodo deve essere utilizzato solo in questo ambito

Il metodo deve essere utilizzato solo in questo ambito

Ambit

o lin

eare

Ambit

o lin

eare

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CO

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IA –

CH

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A A

NA

LIT

ICA

MISURA DELL’ ASSORBANZA

Questo segnale potrebbe essere dovuto al fondo, ad una interferenza o ad una mancanza di sensibilità

Questo segnale potrebbe essere dovuto al fondo, ad una interferenza o ad una mancanza di sensibilità

Questo segnale potrebbe essere dovuto ad un auto-assorbimento o ad un insufficiente passaggio della luce attraverso la soluzione

Questo segnale potrebbe essere dovuto ad un auto-assorbimento o ad un insufficiente passaggio della luce attraverso la soluzioneAm

bito

linea

re

Ambit

o lin

eare

FA

CO

LT

A’

DI

FA

RM

AC

IA –

CH

IMIC

A A

NA

LIT

ICA

Sebbene nella legge di Lambert e Beer compaia l’assorbanza

della soluzione, la grandezza fisica che viene effettivamente

misurata è la trasmittanza.

L’errore nella determinazione di una concentrazione mediante una

misura spettrofotometrica (c) è quindi legato all’errore che si ha

nella misura della trasmittanza (T).

Applicando la legge sulla propagazione degli errori alla legge di

Lambert e Beer si ha:

c/c = (0.4343 / TlogT) T

ERRORE NELLA MISURA DELL’ ASSORBANZA

FA

CO

LT

A’

DI

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RM

AC

IA –

CH

IMIC

A A

NA

LIT

ICA

L’andamento di c/c in funzione di T è il seguente:

E’ consigliabile quindi operare in un ambito di trasmittanza compreso

tra 80-20 %T al fine di minimizzare l’errore spettrofotmetrico.

Errore relativo in funzione della %T

Err

o re

rela

tivo

s u c

o nc .

80% 20%

%T

ERRORE NELLA MISURA DELL’ ASSORBANZA