facolta’ di scienze ff mm nn – chimica analitica con applicazioni cliniche individuazione della...
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HE Individuazione della causa di malattie e
monitoraggio del decorso
DIAGNOSTICA MOLECOLARE
Tecniche a disposizione:
-“Southern blot”, “Northen blot”, digestione enzimatica, sequenziamento
- PCR
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SOUTHERN BLOT
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i.e., your cloned gene(s)
We could just 35,000 Northern to monitor expression of all genes!!!
• mRNAs separated on gel according to size
• mRNAs transferred to a membrane and hybridized with small number (1-5) of radioactively labeled DNA probes.
• Probe corresponds to gene of interest
• Target RNA is spatially fixed and the labeled probe is in solution
• Low throughput
Northern Blot
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Rompendo il DNA in corrispondenza del sito di restrizione, gli enzimi di restrizione possono determinare la formazione di frammenti di dsDNA con estremità “piatte” (A) o “coesive” (B):
ENZIMI DI RESTRIZIONE
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HE L’uso sequenziale di appropriati enzimi di
restrizione e ligasi permette di tagliare ed incollare (“cut and paste”) catene di dsDNA allo scopo di isolare le sequenze geniche di interesse ed ottenere costrutti genici che le includono.
DNA LIGASI
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SOUTHERN BLOT
Consente l’inidividuazione di alterazioni genetiche : - estrazione di DNA intatto - digestion - separazione mediante mobilità elettroforetica - blotting e rivelazione
Applicazioni: meccanismi patologici, indagine prenatale, settore oncologico
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L’estrema importanza in biologia molecolare della PCR è determinata da due fattori principali:- E’ possibile ottenere fattori di amplificazione (rapporto fra copie di dsDNA prodotte e sequenze dsDNA target originali) elevatissimi, anche dell’ordine di 109.-La reazione di amplificazione è specifica: scelta adeguata di “primers”-Applicazioni in:Genetica, microbiologia e virologia, medicina forense, oncologia.
REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)
PCR
amplificazioneamplificazione
DNA
(singola molecola)(singola molecola)MolteMoltemolecolemolecole
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Schema della PCR
DNA
RNA
DNA
Estrazione delEstrazione del DNA o DNA o
RNA dal campioneRNA dal campione
Rivelazione
Amplificazione
Reverse transcriptio
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LIMITI DI RIVELABILITA’ DELLA PCR
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Campioni di DNA adatti per l’identificazione possono essere ottenuti da svariate fonti:
- gomma da masticare- francobolli- capelli (devono però avere la radice intatta)- spazzolini da denti- lamette di rasoio- mozziconi di sigaretta-qualsiasi campione biologico, anche notevolmente degradato
Tali test sono utilizzati per scopi quali test di paternità o per verificare l’identità di un soggetto, nonché per usi in campo forense. Il costo per l’ottenimento di un profilo del DNA contenuto in un campione è dell’ordine di 300-500 €.
CAMPIONI PER PCR
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•Rivelazione del prodotto amplificato: elettroforesi,sonde geniche
RIVELAZIONE DEL PRODOTTO DELLA PCR
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FASI POST-PCR ed ORGANIZZAZIONE LABORATORIO PCR
•Controlli: verifica della specifictà e della sensibilità della reazione e dell’ eventuale presenza di falsi positivi o negativi.
•Organizzazione del laboratorio:
Elettroforesi su gelAnalisi di restrizioneTecniche d’ibridazione
AREA PRE-PCR Preparazione del campioneSeparazione del sieroIsolamento dei linfociti perifericiLisi cellulareEstrazione acido nucleico
Preparazione della reazione
Preparazione del tamponePreparazione aliquote dei reagentiAllestimento della reazione
Rivelazione del prodottoAREA POST-PCR
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La PCR in situ permette di combinare lo studio della localizzazione cellulare mediante ibridazione in situ con l’estrema sensibilità dell’amplificazione
•SCCP ( single strand conformational polymorfism)
•PCR “in situ”
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APPLICAZIONI DELLA PCR
•Diagnosi d’infezioni batteriche e virali: Tecniche classiche : 1) Isolamento in coltura 2) Identificazione mediante anticorpi
•Diagnosi cliniche di malattie causate da mutazioni
•Controllo efficacia terapie anti-cancro
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Le tecniche PCR presentano definiti vantaggi quando applicate alla diagnostica di infezioni virali o batteriche permettendo di superare alcune limitazioni delle tecniche diagnostiche convenzionali, quali:
-tecniche di coltura-metodi immunometrici
Es: diagnosi da infezione da immunodeficienza acquisita (HIV)La PCR (qualitativa e quantitativa) permette la diagnosi precoce e la valutazione della terapia antivirale
La PCR rappresenta un importante strumento diagnostico s:-valutare patologie virali non diversamente diagnosticabili-Monitorare l’andamento della malattia-Valutazione di variazioni nel genoma virale
PCR: diagnosi di infezioni virali o batteriche
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Diagnosi di neoplasie maligne
Per quanto riguarda la diagnosi di neoplasie maligne, le tecniche di biologia molecolare hanno portato alla identificazione e caratterizzazione di numerosi elementi genetici (oncogeni, geni oncosoppressori, ecc.) coinvolti nell’evoluzione delle malattie neoplastiche.
Le tecniche di PCR quantitativa possono essere invece utilizzate per valutare il grado di amplificazione di un oncogene (numero di copie presenti nel genoma delle cellule neoplastiche), comunemente considerato un indice prognostico sfavorevole.
PCR: applicazioni in campo oncologico
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Diagnosi molecolare di malattie genetiche
La PCR permette di fare:
- diagnosi (prenatale e asintomatica)- prevenzione
PCR: diagnosi di malattie genetiche
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HE Diagnosi molecolare di malattie genetiche
Identificazione di mutazioni notePer la diagnosi simultanea di un numero elevato di mutazioni, si utilizzano approcci “multiplexed” basati su micropiastra o microarray, nei quali sonde complementari per il legame delle varie possibili sequenze mutate vengono immobilizzate in differenti posizioni di un supporto solido.
Identificazione di mutazioni non note. Le tecniche PCR possono essere utilizzate anche per l’identificazione e la caratterizzazione di eventuali mutazioni non note, o eventualmente per la diagnosi di mutazioni talmente rare che non sono disponibili (o non è conveniente sintetizzare) sonde specifiche.
La PCR nella diagnostica
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Le caratteristiche intrinseche della PCR limitano la sua applicazione quando è richiesta una accurata valutazione quantitativa della sequenza target: la quantità di prodotto ottenuto dipende infatti anche da fattori non facilmente controllabili (es. presenza di inbitori)..L’importanza applicativa di una PCR quantitativa è però talmente elevata che sono state sviluppate diverse metodologie che permettono di ridurre questi inconvenienti.
PCR QUANTITATIVA
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Si effettua l’amplificazione su di una serie di diluizioni seriali del campione, allo scopo di individuare la massima diluizione alla quale l’amplificazione è ancora possibile. -Svantaggi:-Richiede un numero elevato di reazioni di amplificazione per ogni campione-Non tiene conto degli eventuali fattori di variazione interprovetta-Per diluizioni molto elevate la sensibilità della PCR non è sufficientemente alta
PCR
Fattore di diluizione limite
PCR QUANTITATIVA: DILUIZIONE SCALARE
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Si basa sulla costruzione di una curva di calibrazione ottenuta amplificando standard a concentrazione nota di sequenza target.
n
Y
Y
[dsDNA] iniziale
[dsDNA]iniziale
crescente
- La reazione di amplificazione deve essere interrotta nella fase esponenziale, riducendo così la quantità di amplificato ottenibile- Essendo una calibrazione esterna, non può tenere conto dell’effetto di eventuali inibitori o di altri fattori dipendenti dal particolare campione che si analizza
Reazioni interrotte dopo la fase di amplificazione esponenziale
n =
cost
ante
PCR QUANTITATIVA: STANDARD ESTERNO
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La PCR quantitativa non competitiva utilizza uno standard interno: questa tecnica prevede l’amplificazione simultanea all’interno del campione della sequenza dsDNA target e di una sequenza standard aggiunta in quantità nota, ognuna delle quali sfrutta una DIVERSA coppia di “primers”.Vantaggi:le variabili non controllabili legate alle caratteristiche del campione dovrebbero influenzare nello stesso modo le due reazioni di amplificazione.Svantaggi:poiché la reazione deve essere bloccata nella fase esponenziale, differenze nella cinetica ed efficienza di amplificazione per le diverse coppie di “primers” possono modificare il risultato dell’analisi.
dsDNA standard(quantità nota)
dsDNA target(quantità incognita) PCR
Amplificato dello standard
Amplificato del target
dsDNA standard(quantità nota)
dsDNA targetAmplificato dello standard
Amplificato del target=
PCR QUANTITATIVA: PCR NON COMPETITIVA
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Anche la PCR quantitativa competitiva utilizza uno standard interno: in questa tecnica la sequenza dsDNA target e la sequenza standard aggiunta in quantità nota vengono amplificate utilizzando la STESSA coppia di “primers” Si costruisce una curva di calibrazione interna: quando le quantità dei due amplificati sono equivalenti, la quantità di dsDNA target iniziale coincide con quella della sequenza standard aggiunta.
La misura può essere effettuata anche quando l’amplificazione ha raggiunto il “plateau”.
Amplificati della sequenza target e dello standard interno separati mediante elettroforesi su gel
PCR QUANTITATIVA: PCR COMPETITIVA
target
competitorePunto di equivalenza
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La PCR ha quindi applicazioni specifiche nella diagnostica se:- non esistono (o non sono sufficientemente specifici) marcatori sierologici di infezione (antigeni e/o anticorpi)- occorre un risultato molto tempestivo- è richiesta una particolare sensibilità- occorre discriminare ceppi o varianti, oppure identificare diverse specie, non differenziabili con altri sistemi. In particolare questa possibilità può essere importante per studi epidemiologici, allo scopo di confermare o escludere una epidemia da fonte comune sulla base delle differenze genetiche fra i ceppi virali o batterici.- occorre identificale mutazioni responsabili, ad esempio, dell’insorgenza di resistenza alle terapie.
La PCR nella diagnostica
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HE It’s used for accurate quantitation of DNA samples
In real time PCR the concentration of a DNA sample is proportional to the amount of fluorescence generated at each round of amplification.
It’s based on the detection and quantitation of a fluorescent reporter
•This signal increases in direct proportion to the amount of PCR product in a reaction. •By recording the amount of fluorescence emission at each cycle, it is possible to monitor the PCR reaction during exponential phase where the first significant increase in the amount of PCR product correlates to the initial amount of target template.
Real time PCR
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HE The best method for quantitative detection of the amplicon uses
fluorescent probes. The TaqMan probes use the fluorogenic 5' exonuclease activity of Taq polymerase to measure the amount of target sequences in cDNA samples.
TaqMan probes are oligonucleotides that contain a fluorescent dye usually on the 5' base, and a quenching dye on the 3' base.When irradiated, the excited fluorescent dye transfers energy to the nearby quenching dye molecule rather than fluorescing (this is called FRET = Förster or fluorescence resonance energy transfer).
Thus, the close proximity of the reporter and quencher prevents emission of any fluorescence while the probe is intact.
Real time PCR
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L’andamento della reazione di amplificazione viene seguito in tempo reale, e quindi è possibile visualizzare l’accrescimento esponenziale dell‘amplificato permettendo l’analisi simultanea di campioni a contenuto di DNA molto differente La formazione dell’amplificato viene seguita attraverso misure di fluorescenza, attraverso l’impiego di:-Intercalanti fluorescenti del DNA, che permettono la rivelazione del dsDNA (es. SYBR® Green). -“TaqMan probes”, cioè oligonucleotidi in grado di ibridizzare con una regione interna del prodotto dell’amplificazione che portano un tracciante fluorescente in 5’ ed un “quencher” in 3’. Essi normalmente non sono fluorescenti ma quando durante la PCR viene replicata una catena ssDNA alla quale è legata una di queste molecole, l’attività 5' esonucleasica della polimerasi rompe la molecola rendendo possibile la fluorescenza.-“Molecular beacons” disegnati per ibridizzare con una regione interna del prodotto dell’amplificazione. “TaqMan probes” e “molecular beacons” permettono di effettuare PCR multiple (ad esempio è possibile amplificare anche uno standard interno) poiché sono specifici per una data sequenza amplificata (i segnali fluorescenti dei due “probes”possono essere differenziati usando due fluorofori che emettono ad una diversa lunghezza d’onda).
PCR “REAL TIME”
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Plot di amplificazione
PCR cycle number
No
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rter
flu
ore
sc
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(R
n)
E’ il ciclo della reazione di amplificazione in cui il segnaledi fluorescenza del campione è maggiore rispetto a quello della Threshold
Indica il valore al di sopra del quale inizia l’accumulo di un amplificato
Linea soglia scelta dall’operatoreIn maniera da intersecare le curve di tutti i campioni nella fase esponenziale
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Quantitativa assolutaQuantitativa assoluta
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10 4
10 3
10 2
10 1
15
2 3 4 5 6 7
log10 quantity
Ct
unknown sample
3500 copies
35
25
1
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Quantitativa relativaQuantitativa relativa
Plot di amplificazione
Numero di cicli
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SampleControl
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Analisi tramite software
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Genomics
• Gene Sequencing
• Conventional Karyotyping
• FISH (Fluorescent in Situ Hybridization)
• CISH (Chromogenic in Situ Hybridization)
• CGH (Comparative Genomic Hybridization)
• SKY (Spectral Karyotyping)
• Real Time RT-PCR
• cDNA Microarrays
Novel analytical tools
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• 2D-PAGE
• MS (Mass Spectrometry)
• HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
• CA (Capillary Array)
• MALDI (Matrix Associated Laser Desorption/Ionisation)
• MALDI-TOF – MS (Time of Flight)
• MALDI – ION TRAP- TOF – MS
• ESI (Electron Spray Ionisation) Tandem – MS
• Quadrupole
Functional proteomicsFunctional proteomics
• TWO YEAST– HYBRID SYSTEM
• PROTEIN MICROARRAY
• FRET (Fluorescence Resonance)
• SELDI (Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionisation)
• TISSUE MICROARRAY
Proteomics
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Multispot Arrays
Sonde
(DNA, oligonucleotidi, proteine, anticorpi)
Spots sulla superficie di un substrato solido
Deposito o sintesi
Gene chip, DNA chip, DNA array,
Protein chip…..
Sonde:• antigeni• anticorpi• cDNA• oligonucleotidi• prodotti di PCR• plasmidi• BACs (Bacterial Artificial Chromos.)• YACs (Yeast Artificial Chromos.)
Substrato:• vetro• nitrocellulosa• nylon• vetro rivestito di poliacrilammide• polipropilene• silicone• polistirene
Deposito • blotting• printing• elettrodipendente
Sintesi in situ• meccanica• fotolitografica• elettrodi• printing di precisione• deposito sulla superficie
tensione-dipendente
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Attualmente è possibile costruire dei chips - i vetrini su cui si posizionano gli spots di DNA - contenenti fino a 10000 sequenze DNA/cm2 e fino a 500000 oligonucleotidi/cm2 per studi di trascriptomica
Microarray a DNA
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Microarray a DNA
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Applied BiosystemsHuman Genome Survey Microarray V2.0
The Applied Biosystems Human Genome Survey Microarray V2.0 contains 32,878 probes for the interrogation of 29,098 genes, making it the most informative and comprehensive genomic coverage of any microarray platform.
• Access the most comprehensive human genome set available, with probe designs for 2,180 more genes than any other microarray platform. • Interrogate more than 8,000 genes not covered by other commercial microarrays.
Microarray a DNA
Applications• Clinical diagnosis• Environmental surveillance• Industry• Food and Agriculture• Military
Advantages: • Speed • Feasibility• Sensitivity• Reproducibility
• Sample from specific organ to show which genes are expressed• Compare samples from healthy and sick host to find gene-disease
connection• Probes are sets of human pathogens for disease detection
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Campione eterogeneo
Campione A
Campione BMicrodissezione
Microdissezione
Popolazione eterogenea
Popolazione eterogenea
Laser capture microdissection (LCM)
Popolazione omogeneaPopolazione
omogenea
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ANALISI PROTEOMICA
Possibilità di individuare markers molecolari di tumori (o altre patologie)
Siero Proteine
Frazionamento Digestione con enzimi proteolitici
Peptidi
Cromatografia o 2D-PAGE
Spettrometria di massa
Analisi con algoritmi specifici
Sidransky D. Emerging molecular markers of cancer. Nature Cancer Rev 2002; 2:210-9.
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PROTEIN MICROARRAYS (ProteinChip)
Sono utilizzati per esaminare:
• i livelli di espressione delle proteine
• le interazioni proteina-proteina
• le interazioni proteina-piccole molecole (farmaci, etc)
• le attività enzimatiche
Page, M. J. et al. Proteomic definition of normal human luminal and myoepithelial breast cells purified from reduction mammoplasties. PNAS 1999; 96:12589–12594.
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PROTEIN MICROARRAYS
Esistono due tipi principali di chip:
• antibody arrays
Ab Microarray 500™ - BD Biosciences' Clontech division, Palo Alto, CA
> 500 anticorpi per quantificare proteine in lisati cellulari o altri campioni biologici
TranSignal Human Cytokine Antibody Array 2.0 (Redwood City, CA)
> 21 anticorpi per misurare citochine
• general protein arrays
Yeast ProtoArray™ from Protometrix, Branford, CT, con circa 5.000 polipeptidi da Saccharomyces cervisiae
per monitorare le interazioni proteina-proteina e proteina-piccole molecole (farmaci….)
Yeast ProtoArray™
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PROTEIN MICROARRAYS
Conrads TM et al. Cancer diagnosis using proteomic patterns.Expert Rev Mol Diagn 3:411-20 (2003)
IndividuazioneIndividuazionenuovi nuovi
biomarkersbiomarkers
SieroProteine
Bio-chip
SELDI-TOF MS
m/zPattern proteico Riconoscimento
del pattern
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Nuovi Biomarkers individuati con il ProteinChip e tecnologia SELDI-TOF-MS
Tumore kDa Nome Autore
Pancreas 16.57 HIP/PAP-1 Rosty et al.
Cancer Res 2002; 62:1868-1875
Vescica 3.4 Alpha-Defensina Vlahou et al. Am J. Pathol 2002; 158:1491-1501
Nasofaringe 11.6
11.8
Serum Amyloid A (SAA) isoform Yip et al - AACR 2002
Prostata 100 PSMA Wang et al. Int J. Cancer 2002; 92:871-876
Ovaio
9.2
79
54
Frammento di Aptoglobina
Transferrina
Catena pesante Ig
Ye et al. Poster 3687 - AACR 2002
Rai et al. Arch. Pathol. Lab. Med 2002; 126:1518-1526
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Curva di dissociazione
Dopo l'amplificazione, i campioni vengono riscaldati e la variazione dell'energia di fluorescenza viene
monitorata per generare una curva di dissociazione
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82.6 88.1
melting peak
Curva di dissociazione
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Metodi di rilevamento della fluorescenza
SYBR Green TaqMan Molecular Beacons
Scorpion probe