faculdade de ciências médicas - unicamp
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS UNICAMP
Faculdade de Ciências Médicas
ALFONSO EDUARDO ALVAREZ BRAGUNDE
AVALIAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS EPIDEMIOLÓGICAS, ETIOLÓGICAS
E GENÉTICAS ASSOCIADAS À BRONQUIOLITE VIRAL AGUDA GRAVE
CAMPINAS
2016
ALFONSO EDUARDO ALVAREZ BRAGUNDE
AVALIAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS EPIDEMIOLÓGICAS, ETIOLÓGICAS
E GENÉTICAS ASSOCIADAS À BRONQUIOLITE VIRAL AGUDA GRAVE
Tese apresentada à Faculdade de
Ciências Médicas da Universidade
Estadual de Campinas como parte dos
requisitos exigidos para a obtenção do
título de Doutor em Ciências, na área
de concentração em Saúde da Criança
e do Adolescente.
ORIENTADOR: PROF. DR. JOSÉ DIRCEU RIBEIRO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO
FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO
ALFONSO EDUARDO ALVAREZ BRAGUNDE, E
ORIENTADA PELO PROF. DR. JOSÉ DIRCEU
RIBEIRO.
CAMPINAS
2016
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2012/05458-2
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Alvarez, Alfonso Eduardo, 1970-
AL86a AlvAvaliação das características epidemiológicas, etiológicas e genéticas
associadas à bronquiolite viral aguda grave / Alfonso Eduardo Alvarez
Bragunde. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.
AlvOrientador: José Dirceu Ribeiro.
AlvTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de
Ciências Médicas.
Alv1. Bronquiolite. 2. Lactentes. 3. Fatores de risco. 4. Vírus sinciciais
respiratórios. 5. Receptores Toll-like. I. Ribeiro, José Dirceu,1952-. II.
Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III.
Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Evaluation of epidemiological, aetiological and genetic features
associated with severe acute viral bronchiolitis
Palavras-chave em inglês:Bronchiolitis
Infants
Risk factors
Respiratory syncytial viruses
Toll-like receptors
Área de concentração: Saúde da Criança e do Adolescente
Titulação: Doutor em Ciências
Banca examinadora:José Dirceu Ribeiro [Orientador]
Marcus Herbert Jones
João Paulo Becker Lotufo
José Luiz Proença Módena
Rodrigo Nogueira Angerami
Data de defesa: 31-08-2016
Programa de Pós-Graduação: Saúde da Criança e do Adolescente
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO
ALFONSO EDUARDO ALVAREZ BRAGUNDE
Orientador (a) PROF(A) DR(A) JOSÉ DIRCEU RIBEIRO
MEMBROS:
1. PROF(A). DR(A). JOSÉ DIRCEU RIBEIRO
2. PROF(A). DR(A). MARCUS HERBERT JONES
3. PROF(A). DR(A). JOÃO PAULO BECKER LOTUFO
4. PROF(A).DR(A). JOSÉ LUIZ PROENÇA MÓDENA
5. PROF(A).DR(A). RODRIGO NOGUEIRA ANGERAMI
Programa de Pós-Graduação em Saúde da Criança e do Adolescente da Faculdade de
Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora
encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Data: 31 de agosto de 2016
DEDICATÓRIA
À minha esposa Vanessa e às minhas filhas Giovana e Marina, por deixarem
meus dias repletos de amor e felicidade, pelo apoio incondicional aos meus
sonhos e por me inspirarem a tentar ser a cada dia uma pessoa melhor...
Aos meus pais, Jorge e Betty, e ao meu irmão Julio, pelo amor incondicional,
por terem me dado a oportunidade de crescer num ambiente familiar repleto de
carinho e pelos valores preciosos que sempre me transmitiram...
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. José Dirceu Ribeiro, meu amigo e orientador, exemplo de
competência e capacidade, por todo o tempo que me dedicou, pelo inestimável
apoio em todas as fases do projeto, pelo constante incentivo nos momentos
difíceis e pelas sugestões, conselhos e excelência na orientação da pesquisa.
Muito obrigado por sua amizade e por constantemente me contagiar com seu
entusiasmo. Todo meu respeito, gratidão e admiração...
Ao grande amigo Prof. Dr. Fernando Augusto de Lima Marson, pelo seu
inestimável apoio em todas as fases da pesquisa, pela realização da análise
estatística, pela confecção das tabelas e gráficos e pelo imenso trabalho na
identificação dos polimorfismos. Agradeço por ser um exemplo de ser humano
e de altruísmo, sempre disposto a ajudar os colegas e dividir seu
conhecimento. Todo meu respeito e gratidão pela enorme ajuda recebida neste
projeto...
À Prof. Dra. Clarice Weis Arns, por ter me recebido com tanto entusiasmo e
alegria desde a primeira vez que a procurei para falar do projeto, pelo
constante incentivo, pelas sugestões e por disponibilizar o laboratório de
virologia para a realização da identificação viral.
À Juliana Cristina Santiago Bastos, pela enorme competência e pelo tempo e
esforço dedicados à realização da identificação viral.
À Prof. Dra. Carmem Sílvia Bertuzzo, pelo incentivo, pelas sugestões e por
disponibilizar o laboratório de genética médica para a identificação dos
polimorfismos.
À Dra. Antônia Teresinha Tresoldi por disponibilizar a enfermaria de pediatria e
a UTI pediátrica do Hospital das Clínicas da UNICAMP para a coleta dos
dados.
Ao Prof. Dr. Emilio Carlos Elias Baracat por disponibilizar a enfermaria de
pediatria e a UTI Pediátrica do Hospital Estadual de Sumaré e o pronto socorro
de pediatria do Hospital das Clínicas da UNICAMP para a coleta dos dados.
Ao Dr. Geraldo Roberto Cogo por disponibilizar a enfermaria de pediatria e a
UTI pediátrica do Hospital Vera Cruz para a coleta dos dados.
Às fisioterapeutas Celize Cruz Bresciani Almeida e Therezinha de Oliveira e à
Dra. Mariana Tresoldi das Neves Romaneli pelo apoio nas coletas dos dados
dos pacientes internados no Hospital das Clínicas da UNICAMP.
Aos Drs. Marcelo Barciela Brandão, Marcelo Conrado dos Reis e Maria Luisa
Ferreira de Miranda pelo apoio nas coletas dos dados dos pacientes internados
no Hospital Estadual de Sumaré.
Às fisioterapeutas Patricia Godano Schlodtmann e Ester Corrêa e ao Dr. José
Vicente De Pieri pelo apoio nas coletas dos dados dos pacientes internados no
Hospital Vera Cruz.
À Fundação Roberto Rocha Brito do Hospital Vera Cruz pelo apoio financeiro à
realização do projeto.
À Marcia de Britto, secretaria da pós-graduação em saúde da criança e do
adolescente da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP pela
competência e prontidão sempre que precisei de sua ajuda.
Ao Milton Cesar de Souza e à Rosa Maria Genesio do CIPED (Centro de
Investigações em Pediatria) por toda a ajuda recebida nas diversas fases do
projeto.
À toda a equipe do audiovisual da Faculdade de Ciências Médicas da
UNICAMP pela eficiência em preparar os materiais sempre que solicitado.
Às equipes de enfermagem dos 3 Hospitais envolvidos no estudo, pelo apoio e
dedicação em viabilizar o projeto.
Por último, e como homenagem, agradeço aos pacientes e seus pais, pela
colaboração neste estudo e pela coragem em enfrentar momentos difíceis,
lembrando-me constantemente de colocar os diversos aspectos da vida em
uma perspectiva correta.
AGRADECIMENTOS AS AGÊNCIAS DE FOMENTO À PESQUISA
À FAPESP pelo auxílio à pesquisa recebido para a realização deste projeto
(2012/05458-2).
Ao CNPQ pela Bolsa Produtividade em Pesquisa ao Prof. Dr. José Dirceu
Ribeiro recebida para a realização deste projeto (300711/2013-1).
RESUMO
A bronquiolite viral aguda (BVA) é a principal causa de hospitalização em
crianças durante o primeiro ano de vida. Nos Estados Unidos ocorrem 100.000
hospitalizações por ano por BVA, com um custo estimado em U$ 1,73 bilhão. O
Vírus Sincicial Respiratório (VSR) é o principal agente causador dessa doença
e praticamente 100% das crianças são infectadas por esse vírus nos 2
primeiros anos de vida. As manifestações clínicas da infecção pelo VSR tem
grande variabilidade e vão desde sintomas leves de infecção em vias aéreas
superiores até quadros graves com necessidade de internação em unidade de
terapia intensiva (UTI), ventilação mecânica e óbito. Estima-se que esse vírus
seja responsável por 66.000 a 199.000 mortes por ano em menores de 5 anos
no mundo.
Existem vários fatores de risco que tem sido associados na literatura com a
gravidade da BVA, como prematuridade, tabagismo passivo, baixa idade,
ausência de aleitamento materno, doença pulmonar crônica e cardiopatia
congênita. Apesar do conhecimento desses fatores de risco, a maior parte dos
lactentes internados por BVA não apresenta nenhuma dessas condições. Isto
levou os pesquisadores a acreditar que os fatores epidemiológicos não seriam
os únicos responsáveis pela determinação da gravidade do quadro e a estudar
se características genéticas estariam associados à evolução mais grave da
doença.
Realizamos um trabalho prospectivo, multicêntrico, em três hospitais, em um
período de 2 anos (2013-2014), avaliando todos os pacientes menores de 2
anos com quadro de BVA grave que necessitaram internação para realizar
oxigenoterapia. Foram excluídos os pacientes que tinham apresentado quadro
anterior de sibilância. O grupo controle foi composto por 536 adultos saudáveis
(19 a 25 anos de idade) sem história pessoal ou familiar de doença respiratória
por 2 gerações.
Os pacientes foram avaliados para variáveis epidemiológicas através de um
questionário respondido pelos os pais ou responsáveis, realizaram aspirado
nasofaríngeo para detecção de vírus por multiplex-PCR e coleta de sangue
para a identificação de polimorfismos (SNPs) nos genes da resposta imune. Foi
verificada a evolução dos pacientes até o momento da alta.
Foram avaliados 181 pacientes, 69,9% apresentavam VSR. A mediana de
internação foi 6,5 dias e a de oxigenoterapia foi 5 dias; 34% dos pacientes
necessitaram internação em UTI e 21% necessitaram ventilação mecânica; 5
pacientes (2,8%) evoluíram a óbito. Observou-se associação entre o SNP
rs2107538 (RANTES) e bronquiolite causada pelo VSR e VSR subtipo A, e
entre o rs1060826 (NOS2) e bronquiolite causada por Rinovírus. Os SNPs
rs4986790 (TLR4), rs898830 (TLR2) e rs2228570 (VDR) foram associados com
evolução à óbito. O SNP rs7656411 (TLR2) foi associado com o tempo de
oxigenoterapia; os SNPs rs352162 (TLR9), rs187084 (TLR9) e rs2280788
(RANTES) foram associados com necessidade de internação em UTI e os
SNPs rs1927911 (TLR4), rs352162 (TLR9) e rs2107538 (RANTES) foram
associados com necessidade de ventilação mecânica. Os pacientes com
infecções por VSR subtipo B apresentaram menor tempo de internação e
oxigenoterapia do que aqueles infectados com outros vírus.
Nossos resultados indicam que a variabilidade genética nos genes da resposta
imune contribui para a gravidade da BVA.
PALAVRAS CHAVES: Bronquiolite; Lactentes; Genética; Fatores de Risco;
Vírus Sincicial Respiratório; Receptores Toll-Like
ABSTRACT
Acute viral bronchiolitis (AVB) is the leading cause of hospitalization in children
during the first year of life. Approximately 100,000 bronchiolitis admissions
occur annually in the United States, at an estimated cost of $1.73 billion.
Respiratory syncytial virus (RSV) is the major causative agent of bronchiolitis
cases, and nearly all children become infected with this virus during the first 2
years of life. RSV infection ranges from a mild upper respiratory illness to
severe bronchiolitis, which may require admission to the intensive care unit
(ICU), mechanical ventilation, and possibly lead to death. Globally, RSV is
estimated to cause 66,000 to 199,000 deaths per year among children younger
than 5 years of age.
There are several risk factors that have been associated in the literature with
the severity of AVB, such as prematurity, passive smoking, young age, lack of
breastfeeding, chronic lung disease and congenital heart disease. Despite the
knowledge of the risk factors, most infants hospitalized with AVB present with
no risk factors and are otherwise healthy. This led researchers to believe that
epidemiological factors would not be solely responsible for determining the
severity of the condition and to study whether genetic characteristics were
associated with more severe disease progression.
We performed a prospective, multicenter study in three hospitals in a period of
two years (2013-2014), evaluating all patients younger than 2 years with severe
BVA who required oxygen therapy. Patients with previous wheezing were
excluded. The control group consisted of 536 healthy controls (aged 19 to 25
years) with no personal or family history of lung or other chronic disease for two
generations.
Patients were evaluated for epidemiological variables through a questionnaire
answered by parents or guardians, and underwent nasopharyngeal aspirate for
the detection of viruses by multiplex-PCR, and blood collection for the
identification of polymorphisms (SNPs) in genes of the immune response. A
longitudinal follow-up was carried out of these patients until the time of
discharge.
We evaluated 181 patients, 69.9% had RSV. The median length of hospital stay
was 6.5 days, and the median length of oxygen use was 5 days; 34% of
patients required ICU admission and 21% required mechanical ventilation; 5
patients (2.8%) died. There was an association between SNP rs2107538
(RANTES) and bronchiolitis caused by RSV and RSV subtype A, and between
rs1060826 (NOS2) and bronchiolitis caused by rhinovirus. SNPs rs4986790
(TLR4), rs898830 (TLR2), and rs2228570 (VDR) were associated with
progression to death. SNP rs7656411 (TLR2) was associated with length of
oxygen use; SNPs rs352162 (TLR9), rs187084 (TLR9), and rs2280788
(RANTES) were associated with requirement for ICU admission; while SNPs
rs1927911 (TLR4), rs352162 (TLR9), and rs2107538 (RANTES) were
associated with the need for mechanical ventilation. Patients with RSV subtype
B infections had shorter lengths of hospital stay and oxygen use than those
infected with other viruses.
Our findings indicate that genetic variability in immune response genes
contributes to outcomes of severe BVA.
KEY-WORDS: Bronchiolitis; Infants; Genetics; Risk factors; Respiratory
Syncytial Virus, Toll-like receptors
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
BVA - Bronquiolite Viral Aguda
VSR - Vírus Sincicial Respiratório
UTI - Unidade de Terapia Intensiva
TLR – Toll Like Receptor
SNP – Single Nucleotide Polymorphism (Polimorfismo de Nucleotídeo Único)
RANTES - Regulated on Activation, normal T cell Expressed and Secreted
VDR – Vitamin D Receptor (Receptor de Vitamina D)
NOS - Nitric Oxide Synthase
IFN – Interferon
NETs - Neutrophil Extracellular Traps
PCR – Polimerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO...................................................................................................18
Fatores de risco.......................................................................................20 Prematuridade.........................................................................................20 Tabagismo passivo.................................................................................21 Baixa idade...............................................................................................22 Aleitamento materno...............................................................................23 Doença pulmonar crônica......................................................................24 Cardiopatia congênita.............................................................................24 Gênero......................................................................................................25 Etnia..........................................................................................................25 Etiologia e codetecção viral...................................................................25 Outros fatores de risco...........................................................................26 Fatores genéticos....................................................................................27
JUSTIFICATIVA................................................................................................29 OBJETIVOS......................................................................................................30 MÉTODOS.........................................................................................................32
Pacientes..................................................................................................32 Identificação Viral....................................................................................34 Identificação dos Polimorfismos...........................................................36 Análise estatística...................................................................................61
Aspectos Éticos.......................................................................................62 RESULTADOS..................................................................................................63 DISCUSSÃO....................................................................................................110
Receptores Toll-Like.............................................................................110
Toll-Like 4...............................................................................................111 Toll-Like 2...............................................................................................112 Toll-Like 9...............................................................................................113 RANTES..................................................................................................113 Receptor de Vitamina D........................................................................114 Etiologia.................................................................................................116 Codetecção Viral ..................................................................................117 Considerações Finais ..........................................................................118
CONCLUSÃO..................................................................................................120 REFERÊNCIAS...............................................................................................121 ANEXOS..........................................................................................................142
Anexo 1 - Questionário para grupo controle......................................142
Anexo 2 - Questionário para coleta dos dados dos pacientes internados..............................................................................................145 Anexo 3 - Aprovação do projeto pela comissão nacional de ética em pesquisa ................................................................................................150 Anexo 4 - Termo de consentimento livre e esclarecido....................157 Anexo 5 - Aprovação pelo jornal de pediatria para inclusão na tese do artigo publicado...............................................................................162 Anexo 6 - Atividades acadêmicas realizadas durante o doutorado.164
INTRODUÇÃO
A Bronquiolite Viral Aguda (BVA) é a principal causa de internação em
criança menores de um ano de idade no mundo. Nos Estados Unidos ocorrem
100.000 hospitalizações por ano por BVA, com um custo estimado em U$ 1,73
bilhão (Meissner, 2016; Ralston et al., 2014; Hall et al., 2009).
O Vírus Sincicial Respiratório (VSR) é o agente responsável por 41,7
(Sung et al., 2011) a 83,6% dos casos (García et al., 2001). No Brasil, o VSR é
responsável por 31,9 (Riccetto et al., 2009) a 64% dos pacientes internados
com BVA (Salomão Junior et al., 2011). Praticamente 100% das crianças são
infectadas por esse vírus nos 2 primeiros anos de vida (Meissner, 2016; Hall et
al., 2009). Stockman e colaboradores (2012) estimaram que a incidência de
hospitalização por VSR nos Estados Unidos é de 48,9 para 1.000 em menores
de 3 meses, 26 para 1.000 em menores de 1 ano e 1,8 para 1.000 em crianças
de 1 a 5 anos (Stockman et al., 2012).
Em outras regiões, a taxa de hospitalização para cada 1.000 lactentes
com VSR varia de 8,7 na Austrália (Ranmuthugala et al., 2011) a 60 no Japão
(Simões et al., 2003). Na Austrália, a incidência de BVA por VSR é de 110,0 a
226,5 para cada 1.000 lactentes, e o custo anual estimado é de 50 milhões de
dólares, sendo mais significativo que os custos com influenza e rotavírus.
(Ranmuthugala et al., 2011). Na Europa, o VSR é responsável por 45% das
hospitalizações por infecção das vias aéreas inferiores em menores de dois
anos. (Simões et al., 2003). No Brasil, estudo com 5.304 crianças menores de
um ano demonstrou que 113 (2,1%) foram internadas por BVA. (Albernaz et al.,
2003).
Em estudo grego o VSR foi responsável por 38% do total de dias de
hospitalização em crianças menores de 2 anos com infecção respiratória e 77%
dos dias de hospitalização por VSR foram em crianças menores que 6 meses
(Constantopoulos et al., 2002).
Estima-se que o VSR seja responsável por 66.000 a 199.000 mortes por
ano em menores de 5 anos no mundo (Meissner, 2016).
18
A infecção pelo VSR tem grande variabilidade em relação à gravidade
de sua apresentação, suas manifestações clínicas vão desde sintomas leves
de infecção em vias aéreas superiores até bronquiolite e pneumonia, podendo
evoluir de forma grave, com necessidade de internação em unidade de terapia
intensiva (UTI), ventilação mecânica e levar a óbito, o tratamento é de suporte
(Meissner, 2016; Ralston et al., 2014; National Collaborating Centre for
Women's and Children's Health, 2015).
Fryzek e colaboradores (2011) analisando os dados de 1,1 milhão de
crianças menores de 2 anos internadas nos Estados Unidos por VSR em um
período de 8 anos concluíram que a maior porcentagem das internações ocorre
entre 3 e 6 meses de idade (Fryzek et al., 2011). As primeiras infecções são
geralmente sintomáticas e frequentemente atingem as vias aéreas inferiores,
as infecções subsequentes são geralmente mais leves (Meissner, 2016;
Ralston et al., 2014; National Collaborating Centre for Women's and Children's
Health, 2015).
Para crianças de alto risco deve ser indicada a realização de imunização
passiva com anticorpo monoclonal anti VSR (Palimizumabe) o qual promove
proteção contra quadros graves. Groothuis e colaboradores (2011)
demonstraram que após a introdução do Palimizumabe houve redução de 48%
nas internações de lactentes com doença pulmonar crônica da prematuridade
(Groothuis et al., 2011). Harris e colaboradores (2011) em estudo no Canadá
demonstraram que após a introdução do Palimizumabe houve uma redução de
42% nas internações e de 83% nos dias de permanência hospitalar para
pacientes com cardiopatias congênitas (Harris et al., 2011). Ainda não foi
possível o desenvolvimento de uma vacina que seja eficaz na prevenção da
BVA por VSR, apesar de esforços nesse sentido ocorrerem desde a década de
1960 (Higgins et al., 2016; Farrag et al., 2016; Esposito et al., 2016; Jorquera et
al., 2016, Graham et al., 2016, Heikkinen, 2016; Arruvito et al., 2015).
O segundo vírus mais frequente na BVA é o Rinovírus, o qual tem sido
implicado em aproximadamente 18% dos casos (Azkur, 2014 et al.; Miller et al.,
2011, Richard et al., 2008). Um estudo em nosso meio detectou o Rinovírus em
39% dos casos (Nascimento et al., 2010).
19
Vários outros vírus tem sido detectados na BVA, como Influenza,
Parainfluenza, Metapneumovírus, Bocavírus, enterovírus (Sung et al., 2011;
Wong-Chew et al., 2011, Garcia et al., 2001; Nascimento 2010 et al., Calvo et
al., 2010)
FATORES DE RISCO
Devido a possibilidade da doença evoluir de forma grave é importante
tentar identificar os fatores de risco que contribuem para uma evolução
desfavorável. Diversos trabalhos na literatura têm tentado demonstrar quais
são esses fatores de risco, sendo que alguns fatores já foram bem elucidados,
como prematuridade, tabagismo passivo, baixa idade, ausência de aleitamento
materno, doença pulmonar crônica e cardiopatia congênita.
PREMATURIDADE
Um estudo com 296.618 crianças das quais 7.189 foram internadas por
BVA demonstrou que a prematuridade era um fator de risco para internação
por essa doença (Murray et al., 2014). Esses achados foram confirmados em
um estudo prospectivo durante um ano com 2.210 crianças das quais 120
foram internadas por BVA (Lanari et al., 2015-May). Outro estudo,
retrospectivo, com 599.535 lactentes dos quais 7.597 foram internados por
BVA, demonstrou que os lactentes prematuros tardios (Idade gestacional entre
33 semanas e 36 semanas e 6 dias) apresentavam maior risco de internação e
maior tempo de internação por essa doença quando comparados a lactentes
nascidos a termo (Helfrich et al., 2015). Um estudo em nosso meio
acompanhou uma corte de 5.301 crianças por um ano das quais 113 foram
hospitalizadas por BVA, e observou que o risco de hospitalização foi 80% maior
nas crianças prematuras (Albernaz et al., 2003). Outros estudos também
demonstram a associação entre prematuridade e risco de internação por BVA
(Grimwood et al., 2008; Ruiz-Charles et al., 2002).
20
Um estudo retrospectivo com dados de 122.832 pacientes internados
com BVA entre 2004 e 2012 na Espanha demonstrou que a prematuridade foi
um fator de risco para mortalidade (Sanches-Luna et al., 2016). Outro estudo
recente com crianças internadas por VSR demonstrou que as prematuras
apresentavam maior risco de internação em UTI, maior tempo de internação e
de oxigenoterapia e maior risco de evoluir a óbito (Van de Steen et al., 2016).
Chan e colaboradores (2002) avaliando 216 crianças internadas com BVA por
VSR demonstraram que os prematuros tiveram maior risco de hipoxemia e de
falência respiratória com necessidade de ventilação mecânica (Chan et al.,
2002). Ricart e colaboradores (2013), em um estudo prospectivo com 484
internadas por BVA, confirmaram a associação da prematuridade com maior
gravidade da doença (Ricart et al., 2013). Outros estudos também demonstram
a associação da prematuridade com a gravidade da BVA e risco de internação
em UTI (Vizcarra-Ugalde et al., 2016; Gurgel et al., 2016; Rodriguez et al.,
2014; Garcia et al., 2010; Fodha et al., 2007; López Guinea et al., 2007; Flores
et al., 2004; Bonillo Perales et al., 2002), incluindo um estudo em nosso meio
(Nascimento et al., 2010). Em outra pesquisa foi verificado que a
prematuridade, sem presença de Displasia Borncopulmonar, leva a um risco 7
vezes maior de BVA por VSR, concluindo que a prematuridade por si só é um
fator de risco, e não a Displasia Broncopulmonar eventualmente a ela
associada (Gouyon et al., 2012).
TABAGISMO PASSIVO
Lanari e colaboradores (2015) acompanharam 2.210 crianças desde o
nascimento e observaram que o tabagismo materno era um fator de risco para
internação por BVA (Lanari et al., 2015). Esses achados foram confirmados por
Green e colaboradores (2016) em um trabalho retrospectivo com 468.138
lactentes com BVA (Gree et al., 2016). Stevenson e colaboradores (2016)
demonstraram que o tabagismo passivo aumentava a chance de admissão em
UTI para crianças internadas por BVA (Stevenson et al., 2016). Semple e
colaboradores (2011) em um estudo avaliando 378 pacientes internados com
21
BVA demonstraram que o tabagismo passivo foi fator de risco para
necessidade de oxigênio suplementar e de ventilação mecânica (Semple et al.,
2011). Outro estudo verificou que o tabagismo passivo estava associado com
maior gravidade do quadro e maior tempo de hospitalização em pacientes
internados por BVA (Chatzmichael et al., 2007). Bradley e colaboradores
(2005) em estudo prospectivo com 206 pacientes internados por BVA por VSR
verificaram que as crianças expostas a tabagismo materno pós-natal tinham
menores níveis de saturação da hemoglobina pelo oxigênio que os não
expostos (Bradley et al., 2005). Em nosso meio um estudo evidenciou que o
risco de hospitalização por BVA foi 57% maior nas crianças expostas a
tabagismo materno do que naquelas não expostas (Albernaz et al., 2003).
Jones e colaboradores (2011) realizaram uma metanálise, avaliando 60
estudos, e demonstraram que o tabagismo passivo era importante fator de
risco para BVA (Jones et al., 2011).
BAIXA IDADE
Um estudo prospectivo com 12.555 crianças internadas por infecções
respiratórias agudas demonstrou que idade menor que 3 meses era um fator
de risco para infecção por VSR (Lucion et al., 2014). Um estudo recente
demonstrou que crianças menores de 6 meses internadas por BVA apresentam
um risco maior de necessitarem de UTI quando comparadas às maiores de 6
meses (Vizcarra-Ugalde et al., 2016). Damore e colaboradores (2008) em
estudo prospectivo com 1.456 pacientes com BVA verificaram que a idade
menor que 2 meses era fator de risco para internação em UTI (Damore et al.,
2008). Em nosso meio, Nascimento e colaboradores (2010), verificaram que a
idade apresentava um OR de 0,838 (95% IC 0,718–0,979, p=0,026) em relação
à internação hospitalar, indicando que idade maior levava a diminuição da
incidência de internação (Nascimento et al., 2010). Oñoro e colaboradores
(2011) avaliando 229 pacientes internados em UTI por BVA verificaram que a
idade era inversamente proporcional ao tempo necessário de UTI e ao tempo
necessário de suporte ventilatório (Oñoro et al., 2011). Um estudo avaliando
22
284 pacientes internados em UTI por BVA verificou que a idade menor que 6
semanas foi o principal fator de risco, correspondendo a 45% dos pacientes
(López Guinea et al., 2007). Bradley e colaboradores (2005) em estudo
prospectivo com 206 pacientes internados por BVA por VSR verificaram que
quanto menor a idade da criança menor eram os níveis de saturação da
hemoglobina pelo oxigênio, sendo que cada mês a menos que a criança tinha
correspondia a uma diminuição de 0,41% da saturação de oxigênio (Bradley et
al., 2005). Outros estudos confirmam que quanto menor a idade da criança
maior é a gravidade da BVA (Gurgel et al., 2016; Rodriguez et al., 2014; Papoff
et al., 2011; Vidaurreta et al., 2011; Jeena et al., 2003; Bonillo Perales et al.,
2002).
ALEITAMENTO MATERNO
O aleitamento materno tem sido descrito como fator protetor contra BVA
grave. Um estudo prospectivo durante um ano com 2.210 crianças das quais
120 foram internadas por BVA demonstrou que a ausência de aleitamento
materno era um fator de risco para a internação (Lanari et al., 2015-May).
Koehoorn e colaboradores (2008) em um estudo avaliando 12.474 crianças
com BVA, das quais 1.588 necessitaram internação, concluíram que as
crianças que não iniciaram aleitamento materno na maternidade tinham maior
risco de serem internadas (Koehoorn et al., 2008). Chatzimichael e
colaboradores (2007) acompanhando 240 crianças internadas por BVA
concluíram que aleitamento materno inferior a 4 meses foi fator de risco para
evolução mais grave e maior tempo de internação (Chatzmichael et al., 2007).
O aleitamento materno como proteção para BVA foi também demonstrado em
estudo que comparou 110 crianças avaliadas na emergência com BVA com
controles saudáveis (Ruiz-Charles et al., 2002).
Em nosso meio Dornelles e colaboradores (2007) realizaram um estudo
prospectivo com 175 crianças internadas com BVA e verificaram que a duração
do aleitamento materno exclusivo foi inversamente relacionada ao tempo de
utilização de oxigênio e duração da internação, evidenciando que para cada
23
mês de aleitamento materno exclusivo havia uma redução de 11 hs no tempo
de utilização de oxigênio (Dornelles et al., 2007). Outro estudo em nosso meio
demonstrou que as crianças desmamadas antes de completar um mês de vida
apresentaram risco 7,7 vezes maior de serem hospitalizadas por BVA
(Albernaz et al., 2003).
DOENÇA PULMONAR CRÔNICA
A presença de doença pulmonar crônica tem sido relacionada à maior
gravidade de BVA em diversos estudos (Vizcarra-Ugalde et al., 2016; Paes et
al., 2011; Ochoa Sangrador et al., 2010; Al-Shehri et al., 2005; Bonillo Perales
et al., 2000). Na Espanha, um estudo retrospectivo com dados de 122.832
pacientes internados com BVA entre 2004 e 2012 demonstrou que doença
pulmonar crônica foi um fator de risco para mortalidade (Sanches-Luna et al.,
2016). Em outro estudo lactentes com Displasia Broncopulmonar
apresentavam um risco 6,7 maior de evoluir a óbito por BVA quando
comparados a lactentes sem essa condição (Che et al., 2012).
CARDIOPATIA CONGÊNITA
A presença de cardiopatia congênita tem sido relacionada à maior
gravidade de BVA (Vizcarra-Ugalde et al., 2016; Chu et al., 2016; Resch et al.,
2016; Granbom et al., 2016; Rodriguez et al., 2014; Ricart et al., 2013; Jung,
2011; Paes et al., 2011; Ochoa Sangrador et al., 2010; Bonillo Perales et al.,
2000). O estudo retrospectivo com dados de 122.832 pacientes internados com
BVA entre 2004 e 2012 na Espanha, citado anteriormente, demonstrou também
que cardiopatia congênita foi um fator de risco para mortalidade (Sanches-Luna
et al., 2016). Uma pesquisa verificou que o tempo de internação por BVA foi
maior nas crianças que apresentavam cardiopatia congênita (Hervás et al.,
2012). Fjaerli e colaboradores (2004) em estudo retrospectivo com 764
pacientes internados com BVA evidenciaram que a presença de cardiopatia
24
congênita estava associada com tempo de internação 50% maior do que em
crianças sem cardiopatias (Fjarrli et al., 2004).
GÊNERO
Um estudo prospectivo durante um ano com 2.210 crianças demonstrou
que ser do sexo masculino estava associado a um risco maior de internação
por BVA (Lanari et al., 2015-May). Uma pesquisa demonstrou que pacientes do
sexo masculino com BVA apresentam risco maior de necessitar suplementação
de oxigênio e ventilação mecânica quando comparado aos pacientes do sexo
feminino (Semple et al., 2011). Outros estudos confirmam esse achado
(Pezzotti et al., 2009; Koehoorn et al., 2008).
ETNIA
Ainda não está claro o papel da etnia como fator de risco para BVA. Um
estudo relata que os pacientes de raça negra tem uma evolução melhor
comparada com os da etnia branca (Bradley et al., 2005), enquanto outro
estudo refere o oposto (Leader et al., 2003). Um estudo na Nova Zelândia
demonstrou que os pacientes de origem Maori apresentam evolução pior
(Grimwood et al., 2008). Meissner (2003) demonstrou que os americanos
nativos e os que têm origem no Alasca apresentam maior gravidade quando
comparados aos da etnia branca (Meissner, 2003).
ETIOLOGIA E PRESENÇA DE CO-INFECÇÃO VIRAL
Existe controvérsia na literatura sobre a influência do tipo de vírus
causador da BVA com a evolução mais grave da mesma. Alguns estudos
sugerem que o VSR é um fator de gravidade para a BVA quando comparado a
outros vírus (Sanches-Luna et al., 2016; Bamberger et al., 2012; Hervás et al.,
2012; Papoff et al., 2011; Garcia et al., 2010; Calvo et al., 2010; Al-Shawwa et
al., 2007). Outros estudos porém, demonstraram que o VSR não leva a uma
25
maior gravidade do quadro quando comparado a outros vírus (Ricart et al.,
2013; D’elia et al., 2005; Weigl et al., 2004).
Existe também controvérsia em relação ao aumento da gravidade do
quadro nos casos em que ocorre coinfecção viral. Alguns estudos sugerem que
a coinfecção leva a um quadro mais grave (Rodriguez et al., 2014; da Silva et
al., 2013; Richard et al., 2008; Semple et al., 2005) enquanto outros estudos
demonstram que pacientes com coinfecção viral não apresentam um quadro
mais grave do que os pacientes infectados por um único vírus (Ricart et al.,
2013; Brand et al., 2012; De Paulis et al., 2011; Nascimento et al., 2010).
OUTROS FATORES DE RISCO
Outros fatores relacionados com a gravidade da BVA são:
• Baixo peso na admissão (Semple et al., 2011).
• Baixo peso ao nascimento (Green et al., 2016; Hasegawa et al., 2015).
• Baixa idade materna (Haerskjold et al., 2016; Green et al., 2016).
• Tabagismo materno na gestação (Lanari et al., 2015-dec; Stevenson et
al., 2016; Koehoorn et al., 2008; Carroll et al., 2007).
• Apresentar quadro de Dermatite Atópica (Balekian et al., 2016; Al-Shehri
et al., 2005).
• Ter sido submetido a ventilação mecânica no período neonatal (Lanari et
al., 2015-May; Ochoa Sangrador et al., 2010).
• Antecedente materno de Atopia (Haerskjold et al., 2016; Miller et al.,
2011).
• Antecedente materno de Asma na gestação (Carroll et al., 2012; Carroll
et al., 2007).
• Época do ano em que nasceram (Reeves, et al., 2016; Lanari et al.,
2015-May; Grimwood et al., 2008).
• Baixo nível socioeconômico (Green et al., 2016; Ochoa Sangrador et al.,
2010; Pezzotti et al., 2009; Albernaz et al., 2003; Jansson et al., 2002).
• Baixo nível educacional dos pais (Gurgel et al., 2016).
26
• Ser portador de Síndrome de Down (Sanches-Luna et al., 2016; Murray
et al., 2014; Bloemers et al., 2007; Fjaerli et al., 2004).
• Morar em área com elevada poluição ambiental (Lanari et al., 2015-Set;
Karr et al., 2007).
• Morar em regiões com elevada altitude (Wang et al., 2012; Choudhuri et
al., 2006).
• Ter nascido através de parto cesárea (Haerskjold et al., 2016; Shang et
al., 2014; Moore et al., 2012).
• Ter irmãos mais velhos (Haerskjold et al., 2016; Lanari et al., 2015-May).
• Morar em casas com muitas pessoas (Lanari et al., 2015-May).
• Frequentar creche (Haerskjold et al., 2016; Gurgel et al., 2016).
FATORES GENÉTICOS
Apesar do conhecimento dos fatores de risco acima citados, cabe
lembrar que a maior parte dos lactentes internados por BVA não apresenta
nenhuma dessas condições, como demonstrado num estudo retrospectivo com
122.832 pacientes internados com BVA, no qual 98,3% destes não
apresentavam nenhum fator de risco (Sanches-Luna et al., 2016). Isto levou os
pesquisadores a acreditar que os fatores epidemiológicos não seriam os únicos
responsáveis pela determinação da gravidade do quadro. Alguns
pesquisadores começaram então a estudar se características genéticas
estariam associadas à evolução mais grave da doença.
Um estudo avaliou 12.346 pares de gêmeos nascidos na Dinamarca em
um período de 10 anos e verificou a concordância entre os gêmeos em relação
a hospitalização por VSR. A concordância foi de 0,66 nos gêmeos
homozigóticos e 0,53 nos gêmeos dizigóticos, estimando-se uma contribuição
genética de 16 a 20% para a gravidade da doença (Thomsen et al., 2008).
Calcula-se que existam mais de 10 milhões de variações no genoma
humano e a forma mais frequente de variação são os polimorfismos de
nucleotídeo único ou Single Nucleotide Polymorphism (SNP), que consistem na
substituição de uma base por outra diferente.
27
Na BVA a infecção restringe-se às células superficiais do epitélio
respiratório, principalmente às células ciliadas dos bronquíolos e dos
pneumócitos tipo 1 nos alvéolos, e é combatida através da resposta imune
inata e adaptativa. O VSR é reconhecido por estas células epiteliais através de
receptores especializados de reconhecimento de padrões moleculares
associados a patógenos, conhecidos como Pattern recognition receptors, em
forma de moléculas transmembrana denominados receptores tipo Toll ou Tool
Like Receptors (TLR) presente em macrófagos e células dendítricas, e ocorre a
produção de citocinas pro-inflamatórias (Interleucinas 6, 8, 10 e 13, fator de
necrose tumoral, RANTES, CX3CK1) e proteínas do surfactante. Alguns
desses fatores apresentam propriedades antivirais diretas, enquanto outros
estimulam a ativação de células natural killer, granulócitos, monócitos e
macrófagos, dando início à resposta imune adaptativa.
O principal receptor Toll-like responsável pelo reconhecimento do VSR é
o Toll-like 4 (TLR4). Variações genéticas do TLR4 foram associadas com o
risco de BVA grave por VSR, mas os resultados tem variado entre os estudos
(Tal et al., 2004; Puthothu et al.,2006; Douville et al., 2010; Löfgren et al., 2010;
Mandelberg et al., 2006; Goutaki et al., 2014; Zhu et al., 2015; Zhou et al.,
2016).
Polimorfismos no Toll-like 9 e Toll-like 10 também foram associados ao
risco de BVA por VSR (Mailaparambil et al., 2008). Outros genes que
apresentam polimorfismos relacionados à gravidade da BVA são regulated on
activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES) (Amantidou, 2008;
Schlender et al., 2005; Hattori et al., 2011), Receptor de Vitamina D (VDR)
(Kresfelder et al., 2011; Janssen et al., 2007; Roth et al., 2008; McNally et al.,
2014), inducible nitric oxide synthase 2 (NOS2), interferon 5 (IFNA5), e JUN
(Janssen et al., 2007).
O melhor entendimento da influência de polimorfismos nos genes da
resposta imune é importante para tentar identificar de maneira mais eficiente os
lactentes que apresentam risco para evolução mais grave da BVA (Rämet et
al., 2011).
28
JUSTIFICATIVA
A BVA é uma doença com alta incidência, responsável por grande
número de internações, acarretando em custo elevado. Pode evoluir de forma
grave e levar a óbito, sendo então responsável também por um enorme
sofrimento para os pais e pacientes. É importante tentar identificar quais são os
fatores de risco que contribuem para a maior gravidade da doença. No Brasil
existem poucos estudos epidemiológicos com BVA. A contribuição genética na
prevalência e gravidade da BVA ainda não está esclarecida. Genes
relacionados a resposta imunológica têm sido relatados como fatores
associados a presença e maior gravidade da BVA em diferentes populações.
Esses estudos são escassos na literatura cientifica e não existe nenhum estudo
com a população brasileira. Os estudos também demonstram controvérsia
quanto aos resultados obtidos para um mesmo polimorfismo. O conhecimento
de polimorfismo em genes da resposta imunológica associados à presença e
gravidade da BVA poderá auxiliar na identificação de populações de risco, e
levará a um maior entendimento dos mecanismos que levam a doença,
podendo contribuir para novas terapias e para o desenvolvimento de uma
vacina para o VSR.
29
OBJETIVO
O objetivo do estudo é determinar quais são as características
epidemiológicas, etiológicas e genéticas associadas à gravidade da evolução
da BVA.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Descrição da população de pacientes incluídos no estudo pela
caracterização das seguintes variáveis epidemiológicas: Gênero, etnia,
presença de prematuridade, tipo de parto, peso ao nascimento, época
do ano em que nasceram, duração do aleitamento materno, idade no
momento da internação, tabagismo materno na gestação, presença de
tabagismo passivo, presença de doença pulmonar crônica, presença de
cardiopatia congênita, número de irmãos, número de pessoas vivendo
na mesma casa, antecedente materno, paterno e dos irmãos para
atopia, escolaridade materna e frequência à escola.
2. Determinação da presença dos seguintes vírus nos pacientes incluídos
no estudo: VSR subtipo A, VSR subtipo B, Rhinovírus A/B/C,
Parainfluenza 1/2/3/4, Adenovírus, Coronavírus 229E/NL63/OC43,
Influenza A, Influenza B, Bocavírus 1/2/3/4, Metapneumovírus e
Enterovírus.
3. Determinação da presença dos seguintes polimorfismos nos pacientes
incluídos no estudo: rs4986790 (TLR4), rs4986791 (TLR4), rs1927911
(TLR4), rs898830 (TLR2), rs7656411 (TLR2), rs352162 (TLR9),
rs187084 (TLR9), rs1065341 (RANTES), rs2107538 (RANTES),
rs2280788 (RANTES), rs2280789 (RANTES), rs10735810 (VDR),
rs2228570 (VDR), rs1060826 (NOS2), rs10757212 (IFNA5), rs11688
(JUN).
4. Descrever a evolução do quadro em relação à: tempo de internação,
tempo de utilização de oxigenoterapia, necessidade e tempo de
30
internação em UTI, necessidade e tempo de ventilação mecânica e
evolução a óbito.
5. Verificar a associação da gravidade da evolução do quadro conforme os
parâmetros descritos no item 4, com as características epidemiológicas
descritas no item 1, com a presença dos vírus descritos no item 2 e com
a presença dos polimorfismos descritos no item 3.
31
MÉTODOS
PACIENTES
Foram avaliados prospectivamente todos os pacientes menores de 2
anos de idade com quadro de BVA grave internados com necessidade de
oxigenoterapia no Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP), Hospital Estadual de Sumaré (UNICAMP), e Hospital Vera Cruz
entre janeiro de 2013 e dezembro de 2014.
O diagnóstico da BVA foi baseado em dados clínicos. Para o diagnostico
clinico da BVA foi utilizada a definição mais aceita na literatura, a qual
considera bronquiolite o primeiro episódio agudo de dificuldade respiratória
com sibilos, precedido por um quadro catarral de vias aéreas superiores (rinite,
tosse, com ou sem febre) em menores de 2 anos de idade (McConnochie,
1983; Ralston, 2014). Foram excluídos os pacientes que tinham apresentado
quadro anterior de sibilância.
O critério para BVA grave foi uma saturação de oxigênio < 92% em ar
ambiente, os pacientes nessa condição foram internados para oxigenoterapia.
Os pacientes foram internados na UTI quando a saturação de oxigênio
mantinha-se < 92% mesmo com o paciente recebendo uma fração inspirada de
oxigênio > 60%. A indicação de ventilação mecânica ocorreu quando o
paciente apresentava uma pressão parcial arterial de oxigênio < 60 mmHg ou
pressão parcial arterial de dióxido de carbono > 50 mmHg na gasometria
arterial. A suspensão da oxigenoterapia ocorreu quando o paciente mantinha
uma saturação de oxigênio > 92% em ar ambiente. A alta hospitalar ocorreu 24
hs após a suspensão da oxigenoterapia.
O grupo controle foi composto por 536 adultos saudáveis (19 a 25 anos
de idade) sem história pessoal ou familiar de doença respiratória por duas
gerações. A utilização de grupo controle com adultos saudáveis é uma
ferramenta útil e aceita que tem sido utilizada em um grande número de
estudos de associação genética (Tal, 2004, Mailaparambi, 2008; Amanatidou,
32
2008; Janssen, 2007; Puthothu, 2006; McNally 2014). O questionário aplicado
no grupo controle está no ANEXO 1.
Os pacientes foram avaliados em relação a variáveis epidemiológicas,
evolução do quadro, presença de vírus e presença de polimorfismos gênicos,
conforme descrição a seguir.
Ø Variáveis epidemiológicas que foram avaliadas:
• Gênero: masculino ou feminino.
• Etnia: caucasóide, negróide ou mongolóide.
• Prematuridade: nascimento com menos que 37 semanas de idade
gestacional.
• Tipo de parto.
• Peso ao nascimento.
• Época do ano em que nasceram.
• Duração do aleitamento materno (em meses).
• Idade no momento da internação.
• Tabagismo materno na gestação.
• Tabagismo passivo: presença ou ausência de fumante morando na casa
da criança.
• Doença pulmonar crônica: presente ou ausente.
• Cardiopatia congênita: presente ou ausente.
• Número de irmãos.
• Número de pessoas que vivem na mesma casa.
• Antecedente materno para atopia: presente ou ausente.
• Antecedente paterno para atopia: presente ou ausente.
• Antecedente de irmãos com atopia: presente ou ausente.
• Escolaridade materna.
• Frequência à escola: presente ou ausente.
33
Estes dados foram coletados com os responsáveis pelos pacientes através
do questionário apresentado no ANEXO 2.
Ø Evolução do quadro:
Foi realizado um acompanhamento prospectivo dos pacientes até o
momento da alta. Os parâmetros avaliados foram:
• Duração da internação.
• Duração da oxigenoterapia.
• Necessidade e duração da internação na UTI.
• Necessidade e duração de ventilação mecânica.
• Evolução à óbito.
IDENTIFICAÇÃO VIRAL
Os pacientes foram submetidos a coleta de aspirado nasofaríngeo para
posterior identificação viral.
A identificação viral foi realizada no Departamento de Genética,
Evolução e Bioagentes do Instituto de Biologia da UNICAMP, pela Profa.
Juliana Cristina Santiago Bastos com supervisão da Profa. Dra. Clarice Weis
Arns.
Ø Processamento das amostras:
Antes de iniciar a extração, cada amostra foi centrifugada e o
sobrenadante removido, conforme protocolo do RNAprotect® Cell
Reagent.
Ø Extração de DNA e RNA:
Para realizar a extração de DNA e RNA viral foi utilizado o Allprep DNA
RNA kit (Qiagen®) conforme recomendações do fabricante. As amostras
34
foram primeiro lisadas e homogeneizadas em um tampão contendo
guanidina-isocianato, que inativam imediatamente DNAses e RNAses
para assegurar o isolamento do DNA e do RNA. O material passou,
então, através de uma coluna que, em combinação com o tampão de
alto teor salino, permitiu a ligação seletiva do DNA genômico. O DNA foi
então isolado. Em seguida, foi adicionado etanol ao fluxo da coluna para
proporcionar condições adequadas ao isolamento do RNA, e a amostra
foi adicionada. Desse modo, o RNA total se ligou à membrana e o RNA
foi isolado. O procedimento foi realizado para todas as amostras
coletadas.
Ø Síntese de cDNA:
A partir do RNA extraído, o cDNA foi transcrito utilizando-se o kit High
Capacity cDNA Reverse Transcription (AppliedBiosystems®). Foram
utilizados 10µL de RNA total ao qual foi adicionado 4,2µL de água DEPC
(Dietilpirocarbonato – Sigma), 2,0µL de buffer (10XRT), 2,0µL de
randomprimers (10X), 0,8µL dNTP (25X – concentração 100 mM) e
1,0µL da enzima transcriptase reversa multiscribe (concentração 50 U/
µL). Em seguida, o material foi levado ao termociclador nos seguintes
ciclos: a 25ºC por dez minutos, seguido de 37ºC por duas horas, 85ºC
por 5 minutos e manutenção a 4ºC por curto intervalo de tempo.
Ø PCR Multiplex:
As reações de PCR foram realizadas utilizando-se o kit Seeplex® RV15
ACE Detection, que é um teste qualitativo in vitro para a detecção de 15
patógenos respiratórios em aspirados nasofaríngeos. Para isso, foi
preparado mix contendo RV15 ACE PM, 8-Mop Solution e 2X Multiplex
Master Mix. Foram, então, preparados tubos contendo alíquotas de 17 µl
desse mix e 3 µl de cada amostra de DNA + cDNA. Os tubos foram
colocados em termociclador pré-aquecido (94 °C) e a reação foi
35
realizada com a seguinte programação: 1 ciclo de 15 min a 94 °C, 40
ciclos sendo 0,5 min a 94 °C, 1,5 min a 60 °C e 1,5 min a 72 °C. Por fim,
1 ciclo de 10 min a 72 °C. A detecção foi realizada em gel de agarose 2
% contendo GelRed (Biotium®). A visualização deu-se por meio de luz
UV, e a identificação foi baseada no peso molecular de cada banda
amplificada e conforme controle positivo.
Ø Os vírus pesquisados foram:
• VSR subtipo A
• VSR subtipo B
• Rhinovírus A/B/C
• Parainfluenza 1
• Parainfluenza 2
• Parainfluenza 3
• Parainfluenza 4
• Adenovírus
• Coronavírus 229E/NL63
• Coronavírus OC43
• Influenza A
• Influenza B
• Bocavírus 1/2/3/4
• Metapneumovírus
• Enterovírus
IDENTIFICAÇÃO DOS POLIMORFISMOS
A identificação dos polimorfismos foi realizada no Departamento de
Genética Médica da UNICAMP pelo Prof. Dr. Fernando Augusto de Lima
Marson. Profa. Dra. Carmen Sílvia Bertuzzo.
36
Ø Extração do DNA genômico:
• Extração de DNA genômico pela técnica do cloreto de lítio
A técnica de cloreto de lítio para a extração de DNA genômico foi
realizada na amostra de indivíduos controles. A técnica foi selecionada por ser
de rápida realização, baixo custo e possibilitar a extração de 36 amostras ao
mesmo tempo.
Como protocolo, após a coleta do sangue em tudo com EDTA, foi
realizada a centrifugação da amostra em 4500 r.p.m. com posterior retirada do
plasma. Após o procedimento inicial, a amostra foi vertida no próprio tubo de
coleta para a ressuspensão dos leucócitos. Em um tubo de propileno (C3H6)
com fundo cônico foram adicionados 500 µL de sangue (sem o plasma) e 800
µL de tampão de lise celular [para cada 100 mL – 10,96 g de sacarose, 500 µL
de Tris-HCl pH 7,5 (2 M), 500 µL de MgCl2, um mL de Triton X-100
(C14H22O(C2H4O)n (correspondendo a 1% do volume da solução),
completando-se o volume para 100 mL de água, e armazenada a -4°C. A
mistura foi agitada em vórtex por 15 segundos e centrifugada a 8000 r.p.m. por
dez minutos para a formação de precipitado. O sobrenadante foi descartado, e
o processo anteriormente citado foi realizado outras duas vezes com a adição
de um mL ao sobrenadante do tampão de lise celular.
Após a etapa de lise celular, foi realizado o descarte final do
sobrenadante e no precipitado adicionado 395 µL de tampão de digestão [100
µL de Tris-Hcl pH 7,5 (2M), 400 µL de EDTA (0,5 M), 40 µL de NaCl (5M) e 500
µL de SDS 20%, com a adição final de água até o valor total de 20 mL para a
solução, armazenada à temperatura ambiente] e cinco µL de Proteinase K
(Sigma-Aldrich®, 3050 Spruce St. St. Louis, MO 63103, USA).
A mistura ficou incubada por duas horas, em banho úmido, a 55°C. Após
uma hora de banho, foi realizado o vórtex por 15 segundos para quebra de
eventual resíduo do precipitado.
Após o período de incubação, 200 µL de LiCl 7,5 N foram adicionados,
com posterior incubação a -4°C por 15 minutos. Após a incubação, o tubo foi
centrifugado por dez minutos a 13.000 r.p.m. O sobrenadante livre de proteínas
37
e outros contaminantes foi transferido para outro tubo de propileno, onde foi
adicionado um mL de álcool etílico (CH3CH2OH) absoluto. O tubo foi invertido
manualmente até a formação do precipitado (DNA) e centrifugado a 13 r.p.m.
por oito minutos. O sobrenadante foi descartado, e posteriormente, foi
adicionado ao tubo um mL de álcool etílico [70%]. O tubo foi agitado
novamente com posterior centrifugação a 13.000 r.p.m. por oito minutos. Após
o procedimento, o sobrenadante foi descartado e o tubo foi deixado em estufa
(37°C) até total evaporação do álcool residual. Ao precipitado, foi adicionado 60
µL de água. Após 12 horas de eluição, o DNA foi quantificado como descrito a
seguir.
• Extração pelo QIAamp® DNA Blood Mini kit (Código do catálogo:
51106) (Qiagen®, 27220 Tumberry Lane, Valencia CA 91355, USA)
O kit de extração foi utilizado para amostras dos pacientes com
bronquiolite viral aguda. A escolha do kit foi baseada no grau de pureza da
amostra de DNA obtida e na facilidade de extração de múltiplas amostras de
sangue periférico armazenadas em EDTA ao mesmo tempo. Todo o protocolo
seguido foi proposto pelo fabricante com algumas adaptações (Qiagen®, 27220
Tumberry Lane, Valencia CA 91355, USA)
Para a extração foi seguido o protocolo, passo a passo, como descrito a
seguir:
1. Foram pipetados 20 µL da proteinase K fornecida no kit de extração no fundo
de um tubo de propileno (1,5 mL de volume máximo) para microcentrífuga e,
posteriormente, adicionado 200 µL de sangue total.
2. Foram adicionados a mistura quatro µL da solução RNase A, fornecida junto
ao kit antes da adição das outras soluções. Após a adição da RNase A, a
mistura foi agitada para a homogeneização.
3. Foi adicionado 200 µL do tampão AL (características químicas não descritas
pelo fabricante) na amostra, sendo realizada a homogeneização em agitador.
Para fornecer melhor rendimento ao processo de extração do DNA, a mistura
foi homogeneizada o máximo de tempo possível.
38
4. A mistura foi incubada a 56°C por dez minutos. Para a lise proteica, a
amplitude máxima é alcançada em dez minutos de incubação e períodos
superiores de incubação não afetam a qualidade e quantidade da amostra
obtida após o procedimento de extração do DNA da amostra.
5. Após o período de incubação, o microtubo foi centrifugado brevemente para
remover bolhas e eliminar resíduos nas bordas e paredes do mesmo.
6. Na mistura, foi adicionada 200 µL de álcool etílico absoluto (100%), e
posteriormente homogeneização em vórtex foi realizada por 15 segundos,
seguida por breve centrifugação (passo 5).
7. A mistura foi transferida em seu volume total para uma mini coluna do tipo
“spin” (alocada dentro de um tubo de coleta com volume máximo de dois mL)
sem que a borda da coluna fosse umedecida pela mistura, com o intuito de
evitar contaminação entre as amostras de sangue periférico. Após o
fechamento do microtubo, a centrifugação foi realizada em 8.000 r.p.m. por um
minuto. A centrifugação em maiores rotações não altera o valor de [DNA]
obtido no final do procedimento, e caso ocorresse sobra de amostra dentro da
coluna, a mesma era novamente centrifugada.
8. A mini coluna foi transferida para um novo tubo de coleta e foi adicionado
500 µL do tampão AW1 (características químicas não descritas pelo fabricante)
sem umedecer as bordas do microtubo. Após a adição do tampão, o microtubo
foi centrifugado a 8.000 r.p.m. por um minuto. Após o processo a coluna foi
transferida para um novo microtubo de coleta.
9. Após a transferência da coluna, foi adicionado 500 µL do tampão AW2
(características químicas não descritas pelo fabricante) sem que a borda do
microtubo fosse umedecida. Após a adição do tampão, o microtubo foi
centrifugado a 14.000 r.p.m. por três minutos.
10. Após a centrifugação, a coluna foi transferida para novo microtubo de
propileno com tampa. Na coluna foi adicionado 200 µL do tampão AE
(características químicas não descritas pelo fabricante). Após a adição do
tampão, a amostra foi mantida em temperatura ambiente (15 a 25 °C) por cinco
minuto, seguido da centrifugação em 8.000 r.p.m. por um minuto.
11. Após a extração a amostra foi mantida a -20°C.
39
O passo a passo do processo de extração vinculado a coluna de sílica
está apresentando na Figura 1.
Figura 1. Passo a passo no processo de extração de DNA pelo QIAamp® DNA
Blood Mini kit, adaptado do manual do fabricante.
• Extração pelo PureLink® Genomic DNA Mini Kit (Número de catálogo
K1820-02) (3175 Staley Road, Grand Island, NY 14072, USA)
40
Para a extração do DNA utilizado o kit da Life Technologies® o mesmo
protocolo foi adotado, seguindo normas do fabricante, com pequenas
alterações, que se seguem:
1. Temperatura do banho úmido foi de 55°C ao invés de 56°C.
2. Foram adicionados 40 µL de RNase A ao invés de quatro µL de RNase A.
3. No lugar do tampão AL foi adicionado o tampão para lise genômica com a
denominação PureLink®.
4. No lugar do tampão de lavagem AW1 e do AW2, foram utilizados,
respectivamente, os tampões de lavagem 1 e 2, sem denominação específica.
5. A eluição foi realizada pelo reagente PureLink® Genomic Elution Buffer.
Os volumes dos reagentes e a centrifugação da amostra nos diferentes
procedimentos são os mesmos descritos no item anterior.
Ø Quantificação do DNA:
A quantificação do DNA na amostra obtida pela extração foi realizada no
espectrofotômetro Epoch® (Highland Park, 100 Tigan Street, Winooski, VT
05404, USA) compatível com 16 amostras. Para cada análise realizada foram
corridas 15 amostras de DNA e um controle negativo. Como parâmetro
negativo foi utilizado o fator de eluição do DNA (água ou TE). Para todas as
amostras foi aplicada na placa dois µL. Para as amostras de DNA foram
anotados os parâmetros: A260/230 (foram apenas utilizadas amostras com
valores entre 1,7 a 1,9 de absorbância – valores menores indicam possível
contaminação com sais ou solventes, como o fenol), A260/280 (foram apenas
utilizadas amostras com valores entre 1,7 a 1,9 de absorbância – valores
menores indicam contaminação com proteína) e a concentração (50 ng/mL).
Todas as amostras extraídas com kit foram quantificadas diretamente.
As amostras com extração realizada por outro método foram purificadas em
colunas de sílica antes da quantificação do DNA, para que inibidores de
amplificação fossem retirados da amostra. Para cada extração realizada, um
gel de agarose a 0,8% corado com SYBR® Green (Life Technologies®, 3175
Staley Road, Grand Island, NY 14072, USA) foi aplicado e submetido à
41
eletroforese para averiguar a presença de degradação do DNA extraído.
Nenhuma amostra foi aquecida em temperatura acima de 60°C, para evitar que
ocorresse degradação do material.
Ø Genotipagem dos polimorfismos pelo sistema TaqMan® OpenArray®
Genotyping (Life Technologies®, 3175 Staley Road, Grand Island,
NY 14072, USA):
• Características gerais da plataforma OpenArray®
O sistema OpenArray® usa a reação em cadeia da polimerase (PCR)
com base em fluorescência para fornecer detecção qualitativa de alvos
específicos por meio de análise de pós-PCR (endpoint). O sistema de
OpenArray® foi utilizado por realizar experimentos de genotipagem para
identificar pequenas variações em genes dentro de uma população. O sistema
OpenArray®, em resumo: (i) fornece análise de endpoint baseado em PCR de
dezenas a centenas de SNPs em poucas a dezenas de milhares de amostras;
(ii) permite que um único pesquisador possa aplicar, amplificar e digitalizar 16
placas do sistema de genotipagem TaqMan® OpenArray® em uma única
jornada de oito horas, sendo cada placa de genotipagem pré-carregada com 16
a 256 ensaios TaqMan®; (iii) finalmente, fornece dados com aproximadamente
99,7% de concordância com os dados gerados com ensaios em um TaqMan
Real-Time PCR System da Applied Biosystems®.
Para a análise dos dados, como componentes da plataforma, temos:
1. Auto Loader OpenArray® (Figura 2A) - aparelho responsável em aplicar as
amostras na placa de genotipagem do sistema TaqMan® OpenArray®.
2. Estação de selagem do case da placa do OpenArray® (Figura 2B) - veda o
case para a genotipagem no sistema TaqMan® OpenArray®.
3. Instrumento OpenArray® (Figura 2D) - executa a imagem das placas de
genotipagem. A detecção da imagem pode ser feita após a corrida da PCR em
termociclador (Dual Flat Block Gene Amp® PCR System 9700) próprio (Figura
2C) para o chip de genotipagem ou diretamente no equipamento. Caso a
corrida seja realizada no aparelho de detecção de imagem, apenas três chips
42
podem ser amplificados ao mesmo tempo, se o termociclador for utilizado, oito
lâminas podem ser amplificadas ao mesmo tempo, para posterior detecção da
fluorescência.
4. Sistema computacional para a análise inicial dos dados - o computador deve
conectado diretamente no sistema OpenArray®, sendo necessário o software
OpenArray® SNP Genotyper para a execução dos dados e identificação dos
polimorfismos mediante a presença de fluorescência.
Figura 2. Equipamentos utilizados para a realização da genotipagem no
sistema OpenArray®. A. Auto Loader OpenArray®. B. Estação de selagem do
case da placa do OpenArray®. C. Dual Flat Block GeneAmp® PCR System
9700. D. Instrumento OpenArray®.
O instrumento OpenArray® coleta dados de fluorescência sem correções
após ciclos térmicos (amplificação por PCR) realizados. Um ponto de coleta de
dados (data point) no instrumento OpenArray® consiste em três fases:
1. Excitação - O instrumento ilumina todos os orifícios de passagem da placa
de genotipagem, excitando os fluoróforos (FAM e VIC) em cada reação.
43
2. Emissão – As unidades ópticas do aparelho reconhecem a fluorescência
residual emitida a partir dos orifícios pela placa de genotipagem. A imagem
resultante consiste somente de luz correspondente a gama de comprimentos
de onda de emissão.
3. Coleta do dado – O instrumento reúne uma representação digital da
fluorescência residual recolhida durante um intervalo de tempo fixo, em
seguida, armazena a imagem de fluorescência em dado bruto para análise.
Após o período de aquisição de imagem, o software do OpenArray®
utiliza regiões de interesse (ROI), dado óptico, valores do fluoróforo, e os dados
de calibração do fundo da imagem para determinar a localização e a
intensidade dos sinais de fluorescência em cada leitura, o corante associado
com cada sinal de fluorescência, e a importância do sinal para a genotipagem.
Na Figura 3 temos um exemplo da imagem adquirida pelo software para os
comprimentos de onda do tipo FAM e VIC.
Figura 3. Visualização do resultado de uma lâmina para a corrida no
OpenArray® para o fluoróforo FAM (A) e para o fluoróforo VIC (B). No total são
aplicadas 12 amostras por lâminas, sendo uma amostra por linha, aplicada
quatro vezes.
FAM VIC
A B AMOST
RASA 1
12
44
• Placa para a distribuição da amostra
A placa do sistema OpenArray® contém orifícios (Figura 4) para o total
de 384 reações. Na placa de amostragem foram aplicados o DNA diluído para
a concentração de 50 ng/µL e o mesmo volume do master mix para
genotipagem do sistema TaqMan® OpenArray® (Número de catálogo 4404846).
Após a aplicação da amostra e do master mix, a placa foi encaminhada para o
sistema OpenArray® AutoLoader para transferir a mistura para a placa de
genotipagem (lâmina/chip) contendo os assays.
Figura 4. Representação esquemática da placa de amostra utilizada pelo
sistema OpenArray®. A. Apresentação de uma região relacionada a 12
amostras, que representa a análise de um chip. B. Placa com a distribuição das
amostras para a análise de oito chips.
• Placa de genotipagem (chip) do sistema TaqMan® OpenArray®
A placa de genotipagem do sistema TaqMan® OpenArray® é uma placa
de reação com 63 mm × 19 mm de densidade. Existem 3.072 poços de reação
em cada placa. Cada orifício é pré-carregados com um ensaio TaqMan e pode
1
2
3
4
5
6
7
8
Repetição da
amostra A - D
Poço para
aplicação do DNA
e do master mix
Amostras à 1
a 12
A
B
45
acomodar um volume de reação de 33 nL. A placa de genotipagem é dividida
em 48 subarrays; cada sub disposição consiste em 64 orifícios (Figura 5). A
placa é revestida com reagentes hidrofílicos e hidrofóbicos para permitir que a
amostra seja corretamente disposta em seu interior.
Figura 5. Placa de genotipagem para o sistema TaqMan® OpenArray®
contendo 64 orifícios por subarray e um total de 256 ensaios por amostra
(modelo completo de análise).
Em cada orifício a descriminação alélica foi realizada pela determinação
da fluorescência observada, sendo três possibilidades de resultando
pertinentes:
(i) alelo 1 homozigotos (amostras com apenas alelo 1) – FAM/FAM
(ii) alelo 2 homozigotos (amostras com apenas alelo 2) – VIC/VIC
(iii) heterozigotos (amostras com ambas alelo 1 e alelo 2) – FAM/VIC
Para o experimento foram utilizados além das amostras com a variação
genética desconhecida: (i) réplicas de amostras para validar a acuracidade dos
resultados do equipamento; (ii) amostra sem DNA contendo apenas água ou o
mix de reação em volume dobrado (padrão de qualidade NTC – no template
controls). Como os polimorfismos não foram anteriormente analisados na
amostra e o sequenciamento não foi realizado para nenhum indivíduo incluído
Cada subarray contém 64
orifícios com um ensaio
Por exemplo, temos o orifício
G7
46
no estudo, a adição de controles positivos (com o genótipo conhecido para o
polimorfismo não foi realizada), sendo opcional para o método selecionado.
• Processo para a identificação dos alelos pelo sistema TaqMan®
OpenArray®:
O sistema para identificação alélica dos polimorfismos é baseado em
fluorescência simples e pelo método da PCR, com o uso de sondas específicas
para cada alelo analisado, considerando a particularidade de cada SNP. Cada
sonda contém um fluoróforo como repórter para a genotipagem. Cada ensaio
selecionado na plataforma da LifeTechnologies® é pré-carregado em um orifício
da placa de genotipagem. Cada ensaio contém:
(i) um marcador na extremidade 5 'de cada sonda, sendo:
a. fluoróforo VIC® ligado à extremidade 5' da sonda do alelo 1
b. fluoróforo FAM™ ligado à extremidade 5 ' da sonda do alelo 2
c. primer forward
d. primer reverse
(ii) um ligante para pareamento de menor extensão (minor groove binder –
MGB): esta modificação aumenta a temperatura de fusão (Tf) das sondas sem
o aumento do comprimento da sonda (Afonina et al., 1997; Kutyavin et al.,
1997), assim, possibilita a construção de sonda mais curtas, e favorece maior
diferença na Tf entre sondas com pareamento completo e não pareadas,
possibilitando maior acuracidade para a genotipagem.
(iii) um inibidor não fluorescente (QNQ) na extremidade 3' da sonda: devido
ausência de fluorescência na extremidade 3´, a detecção da fluorescência na
extremidade oposta apresenta melhor padrão de detecção.
Durante a realização da PCR, cada sonda hibridiza especificamente com
a sua sequência complementar entre a sequência forward e reverse dos
primers. A DNA polimerase apenas irá clivar sondas que hibridizam com seu
alelo SNP específico (pareado). A clivagem separa o fluoróforo do MGB –
fragmento completo da sonda – aumentando a detecção da fluorescência para
o fluoróforo. Dessa forma, os sinais de fluorescência gerados durante a
amplificação por PCR indicam os alelos que estão na amostra analisada.
47
Para entendimento do pareamento das sondas, a Figura 6 apresenta os
detalhes do processo e da liberação do fluoróforo da sonda pela DNA
polimerase. A não ocorrência de pareamento reduz a eficiência da hibridização
da sonda e pode acarretar no deslocamento da sonda pela DNA polimerase,
sem que ocorra a clivagem e a liberação do fluoróforo, não havendo sinal de
fluorescência e detecção alélica, favorecendo a maior sensibilidade e
especificidade da técnica.
Figura 6. Pareamento das sondas para o alelo 1 e para o alelo 2. Setas em
vermelho indicam a emissão de sinal para a fluorescência mediante a
amplificação pela DNA polimerase (AmpliTaq Gold DNA polimerase). Adaptado
de Livak, KJ, Marmaro, J, Todd JA. Towards fully automated genome-wide
polymorphism screening. Nat Genet. 1995;9:341-2.
Ø Procedimento, passo a passo, para a identificação dos
polimorfismos no sistema TaqMan® OpenArray® (WorkFlow)
Após a extração do DNA e quantificação, foram feitas alíquotas das
amostras contendo 50 µL na concentração de 50 ng/µL. Antes de executar o
procedimento para a genotipagem, os dados de corrida foram carregados no
sistema TaqMan® OpenArray®, inicialmente no OpenArray® AutoLoader
(Código de catálogo: 4409360). Para o carregamento da amostra dois dados
devem ser executados: (i) informação da placa de genotipagem (será
denominada de lâmina para facilitar o entendimento da técnica) pelo código de
48
barras fornecido pela empresa; (ii) fluxo de amostra a ser analisado com
extensão .csv, contendo a amostra e a localização dos subarrays (Figura 7).
Dados para a corrida no sistema OpenArray®
Amostra Subarray Identificação da amostra*
1 A1 1/2014
2 A2 2/2014
3 A3 3/2014
4 A4 4/2014
5 A5 5/2014
6 A6 6/2014
7 A6 7/2014
8 A8 8/2014
9 A9 9/2014
10 A10 10/2014
11 A11 11/2014
12 A12 12/2014
1 B1 1/2014
2 B2 2/2014
3 B3 3/2014
...
...
...
10 D10 10/2014
11 D11 11/2014
12 D12 12/2014
Figura 7. Dados para a codificação de amostras no sistema do Open Array®.
Para o sistema com 16 ensaios, cada lâmina comporta 192 amostras diferentes
(Um a 192). Cada amostra necessita ser distribuída na placa de amostra quatro
vezes, considerando que temos quatro subarrays por lâmina (A, B, C e D). *A
identificação da amostra é critério pessoal do pesquisador.
49
Com os dados de corrida incluídos no sistema, o passo a passo
realizado, seguindo normatização do protocolo foi:
1. Distribuir a amostra (dois µL) e o mix de reação (dois µL) (TaqMan®
Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG; número de catálogo:
4324018) na placa de amostragem. Como cada placa contém oito quadrantes e
a possibilidade de 96 amostras (cada uma aplicada quatro vezes) (OpenArray®
384-Well Sample Plates, código de catálogo 4406947), sendo um quadrante
para cada lâmina, após a aplicação em cada quadrante, foi protegida com selo
de alumínio as amostras para evitar evaporação. Foi utilizado o selo específico
para a placa de amostra (Corning Life Sciences, número de catálogo 6570).
2. Ligar o sistema OpenArray® AutoLoader, alocar a placa contendo as
amostras protegidas pelo selo (Figura 8A), alocar as ponteiras (OpenArray®
Loader Tips, número de catálogo 4404571) (Figura 8B, 9A e B, 10B) para
transferir o conteúdo da placa de amostras para a lâmina de 16 ensaios (16
TaqMan® OpenArray® Genotyping Plate, número de catálogo 4413554) (Figura
8C). No sistema, o carregamento das lâminas é realizado por pipetador
automático multicanal (FinnPipette Multichannel Digital Pipettor, cinco a 50 µL,
número de catálogo 4452470) (Figura 9A e B, 10A e 10B), a placa de amostra
é alocada no suporte fixo (OpenArray® Plate Guide Set, número de catálogo
20292) (Figura 8A, e 9A), as ponteiras fixadas no suporte com a possibilidade
de duas caixas de ponteiras ao mesmo tempo (OpenArray® AutoLoader Tip
Block, número de catálogo 20322) (Figura 9A) e quatro lâminas podem ser
alocadas ao mesmo tempo no suporte (OpenArray® AutoLoader Plate Holder,
número de catálogo 20384) (Figura 9B e 10C).
50
Figura 8. Placa de amostra, caixa de ponteiras e lâmina de genotipagem do
sistema OpenArray®. A. OpenArray® 384-Well Sample Plates no suporte
(OpenArray® Plate Guide Set). B. OpenArray® Loader Tips no suporte
(OpenArray® AutoLoader Tip Block). C. Lâmina com a proteção e na case para
a corrida da PCR (16 TaqMan® OpenArray® Genotyping Plate).
51
Figura 9. Visão geral do equipamento OpenArray®. A. Visão esquerda do
equipamento OpenArray® AutoLoader. B. Visão direita do equipamento
OpenArray® AutoLoader. 1, Descarte de ponteiras; 2, FinnPipette Multichannel
Digital Pipettor, cinco a 50 µL; 3, OpenArray® AutoLoader Tip Block; 4,
OpenArray® AutoLoader Plate Holder; 5, OpenArray® Plate Guide Set.
52
Figura 10. Visão geral do equipamento OpenArray®, e suporte para as lâminas
de genotipagem. A. Visão geral do equipamento OpenArray® AutoLoader. B.
Detalhe do FinnPipette Multichannel Digital Pipettor, cinco a 50 µL. C. Detalhe
do OpenArray® AutoLoader Plate Holder.
3. Após a organização do equipamento, foi realizado a transferência das
amostras da placa de genotipagem para as lâminas. Apenas uma lâmina é
53
aplicada por vez, sendo assim, cada caixa de ponteira é suficiente para
transferir a amostra de uma placa de amostra, para oito lâminas. O processo
de transferência de amostra levou aproximadamente cinco minutos por lâmina.
Um total de 33 nL foram transferidos para cada orifício na lâmina. A distribuição
da placa de amostra, para a caixa de ponteiras, e posterior transferência para a
lâmina, pode ser visualizada na Figura 11.
Figura 11. Distribuição da placa de amostragem e das lâminas no OpenArray®
AutoLoader.
4. Após a transferência das amostras para cada lâmina, a lâmina era retirada
cuidadosamente do equipamento e inserida no case (TaqMan® OpenArray®
Genotyping Case) de vidro para proteção. Antes da transferência o case era
preenchido com solução de imersão (OpenArray® Immersion Fluid), que serve
para manter a qualidade da amostra e viabilizar a reação de PCR no
termociclador. A lâmina foi alocada dentro do case com o código de barras
direcionado para a abertura da case (Figura 12A, 12B, 12C).
54
Figura 12. Transferência da lâmina para a case. A. Case vazio (TaqMan®
OpenArray® Genotyping Case). B. Imersão da Lâmina na case contendo o
fluido de imersão (OpenArray® Immersion Fluid). C. Lâmina inserida na case. 1.
Destaque para o fluído de imersão dentro das cases sem as lâminas.
5. Após a inserção da lâmina na case, foi realizada a selagem da lâmina para
posterior reação da PCR. A selagem foi dividida em dois passos: (i) aplicação
da cola (OpenArray® Sealing Glue) na porção superior da case, acima do
código de barras sem que houvesse vazamento para o lado externo da lâmina
(Figura 13A e 13B); (ii) secagem da cola em ultravioleta na estação de
selagem (OpenArray® Case Sealing Station, número de catálogo 4409361) por
dois minutos. Os reagentes para a selagem, o fluido de imersão e a case foram
obtidos com o mesmo kit (TaqMan® OpenArray® Genotyping Acessories Kit,
número de catálogo 4404572) (Figura 13C e 13D).
55
Figura 13. Aplicação da cola e selagem da lâmina dentro da case. A. Cola
(OpenArray® Sealing Glue). B. Aplicação da cola na case. C. Selagem da
lâmina na estação de selagem (OpenArray® Case Sealing Station). D. Case e
lâmina após o procedimento.
6. Após a selagem, oito lâminas foram carregadas no termociclador (Dual Flat
Block Gene Amp PCR System 9700, número de catálogo 4428234) (Figura 14)
para a amplificação dos polimorfismos. O protocolo para a termociclagem está
descrito na Tabela 1.
56
Figura 14. Lâminas de genotipagem preparadas para a corrida e termociclador
utilizado para a amplificação do DNA. A. Lâminas prontas para serem
carregadas no termociclador (Dual Flat Block Gene Amp PCR System 9700). B
e C. Visão geral do termociclador e disposição de lâminas para a corrida da
termociclagem.
57
Tabela 1. Descrição dos passos da termociclagem para a lâmina do
sistema OpenArray®
Passo Temperatura e tempo
1 0,8°C/segundo até 95,5°C
2 91°C por 10 minutos
3 0,5°C/segundo até 51,0°C
4 51,0°C por 23 segundos
5 0,8°C/segundo até 53,5°C
6 53,5°C por 30 segundos
7 0,8°C/segundo até 54,5°C
8 54,5°C por 13 segundos
9 0,8°C/segundo até 97°C
10 97°C por 22 segundos
11 0,8°C/segundo até 92°C
12 92°C por 7 segundos
13 Repita a partir do passo 3 por 49 vezes
14 20°C por 5 minutos
15 4°C até a retirada da lâmina
16 Fim
°C, celsius.
7. Após a termociclagem as lâminas foram carregadas no sistema OpenArray®
para a detecção da fluorescência. Inicialmente no software do OpenArray®
foram carregadas as informações das lâminas que seriam lidas e a codificação
das amostras. No equipamento, foram alocadas três lâminas, e essas foram
lidas ao mesmo tempo, sendo gerado um dado de saída bruto. O equipamento
apenas permite a leitura se a temperatura da câmera de detecção estiver em
temperatura inferior a 1°C e o bloco com as lâminas a temperatura de 25°C
(Figura 15).
58
Figura 15. Visão geral e interna do OpenArray® NT cycler. A. Plataforma
OpenArray® NT cycler. B e C. Bloco de corrida e disposição das lâminas no
sistema para a aquisição de imagem e identificação dos polimorfismos. D. Dato
bruto do software de análise inicial (SNP Genotyping Analysis Software versão
1.0.5).
Para verificar se as corridas das lâminas foram efetivas, o software padrão foi
utilizado (SNP Genotyping Analysis Software Version 1.0.5). O software
apresenta os valores brutos de corrida sem ajustes de imagem, dessa forma,
após a corrida, os dados foram carregados em outro software (TaqMan
Genotyper Software versão 1.3) com disponibilidade de ferramentas de ajuste
dos dados e imagem. No software foram incluídas as informações referentes
aos genes analisados, denominação dos polimorfismos pelo código “rs” e para
os fluoróforo foi atribuído o real significado dos alelos e a fluorescência FAM e
59
VIC, ou seja, para cada polimorfismo foi identificado a base correspondente.
Como demonstrativo da análise do software consulte a Figura 16.
Para cada polimorfismo, o ajuste manual do dado foi realizado, lâmina a
lâmina, sendo um total de 16 polimorfismos analisados para 146 amostras.
Figura 16. Análise do resultado da corrida no sistema OpenArray® pelo
OpenArray® SNP Genotyping Analysis Software versão 1.0.5. Na janela de
visualização dos dados, temos o resultado a fluorescência, e na listagem de
amostras dos polimorfismos, o resultado como descrição do alelo.
Ø Os polimorfismos pesquisados foram:
• rs4986790 (TLR4)
• rs4986791 (TLR4)
• rs1927911 (TLR4)
• rs898830 (TLR2)
• rs7656411 (TLR2)
• rs352162 (TLR9)
• rs187084 (TLR9)
• rs1065341 (RANTES)
• rs2107538 (RANTES)
60
• rs2280788 (RANTES)
• rs2280789 (RANTES)
• rs10735810 (VDR)
• rs2228570 (VDR)
• rs1060826 (NOS2)
• rs10757212 (IFNA5)
• rs11688 (JUN)
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados epidemiológicos e laboratoriais foram descritos por frequência
(porcentagem) para variáveis categóricas, e médias ± desvio padrão e mediana
(mínimo e máximo) para dados numéricos.
Os dados e a evolução da doença foram comparados entre os pacientes
e as frequências dos polimorfismos foi comparada entre os pacientes e os
controles.
Foram também analisadas as frequências dos polimorfismos em
pacientes e controles para cada tipo de vírus (VSR, VSR subtipo A, VSR
subtipo B, Rinovírus e codetecção viral).
Os polimorfismos foram comparados com dados epidemiológicos e
laboratoriais, incluindo o tipo de vírus identificado.
Uma segunda análise foi realizada em 131 pacientes sem comorbidades
(parto prematuro, doença respiratória crônica e doença cardíaca congênita)
para todas as comparações citadas anteriormente.
O teste exato de Fisher e o teste χ2 foram aplicados para comparar os
dados categóricos. Os testes de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis foram usados
para comparar os dados numéricos. Foram descritos os valores de razão de
prevalência (odds ratio – OR) e intervalos de confiança de 95%. Em todas as
análises foi considerado o valor de alpha igual a 0,05. Os dados foram
analisados usando o software SPSS 21.0 (SPSS Inc., Chicago, IL).
Foram avaliados minor allele frequency (MAF) e o equilíbrio de Hardy-
Weinberg (HWE) pelo software OEGE (Online Encyclopedia for Genetic
61
Epidemiology studies, 2008). A fim de avaliar a interação genética entre os
polimorfismos e dados clínicos em nossa amostra, foi utilizado o teste
Multifactor Dimensionality Reduction Model (MDR), que é uma análise de
dados de modelo-livre, não-paramétrica, que considera os dados genéticos e
ambientais para identificação não-linear de interação entre esses fatores
(genéticos e ambientais) (Gola, 2016). Para ajustar os resultados para
comparações múltiplas foi realizado o ajuste pelo teste MDRPT (MDR
permutation test) em nossa amostra, totalizando 100.000 permutações.
O cálculo do poder estatístico para a amostra, levando em consideração
os múltiplos testes, foi realizado pelo software GPOWER 3.1 e demonstrou
poder estatístico acima de 80% para análise pelo χ2, sendo necessário 143
pacientes para a principal análise realizada que considera a comparação para
o risco de BVA grave em relação aos controles e presença dos diferentes
genótipos para os polimorfismos.
ASPECTOS ÉTICOS
A pesquisa foi aprovada pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa
(CAAE: 00869612.7.0000.5404), conforme ANEXO 3.
Os representantes legais dos pacientes receberam todas as explicações
sobre o projeto de pesquisa e assinaram o “Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido”, conforme ANEXO 4.
62
RESULTADOS
Esta tese foi escrita de acordo com o formato alternativo proposto pelo
curso de pós-graduação em saúde da criança e do adolescente da Faculdade
de Ciências Médicas da UNICAMP, desta forma os resultados são
apresentados através de artigos científicos.
63
ARTIGO 1: ARTIGO DE REVISÃO
Epidemiological and genetic characteristics
associated with the severity of acute viral
bronchiolitis by respiratory syncytial vírus
64
J Pediatr (Rio J). 2013;89(6):531−543
© 2013 Sociedade Brasileira de Pediatria. Publicado por Elsevier Editora Ltda. Todos os direitos reservados.
www.jped.com.br
DOI se refere ao artigo: http://dx.doi.org/10.1016/j.jped.2013.02.022☆Como citar este artigo: Alvarez AE, Marson FA, Bertuzzo CS, Arns CW, Ribeiro JD. Epidemiological and genetic characteristics associa-
ted with the severity of acute viral bronchiolitis by respiratory syncytial virus. J Pediatr (Rio J). 2013;89:531-43. * Autor para correspondência.E-mail: [email protected] (F.A.L. Marson).
ARTIGO DE REVISÃO
Epidemiological and genetic characteristics associated with the
severity of acute viral bronchiolitis by respiratory syncytial virus☆
Alfonso E. Alvareza, Fernando A.L. Marsona,*, Carmen S. Bertuzzob, Clarice W. Arnsc
e José D. Ribeiroa
a Departamento de Pediatria, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, Brasilb Departamento de Genética Médica, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP,Brasilc Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, Brasil
Recebido em 22 de janeiro de 2013; aceito em 6 de fevereiro de 2013
KEYWORDS
Bronchiolitis;Risk factors;Respiratory syncytialvirus;Genetics
Abstract
Objective: to assess the epidemiological and genetic factors associated with severity of acute viral bronchiolitis (AVB) by respiratory syncytial virus (RSV).Data source: the key words ‘‘bronchiolitis’’, ‘‘risk factor’’, ‘‘genetics’’ and ‘‘respiratorysyn-cytial virus’’, and all combinations among them were used to perform a search inthe PubMed,SciELO, and Lilacs databases, of articles published after the year 2000 thatincluded individualsyounger than 2 years of age.Data synthesis: a total of 1,259 articles were found, and their respective summaries wereread. Of these, 81 were selected, which assessed risk factors for the severity of AVB, andwere read in full; the 60 most relevant studies were included. The epidemiologic factorsassociated with AVB severity by RSV were prematurity, passive smoking, young age, lack of breastfeeding, chronic lung disease, congenital heart disease, male gender, ethnicity,viral coinfection, low weight at admission, maternal smoking during pregnancy, atopicdermatitis, mechanical ventilation in the neonatal period, maternal history of atopyand/or asthma during pregnancy, season of birth, low socioeconomic status, Downsyndrome, environmental pollution, living at an altitude > 2,500 meters above sea level,and cesarean section birth. Conversely, some children with severe AVB did not presentany of these risk factors. In this regard, recent studies have verified the influence of genetic factors on the severity of AVB by RSV. Polymorphisms of the TLRs, RANTES, JUN, IFNA5, NOS2, CX3CR1, ILs, and VDR genes have been shown to be associated with moresevere evolution of AVB by RSV.Conclusion: the severity of AVB by RSV is a phenomenon that depends on the varyingdegrees of interaction among epidemiological, environmental, and genetic variables.© 2013 Sociedade Brasileira de Pediatria. Published by Elsevier Editora Ltda. All rightsreserved.
http://dx.doi.org/10.1016/j.jpedp.2013.02.008
2255-5536/$ - see front matter © 2013 Sociedade Brasileira de Pediatria. Publicado por Elsevier Editora Ltda. Todos os direitos reservados.
Documento descarregado de http://jped.elsevier.es el 01/05/2014. Cópia para uso pessoal, está totalmente proibida a transmissão deste documento por qualquer meio ou forma.
65
532 Alvarez AE et al.
PALAVRAS-CHAVE
Bronquiolite;Fatores de risco;Vírus sincicial respiratório;Genética
Características epidemiológicas e genéticas associadas à gravidade da bronquiolite
viral aguda pelo vírus sincicial respiratório
Resumo
Objetivo: avaliar os fatores epidemiológicos e genéticos associados à gravidade da Bronquiolite Viral Aguda (BVA) pelo Vírus Sincicial Respiratório (VSR). Fonte dos dados: foram utilizados descritores “bronchiolitis”, “risk factor”, “genetics” e “respiratory syncytial virus” e todas as combinações entre eles, nas bases de dados PubMed, SciELO e Lilacs publicados após o ano de 2000 e que incluíram indivíduos meno-res de dois anos de idade.Síntese dos dados: foram encontrados 1.259 artigos e lidos seus respectivos resumos. Destes foram selecionados 81 que avaliaram fatores de risco para a gravidade da BVA para leitura na íntegra, e foram incluídos os 60 estudos mais relevantes. Os fatores epidemiológicos associados com a gravidade da BVA pelo VSR foram: prematuridade, tabagismo passivo, baixa idade, ausência de aleitamento materno, doença pulmonar crônica, cardiopatia congênita, sexo masculino, etnia, coinfecção viral, baixo peso na admissão hospitalar, tabagismo mater-no na gestação, dermatite atópica, ventilação mecânica no período neonatal, antecedente materno de atopia e/ou asma na gestação, estação do nascimento, baixo nível socioeconô-mico, síndrome de Down, poluição ambiental, morar em altitude acima de 2.500 metros do nível do mar e parto cesariana. Em contrapartida, algumas crianças com BVA grave não apresentam nenhum desses fatores de risco. Neste sentido, estudos recentes têm verificado a influência de fatores genéticos relacionados à gravidade da BVA pelo VSR. Polimorfismos dos genes TLRs, RANTES, JUN, IFNA5, NOS2, CX3CR1, ILs e VDR têm-se mostrado associados com a evolução mais grave da BVA pelo VSR.Conclusão: a gravidade da BVA pelo VSR é um fenômeno dependente da interação entre variáveis epidemiológicas, ambientais e genéticas em seus diferentes graus de interação.© 2013 Sociedade Brasileira de Pediatria. Publicado por Elsevier Editora Ltda. Todos os direitos reservados.
Introdução
A bronquiolite viral aguda (BVA) causada por vírus sincicial respiratório (VSR) é a principal infecção das vias aéreas inferiores em crianças menores de dois anos de idade em todo o mundo, e é a principal causa de internação nessa faixa etária em países desenvolvidos.1 Apesar de todas as crianças serem infectadas pelo VSR até os três anos de idade, a maioria dos casos é leve e não produz sequelas. Os mecanismos envolvidos com a gravidade da BVA pelo VSR ainda não foram completamente esclarecidos. Por que a infecção pelo VSR pode se manifestar com evolução tão variável em diferentes pacientes? Por que uma criança com VSR se apresenta assintomática e outra evolui a óbito? Na avaliação da gravidade da BVA pelo VSR, que fatores podem estar mais associados: genéticos e/ou epidemiológicos/ambientais? Estas são questões que intrigam pesquisadores e permanecem sem resposta definitiva.
Nos Estados Unidos ocorrem de 3.000 a 4.000 mortes anuais devido a BVA pelo VSR.2 A prevalência de hospitali-zação por VSR nos Estados Unidos é de 48,9 para 1.000 em menores de três meses; 26 para 1.000 em menores de um ano; e 1,8 para 1.000 em crianças de um a cinco anos, oco-rrendo entre 132.000 e 172.000 hospitalizações/ano por VSR em menores de cinco anos.3 Nos Estados Unidos, ocorrem, em média, 22,8 visitas a emergência por VSR para cada 1.000 lactentes, sendo que 29% são hospitalizados, o que representa gasto anual com visitas à emergência de 50,5 milhões de dólares e com internações de 650 milhões de
dólares.4 Em outras regiões, a taxa de hospitalização para cada 1.000 lactentes com VSR varia de 8,7 na Austrália5 a 60 no Japão.6 Na Austrália, a incidência de VSR é de 110,0 a 226,5 para cada 1.000 lactentes, e o custo anual estimado é de 50 milhões de dólares, sendo mais significativo que os custos com influenza e rotavírus.5 Na Europa, o VSR é responsável por 45% das hospitalizações por infecção das vias aéreas inferiores em menores de dois anos.6 No Brasil, estudo com 5.304 crianças menores de um ano demonstrou que 113 (2,1%) foram internadas por BVA.7
Entre as crianças internadas por VSR, 2,7% foram admiti-das na unidade de terapia intensiva (UTI), 1,5% necessita-ram ventilação assistida e 0,2% foram a óbito.8
A infecção pelo VSR tem gravidade variável, com mani-festações clínicas de sintomas leves em vias aéreas supe-riores até bronquiolite e pneumonia, podendo evoluir de forma grave, com necessidade de internação em UTI, ventilação mecânica e chegando a óbito. Até o presente momento, o tratamento da BVA pelo VSR é de suporte. Nos Estados Unidos, foi apontado que de 1,1 milhão de crianças menores de dois anos internadas por VSR em um período de oito anos, a maior porcentagem das internações ocor-reu entre três e seis meses de idade, atingindo assim uma faixa populacional de risco ao óbito.9 As primeiras infecções são, geralmente, sintomáticas, e frequentemente atingem as vias aéreas inferiores, sendo as infecções subsequentes geralmente mais leves.
O VSR é o agente responsável pela BVA de 41,710 a 83,6% dos casos.11 No Brasil, o VSR foi responsável por 31,912 a 64% dos
Documento descarregado de http://jped.elsevier.es el 01/05/2014. Cópia para uso pessoal, está totalmente proibida a transmissão deste documento por qualquer meio ou forma.
66
Acute viral bronchiolitis: epidemiology and genetics 533
pacientes internados com BVA.13 Apesar de outros vírus serem detectados em pacientes com BVA, tais como adenovírus, bocavírus, influenza A, influenza B, parainfluenza 1, parain-fluenza 2, parainfluenza 3, rinovírus e metapneumovírus,10,11 o estabelecimento de codetecção ou coinfecção tem sido um aspecto crítico a ser considerado.14 O segundo vírus mais fre-quente na BVA é o rinovírus, correspondendo a aproximada-mente 18% dos casos.15 No Brasil, foi verificado que em 40% das BVA ocorre coinfecção viral, e que o vírus mais frequente após o VSR é o rinovírus, ocorrendo em 40% dos casos.16
Fatores epidemiológicos associados com a gravidade da BVA pelo VSR são conhecidos e relatados na literatura. Em contrapartida, algumas crianças com BVA grave não apre-sentam quaisquer desses fatores de risco (tabela 1). Neste sentido, estudos recentes têm verificado a influência de fatores genéticos relacionados à gravidade (tabela 2).
Devido à possibilidade de a BVA evoluir de forma grave, torna-se importante identificar fatores de risco genéticos e ambientais que contribuem para sua maior gravidade.
Recentemente, vários estudos permitiram a elaboração de guidelines em todo o mundo, mostrando que crianças de alto risco para adquirir infecção grave pelo VSR devem receber imunização passiva com anticorpo monoclonal con-tra o VSR (Palivizumab), a qual promove proteção contra quadros graves. Após a introdução do Palivizumab, houve redução de 48% nas internações de lactentes com doença pulmonar crônica da prematuridade.17 Ainda não foi possí-vel o desenvolvimento de uma vacina que seja eficaz na prevenção da BVA por VSR, apesar de esforços nesse sentido ocorrerem desde a década de 1960.1
Assim, o objetivo desta revisão foi avaliar que fatores epidemiológicos e genéticos contribuem para a gravidade da BVA pelo VSR, possibilitando melhor manejo do pacien-te e predição sobre grupos de risco associados à doença, amenizando custos ao sistema de saúde e possibilitando redução do número de internações e de óbitos.
Métodos
Foram utilizados os descritores Bronchiolitis, Risk Factor, Genetics e Sincitial Respiratory Virus e todas as combi-nações entre eles, nas bases de dados PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed), SciELO (http://www.scielo.org/php/index.php) e Lilacs (http://lilacs.bvsalud.org/en/) publicados após o ano de 2000, e que incluíram indivíduos menores de dois anos de idade. A última busca foi realizada em outubro de 2012.
Foram encontrados 1.259 artigos, dos quais foram lidos todos os resumos. Destes, foram selecionados 81 que avalia-ram fatores de risco para a gravidade da BVA para leitura na íntegra e incluíram-se os 60 estudos mais relevantes (fig. 1).
Resultado e discussão
Fatores de risco
Na literatura, é relatada a associação de fatores genéticos e epidemiológicos/ambientais como percussores para a BVA grave pelo VSR. Alguns fatores de risco são mais conheci-
dos e apresentam associação com a gravidade da doença, dentre eles: prematuridade,18 tabagismo passivo,19 baixa idade,16 ausência de aleitamento materno,20 doença pul-monar crônica e cardiopatia congênita.21 Entretanto, outros fatores, como os aspectos genéticos e outros dados epi-demiológicos, não apresentam associações confirmatórias evidentes e necessitam de mais estudos, como marcadores de gravidade na BVA causada pelo VSR (fig. 2).
Prematuridade
A prematuridade, sem presença de displasia broncopulmo-nar, é fator de risco sete vezes maior de BVA por VSR.18 Um estudo brasileiro demonstrou, em 77 pacientes com BVA, que a prematuridade estava associada a maior proba-bilidade de internação em UTI, com OR de 24,51 (IC 95% 3,21-186,92).16 Em 230 lactentes menores de 24 meses, a prematuridade (idade gestacional < 37 semanas) foi fator de risco para internação.22 Entre 284 pacientes internados em UTI por BVA, 30% apresentavam prematuridade.23 Outro estudo brasileiro com coorte de 5.301 crianças acompanha-das por um ano mostrou que 113 foram hospitalizadas por BVA, e o risco de hospitalização foi 80% maior nas crianças cujas mães tiveram gestações com duração inferior a 37 semanas.7 A prematuridade em pacientes com BVA por VSR também foi relacionada com maior risco de hipoxemia e de falência respiratória com necessidade de ventilação mecânica.24 Na análise retrospectiva de 4.800 lactentes internados por BVA, concluiu-se que a prematuridade e a positividade para VSR representavam fatores de risco para a gravidade da doença.25
Tabagismo passivo
Na avaliação de 378 pacientes internados com BVA, o taba-gismo passivo foi fator de risco para necessidade de oxi-gênio suplementar e de ventilação mecânica19; em outra amostra, com 240 crianças internadas com BVA, verificou-se que o tabagismo passivo estava associado com maior gravi-dade clínica e maior tempo de hospitalização.26 Por estudo de meta-análise com 60 estudos incluídos, o tabagismo pas-sivo foi importante fator de risco para a BVA.27 Na análise prospectiva com 206 pacientes internados por BVA por VSR, verificou-se que as crianças expostas ao tabagismo materno pós-natal tinham menores níveis de saturação da hemoglo-bina pelo oxigênio que os não expostos (89,8% vs 92,2%, p = 0,01).28 No Brasil, o risco de hospitalização por BVA foi 57% maior nas crianças expostas ao tabagismo materno do que naquelas não expostas.7
Baixa idade
Na literatura, está bem estabelecido que quanto menor a idade da criança, maior é a gravidade clínica da BVA pelo VSR. Em um estudo brasileiro, verificou-se que a idade apresentava OR de 0,838 (IC 95% 0,718-0,979) em relação à internação hospitalar, indicando que idade maior está associada a menor incidência de internação.16 Os pacien-tes menores de dois meses apresentavam maior tempo de internação (6 vs 5 dias, p < 0,00001) e maior risco de inter-nação em UTI (OR 3,4; IC 95% 2,5-4,6).29 Na avaliação de 229 pacientes internados em UTI por BVA, foi constatado que a idade era inversamente proporcional ao tempo necessário de UTI e ao tempo necessário de suporte ventilatório,30
Documento descarregado de http://jped.elsevier.es el 01/05/2014. Cópia para uso pessoal, está totalmente proibida a transmissão deste documento por qualquer meio ou forma.
67
534 Alvarez AE et al.
Tabela 1 Estudos com variáveis epidemiológicas associadas com a bronquiolite viral aguda, relacionada ao vírus sincicial respiratório, incluídos na revisão bibliográfica
Variável Autor Ano N Principais achados
Prematuridade Gouyon et al.18 2012 498 lactentes menores Fator de risco sete vezes maior de BVA por VSR de 6 meses internados com BVA Nascimento et al.16 2010 77 pacientes com BVA Maior probabilidade de internação em UTI-OR de 24,51 (IC 95% 3,21-186,92) Grimwood et al.22 2008 230 lactentes Maior probabilidade de internação López Guinea et al.23 2007 284 pacientes internados 30% apresentavam prematuridade em UTI por BVA Albernaz et al.7 2003 5.301 crianças acompanhadas Risco de hospitalização 80% maior nas crianças por um ano - de gestações com duração inferior 113 hospitalizadas por BVA a 37 semanas Chan et al.24 2002 216 lactentes internados Maior risco de hipoxemia e de falência com BVA por VSR respiratória com necessidade de ventilação mecânica Garcia et al.25 2010 4.800 lactentes internados Prematuridade e a positividade para VSR - por BVA fatores de risco para a gravidade da doençaTabagismo Semple et al.19 2011 378 pacientes internados Fator de risco para necessidade de oxigênio passivo com BVA suplementar e de ventilação mecânica Chatzimichael et al.26 2007 240 crianças internadas Maior gravidade clínica e maior tempo com BVA de hospitalização Jones et al.27 2011 Metanálise com 60 estudos Fator de risco para a BVA incluídos Bradley et al.28 2005 206 pacientes internados Crianças expostas ao tabagismo materno por BVA por VSR pós-natal tinham menores níveis de saturação da hemoglobina pelo oxigênio que os não expostos (89,8% versus 92,2%, p = 0,01) Albernaz et al.7 2003 5.301 crianças acompanhadas Risco de hospitalização por BVA - 57% maior por um ano - nas crianças expostas ao tabagismo materno 113 hospitalizadas por BVA do que nas não expostasBaixa idade Nascimento et al.16 2010 77 lactentes atendidos na OR de 0,838 (IC 95% 0,718-0,979) em relação emergência por BVA à internação hospitalar - idade maior associada a menor incidência de internação Hervás et al.29 2012 2384 lactentes internados Pacientes menores de dois meses apresentam por BVA maior tempo de internação (6 versus 5 dias, p < 0,00001) e maior risco de internação em UTI (OR 3,4; IC 95% 2,5-4,6) Oñoro et al.30 2011 229 pacientes internados Idade é inversamente proporcional ao tempo em UTI por BVA necessário de UTI e de suporte ventilatório Damore et al.31 2008 1.456 pacientes com BVA Idade menor que dois meses - fator de risco para internação em UTI (26% versus 53%; OR = 4,1; IC 95% 2,1-8,3) Papoff et al.32 2011 310 pacientes menores Idade menor = principal fator associado de 12 meses com BVA com a gravidade clínica López Guinea et al.23 2007 284 pacientes internados Idade menor que seis semanas = em UTI por BVA principal fator de risco, correspondendo a 45% dos pacientes Bradley et al.28 2005 206 pacientes internados Níveis de saturação da hemoglobina pelo por BVA por VSR oxigênio são menores quanto menor a idade da criança. A cada mês a menos que a criança apresenta, uma redução de 0,41% na saturação de oxigênio foi observada Vidaurreta et al.33 2011 347 pacientes com infecção Idade dos pacientes hospitalizados era menor respiratória aguda, (8 versus 19 meses, p < 0,001) 234 hospitalizados e 112 não hospitalizados
Continua na página seguinte
Documento descarregado de http://jped.elsevier.es el 01/05/2014. Cópia para uso pessoal, está totalmente proibida a transmissão deste documento por qualquer meio ou forma.
68
Acute viral bronchiolitis: epidemiology and genetics 535
Tabela 1 (Continuação) Estudos com variáveis epidemiológicas associadas com a bronquiolite viral aguda, relacionada ao vírus sincicial respiratório, incluídos na revisão bibliográfica
Variável Autor Ano N Principais achados
Aleitamento Koehoorn et al.20 2008 12.474 crianças com O não inicio do aleitamento materno na materno bronquiolite - maternidade era fator de maior risco a 1.588 internadas internação por BVA Dornelles et al.34 2007 175 crianças internadas Duração do aleitamento materno exclusivo é com BVA inversamente proporcional ao tempo de utilização de oxigênio e duração da internação - para cada mês de aleitamento materno exclusivo houve redução de 11 horas no tempo de utilização de oxigênio Albernaz et al.7 2003 5.301 crianças acompanhadas Crianças desmamadas antes de completar um por um ano - mês de vida - risco 7,7 vezes maior de serem 113 hospitalizadas por BVA hospitalizadas por BVA Chatzimichael et al.26 2007 240 crianças internadas Aleitamento materno inferior a quatro meses - por BVA fator de risco para evolução grave e maior tempo de internaçãoDoença Ochoa Sangrador 2010 Estudo de revisão com Doença pulmonar crônica, principalmente pulmonar et al.21 127 artigos displasia broncopulmonar - maior gravidade crônica de BVA Al-Shehri et al.35 2005 166 crianças menores Doença pulmonar crônica, principalmente de 5 anos diagnosticadas displasia broncopulmonar - maior gravidade com BVA, 51 hospitalizadas de BVA e 115 não Che et al.36 2012 27.500 lactentes menores Lactentes com displasia broncopulmonar de 1 ano internados por BVA apresentam risco 6,7 maior de vir a óbito por BVACardiopatia Ochoa Sangrador 2010 Estudo de revisão com Maior gravidade de BVA congênita et al.21 127 artigos Hervás et al.29 2012 2.384 lactentes internados Tempo de internação maior (6 versus 5 dias, por BVA p < 0,0001) Fjaerli et al.37 2004 764 pacientes internados Presença de cardiopatia congênita associada com BVA com tempo de internação 50% maior do que em crianças sem cardiopatiasGênero Semple et al.19 2011 378 lactentes internados Sexo masculino com BVA - risco maior de por BVA suplementação de oxigênio e ventilação mecânica Koehoorn et al.20 2008 12.474 crianças com Sexo masculino – maior risco de internação bronquiolite - 1.588 internadas Etnia Bradley et al.28 2005 206 pacientes internados Pacientes de etnia negróide tem evolução por BVA por VSR melhor quando comparada aos caucasóides Leader et al.4 2003 330.284 lactentes atendidos Pacientes de etnia negróide tem maior risco de na emergência por BVA óbito quando comparados aos caucasóides Grimwood et al.22 2008 141 pacientes internados Nova Zelândia - pacientes de origem por BVA por VSR Maori apresentam evolução pior Meissner et al.38 2003 Estudo de revisão com Americanos nativos e os que têm origem 31 artigos no Alasca apresentam maior gravidade que da etnia caucasóide38
Etiologia e Garcia et al.11 2010 4.800 lactentes internados Alguns estudos sugerem que o VSR é fator de presença de por BVA gravidade para a BVA quando comparado a coinfecção viral outros vírus11,32
Papoff et al.32 2011 310 pacientes menores Alguns estudos sugerem que o VSR é fator de 12 meses com BVA de gravidade para a BVA quando comparado outros vírus11,32
Continua na página seguinte
Documento descarregado de http://jped.elsevier.es el 01/05/2014. Cópia para uso pessoal, está totalmente proibida a transmissão deste documento por qualquer meio ou forma.
69
536 Alvarez AE et al.
Tabela 1 (Continuação) Estudos com variáveis epidemiológicas associadas com a bronquiolite viral aguda, relacionada ao vírus sincicial respiratório, incluídos na revisão bibliográfica
Variável Autor Ano N Principais achados
Hervás et al.29 2012 2.384 lactentes internados BVA grave por VSR leva a internação por BVA prolongada (6 versus 5 dias, p < 0,0001), maior risco de internação em UTI (OR 2,7; IC 95% 1,87-3,9) e maior necessidade de oxigenoterapia (OR 2,2; IC 95% 1,8-2,6) Riccetto et al.39 2006 152 lactentes internados por Oximetria de pulso menor que 90% na admissão infecção aguda das vias hospitalar por infecção de vias aéreas inferiores aéreas inferiores estava associada à infecção por VSR D’Elia et al.40 2005 89 pacientes internados Não houve diferença na gravidade entre os pacientes que apresentaram VSR e os que não apresentaram Ochoa Sangrador 2010 Estudo de revisão Coinfecção viral é responsável por maior et al.21 com 127 artigos gravidade da BVA Brand et al.42 2011 142 lactentes com BVA Coinfecção viral não aumenta a gravidade da BVA De Paulis et al.43 2011 176 pacientes Gravidade clínica da BVA por VSR não aumenta em função da existência de coinfecção viralBaixo peso Semple et al.19 2011 378 pacientes internados Baixo peso na admissão está associado com na admissão com BVA maior risco de necessitar ventilação mecânicaTabagismo Koehoorn et al.20 2008 12.474 crianças com O tabagismo materno na gestação aumenta materno bronquiolite o risco de internação por BVA na gestação - 1.588 internadas Carroll et al.45 2007 101.245 lactentes, dos quais O tabagismo materno na gestação aumenta o 20.249 apresentaram BVA risco de BVADermatite Al-Shehri et al.35 2005 166 crianças menores de Antecedente de Dermatite Atópica aumenta atópica 5 anos diagnosticadas o risco de internação por BVA com BVA, 51 hospitalizadas e 115 não Ventilação Ochoa Sangrador 2010 Estudo de revisão Antecedente de ventilação mecânica neonatal mecânica no et al.21 com 127 artigos aumenta o tempo de internação período e a possibilidade de internação em UTI nos neonatal pacientes com BVAAntecedente Miller et al.15 630 lactentes com BVA Antecedente materno de atopia aumenta materno a gravidade da BVA de atopia Antecedente Carroll et al.45 2007 101.245 lactentes, dos quais Antecedente de Asma materno na gestação materno de 20.249 apresentaram BVA aumenta o risco de BVA asma na gestação Estação Grimwood et al.22 2008 230 lactentes internados Nascimento entre os meses de Fevereiro do nascimento por BVA e Julho aumenta o risco de internação por BVA na Nova ZelândiaBaixo nível Koehoorn et al.20 2008 12.474 crianças com O baixo nível sócio econômico aumenta o risco socioeconômico bronquiolite - 1.588 internadas de internação por BVASíndrome Fjaerli et al.37 2004 764 pacientes internados Síndrome de Down aumenta a gravidade de Down por BVA da BVA Bloemers et al.46 2007 395 pacientes com Síndrome Síndrome de Down aumenta o risco de Down de internação por BVAPoluição Karr et al.47 2007 18.595 lactentes menores Poluição ambiental aumenta o risco ambiental de 1 ano internados por BVA de internação por BVA e 169.472 controles Morar em Choudhuri et al.48 2006 4.847 lactentes internados Morar em altitude maior que 2.500 metros altitude maior por BVA por VSR aumenta o risco de internação por BVA que 2.500 metros Parto cesariana Moore et al.49 2012 212.068 lactentes dos quais Parto cesariana aumenta o risco de internação 7.062 foram internados por BVA por BVA
BVA, bronquiolite viral aguda; IC, intervalo de confiança; OR, odds ratio; UTI, unidade de terapia intensiva; VSR, vírus sincicial respiratório.
Documento descarregado de http://jped.elsevier.es el 01/05/2014. Cópia para uso pessoal, está totalmente proibida a transmissão deste documento por qualquer meio ou forma.
70
Acute viral bronchiolitis: epidemiology and genetics 537
e o mesmo foi verificado em um estudo prospectivo com 1.456 pacientes com BVA, que, comparando internação na enfermaria com internação na UTI, teve a idade menor que dois meses como fator de risco para internação em UTI (26% vs 53%; OR = 4,1; IC 95% 2,1-8,3).31 Na avaliação de 310 pacientes menores de 12 meses com BVA, foi apontado que a idade menor era o principal fator associado com a gravi-dade do quadro clínico,32 o que pode ser ressaltado na ava-
liação de 284 pacientes internados em UTI por BVA, onde a idade menor que seis semanas foi o principal fator de risco, correspondendo a 45% dos pacientes.23 Os níveis de saturação da hemoglobina pelo oxigênio em 206 pacientes internados por BVA por VSR são menos significativos quanto menor a idade da criança, sendo que foi apontado que, a cada mês a menos que a criança possuía, uma redução de 0,41% na saturação de oxigênio era observada.28 A idade em
Tabela 2 Genes associados com a gravidade da bronquiolite viral aguda, relacionada ao vírus sincicial respiratório, incluídos na revisão bibliográfica
Autor Ano N Gene Polimorfismo Principais achados
Tal et al.51 2004 99 lactentes internados TLR4 Asp299Gly (rs4986790) A presença destes por BVA por VSA e e Thr399Ile (rs4986791) polimorfismos está associada 172 controles a maior gravidade da BVADouville et al.52 2010 Avaliação da resposta TLR4 Asp299Gly (rs4986790) A presença destes imunológica em e Thr399Ile (rs4986791) polimorfismos não influencia 200 pacientes de 7 a 9 anos a resposta imunológicaLöfgren et al.53 2010 312 pacientes com BVA TLR4 Asp299Gly (rs4986790) Não existe relação entre a por VSR e 356 controles presença deste polimorfismo e a gravidade da BVAMandelberg et al.54 2006 52 pacientes com BVA TLR4 Asp299Gly (rs4986790) A presença destes por VSR e Thr399Ile (rs4986791) polimorfismos está associada a maior gravidade da BVAPuthothu et al.55 2006 131 lactentes com BVA TLR4 D259G e T359I A presença de um haplótipo por VSR e 270 controles gênico com os 2 polimorfismos está associada a maior gravidade da BVAMailaparambil et al.56 2008 TLR 1, 2, Avaliados Polimorfismos nos TLR 9 e
3, 5, 6, 19 polimorfismos 10 estão associados com
9 e 10 a gravidade da BVAAmanatidou et al.57 2008 106 crianças internadas RANTES -28C/G, -403G/A e A presença de um haplótipo por BVA por VSR In1.1T/C gênico com os 3 polimorfismos e 120 controles está associada a maior gravidade da BVAKresfelder et al.58 2011 296 pacientes com BVA Receptor Thr1Meth O alelo T “minor” tem maior por VSR e 113 controles da (rs10735810) propensão a BVA vitamina D Janssen et al.59 2007 470 crianças internadas Avaliados Avaliados 384 Os polimorfismos nos genes por BVA por VSR 220 genes polimorfismos da resposta imune inata no e 1008 controles receptor da Vitamina D (rs10735810), JUN (rs11688), IFNA5 (rs10757212) e NOS2 (rs1060826) apresentam forte associação com BVAAmanatidou et al.60 2006 82 crianças internadas por Receptor V249I e T280M O polimorfismo T280 está BVA por VSR e 120 controles CX3CR1 associado a maior gravidade da BVAAmpuero et al.61 2011 118 lactentes menores Proteínas Avaliados A presença de haplótipos de 6 meses com infecção do 11 gênicos está associada a por VSR e 104 controles surfactante polimorfismos gravidade da infecção SP-A1, SP-A2 pelo VSR e SP-D Mulet et al.62 2010 Artigo de revisão IL-4, IL-8, Avaliados Associação entre diferentes avaliando 16 artigos IL-10, IL-13 diversos polimorfismos e haplótipos e IL-18 polimorfismos nesses genes com maior gravidade da infecção pelo VSR
BVA, bronquiolite viral aguda; VSR, vírus sincicial respiratório.
Documento descarregado de http://jped.elsevier.es el 01/05/2014. Cópia para uso pessoal, está totalmente proibida a transmissão deste documento por qualquer meio ou forma.
71
538 Alvarez AE et al.
relação à presença de hospitalização por infecção respira-tória pode ser observada na avaliação de 347 pacientes com infecção respiratória aguda, 234 hospitalizados e 112 não hospitalizados, onde se verificou que a idade dos pacientes hospitalizados era menor (8 vs 19 meses, p < 0,001).33
Aleitamento materno
O aleitamento materno é fator protetor contra BVA grave. Uma avaliação de 12.474 crianças com bronquiolite, das quais 1.588 necessitaram de internação, demonstrou que o não início do aleitamento materno na maternidade era fator de maior risco para internação por BVA.20 Um estudo brasileiro realizado com 175 crianças internadas com BVA mostrou que a duração do aleitamento materno exclusivo foi inversamente relacionada ao tempo de utilização de oxigênio e duração da internação, evidenciando que para cada mês de aleitamento materno exclusivo havia redução de 11 horas no tempo de utilização de oxigênio.34 Crianças desmamadas antes de completar um mês de vida apre-sentaram risco 7,7 vezes maior de serem hospitalizadas por BVA.7 A importância do aleitamento materno pode ser ainda evidenciada no estudo com 240 crianças internadas por BVA, que concluiu que aleitamento materno inferior a
quatro meses foi fator de risco para evolução grave e maior tempo de internação.26
Doença pulmonar crônica
A presença de doença pulmonar crônica, principalmente a displasia broncopulmonar, está relacionada com a maior gravidade de BVA.21,35 Lactentes com displasia broncopul-monar apresentam risco 6,7 maior de vir a óbito por BVA quando comparado a lactentes sem essa condição.36
Cardiopatia congênita
A presença de cardiopatia congênita está relacionada com a maior gravidade de BVA.21 Estudo recente verificou que o tempo de internação foi maior nas crianças que apresen-tavam cardiopatia congênita (6 vs 5 dias, p < 0,0001),29 e em estudo retrospectivo com 764 pacientes internados com BVA foi evidenciado que a presença de cardiopatia congê-nita estava associada com tempo de internação 50% maior do que em crianças sem cardiopatias.37
Gênero
Pacientes do sexo masculino com BVA apresentam risco maior de necessitar suplementação de oxigênio e venti-
Pubmed, Scielo e Lilacs Bases dedados consultadas
DescritoresBronchiolitis, Risk Factor, Genetics e Sincitial
Respiratory Virus
Critérios de inclusão
Entre janeiro de 2000 a dezembro de 2012Prazo de inclusão
1.259 artigos
1.198 artigos
Seleccionados
Nao preencheramcritérios de inclusão
61 artigosPreencheram critérios
de inclusão
Pacientesz com idade inferior a dois anos
Figura 1 Caraterização do processo de análise, para a inclusão dos artigos no estudo sobre fatores epidemiológicos e genéticos associados à bronquiolite viral aguda causada pelo vírus sincicial respiratório.
Documento descarregado de http://jped.elsevier.es el 01/05/2014. Cópia para uso pessoal, está totalmente proibida a transmissão deste documento por qualquer meio ou forma.
72
Acute viral bronchiolitis: epidemiology and genetics 539
lação mecânica quando comparados aos pacientes do sexo feminino.19 Estudo com 12.474 lactentes com BVA, dos quais 1.588 foram internados, demonstrou que o risco de inter-nação era maior nos pacientes do sexo masculino.20
Etnia
Não está claro o papel da etnia como fator de risco, com controvérsias na literatura. Um estudo relata que os pacien-tes de etnia negroide têm evolução melhor quando com-parada aos caucasoides,28 enquanto outro estudo refere o oposto.4 Em populações mais isoladas, algumas observações são encontradas: na Nova Zelândia pacientes de origem Maori apresentam evolução pior22 e americanos nativos e os que têm origem no Alasca apresentam maior gravidade quando comparados aos da etnia caucasoide.38
Etiologia e presença de coinfecção viral
Há controvérsia na literatura sobre a influência do tipo de vírus causador da doença com a evolução mais grave da mesma.14 Alguns estudos sugerem que o VSR é fator de gra-vidade para a BVA quando comparado a outros vírus.11,32 Em estudo recente, foi demonstrado que a BVA grave por VSR leva à internação prolongada (6 vs 5 dias, p < 0,0001), maior risco de internação em UTI (OR 2,7; IC 95% 1,87-3,9) e maior necessidade de oxigenoterapia (OR 2,2; IC 95% 1,8-2,6).29 Em estudo brasileiro, foi demonstrado que oximetria de pulso menor que 90% na admissão hospitalar por infecção de vias aéreas inferiores estava associada à infecção por VSR.39 Contudo, outros estudos demonstraram
que o VSR não leva a maior gravidade clínica quando com-parado a outros vírus, como em um estudo brasileiro com 89 pacientes internados em que não houve diferença na gravidade entre os pacientes que apresentaram VSR e os que não apresentaram esse vírus,40 e outro que demonstrou que o fato de ser VSR positivo não teve influência no tempo de hospitalização.41 Em relação à presença de coinfecção viral, um estudo demonstrou que esta é responsável por maior gravidade da BVA.21 Outros sugerem que a coinfecção viral não aumenta a gravidade da BVA,42 incluindo um estu-do em nosso meio, que avaliou 176 pacientes e concluiu que a gravidade clínica da BVA por VSR não aumenta em função da existência de coinfecção viral.43
Atualmente, através do desenvolvimento de métodos quantitativos de PCR, tem sido estudada a importância da carga viral na gravidade da BVA, bem como a diferenciação entre coinfecção e codetecção viral, aspectos que até agora eram pouco conhecidos e considerados na literatura.44
Outros fatores de risco associados à gravidade
da bronquiolite viral aguda
(i) baixo peso na admissão19; (ii) tabagismo materno na ges-tação20,45; (iii) dermatite atópica35; (iv) ventilação mecânica no período neonatal21; (v) antecedente materno de ato-pia15; (vi) antecedente materno de asma na gestação45; (vii) estação do nascimento22; (viii) baixo nível socioeconômi-co7,20; (ix) síndrome de Down37,46; (x) poluição ambiental47; (xi) morar em altitude maior que 2.500 metros48; e (xii) parto cesariana.49
Virus
BVA-Leve
BVA-Grave
Variabilidade
Ambiente
Genética
Intereção gênica
Fatores epidemiológicos associados poucoestudadosBaixo peso na admissãoTabagismo materno na gestaçãoDermatite atópicaVentilação mecânica no período neonatalAntecedente materno de atopiaAntecedente materno de asma na gestaçãoEstação do nascimentoBaixo nivel socioeconomicoSindrome de DownPoluição ambientalMorar em altitude maior que 2.500 metrosParto cesariana
Fatores epidemiológicos associados:PrematuridadeTabagismo passivoBaixa idadeAleitamento maternoDoença pulmonar crônicaCardopatia congênitaGêneroEtniaEtiologia e presença de coinfecçâo viral
Genes associados com a BVA:TLR4, TLR9, TLR10RANTESVDRJUNIFNASNOS-2CX3CR1Codificantes das proteínas do surfactanteInterleucinas 4, 8, 10, 13 e 18
Figura 2 Fatores epidemiológicos e genéticos associados à bronquiolite viral aguda causada pelo vírus sincicial respiratório.
Documento descarregado de http://jped.elsevier.es el 01/05/2014. Cópia para uso pessoal, está totalmente proibida a transmissão deste documento por qualquer meio ou forma.
73
540 Alvarez AE et al.
Fatores genéticos
Apesar do conhecimento dos fatores de risco citados, a maior parte dos lactentes internados por BVA não apresenta quaisquer dessas condições. Isto levou os pesquisadores a acreditar que os fatores epidemiológicos não seriam os úni-cos responsáveis pela determinação da gravidade clínica da BVA pelo VSR. Assim, as características genéticas têm sido estudadas como fator de risco atuante na gravidade da BVA. Estima-se que existam mais de 10 milhões de variações no genoma humano (polimorfismos), e essas podem ser asso-ciadas com a variabilidade clínica em doenças como a BVA, sendo, recentemente, motivo de estudos populacionais. Nesse contexto, alguns estudos abordando variações em genes associados à reposta imune foram realizados na BVA grave por VSR.
Estudo recente avaliou 12.346 gêmeos nascidos na Dinamarca em um período de 10 anos, e verificou a con-cordância entre os mesmos em relação à hospitalização por VSR. A concordância foi de 0,66 nos gêmeos homozigóticos, e 0,53 nos dizigóticos, estimando uma contribuição genética de 16 a 20% para a gravidade da doença,50 o que contribui com a hipótese da atuação gênica na gravidade da BVA.
Na BVA, a infecção restringe-se às células superficiais do epitélio respiratório, principalmente as ciliadas dos bron-quíolos e dos pneumócitos tipo 1 nos alvéolos, e é com-batida pela resposta imune inata e adaptativa. O VSR é reconhecido pelas células epiteliais por receptores espe-cializados de reconhecimento de padrões moleculares asso-ciados a patógenos, conhecidos como Pattern recognition receptors (PRRs), possuindo forma de moléculas trans-membrana, e denominados receptores tipo Toll (Toll like receptor ou TLR), presentes em macrófagos e células den-dítricas, e ocorrem na produção de citocinas proinflama-tórias (Interleucinas 6, 8, 10 e 13, fator de necrose tumo-ral, RANTES, CX3CK1) e proteínas do surfactante. Alguns dos fatores apresentam propriedades antivirais diretas, enquanto outros estimulam a ativação de células natural killer, granulócitos, monócitos e macrófagos, dando início à resposta imune adaptativa.
O principal TLR responsável pelo reconhecimento do VSR é o Toll like 4 (TLR4). Polimorfismos do TLR4 foram asso-ciados com o risco de BVA grave por VSR, mas os resultados têm sido controversos. O melhor entendimento dessa ques-tão é importante para tentar identificar de maneira mais eficiente os lactentes que apresentam risco para evolução mais grave da BVA. Foi verificada a presença de polimor-fismos no gene TLR4 Asp299Gly (rs4986790) e Thr399Ile (rs4986791) em 99 lactentes internados por BVA grave por VSR, 82 pacientes tratados ambulatorialmente para esta doença e 90 adultos saudáveis. Os polimorfismos no TLR4 foram mais frequentes no grupo com BVA grave quando com-parado aos dois outros grupos, levando os autores a concluí-rem que a presença de polimorfismos no TLR4 está associa-da com maior gravidade da doença.51 Outro estudo avaliou a influência dos polimorfismos no gene TLR4 Asp299Gly e Thr399Ile sobre a produção de citocinas, demonstrando não existir qualquer influência nesse sentido e concluindo, assim, que a determinação dos polimorfismos do gene TLR4 não apresenta benefício na prática clínica.52 Outro estu-do, realizado com 312 pacientes e 356 controles, avaliou a
influência do polimorfismo Asp299Gly do gene TLR4 na sus-cetibilidade para BVA grave por VSR, e demonstrou que esse polimorfismo não influencia na gravidade da doença. Os autores concluem que a gravidade da BVA por VSR parece estar associada a fatores constitucionais e ambientais.53 Um estudo analisou 52 crianças com BVA por VSR (26 com trata-mento ambulatorial, 21 internadas em enfermaria e cinco internadas em unidade de terapia intensiva), e verificou que a presença dos polimorfismos Asp299Gly e Thr399Ile no gene TLR4 e uma disfunção de células mononucleares peri-féricas estimuladas por fito-hemaglutininas, manifestada por hiper-responsividade em resposta a lipopolissacarídeos, estavam associadas a maior gravidade da BVA por VSR.54 Já na avaliação dos polimorfismos D259G e T359I do TLR4 em 131 lactentes com BVA grave por VSR, quando comparados com 270 controles, os polimorfismos, isoladamente, não apresentaram associação com a gravidade da doença, mas a presença de um haplótipo gênico com os dois polimorfis-mos demonstrou associação significativa com a gravidade (p < 0,001).55
Um estudo verificou se polimorfismo em outros recepto-res Toll like, além do TLR4, poderiam estar relacionados à susceptibilidade a BVA por VSR, desta forma foram avalia-dos 19 polimorfismos nos receptores Toll like 1, 2, 3, 5, 6, 9 e 10 e foi encontrado associação entre polimorfismos nos receptores 9 e 10.56
Na avaliação de 106 crianças hospitalizadas com BVA por VSR e 120 controles (adultos saudáveis sem histórico de infecção respiratória grave), para verificar a associação de três polimorfismos -28C/G, -403G/A e In1.1T/C no gene RANTES com a gravidade da doença, não houve associação entre a gravidade da doença e os polimorfismos isolada-mente, mas os três polimorfismos combinados, formando haplótipo gênico, eram mais comuns nos casos que nos con-troles. Assim sendo, os autores concluíram que existe asso-ciação entre polimorfismos no gene RANTES e a gravidade da BVA por VSR.57
Um estudo verificou que o polimorfismo Thr1Meth (rs10735810) no receptor da vitamina D estava associado com a BVA, sendo que o alelo T “minor” tinha maior pro-pensão à BVA.58
Um estudo analisou 384 polimorfismos de nucleotídeos únicos em 470 crianças hospitalizadas com BVA por VSR e 1.008 controles, e verificou que os polimorfismos nos genes no receptor da vitamina D (rs10735810), JUN (rs11688), IFNA5 (rs10757212) e NOS-2 (rs1060826) demonstraram associação com BVA. Os autores concluíram que polimor-fismos nos genes da resposta imune inata são importantes para determinar a susceptibilidade para a BVA.59
Pesquisadores avaliaram se a presença de polimorfismos no receptor CX3CR1 presente nos leucócitos, e que se liga à proteína G do VSR, poderia apresentar relação com a gravidade da BVA. Foram avaliadas 82 crianças hospitaliza-das com BVA por VSR, e comparadas com 120 adultos sem histórico de infecção respiratória grave, e concluiu-se que o polimorfismo T280M foi mais frequente nos casos que nos controles (37,8% vs 20,8% OR 2,03; IC 95% 1,1-3,9), demonstrando associação do polimorfismo com a gravidade da infecção.60
As proteínas do surfactante SP-A, B, C e D, além de man-terem a tensão superficial alveolar, participam de meca-
Documento descarregado de http://jped.elsevier.es el 01/05/2014. Cópia para uso pessoal, está totalmente proibida a transmissão deste documento por qualquer meio ou forma.
74
Acute viral bronchiolitis: epidemiology and genetics 541
Conflitos de interesse
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Ao grupo de pesquisa em doenças pulmonares obstrutivas crônicas da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp. Ao laboratório de função pulmonar do Centro de Investigação em Pediatria. Ao laboratório multiusuário do departamento de Genética Médica – http://laboratoriomultiusuario.com.br.
Referências
1. Chávez-Bueno S, Mejías A, Welliver RC. Respiratory syncytial virus bronchiolitis: current and future strategies for treatment and prophylaxis. Treat Respir Med. 2006;5:483-94.
2. Ogra PL. Respiratory syncytial virus: the virus, the disease and the immune response. Paediatr Respir Rev. 2004;5:S119-26.
3. Stockman LJ, Curns AT, Anderson LJ, Fischer-Langley G. Respiratory Syncytial Virus-associated Hospitalizations Among Infants and Young Children in the United States, 1997-2006. Pediatr Infect Dis J. 2012;31:5-9.
4. Leader S, Kohlhase K. Recent trends in severe respiratory syncytial virus (RSV) among US infants, 1997 to 2000. J Pediatr. 2003;143:S127-32.
5. Ranmuthugala G, Brown L, Lidbury BA. Respiratory syncytial virus – the unrecognised cause of health and economic burden among young children in Australia. Commun Dis Intell. 2011;35:177-84.
6. Simões EA, Carbonell-Estrany X. Impact of severe disease caused by respiratory syncytial virus in children living in developed countries. Pediatr Infect Dis J. 2003;22:S13-8; discussion S18-20.
7. Albernaz EP, Menezes AM, César JA, Victora CG, Barros FC, Halpern R. Risk factors associated with hospitalization for bronchiolitis in the post-neonatal period. Rev Saude Publica. 2003;37:485-93.
8. Deshpande SA, Northern V. The clinical and health economic burden of respiratory syncytial virus disease among children under 2 years of age in a defined geographical area. Arch Dis Child. 2003;88:1065-9
9. Fryzek JP, Martone WJ, Groothuis JR. Trends in chronologic age and infant respiratory syncytial virus hospitalization: an 8-year cohort study. Adv Ther. 2011;28:195-201.
10. Sung CC, Chi H, Chiu NC, Huang DT, Weng LC, Wang NY, et al. Viral etiology of acute lower respiratory tract infections in hospitalized young children in Northern Taiwan. J Microbiol Immunol Infect. 2011;44:184-90.
11. García ML, Ordobás Gabin M, Calvo Reya C, González Alvarez M, Aguilar Ruiz J, Arregui Sierra A, et al. Viral infection of the lower respiratory tract in hospitalized infants: etiology, clinical features and risk factors. An Esp Pediatr. 2001;55:101-7.
12. Riccetto AG, Ribeiro JD, Silva MT, Almeida RS, Arns CW, Baracat EC. Respiratory syncytial virus (RSV) in infants hospitalized for acute lower respiratory tract disease: incidence and associated risks. Braz J Infect Dis. 2006;10:357-61.
13. Salomão Junior JB, Gardinassi LG, Simas PV, Bittar CO, Souza FP, Rahal P, et al. Human respiratory syncytial virus in children hospitalized for acute lower respiratory infection. J Pediatr (Rio J). 2011;87:219-24.
nismos imunológicos regulando a liberação de citocinas pró-inflamatórias, e participam da quimiotaxia e reparação tecidual. Estudo recente investigou se polimorfismos nos genes das proteínas SP-A1, SP-A2 e SP-D estavam associa-dos com a gravidade da infecção por VSR. Foi realizado estudo prospectivo com 118 crianças menores de seis meses com infecção por VSR, e com 104 controles sem histórico de infecção respiratória grave. Foram encontradas diferenças significativas em relação a alguns polimorfismos, e quando analisada a presença de haplótipo gênico, houve associação significativa entre a sua ocorrência e a gravidade da evo-lução da infecção pelo VSR (p < 0,001).61
As Interleucinas (IL) têm papel importante na respos-ta imunológica, e tem sido encontrada associação entre diferentes polimorfismos e haplótipo gênico dos genes da IL-4, IL-8, IL-10, IL-13 e IL-18 e a maior gravidade da infec-ção pelo VSR. Os estudos são controversos, pois a asso-ciação geralmente apresenta OR baixo e alguns deles não demonstraram qualquer associação. Às vezes, a associação só é significativa nos pacientes maiores de seis meses para IL-4, ou menores de seis meses para IL-10, sugerindo efeito dependente da idade no equilíbrio Th1/Th2.62
Como polimorfismos em genes relacionados à presença e maior gravidade da BVA estão associados à resposta imuno-lógica, sua identificação possibilitará um melhor entendi-mento de quais são as vias imunológicas implicadas na res-posta aos vírus e, dessa forma, colaborar com um parecer mais completo da doença. O conhecimento dos polimor-fismos implicados na evolução mais grave abrirá a possibi-lidade da introdução de novas terapias condicionadas por farmacogenética.
Conclusão
A BVA grave é a complicação mais frequente da infecção pelo VSR, sendo responsável por grande número de inter-nações, apresentando custo elevado podendo levar, inclu-sive, a óbito.
Nos últimos anos, têm ocorrido avanços em relação ao entendimento da variabilidade da gravidade da BVA pelo VSR. Os principais fatores epidemiológicos incluem pre-maturidade, tabagismo passivo, baixa idade, ausência de aleitamento materno, doença pulmonar crônica e cardio-patia congênita. Outros fatores permanecem controversos, como gênero e etnia, vírus causador da doença e presença de coinfecção viral. Existem relatos de outros fatores que também podem atuar na gravidade, mas que necessitam de mais estudos, tais como: baixo peso na admissão, taba-gismo materno na gestação, dermatite atópica, ventilação mecânica no período neonatal, antecedente materno de atopia, antecedente materno de asma na gestação, estação de nascimento, baixo nível socioeconômico, sín-drome de Down, poluição ambiental, morar em altitude maior que 2.500 metros e parto cesáreo. Em relação aos fatores genéticos, alguns polimorfismos parecem estar associados à evolução mais grave, sendo os mais estu-dados os polimorfismos dos genes do TLR4, TLR9, TLR10, RANTES, VDR, JUN, IFNA5, NOS-2, CX3CR1, codificantes das proteínas do surfactante e interleucinas 4, 8, 10, 13 e 18.
Documento descarregado de http://jped.elsevier.es el 01/05/2014. Cópia para uso pessoal, está totalmente proibida a transmissão deste documento por qualquer meio ou forma.
75
542 Alvarez AE et al.
14. Sly PD, Jones CM. Viral co-detection in infants hospitalized with respiratory disease: is it important to detect? J Pediatr (Rio J). 2011;87:277-80.
15. Miller EK, Williams JV, Gebretsadik T, Carroll KN, Dupont WD, Mohamed YA, et al. Host and viral factors associated with severity of human rhinovirus-associated infant respiratory tract illness. J Allergy Clin Immunol. 2011;127:883-91.
16. Nascimento MS, Souza AV, Ferreira AV, Rodrigues JC, Abramovici S, Silva Filho LV. High rate of viral identification and coinfections in infants with acute bronchiolitis. Clinics (São Paulo). 2010;65:1133-7.
17. Groothuis JR, Fryzek JP, Makari D, Steffey D, Martone WJ. Respiratory syncytial virus hospitalization trends in infants with chronic lung disease of infancy, 1998-2008. Clin Epidemiol. 2011;3:245-50.
18. Gouyon JB, Rozé JC, Guillermet-Fromentin C, Glorieux I, Adamon L, DI Maio M, et al. Hospitalizations for respiratory syncytial virus bronchiolitis in preterm infants at <33 weeks gestation without bronchopulmonary dysplasia: the CASTOR study. Epidemiol Infect. 2012 15:1-11.
19. Semple MG, Taylor-Robinson DC, Lane S, Smyth RL. Household tobacco smoke and admission weight predict severe bronchiolitis in infants independent of deprivation: prospective cohort study. PLoS One. 2011;6:e22425.
20. Koehoorn M, Karr CJ, Demers PA, Lencar C, Tamburic L, Brauer M. Descriptive epidemiological features of bronchiolitis in a population-based cohort. Pediatrics. 2008;122:1196-203.
21. Ochoa Sangrador C, González de Dios J; Grupo de Revisión del Proyecto aBREVIADo (BRonquiolitis-Estudio de Variabilidad, Idoneidad y Adecuación). [Consensus conference on acute bronchiolitis (VI): prognosis of acute bronchiolitis. Review of scientific evidence]. An Pediatr (Barc). 2010;72:354.e1-34.
22. Grimwood K, Cohet C, Rich FJ, Cheng S, Wood C, Redshaw N, et al. Risk factors for respiratory syncytial virus bronchiolitis hospital admission in New Zealand. Epidemiol Infect. 2008;136: 1333-41.
23. López Guinea A, Casado Flores J, Martín Sobrino MA, Espínola Docio B, de la Calle Cabrera T, Serrano A, García Teresa MA. Severe bronchiolitis. Epidemiology and clinical course of 284 patients. An Pediatr (Barc). 2007;67:116-22.
24. Chan PW, Lok FY, Khatijah SB. Risk factors for hypoxemia and respiratory failure in respiratory syncytial virus bronchiolitis. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2002;33:806-10.
25. Garcia CG, Bhore R, Soriano-Fallas A, Trost M, Chason R, Ramilo O, Mejias A. Risk factors in children hospitalized with RSV bronchiolitis versus non-RSV bronchiolitis. Pediatrics. 2010;126: e1453-60.
26. Chatzimichael A, Tsalkidis A, Cassimos D, Gardikis S, Tripsianis G, Deftereos S, et al. The role of breastfeeding and passive smoking on the development of severe bronchiolitis in infants. Minerva Pediatr. 2007;59:199-206.
27. Jones LL, Hashim A, McKeever T, Cook DG, Britton J, Leonardi-Bee J. Parental and household smoking and the increased risk of bronchitis, bronchiolitis and other lower respiratory infections in infancy: systematic review and meta-analysis. Respir Res. 2011;12:5.
28. Bradley JP, Bacharier LB, Bonfiglio J, Schechtman KB, Strunk R, Storch G, et al. Severity of respiratory syncytial virus bronchiolitis is affected by cigarette smoke exposure and atopy. Pediatrics. 2005;115:e7-14.
29. Hervás D, Reina J, Yañez A, Del Valle JM, Figuerola J, Hervás JA. Epidemiology of hospitalization for acute bronchiolitis in children: differences between RSV and non-RSV bronchiolitis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2012;31:1975-81.
30. Oñoro G, Pérez Suárez E, Iglesias Bouzas MI, Serrano A, Martínez De Azagra A, et al. Severe bronchiolitis. Changes in epidemiology and respiratory support. An Pediatr (Barc). 2011;74:371-6.
31. Damore D, Mansbach JM, Clark S, Ramundo M, Camargo CA Jr. Prospective multicenter bronchiolitis study: predicting intensive care unit admissions. Acad Emerg Med. 2008;15: 887-94.
32. Papoff P, Moretti C, Cangiano G, Bonci E, Roggini M, Pierangeli A, et al. Incidence and predisposing factors for severe disease in previously healthy term infants experiencing their first episode of bronchiolitis. Acta Paediatr. 2011;100:e17-23.
33. Vidaurreta SM, Marcone DN, Ellis A, Ekstrom J, Cukier D, Videla C. Acute viral respiratory infection in children under 5 years: Epidemiological study in two centers in Buenos Aires, Argentina. Arch Argent Pediatr. 2011;109:296-304.
34. Dornelles CT, Piva JP, Marostica PJ. Nutritional status, breastfeeding, and evolution of Infants with acute viral bronchiolitis. J Health Popul Nutr. 2007;25:336-43.
35. Al-Shehri MA, Sadeq A, Quli K. Bronchiolitis in Abha, Southwest Saudi Arabia: viral etiology and predictors for hospital admission. West Afr J Med. 2005;24:299-304.
36. Che D, Nicolau J, Bergounioux J, Perez T, Bitar D. Bronchiolitis among infants under 1 year of age in France: Epidemiology and factors associated with mortality. Arch Pediatr. 2012;19: 700-6.
37. Fjaerli HO, Farstad T, Bratlid D. Hospitalisations for respiratory syncytial virus bronchiolitis in Akershus, Norway, 1993-2000: a population-based retrospective study. BMC Pediatr. 2004;4:25.
38. Meissner HC. Selected populations at increased risk from respiratory syncytial virus infection. Pediatr Infect Dis J. 2003; 22:S40-5.
39. Riccetto AG, Silva LH, Spilki FR, Morcillo AM, Arns CW, Baracat EC. Genotypes and clinical data of respiratory syncytial virus and metapneumovirus in brazilian infants: a new perspective. Braz J Infect Dis. 2009;13:35-9.
40. D’Elia C, Siqueira MM, Portes SA, Sant’Anna CC. Respiratory syncytial virus – associated lower respiratory tract infections in hospitalized infants. Rev Soc Bras Med Trop. 2005;38:7-10.
41. Weigl JA, Puppe W, Schmitt HJ. Variables explaining the duration of hospitalization in children under two years of age admitted with acute airway infections: does respiratory syncytial virus have a direct impact? Klin Padiatr. 2004;216:7-15.
42. Brand HK, de Groot R, Galama JM, Brouwer ML, Teuwen K, Hermans PW, et al. Infection with multiple viruses is not associated with increased disease severity in children with bronchiolitis. Pediatr Pulmonol. 2012;47:393-400
43. De Paulis M, Gilio AE, Ferraro AA, Ferronato AE, do Sacramento PR, Botosso VF, et al,. Severity of viral coinfection in hospitalized infants with respiratory syncytial virus infection. J Pediatr (Rio J). 2011;87:307-13.
44. Jartti T, Söderlund-Venermo M, Hedman K, Ruuskanen O, Mäkelä MJ. New molecular virus detection methods and their clinical value in lower respiratory tract infections in children. Paediatr Respir Rev. 2013;14:38-45.
45. Carroll KN, Gebretsadik T, Griffin MR, Dupont WD, Mitchel EF, Wu P, et al. Maternal asthma and maternal smoking are associated with increased risk of bronchiolitis during infancy. Pediatrics. 2007;119:1104-12.
46. Bloemers BL, van Furth AM, Weijerman ME, Gemke RJ, Broers CJ, van den Ende K, et al. Down syndrome: a novel risk factor for respiratory syncytial virus bronchiolitis – a prospective birth-cohort study. Pediatrics. 2007;120:e1076-81.
47. Karr C, Lumley T, Schreuder A, Davis R, Larson T, Ritz B, et al. Effects of subchronic and chronic exposure to ambient air pollutants on infant bronchiolitis. Am J Epidemiol. 2007;165: 553-60.
48. Choudhuri JA, Ogden LG, Ruttenber AJ, Thomas DS, Todd JK, Simoes EA. Effect of altitude on hospitalizations for respiratory syncytial virus infection. Pediatrics. 2006;117:349-56.
Documento descarregado de http://jped.elsevier.es el 01/05/2014. Cópia para uso pessoal, está totalmente proibida a transmissão deste documento por qualquer meio ou forma.
76
Acute viral bronchiolitis: epidemiology and genetics 543
56. Mailaparambil B, Krueger M, Heinze J, Forster J, Heinzmann A. Polymorphisms of toll like receptors in the genetics of severe RSV associated diseases. Dis Markers. 2008;25:59-65.
57. Amanatidou V, Sourvinos G, Apostolakis S, Neonaki P, Tsilimigaki A, Krambovitis E, et al. RANTES promoter gene polymorphisms and susceptibility to severe respiratory syncytial virus-induced bronchiolitis. Pediatr Infect Dis J. 2008;27:38-42.
58. Kresfelder TL, Janssen R, Bont L, Venter M. Confirmation of an association between single nucleotide polymorphisms in the VDR gene with respiratory syncytial virus related disease in South African children. J Med Virol. 2011;83:1834-40.
59. Janssen R, Bont L, Siezen CL, Hodemaekers HM, Ermers MJ, Doornbos G, et al. Genetic susceptibility to respiratory syncytial virus bronchiolitis is predominantly associated with innate immune genes. J Infect Dis. 2007;196:826-34.
60. Amanatidou V, Sourvinos G, Apostolakis S, Tsilimigaki A, Spandidos DA. T280M variation of the CX3C receptor gene is associated with increased risk for severe respiratory syncytial virus bronchiolitis. Pediatr Infect Dis J. 2006;25:410-4.
61. Ampuero S, Luchsinger V, Tapia L, Palomino MA, Larrañaga CE. SP-A1, SP-A2 and SP-D gene polymorphisms in severe acute respiratory syncytial infection in Chilean infants. Infect Genet Evol. 2011;11:1368-77.
62. Mulet JF, Rodríguez de Torres BO. Viral induced bronchiolitis and genetics. An Pediatr (Barc). 2010;73:159-61.
49. Moore HC, de Klerk N, Holt P, Richmond PC, Lehmann D. Hospitalisation for bronchiolitis in infants is more common after elective caesarean delivery. Arch Dis Child. 2012;97:410-4.
50. Thomsen SF, Stensballe LG, Skytthe A, Kyvic KO, Backer V, Bisgaard H. Increased concordance of severe respiratory syncytial virus infection in identical twins. Pediatrics. 2008; 121:493-6.
51. Tal G, Mandelberg A, Dalal I, Cesar K, Somekh E, Tal A, et al. Association between common Toll-like receptor 4 mutations and severe respiratory syncytial virus disease. J Infect Dis. 2004;189:2057-63.
52. Douville RN, Lissitsyn Y, Hirschfeld AF, Becker AB, Kozyrskyj AL, Liem J, et al. TLR4 Asp299Gly and Thr399Ile polymorphisms: no impact on human immune responsiveness to LPS or respiratory syncytial virus. PLoS One. 2010;5:e12087.
53. Löfgren J, Marttila R, Renko M, Rämet M, Hallman M. Toll-like receptor 4 Asp299Gly polymorphism in respiratory syncytial virus epidemics. Pediatr Pulmonol. 2010;45:687-92.
54. Mandelberg A, Tal G, Naugolny L, Cesar K, Oron A, Houri S, et al. Lipopolysaccharide hyporesponsiveness as a risk factor for intensive care unit hospitalization in infants with respiratory syncitial virus bronchiolitis. Clin Exp Immunol. 2006;144:48-52.
55. Puthothu B, Forster J, Heinzmann A, Krueger M. TLR-4 and CD14 polymorphisms in respiratory syncytial virus associated disease. Dis Markers. 2006;22:303-8.
Documento descarregado de http://jped.elsevier.es el 01/05/2014. Cópia para uso pessoal, está totalmente proibida a transmissão deste documento por qualquer meio ou forma.
77
ARTIGO 2: ARTIGO ORIGINAL
Genetic influence on the severity of Acute
Viral Bronchiolitis
78
Genetic influence on the severity of Acute Viral
Bronchiolitis
Alfonso Eduardo Alvarez1,*, M.D., M.S., Fernando Augusto de Lima Marson1,2,
PhD., Carmen Sílvia Bertuzzo2, PhD., Juliana Cristina Santiago Bastos3, M.S.,
Emilio Carlos Elias Baracat1,4, M.D., Ph.D., Marcelo Barciela Brandão1,4, M.D.,
Ph.D., Antonia Teresinha Tresoldi1, M.D., Ph.D., Mariana Tresoldi das Neves
Romaneli1, M.D., M.S., Celize Cruz Bresciani Almeida1, Ph.D., Therezinha de
Oliveira1, B.S., Patricia Godano Schlodtmann5, B.S., Ester Corrêa5, B.S., Maria
Luisa Ferreira de Miranda4, M.D., Marcelo Conrado dos Reis4, M.D., M.S., José
Vicente De Pieri5, M.D., Clarice Weis Arns3, Ph.D., and José Dirceu Ribeiro1,
M.D., Ph.D.
1. Department of Pediatrics, Faculty of Medical Sciences, State University of
Campinas. Rua Tessália Vieira de Camargo, 126, Cidade Universitária Zeferino
Vaz, Campinas – São Paulo, Brasil, CEP 13083-887.
2. Department of Medical Genetics, Faculty of Medical Sciences, State
University of Campinas. Rua Tessália Vieira de Camargo, 126, Cidade
Universitária Zeferino Vaz, Campinas – São Paulo, Brasil, CEP 13083-887.
3. Biological Institute, State University of Campinas, Department of Genetics,
Evolution and Bioagents. Rua Monteiro Lobato, 255, Cidade Universitária
Zeferino Vaz, Campinas - SP - Brasil - CEP 13083-862.
4. Clinical Hospital of Sumare, State University of Campinas. Av. da Amizade,
2.400, Jd Bela Vista, Sumaré – SP – Brasil – CEP 13175-49.
5. Vera Cruz Hospital. Av. Andrade Neves, 402 , Centro, Campinas – SP –
Brasil – CEP 13013-160.
* Corresponding author: AEA: [email protected]. Department of
Pediatrics, Faculty of Medical Sciences, State University of Campinas
(Unicamp), Rua Tessália Vieira de Camargo, 126 Cidade Universitária Zeferino
79
Vaz, Campinas, SP, Brasil 13083-887. Tel: + 551935218983 / 35218959; Fax:
+55 19 35218970.
Financial disclosure: The authors report no financial relationships relevant to
the subject of this article.
Funding source: AEA: São Paulo Research Foundation (FAPESP) grant
#2012/05458-2 and Roberto Rocha Brito Foundation of Vera Cruz Hospital
grant. FALM: FAPESP grants #2011/12939-4. JDR: FAPESP grants
#2011/18845-1 and #2012/05458-2.
Potential conflicts of interest: The authors declare that they have no conflicts
of interest.
Keywords: Infants; Genetics; Risk factors; Respiratory Syncytial Virus, Toll-like
receptors
Running head: Genetic influence on Acute Viral Bronchiolitis
80
Abstract
Background and objectives: Acute viral bronchiolitis is the leading cause of
hospitalization among infants during the first year of life. Most infants
hospitalized for bronchiolitis do not present with risk factors and are otherwise
healthy. The objective of this study was to determine the genetic features
associated with a severe course and prevalence of bronchiolitis. Secondarily,
we analyzed the influence of epidemiologic and etiologic features associated
with bronchiolitis severity.
Methods: We prospectively evaluated 181 severe bronchiolitis infants admitted
at three hospitals over a 2-year period (2013-2014) who required oxygen
therapy. The control group consisted of 536 healthy adults. Patients were
evaluated for epidemiological variables, and underwent nasopharyngeal
aspirate testing for virus detection by multiplex-PCR, and blood collection for
the SNPs identification in immune response genes. Patient outcomes were
assessed.
Results: We observed association between SNP rs2107538 (RANTES) and
bronchiolitis caused by respiratory syncytial virus(RSV) and RSV-subtype-A,
and between rs1060826 (NOS2) and bronchiolitis caused by rhinovirus. SNPs
rs4986790 (TLR4), rs898830 (TLR2), and rs2228570 (VDR) were associated
with progression to death. SNP rs7656411 (TLR2) was associated with length
of oxygen use; SNPs rs352162 (TLR9), rs187084 (TLR9), and rs2280788
(RANTES) were associated with requirement for intensive care unit admission;
while SNPs rs1927911 (TLR4), rs352162(TLR9), and rs2107538(RANTES)
were associated with the need for mechanical ventilation. Patients with RSV
subtype-B infections had shorter lengths of hospital stay and oxygen use than
those infected with other viruses.
Conclusions: Our findings indicate that genetic variability in immune response
genes contributes to outcomes of severe bronchiolitis.
81
Introduction
Acute viral bronchiolitis is the leading cause of hospitalization among
infants aged < 12 months. Approximately 100,000 bronchiolitis admissions
occur annually in the United States, at an estimated cost of $1.73 billion1-3.
Respiratory syncytial virus (RSV) is the causative agent in approximately
70% of bronchiolitis cases, and nearly all children become infected with this
virus during the first 2 years of life. RSV infection ranges from a mild upper
respiratory illness to severe bronchiolitis, which may require admission to the
intensive care unit (ICU), mechanical ventilation, and possibly lead to death.
Treatment is supportive1,2,4. Globally, RSV is estimated to cause 66,000–
199,000 deaths per year among children younger than 5 years of age1.
Because of the possibility of bronchiolitis changing to a more severe form,
it is important to identify its risk factors. We recently published a review of these,
which include prematurity, passive smoking, young age, absence of
breastfeeding, chronic lung disease, and congenital heart disease; some of
these risk factors are controversial in the literature5. Some controversy also
exists regarding the influence of the type of virus and the presence of
codetection in the severity of bronchiolitis6-9.
Most infants hospitalized with bronchiolitis present with no risk factors and
are otherwise healthy. This led researchers to believe that epidemiological
factors are not solely responsible for determining the prevalence and severity of
bronchiolitis, and that these might be influenced by genetic variability. Indeed,
one study found a correlation between 12,346 pairs of twins and hospitalization
for RSV of 0.66 in homozygous twins and 0.53 in dizygotic twins, estimating a
genetic contribution from 16% to 20% for RSV severity10.
Toll-like receptor (TLR)4 plays a role in RSV recognition, and genetic
variations of TLR4 have been studied as risk factors of RSV infection11-13. TLR9
and TLR10 also carry polymorphisms that have been associated with
bronchiolitis14, as well as other genes such as regulated on activation, normal T
cell expressed and secreted (RANTES)15, vitamin D receptor (VDR)16,17,
inducible nitric oxide synthase (NOS2), interferon (IFNA5), and JUN17.
82
The aim of this study was to determine the genetic features associated
with a severe course and prevalence of bronchiolitis. Secondarily, we analyzed
the influence of epidemiologic and etiologic features associated with
bronchiolitis severity.
Patients and Methods
Patients
We prospectively evaluated all severe acute viral bronchiolitis patients
aged < 2 years admitted at three hospitals in a 2-year period (2013-2014), who
required oxygen therapy. The diagnosis of bronchiolitis was based on clinical
data, using the most widely accepted definition, which considers it to be the first
episode of acute respiratory distress with wheezing, preceded by upper airway
symptoms such as rhinorrhea and cough, with or without fever, in children
under 2 years of age2. The severe bronchiolitis criterion was oxygen saturation
< 92%. Patients with this condition were admitted for oxygen therapy2. Patients
with previous wheezing were excluded. Patients were admitted in ICU when
oxygen saturation remains < 92% even with the patient getting inspired oxygen
fraction > 60%. Patients were submitted to mechanical ventilation if arterial
partial pressure of oxygen were < 60 mmHg or arterial partial pressure of
carbon dioxide were > 50 mmHg in arterial blood gas analysis. The oxygen
therapy was suspended when oxygen saturation remains > 92% in room air.
The patient was discharged 24 hours after suspending the oxygen therapy. The
control group consisted of 536 healthy controls (aged 19 to 25 years) with no
personal or family history of lung or other chronic disease for two generations.
Control group with healthy adults is a useful and accepted tool that has been
applied in a large number of genetic association studies11,14,15,17,24,36.
Patients were evaluated for epidemiological variables, outcome of
disease, type of virus, and genetic polymorphisms. Parents or guardians
answered a questionnaire about epidemiological factors. A longitudinal follow-
up was carried out of these patients until the time of discharge, evaluating the
length of hospital stay, length of oxygen use, need and length of ICU stay, need
83
and length of mechanical ventilation, and progression to death. Patients
underwent nasopharyngeal aspirate for the detection of viruses, and blood
collection for the identification of polymorphisms.
Virus identification
RNAprotect® Cell Reagent (Qiagen, Valencia, CA) was added to
nasopharyngeal aspirates in a 1:5 ratio, and stored at -80°C. Stored material
was centrifuged and the supernatant discarded. The cell pellet was then
resuspended in buffer RLT Plus and DNA and RNA isolation was performed
using the AllPrep DNA/RNA Mini kit (Qiagen) according to the manufacturer’s
protocol.
cDNA was synthesized using the High Capacity cDNA Reverse
Transcription kit (Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific, São Paulo,
Brazil) according to the manufacturer’s protocol. Samples were then tested
using the Seeplex® RV15 ACE detection kit (Seegene, Concord, CA) for 13
types of RNA viruses and two types of DNA viruses according to the
manufacturer’s instructions. PCR was conducted in a thermocycler based on
the manufacturer’s protocol in a final volume of 20 µL containing 3 µL of cDNA
(or 1.5 µL cDNA and 1.5 µL DNA), 4 µL of 5× RV15 ACE primer (A, B, or C), 3
µL of 8-MOP solution, and 10 µL of 2× master mix. Amplified PCR products
were analyzed in 2% agarose gels stained with GelRed (Biotium Inc., Hayward,
CA). The viruses tested for were: RSV subtypes A and B; rhinovirus A/B/C;
parainfluenza virus 1, 2, 3, and 4; adenovirus; coronaviruses 229E/NL63 and
OC43; influenza A virus and influenza B virus; bocavirus 1/2/3/4;
metapneumovirus; and enterovirus.
Polymorphism screening
Genomic DNA was extracted from blood samples using the QIAamp®
DNA Blood Mini kit (Qiagen) according to the manufacturer’s protocol. The
OpenArray® Real-Time PCR Platform and AccuFill™ System (Thermo Fisher
Scientific) were used to screen the following 16 polymorphisms with TaqMan®
OpenArray® Genotyping Plates, format 16 (PN: 4413546): rs4986790 (TLR4),
84
rs4986791 (TLR4), rs1927911 (TLR4), rs898830 (TLR2), rs7656411 (TLR2),
rs352162 (TLR9), rs187084 (TLR9), rs1065341 (RANTES), rs2107538
(RANTES), rs2280788 (RANTES), rs2280789 (RANTES), rs10735810 (VDR),
rs2228570 (VDR), rs1060826 (NOS2), rs10757212 (IFNA5), and rs11688
(JUN).
Statistical analysis
Epidemiological and laboratory data were described by frequency
(percentage) for categorical variables, and means ± standard deviation or
medians (minimum and maximum) for numerical data. Data and disease
outcomes were compared between patients, and polymorphism frequency was
compared between patients and controls. We also analyzed polymorphism
frequencies in patients and controls for each type of virus (RSV, specific RSV
subtype A or RSV subtype B, rhinovirus, and virus codetection). Polymorphisms
were compared with epidemiological and laboratory data, including the type of
virus identified. A second analysis was performed in 131 patients without
comorbidities (premature birth, chronic respiratory disease, and congenital heart
disease) for all previously mentioned comparisons.
Fisher’s exact test and the χ2 test were applied to compare categorical
data, and the Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests were used to compare
numerical data. We reported odds ratios and 95% confidence intervals; two-
sided P<0.05 was considered statistically significant. Data were analyzed using
SPSS 21.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL).
We evaluated minor allele frequency (MAF) and Hardy-Weinberg
equilibrium (HWE) using OEGE software (Online Encyclopedia for Genetic
Epidemiology studies, 2008). In order to evaluate genetic interaction among the
polymorphisms and clinical data in our sample, we used the Multifactor
Dimensionality Reduction (MDR) model, which is a nonparametric, genetic, and
environmental model-free data mining for nonlinear interaction identification
among genetic and environmental attributes18. To adjust results for multiple
comparisons, we performed a MDR permutation test in our sample, totalizing
100,000 permutations.
85
Ethics statement
This study was approved by the National Research Ethics Commission.
Legal representatives of patients received explanations about the research and
gave written informed consent.
Results
Table 1 shows patient demographics, clinical characteristics, and details
of the viruses identified. One hundred and eighty-one patients were included in
the study, of whom 173 underwent nasopharyngeal aspirate. Viral identification
was positive in 87.3% of cases.
Association between polymorphisms and bronchiolitis presence and
severity
Table 2 shows SNPs description including minor allele frequency and
Hardy-Weinberg equilibrium.
Figure 1 and supplemental online table 1 show association between
polymorphisms and the presence of bronchiolitis for different types of virus. The
evaluation of the presence of bronchiolitis for different types of virus revealed an
association between SNP rs2107538 (RANTES) and bronchiolitis caused by
RSV and RSV-A specifically, and between SNP rs1060826 (NOS2) and
bronchiolitis caused by rhinovirus. In patients without comorbidities, we
observed an association between SNP rs1060826 (NOS2) and bronchiolitis
caused by rhinovirus.
Figure 2 and supplemental online table 2 show association between
polymorphisms and bronchiolitis severity. SNPs rs4986790 (TLR4) and
rs2228570 (VDR) were associated with progression to death, rs352162 (TLR9),
and rs187084 (TLR9) with ICU admission, and rs352162 (TLR9) and rs2107538
(RANTES) with need for mechanical ventilation.
In patients without comorbidities, SNP rs898830 (TLR2) was associated
with progression to death because the four patients who died during the study
were heterozygous for this SNP (P=0.036). Additionally, rs1927911 (TLR4) and
86
rs2107538 (RANTES) were associated with need for mechanical ventilation,
rs7656411 (TLR2) with length of oxygen use, and rs352162 (TLR9) and
rs2280788 (RANTES) with ICU admission. The rs2280788 heterozygous
genotype was only present in patients who required ICU admission (P=0.036).
Association between epidemiological parameters and bronchiolitis
severity
Figure 3A and supplemental online table 3 show association between
epidemiological parameters and bronchiolitis severity. The worst outcomes
correlated with the presence of atopy in parents and siblings, lower maternal
education, and a greater number of siblings and people in the house. Clinical
features associated with bronchiolitis have already been reported in the
literature5, so we instead focused on genetic variability in genes involved in the
immune system.
Association between virus infection and bronchiolitis severity
Figure 3B and supplemental online table 3 also show association
between viral infection and bronchiolitis severity. Patients with RSV-B infections
had a shorter length of stay and length of oxygen use than those with other
infections. This was also observed for patients without comorbidities regarding
the length of oxygen use. Codetection was associated with patient age,
frequency of nursery attendance, and a father with allergic rhinitis.
Interaction analysis
The MDR analysis showed no evidence of interaction of genetic variants
enrolled between severe acute viral bronchiolitis and health control subjects.
For patient’s outcomes, no positive interaction was observed among the clinical
data.
Discussion
To the best of our knowledge, this is the first study into the association of
SNPs in genes involved in the immune response with the severity of
87
bronchiolitis that compared patient outcomes. Until now, studies analyzing the
prevalence of bronchiolitis have compared patients with controls, while those
examining the severity of bronchiolitis have compared inpatients with patients
seen in the emergency room and then discharged.
The human Toll-like family of proteins consists of at least 10 members of
pattern recognition receptors present in macrophages and dendritic cells that
represent a critical link between immune stimulants produced by
microorganisms and the initiation of host defense. The interaction between
TLR4 and the RSV fusion protein leads to the production of pro-inflammatory
cytokines (interleukins 6, 8, 10, and 13, tumor necrosis factor, RANTES, and
CX3CK1) and surfactant proteins. Some of these factors have direct antiviral
properties, while others stimulate the activation of natural killer cells,
granulocytes, monocytes, and macrophages, thus initiating the adaptive
immune response19-22. A TLR deficiency may lead to the absence of Th1
polarizing signals, and change T cell responses from protective Th1 and
cytotoxic T cell immunity toward dysregulated Th2 and Th17 polarization,
causing bronchiolitis in susceptible infants19, 20. A recent study demonstrated
that the RSV fusion protein was capable of inducing the formation of neutrophil
extracellular traps (NETs), which immobilize and kill pathogens, through TLR4
activation. The excessive production of NETs contributes to the pathology of
respiratory viral infections23.
Previous studies found that severe RSV bronchiolitis is associated with
SNPs in TLR4 (rs4986790 and rs4986791)11,24. Moreover, peripheral blood
mononuclear cells from children expressing exonic TLR4 variants were shown
to have blunted responses to RSV21. However, other studies found no
association between these SNPs and bronchiolitis12,13. The present study found
that death from bronchiolitis is associated with SNP rs4986790 (TLR4), but no
association was detected between bronchiolitis severity and SNP rs1927911
(TLR4). SNP rs1927911 was recently associated with an increased risk of
asthma development in children with a history of bronchiolitis25, so we are
following up our patients to verify any association between bronchiolitis severity,
the virus type, genetic polymorphisms, and asthma development.
88
Environmental factors have also been shown to interact with the TLR4 genotype
to modulate the RSV infection severity26.
TLR2 is expressed on the surface of immune cells and tissues as a
heterodimer complex with either TLR1 or TLR6. Using knockout mice, TLR2
and TLR6 signaling in leukocytes was shown to activate innate immunity
against RSV by promoting tumor necrosis factor alpha, interleukin-6, chemokine
(C-C motif) ligand (CCL)2, and RANTES, and was important for controlling viral
replication and promoting neutrophil migration and dendritic cell activation in
vivo27. Additionally, TLR4 signaling was reported to influence TLR2 expression
following certain stimuli, suggesting a role for both TLR4 and TLR2 in the
response to RSV28. We found that death in bronchiolitis is associated with SNP
rs898830 (TLR2) in patients without comorbidities. A recent study, however,
found no association between TLR1, TLR2, and TLR6 polymorphisms and the
bronchiolitis severity29.
TLR9 has previously been associated with different diseases, such as
bronchial asthma30. Additionally, RSV was shown to inhibit the production of
interferon-γ in human plasmacytoid dendritic cells by TLR9 signaling31, and TH2
response upregulation, which is characteristically seen in severe RSV-
associated diseases. Thus, an involvement of TLR9 in the genetics of
bronchiolitis seems reasonable. An association of SNP rs5743836 (TLR9) with
RSV infection was documented in an earlier study14, and we found that SNPs
rs352162 (TLR9) and rs187084 (TLR9) were associated with a requirement for
ICU admission, and that rs352162 was also associated with the need for
mechanical ventilation.
In the course of RSV infection, enhanced chemokine activity modulates
cell recruitment and infiltration to the inflammation site. RANTES is a chemokine
produced by CD8+ T-lymphocytes, macrophages, platelets, and epithelial cells
that attracts monocytes, eosinophils, basophils, and memory T-lymphocytes to
the area of infection. It is highly expressed in respiratory epithelial cell lines,
nasal secretions, and broncho-alveolar lavages of RSV-infected subjects.
Moreover, evidence supports an association between RANTES activity and
RSV infection32.
89
A previous study reported an association between SNPs rs2107538 and
rs2280788 in the promoter region and rs2280789 in intron 1 of RANTES with
RSV bronchiolitis31. However, another study found no association between RSV
bronchiolitis and these SNPs when tested separately, but observed a
significantly more common combined SNP genotype in patients than in
controls15. We found that SNP rs2107538 (RANTES) was associated with the
need for mechanical ventilation in bronchiolitis patients.
Vitamin D modulates white blood cell proliferation, maturation, and
cytokine expression through the VDR on lymphocytes and macrophages. VDR
signaling also contributes to the expression of antimicrobial peptides, which are
important for the innate defense against viruses and bacteria33. Lower vitamin D
levels have been postulated as a risk factor for respiratory illness based on the
well-established seasonality of respiratory infections that occur during winter
when UV-B production of vitamin D is low. Subsequent bronchiolitis research in
developed countries investigating subclinical vitamin D deficiency supports this
hypothesis34. Additionally, a prospective newborn cohort study identified low
cord blood vitamin D levels as an independent predictor of RSV infection during
the first year of life35.
Genetic alterations of VDR have the potential to affect vitamin D signaling
through impaired gene transcription, mRNA stability and translation, protein
activity, and protein stability. A common VDR SNP, rs2228570, has previously
been associated with moderately lower VDR transcriptional activity and a recent
meta-analysis concluded that presence of the rs2228570 minor allele
significantly increased the risk of RSV bronchiolitis36. Similarly, we found that
rs2228570 was associated with death from bronchiolitis in the current study.
In airway epithelial cells, vitamin D controls the expression of signal
transducer and activator of transcription (STAT)1. A recent study demonstrated
that the predisposition of SNP rs2228570 (VDR) to severe RSV bronchiolitis
may involve the impaired ability of vitamin D to restrain antiviral signaling in
airway epithelia, and that vitamin D fails to regulate STAT1 phosphorylation and
downstream gene expression in cells expressing this VDR variant. Strong
activation of the STAT1 pathway in RSV-infected cells may therefore contribute
90
to RSV immunopathogenesis37. Two studies found that another VDR SNP,
rs10735810, was associated with an increased likelihood of bronchiolitis and
that carriers of the minor T allele were more likely to develop this disease16,17.
A recent study analyzed 60 infants hospitalized with bronchiolitis and
found no significant differences in demographic factors, clinical characteristics,
or clinical severity between infants with RSV-A and RSV-B infections38. Another
study found no difference in the duration of hospitalization or need for ICU in
children infected with RSV-A compared with those infected with RSV-B, but
RSV-A-infected infants had a significantly higher clinical score, supporting the
notion that RSV-A-induced bronchiolitis is more severe than RSV-B-induced
disease39. We showed that RSV-B infection was associated with a reduced
length of stay and length of oxygen utilization compared with the presence of
other viral infections, indicating a lower level of disease severity for this viral
subtype. Development of an RSV vaccine is a high priority for public health, but
attempts to date have been frustrated. Resolving the mechanism by which RSV
induces pathogenesis is essential for developing new effective vaccines19,20,40.
In conclusion, our findings indicate that genetic variability in immune
response genes contributes to outcomes of severe bronchiolitis. The
determination of polymorphisms in immune response genes could be used in
future work to help predict high-risk infants who might benefit from preventive
measures. A knowledge of SNPs associated with severe bronchiolitis will also
contribute to an understanding of disease pathogenesis and the innate immune
response to its infection. This will be useful in guiding efforts to develop more
effective treatment for this potentially fatal infection.
Acknowledgments
We thank Luciana Montes Rezende and Tania Kawazaki de Araújo from
the Department of Medical Genetics, Faculty of Medical Sciences, State
University of Campinas, for performing DNA extraction, polymorphism
screening, and the collection of control subjects.
91
References
1. Meissner HC. Viral Bronchiolitis in Children. N Engl J Med 2016;374:62-72.
2. Ralston SL, Lieberthal AS, Meissner HC, Alverson BK, Baley JE, Gadomski
AM, Johnson DW, Light MJ, Maraqa NF, Mendonca EA, Phelan KJ, Zorc JJ,
Stanko-Lopp D, Brown MA, Nathanson I, Rosenblum E, Sayles S 3rd,
Hernandez-Cancio S; American Academy of Pediatrics. Clinical practice
guideline: the diagnosis, management, and prevention of bronchiolitis.
Pediatrics 2014;134(5):e1474-1502.
3. Hall CB, Weinberg GA, Iwane MK, Blumkin AK, Edwards KM, Staat MA,
Auinger P, Griffin MR, Poehling KA, Erdman D, Grijalva CG, Zhu Y, Szilagyi P.
The burden of respiratory syncytial virus infection in young children. N Engl J
Med 2009;360:588-598.
4. National Collaborating Centre for Women's and Children's Health (UK).
Bronchiolitis: Diagnosis and Management of Bronchiolitis in Children. London:
National Institute for Health and Clinical Excellence, 2015.
5. Alvarez AE, Marson FA, Bertuzzo CS, Arns CW, Ribeiro JD. Epidemiological
and genetic characteristics associated with the severity of acute viral
bronchiolitis by respiratory syncytial virus. J Pediatr (Rio J) 2013;89:531-543.
6. Hervás D, Reina J, Yañez A, Del Valle JM, Figuerola J, Hervás JA.
Epidemiology of hospitalization for acute bronchiolitis in children: differences
between RSV and non-RSV bronchiolitis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis
2012;31:1975-1981.
7. Weigl JA, Puppe W, Schmitt HJ. Variables explaining the duration of
hospitalization in children under two years of age admitted with acute airway
infections: does respiratory syncytial virus have a direct impact? Klin Padiatr
2004;216:7-15.
8. da Silva ER, Pitrez MC, Arruda E, Mattiello R, Sarria EE, de Paula FE,
Proença-Modena JL, Delcaro LS, Cintra O, Jones MH, Ribeiro JD, Stein RT.
Severe lower respiratory tract infection in infants and toddlers from a non-
92
affluent population: viral etiology and co-detection as risk factors. BMC Infect
Dis 2013;13:41.
9. Brand HK, de Groot R, Galama JM, Brouwer ML, Teuwen K, Hermans PW,
Melchers WJ, Warris A. Infection with multiple viruses is not associated with
increased disease severity in children with bronchiolitis. Pediatr Pulmonol
2012;47:393-400.
10. Thomsen SF, Stensballe LG, Skytthe A, Kyvic KO, Backer V, Bisgaard H.
Increased concordance of severe respiratory syncytial virus infection in identical
twins. Pediatrics 2008;121:493-496.
11. Tal G, Mandelberg A, Dalal I, Cesar K, Somekh E, Tal A, Oron A, Itskovich
S, Ballin A, Houri S, Beigelman A, Lider O, Rechavi G, Amariglio N. Association
between common Toll-like receptor 4 mutations and severe respiratory syncytial
virus disease. J Infect Dis 2004;189:2057-2063.
12. Löfgren J, Marttila R, Renko M, Rämet M, Hallman M. Toll-like receptor 4
Asp299Gly polymorphism in respiratory syncytial virus epidemics. Pediatr
Pulmonol 2010;45:687-692.
13. Goutaki M, Haidopoulou K, Pappa S, Tsakiridis P, Frydas E, Eboriadou M,
Hatzistylianou M. The role of TLR4 and CD14 polymorphisms in the
pathogenesis of respiratory syncytial virus bronchiolitis in greek infants. Int J
Immunopathol Pharmacol 2014;27:563-572.
14. Mailaparambil B, Krueger M, Heinze J, Forster J, Heinzmann A.
Polymorphisms of toll like receptors in the genetics of severe RSV associated
diseases. Dis Markers 2008;25:59-65.
15. Amanatidou V, Sourvinos G, Apostolakis S, Neonaki P, Tsilimigaki A,
Krambovitis E, Spandidos DA. RANTES promoter gene polymorphisms and
susceptibility to severe respiratory syncytial virus-induced bronchiolitis. Pediatr
Infect Dis J 2008;27:38-42.
16. Kresfelder TL, Janssen R, Bont L, Venter M. Confirmation of an association
between single nucleotide polymorphisms in the VDR gene with respiratory
93
syncytial virus related disease in South African children. J Med Virol
2011;83:1834-1840.
17. Janssen R, Bont L, Siezen CL, Hodemaekers HM, Ermers MJ, Doornbos G,
van 't Slot R, Wijmenga C, Goeman JJ, Kimpen JL, van Houwelingen HC,
Kimman TG, Hoebee B. Genetic susceptibility to respiratory syncytial virus
bronchiolitis is predominantly associated with innate immune genes. J Infect Dis
2007;196:826-834.
18. Gola D, Mahachie John JM, van Steen K, König IR. A roadmap to
multifactor dimensionality reduction methods. Brief Bioinform 2016;17:293-308.
19. Farrag MA, Almajhdi FN. Human Respiratory Syncytial Virus: Role of Innate
Immunity in Clearance and Disease Progression. Viral Immunol 2016;29:11-26.
20. Arruvito L, Raiden S, Geffner J. Host response to respiratory syncytial virus
infection. Curr Opin Infect Dis 2015;28:259-266.
21. Lambert L, Sagfors AM, Openshaw PJ, Culley FJ. Immunity to RSV in
Early-Life. Front Immunol 2014;5:466.
22. Choi EH, Lee HJ, Chanock SJ. Human genetics and respiratory syncytial
virus disease: current findings and future approaches. Curr Top Microbiol
Immunol 2013;372:121-137.
23. Funchal GA, Jaeger N, Czepielewski RS, Machado MS, Muraro SP, Stein
RT, Bonorino CB, Porto BN. Respiratory syncytial virus fusion protein promotes
TLR-4-dependent neutrophil extracellular trap formation by human neutrophils.
PLoS One 2015;10(4):e0124082.
24. Puthothu B, Forster J, Heinzmann A, Krueger M. TLR-4 and CD14
polymorphisms in respiratory syncytial virus associated disease. Dis Markers
2006;22:303-308.
25. Lee E, Kwon JW, Kim HB, Yu HS, Kang MJ, Hong K, Yang SI, Jung YH,
Lee SH, Choi KY, Shin HL, Hong SA, Kim HY, Seo JH, Kim BJ, Lee SY, Song
DJ, Kim WK, Jang GC, Shim JY, Hong SJ. Association Between Antibiotic
94
Exposure, Bronchiolitis, and TLR4 (rs1927911) Polymorphisms in Childhood
Asthma. Allergy Asthma Immunol Res 2015;7:167-174.
26. Caballero MT, Serra ME, Acosta PL, Marzec J, Gibbons L, Salim M,
Rodriguez A, Reynaldi A, Garcia A, Bado D, Buchholz UJ, Hijano DR, Coviello
S, Newcomb D, Bellabarba M, Ferolla FM, Libster R, Berenstein A, Siniawaski
S, Blumetti V, Echavarria M, Pinto L, Lawrence A, Ossorio MF, Grosman A,
Mateu CG, Bayle C, Dericco A, Pellegrini M, Igarza I, Repetto HA, Grimaldi LA,
Gudapati P, Polack NR, Althabe F, Shi M, Ferrero F, Bergel E, Stein RT,
Peebles RS, Boothby M, Kleeberger SR, Polack FP. TLR4 genotype and
environmental LPS mediate RSV bronchiolitis through Th2 polarization. J Clin
Invest 2015;125:571-582.
27. Murawski MR, Bowen GN, Cerny AM, Anderson LJ, Haynes LM, Tripp RA,
Kurt-Jones EA, Finberg RW. Respiratory syncytial virus activates innate
immunity through Toll-like receptor 2. J Virol 2009;83:1492-1500.
28. Fan J., R. S. Frey, A. B. Malik. TLR4 signaling induces TLR2 expression in
endothelial cells via neutrophil NADPH oxidase. J Clin Investig 2003;112:1234-
1243.
29. Nuolivirta K, Vuononvirta J, Peltola V, Koponen P, Helminen M, He Q,
Korppi M. Toll-like receptor 2 subfamily genotypes are not associated with
severity of bronchiolitis or postbronchiolitis wheezing in infants. Acta Paediatr
2013;102:1160-1164.
30. Lazarus R, Klimecki WT, Raby BA, Vercelli D, Palmer LJ, Kwiatkowski DJ,
Silverman EK, Martinez F, Weiss ST. Single-nucleotide polymorphisms in the
Toll-like receptor 9 gene (TLR9): frequencies, pairwise linkage disequilibrium,
and haplotypes in three US ethnic groups and exploratory case-control disease
association studies. Genomics 2003;81:85-91.
31. Schlender J, Hornung V, Finke S, Günthner-Biller M, Marozin S, Brzózka K,
Moghim S, Endres S, Hartmann G, Conzelmann KK. Inhibition of toll-like
receptor 7- and 9-mediated alpha/beta interferon production in human
95
plasmacytoid dendritic cells by respiratory syncytial virus and measles virus. J
Virol 2005;79:5507-5515.
32. Hattori S, Shimojo N, Mashimo T, Inoue Y, Ono Y, Kohno Y, Okamoto Y,
Hata A, Suzuki Y. Relationship between RANTES polymorphisms and
respiratory syncytial virus bronchiolitis in a Japanese infant population. Jpn J
Infect Dis 2011;64:242-245.
33. Liu PT, Stenger S, Tang DH, Modlin RL. Cutting edge: vitamin D mediated
human antimicrobial activity against myocbacterium tuberculosis is dependent
on the induction of cathelicidin. J Immunol 2007;179:2060.
34. Roth DE, Shah R, Black RE, Baqui AH. Vitamin D status and acute lower
respiratory infection in early childhood in Sylhet, Bangladesh. Acta Paediatr
2010;99:389-393.
35. Belderbos ME, Houben ML, Wilbrink B, Lentjes E, Bloemen EM, Kimpen JL,
Rovers M, Bont L. Cord blood vitamin D deficiency is associated with
respiratory syncytial virus bronchiolitis. Pediatrics 2011;127:e1513-e1520.
36. McNally JD, Sampson M, Matheson LA, Hutton B, Little J. Vitamin D
receptor (VDR) polymorphisms and severe RSV bronchiolitis: a systematic
review and meta-analysis. Pediatr Pulmonol 2014;49:790-799.
37. Stoppelenburg AJ, von Hegedus JH, Huis in't Veld R, Bont L, Boes M.
Defective control of vitamin D receptor-mediated epithelial STAT1 signalling
predisposes to severe respiratory syncytial virus bronchiolitis. J Pathol
2014;232:57-64.
38. Zhou L, Xiao Q, Zhao Y, Huang A, Ren L, Liu E. The impact of viral
dynamics on the clinical severity of infants with respiratory syncytial virus
bronchiolitis. J Med Virol 2015;87:1276-1284.
39. Papadopoulos NG, Gourgiotis D, Javadyan A, Bossios A, Kallergi K,
Psarras S, Tsolia MN, Kafetzis D. Does respiratory syncytial virus subtype
influences the severity of acute bronchiolitis in hospitalized infants? Respir Med
2004;98:879-882.
96
40. Jorquera PA, Anderson L, Tripp RA. Understanding respiratory syncytial
virus (RSV) vaccine development and aspects of disease pathogenesis. Expert
Rev Vaccines 2016;15:173-187.
97
Table 1. Demographic and clinical characteristics of 181 infants, and viral type
identified in nasopharyngeal aspirate of 173 infants hospitalized with bronchiolitis.
Item Value
Birth weight (gr) 3102 (565 to 4850)
Male gender 105 (58%)
White ethnicity 130 (73.9%)
Black ethnicity 42 (23.9%)
Cesarean delivery 103 (58.2%)
Gestational age (weeks) 38 (28 to 42)
Premature birth (< 37 weeks) 38 (21%)
Age (days) 104 (14 to 622)
Infants breastfed since birth 64 (36.6%)
Infants not breastfed 64 (36.2%)
Maternal smoking during pregnancy 18 (10.2%)
Passive smoke exposure 50 (28.4%)
Mother with asthma 22 (12.4%)
Father with asthma 21 (11.9%)
Siblings with asthma 38 (21.5%)
Mother with allergic rhinitis 45 (25.6%)
Father with allergic rhinitis 27 (15.3%)
Siblings with allergic rhinitis 33 (18.6%)
Mother with atopic dermatitis 8 (4.5%)
Father with atopic dermatitis 3 (1.7%)
Siblings with atopic dermatitis 17 (9.6%)
98
Number of siblings 1 (0 to 7)
Numbers of persons in the house 4 (2 to 13)
Mold exposure 37 (21%)
Pets in the house 79 (44.9%)
Chronic respiratory disease 3 (1.7%)
Congenital heart disease 13 (7.3%)
Down syndrome 4 (2.2%)
Day care attendance 25 (14.1%)
Mothers with ≤ 9 years of education 83 (48%)
Mothers with 10 to 16 years of education 62 (35.8%)
Mothers with ≥ 17 years of education 28 (16.2%)
Length of hospital stay (days) 6.5 (1 to 64)
Length of oxygen therapy (days) 5 (1 to 63)
Intensive care unit (ICU) admission 61 (34%)
Length of ICU stay (days) 9 (2 to 37)
Need of mechanical ventilation 38 (21%)
Length of mechanical ventilation 8.5 (2 to 37)
Death 5 (2.8%)
Respiratory syncytial virus 121 (69.9)
Respiratory syncytial virus-a 91 (52.6)
Respiratory syncytial virus-b 31 (17.9)
Rhinovirus 46 (26.6)
Parainfluenza virus 6 (3.5)
Adenovirus 8 (4.6)
99
Coronavirus 3 (1.7)
Influenza virus 2 (1.2)
Bocavirus 1 (0.6)
Metapneumovirus 3 (1.7)
Enterovirus 2 (1.2)
Negative 22 (12.7)
Codetection 37 (21.4)
Data are expressed as medians (range) or frequencies (percentage)
100
Ta
ble
2.
SN
Ps
des
crip
tio
n i
ncl
ud
ing
min
or
alle
le f
req
uen
cy a
nd
Har
dy
-Wei
nb
erg
eq
uil
ibri
um
.
Gen
e
SN
Ps
An
cest
ra
l a
llele
(A
A)
Ra
re a
llele
(RA
) F
un
cti
on
al
co
nse
qu
en
ce
Am
ino
acid
AA
A
min
o a
cid
RA
G
ro
up
M
AF
H
W
TL
R4
rs
49
86
79
0
A
G
Mis
sen
se
Asp
G
ly
SA
VB
0
.09
(G
) >
0.0
5
C
on
tro
l 0
.07
(G
) >
0.0
5
rs
49
86
79
1
C
T
Mis
sen
se
Th
r Il
e S
AV
B
0.0
2 (
T)
> 0
.05
C
on
tro
l 0
.05
(T
) >
0.0
5
rs
19
27
91
1
T
C
Intr
on
var
ian
t
S
AV
B
0.3
4 (
T)
> 0
.05
C
on
tro
l 0
.33
(T
) >
0.0
5
TL
R2
rs
89
88
30
C
A
In
tro
n v
aria
nt
SA
VB
0
.34
(C
) >
0.0
5
C
on
tro
l 0
.34
(C
) >
0.0
5
rs
76
56
41
1
G
T
Do
wn
stre
am v
aria
nt
50
0B
S
AV
B
0.3
4 (
G)
> 0
.05
Co
ntr
ol
0.3
7 (
G)
> 0
.05
TL
R9
rs
35
21
62
C
T
SA
VB
0
.47
(T
) >
0.0
5
C
on
tro
l 0
.46
(T
) >
0.0
5
rs
18
70
84
C
T
U
pst
ream
var
ian
t 2
KB
S
AV
B
0.3
9 (
C)
> 0
.05
Co
ntr
ol
0.4
2 (
C)
> 0
.05
RA
NT
ES
rs
10
65
34
1
A
G
Intr
on
var
ian
t, U
TR
3 p
rim
e
S
AV
B
0.4
9 (
G)
< 0
.05
Co
ntr
ol
0.4
8 (
G)
< 0
.05
rs
21
07
53
8
T
C
Up
stre
am v
aria
nt
2K
B
SA
VB
0
.28
(T
) >
0.0
5
Co
ntr
ol
0.2
7 (
T)
> 0
.05
rs
22
80
78
8
C
G
Intr
on
var
ian
t, U
pst
ream
var
ian
t 2
KB
SA
VB
0
.43
(G
) <
0.0
5
Co
ntr
ol
0.3
8 (
G)
< 0
.05
rs
22
80
78
9
C
T
Intr
on
var
ian
t
S
AV
B
0.2
0 (
C)
> 0
.05
C
on
tro
l 0
.18
(C
) >
0.0
5
VD
R
rs1
07
35
81
0
A
G
Mis
sen
se
Met
T
hr
SA
VB
-
-
C
on
tro
l -
-
rs
22
28
57
0
A
G
Mis
sen
se
Met
T
hr
SA
VB
0
.33
(A
) >
0.0
5
C
on
tro
l 0
.33
(A
) <
0.0
5
NO
S2
rs
10
60
82
6
G
A
Sy
no
ny
mo
us
cod
on
T
hr
Th
r S
AV
B
0.3
3 (
T)
> 0
.05
C
on
tro
l 0
.35
(T
) >
0.0
5
IFN
A5
rs
10
75
72
12
A
G
S
yn
on
ym
ou
s co
do
n
Th
r T
hr
SA
VB
0
.30
(A
) >
0.0
5
C
on
tro
l 0
.30
(A
) >
0.0
5
JU
N
rs1
16
88
G
A
S
yn
on
ym
ou
s co
do
n
Gln
G
ln
SA
VB
-
-
C
on
tro
l -
-
AA
, an
cest
ral
alle
le;
RA
, ra
re a
llel
e; S
NP
, si
ngle
nucl
eoti
de
poly
morp
his
m;
MA
F,
min
or
alle
le f
requen
cy;
HW
, H
ardy
-Wei
nber
g E
quil
ibri
um
; S
AV
B,
sever
e
acute
vir
al b
ronch
ioli
tis.
101
Figure 1. Association between polymorphisms and presence of bronchiolitis for
different types of virus. RSV, respiratory syncytial virus; OR, odds ratio; CI,
confidence interval. All parameters show significant differences between or
among groups (P<0.05). Fisher’s exact test and the χ2 test were applied
considering data distribution. The MDR analysis showed no evidence of
interaction of genetic data with acute severe viral bronchiolitis for the positive
association.
All acute severe viral bronchiolitis (ASVB) patients (n= 181)ASVB patients without
comorbidities (n= 131)
Od
ds
rati
o(9
5%
CI)
102
Figure 2. Association between polymorphisms and bronchiolitis severity. OR,
odds ratio; CI, confidence interval; ICU, intensive care unit. All parameters show
significant differences between or among groups (P<0.05). Fisher’s exact test
and the χ2 test were applied considering data distribution. The MDR analysis
showed no evidence of interaction of clinical and genetic data with acute severe
viral bronchiolitis for the positive association. The OR axis is out of scale.
DeathICU admission
ASVB without comorbidities (n= 131)All acute severe viral bronchiolitis (ASVB) patients (n= 181)
Mechanical ventilationMechanical
ventilationICU
admissionLength of
oxygen use
Od
ds
rati
o(9
5%
CI)
103
Figure 3. Association between epidemiological parameters, virus type, and
bronchiolitis severity. (A) Epidemiological parameters and bronchiolitis severity.
(B) Virus infection and bronchiolitis severity. RSV, respiratory syncytial virus;
OR, odds ratio; CI, Confidence Interval; ICU, intensive care unit; 1, Mother with
atopic dermatitis; 2; Siblings with asthma; 3, Maternal education 10 to 16 years;
4, Maternal education > (or equal) 17 years; LOS, length of stay; LOU, length of
oxygen use; FN, frequency to nursery; FWAR, father with allergic rhinitis. All
parameters show significant differences between or among groups (P<0.05).
Fisher’s exact test and the χ2 test were applied considering data distribution.
The MDR analysis showed no evidence of interaction of clinical data with acute
severe viral bronchiolitis for the positive association. The OR axis is out of
scale.
ICU admission Lenght of stay Lenght of oxygen use
A
All acute severe viral bronchiolitis (ASVB) patients (n= 181)ASVB without
comorbidities (n= 131)
B
Od
ds
rati
o(9
5%
CI)
Od
ds
rati
o(9
5%
CI)
104
Supplementary table 1. Associations between polymorphisms and presence of bronchiolitis for
different types of virus.
All Patients
Polymorphism RSV
Total OR 95%CI Yes Control group
rs2107538 (CCL5) CT 48 170 218 1.646 1.054 to 2.57
CC +TT 47 274 321 1 -
Polymorphism RSV-A
Total OR 95%CI Yes Control group
rs2107538 (CCL5) CT 37 170 207 1.754 1.06 to 2.902
CC +TT 34 274 308 1 -
Polymorphism Rhinovirus
Total OR 95%CI Yes Control group
rs1060826 (NOS2) CC 23 185 208 2.649 1.309 to 5.362
CT + TT 13 277 290 1 -
Polymorphism Rhinovirus
Total OR 95%CI Yes Control group
rs1060826 (NOS2) CC + TT 28 234 262 3.410 1.522 to 7.640
CT 8 228 236 1 -
Patients without comorbidities
Polymorphism Rhinovirus
Total OR 95%CI Yes Control group
rs1060826 (NOS2)
CC 18 185 203 3.369 1.435 to 7.908
CT 5 228 233 0.244 0.091 to 0.659
TT 3 49 52 1.099 0.318 to 3.795
RSV, respiratory syncytial virus; OR, odds ratio; CI, confidence interval. All parameters show significant
differences between or among groups (P<0.05). Fisher’s exact test and the χ2 test were applied considering
the data distribution. The MDR analysis showed no evidence of interaction of genetic and viral data with
acute severe viral bronchiolitis for the positive association (data not showed).
105
Supplementary table 2. Association between polymorphisms and bronchiolitis severity.
All Patients
Polymorphism Death
Total OR 95%CI Yes No
rs4986790 (TLR4) AG 3 20 23 8.025 1.26 to 51.12
AA 2 107 109 1 -
Polymorphism ICU admission
Total OR 95%CI Yes No
rs352162 (TLR9)
CC 9 27 36 0.467 0.198 to 1.099
CT 21 47 68 0.575 0.282 to 1.172
TT 19 9 28 5.207 2.118 to 12.8
Polymorphism Mechanical ventilation
Total OR 95%CI Yes No
rs352162 (TLR9) CC + CT 11 17 28 2.718 1.103 to 6.695
TT 20 84 104 1 -
Polymorphism ICU admission
Total OR 95%CI Yes No
rs187084 (TLR9) TC 20 50 70 0.455 0.222 to 0.935
TT+CC 29 33 62 1 -
Polymorphism Mechanical ventilation
Total OR 95%CI Yes No
rs2107538 (CCL5)
CC 18 45 63 1.833 0.799 to 4.204
CT 8 52 60 0.336 0.137 to 0.825
TT 4 3 7 4.974 1.047 to 23.63
Polymorphism Death
Total OR 95%CI Yes No
rs2228570 (VDR)
CC 2 9 11 8.889 1.312 to 60.21
CT 3 63 66 1.571 0.254 to 9.719
TT 0 57 57 - -
Patients without comorbidities
Polymorphism Mechanical ventilation
Total OR 95%CI Yes No
rs1927911 (TLR4)
TT 1 12 13 0.281 0.034 to 2.299
TC 5 34 39 0.412 0.136 to 1.248
CC 14 30 44 3.578 1.238 to 10.34
Polymorphism Length of oxygen use
Total OR 95%CI > median < median
rs7656411 (TLR2)
GG 1 6 36 0.195 0.022 to 1.688
GT 25 20 68 2.5 1.093 to 5.718
TT 16 28 28 0.571 0.252 to 1.298
Polymorphism ICU admission
Total OR 95%CI Yes No
rs352162 (TLR9)
CC 6 21 27 0.473 0.169 to 1.323
CT 14 36 50 0.605 0.257 to 1.423
TT 12 7 19 4.886 1.689 to 14.13
Polymorphism Mechanical ventilation
Total OR 95%CI Yes No
rs2107538 (CCL5)
CC 10 35 45 1.143 0.426 to 3.066
CT 6 37 43 0.440 0.153 to 1.268
TT 4 3 7 6 1.221 to 29.48
106
OR, odds ratio; CI, confidence interval; ICU, intensive care unit. All parameters show significant differences
between or among groups (P<0.05). Fisher’s exact test and the χ2 test were applied considering the data
distribution. The MDR analysis showed no evidence of interaction of genetic and clinical data with acute
severe viral bronchiolitis for the positive previous association.
107
Supplementary table 3. Association between epidemiological parameters, virus type, and bronchiolitis
severity.
Epidemiological parameters – All Patients
Parameter ICU admission
Total OR 95%CI Yes No
Mother with
atopic dermatitis
Yes 5 2 7 5.529 1.039 to 29.43
No 52 115 167 1 -
Parameter Length of stay
Total OR 95%CI > median < median
Siblings with
asthma
Yes 28 9 37 4.366 1.915 to 9.956
No 57 80 137 1 -
Maternal
education
≤ 9 years 46 36 82 1.761 0.959 to 3.234
10-16 years 31 29 60 3.92 1.392 to 11.03
≥ 17 years 6 22 28 0.230 0.088 to 0.602
Parameter Length of oxygen use
Total OR 95%CI > median < median
Siblings with
asthma
Yes 26 11 37 3.818 1.741 to 8.372
No 52 84 136 1 -
Maternal
education
≤ 9 years 42 40 82 1.637 0.889 to 3.014
10-16 years 28 31 59 3.312 1.174 to 9.344
≥ 17 years 6 22 28 0.277 0.106 to 0.723
Parameter Father with allergic
rhinitis N Mean ± SD Median Min to max
Length of stay Yes 37 6.81 ± 5.10 5 1 to 25
No 147 8.99 ± 7.59 7 1 to 64
Parameter Maternal Education N Mean ± SD Median Min to max
Length of stay
≤ 9 years 82 9.62 ± 8.51 7 1 to 64
10-16 years 60 8.63 ± 6.52 7 1 to 45
≥ 17 years 28 6.11 ± 4.27 5 2 to 20
Length of oxygen use
≤ 9 years 82 8.13 ± 8.18 6 1 to 63
10-16 years 59 6.95 ± 6.09 5 1 to 41
≥ 17 years 28 4.36 ± 4.23 3 1 to 19
Parameter Length of stay N Mean ± SD Median Min to max
Number of siblings
< median 88 0.98 ± 1.05 1 0 to 5
> median 85 1.69 ± 1.45 1 0 to 7
No 171 7.17 ± 7.01 5 1 to 63
Parameter Sibling with asthma N Mean ± SD Median Min to max
Length of stay Yes 37 11.84 ± 8.17 10 1 to 45
No 137 7.80 ± 6.81 6 1 to 64
Length of oxygen use Yes 37 10.27 ± 7.67 8 1 to 41
No 136 6.20 ± 6.56 5 1 to 63
Length of ICU stay Yes 37 4.92 ± 6.54 0 0 to 24
No 137 2.39 ± 4.62 0 0 to 23
Parameter Length of stay N Mean ± SD Median Min to max
Number of people in the
house
< median 89 4.29 ± 1.51 4 2 to 13
> median 84 4.75 ± 1.31 4 3 to 10
Parameter Length of oxygen use N Mean ± SD Median Min to max
Number of siblings in the
house
< median 94 1.02 ± 1.10 1 0 to 5
> median 78 1.72 ± 1.44 1 0 to 7
Number of people in the
house
< median 95 4.27 ± 1.48 4 2 to 13
> median 77 4.82 ± 1.33 5 3 to 10
Virus – All Patients
Parameter Length of stay Total OR 95%CI
108
> median < median
RSV-B Yes 10 20 30 0.421 0.184 to 0.964
No 76 64 140 1 -
Parameter Length of oxygen use
Total OR 95%CI > median < median
RSV-B Yes 7 23 30 0.282 0.114 to 0.703
No 72 67 139 1 -
Parameter Age
Total OR 95%CI > median < median
Codetection Yes 25 12 37 2.493 1.157 to 5.372
No 61 73 134 1 -
Parameter Father with allergic rhinitis
Total OR 95%CI Yes No
Codetection Yes 11 26 37 3.067 1.275 to 7.377
No 16 116 132 1 -
Parameter Frequency to nursery
Total OR 95%CI Yes No
Codetection Yes 11 26 37 4.654 1.824 to 11.88
No 11 121 132 1 -
Parameter Codetection N Mean ± SD Median Min to max
Age (months) Yes 37 155.05 ± 85.90 144 31 to 413
No 134 133.04 ± 106.5 96.50 16 to 621
Virus - Patients without comorbidities
Parameter Length of oxygen use
Total OR 95%CI > median < median
RSV-B Yes 5 19 24 0.291 0.101 to 0.841
No 47 52 99 1 -
RSV, respiratory syncytial virus; OR, odds ratio; CI, Confidence Interval; ICU, intensive care unit; N,
number of patients, SD, standard deviation; min to max, minimum to maximum. All parameters show
significant differences between or among groups (P<0.05). Fisher’s exact test and the χ2 test were applied
considering the categorical data and Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests were used to compare
numerical data. The MDR analysis showed no evidence of interaction of clinical data with acute severe viral
bronchiolitis for the positive previous association.
109
DISCUSSÃO
Acreditamos que um grande diferencial desta pesquisa é o fato de ser o
primeiro estudo sobre a associação de polimorfismos em genes envolvidos na
resposta imune com a gravidade da bronquiolite que comparou a evolução dos
pacientes. Até agora, os estudos que analisaram a prevalência de bronquiolite
compararam pacientes com controles, e os que analisaram a gravidade da
bronquiolite compararam pacientes internados com pacientes atendidos na sala
de emergência e dispensados.
Os fatores epidemiológicos relacionados à gravidade da BVA foram
amplamente discutidos na literatura, conforme visto na introdução e em nosso
artigo de revisão (Alvarez et al., 2013). Desta forma, iremos focar a discussão
na associação entre os fatores genéticos e a prevalência e gravidade da BVA.
RECEPTORES TOLL-LIKE
A família de proteínas Toll-Like é constituída por pelo menos 10
membros de receptores de reconhecimento de padrões presentes em
macrófagos e células dendríticas, e representa uma ligação importante entre
estímulos imunes produzidos por microorganismos e o início da resposta
imunológica do hospedeiro. A interação entre o TLR4 e a proteína de fusão do
VSR leva à produção de citocinas pró-inflamatórias (interleucina 6, 8, 10, e 13,
fator de necrose tumoral, RANTES, e CX3CK1) e proteínas surfactantes.
Alguns destes fatores têm propriedades antivirais diretas, enquanto outros
estimulam a ativação de células Natural Killer, granulócitos, monócitos e
macrófagos, iniciando assim a resposta imune adaptativa (Farrag 2016 et al.;
Arruvito et al., 2015; Lambert et al., 2014; Choi et al., 2013). Uma deficiência
nos TLR pode resultar na ausência de sinais para polarização para resposta
Th1, e mudar a resposta das células T da proteção fornecida pela resposta
TH1 e pelas células T citotóxicas para uma resposta TH2 e TH17, muito menos
110
efetivas, levando a bronquiolite em lactentes suscetíveis (Farrag et al., 2016;
Arruvito et al., 2015).
Um estudo recente demonstrou que a proteína de fusão do VSR foi
capaz de induzir a formação de Neutrophil Extracellular Traps (NETs), que
imobilizam e matam agentes patogénicos, através da ativação do TLR4. A
produção excessiva de NETs contribui para a patogênese de infecções virais
respiratórias (Funchal et al., 2015).
TOLL-LIKE 4
Tal e colaboradores (2004) estudaram a presença de SNPs no gene
TLR4 rs4986790 e rs4986791 em 99 lactentes internados por BVA grave por
VSR, 82 pacientes tratados ambulatorialmente para esta doença e 90 adultos
saudáveis. Os polimorfismos no TLR4 foram mais frequentes no grupo com
BVA grave comparado aos 2 outros grupos (Tal et al., 2004). Esses achados
foram posteriormente confirmados por outro estudo (Puthothu et al.,2006). Um
estudo demonstrou que células epiteliais brônquicas humanas com os SNP
rs4986790 e rs4986791 (TLR4) não conseguiam realizar a translocação do
receptor para a superfície da célula e que células mononucleares periféricas de
crianças com esses polimorfismos apresentavam resposta diminuída ao VSR
(Tulic et al., 2007). Mandelberg e colaboradores (2006) analisando 52 crianças
com BVA por VSR (26 com tratamento ambulatorial, 21 internadas em
enfermaria e 5 internadas em unidade de terapia intensiva) verificaram que a
presença dos polimorfismos rs4986790 e rs4986791 e uma disfunção de
células mononucleares periféricas estimuladas por fitohemaglutininas,
manifestada por hiperresponsividade em resposta a lipossacárides, estava
associada a maior gravidade da doença (Mandelberg et al., 2006).
Por outro lado, Douville e colaboradores (2010) avaliaram a influência
desses mesmos polimorfismos sobre a produção de citocinas e demonstraram
que não existe nenhuma influência nesse sentido, concluindo que a
determinação dos polimorfismos do gene TLR4 não apresenta nenhum
benefício na prática clínica (Douville et al., 2010). Löfgren e colaboradores
111
(2010) estudaram 312 casos e 356 controles para avaliar a influência do SNP
rs4986790 na suscetibilidade para BVA grave por VSR e demonstraram que
esse polimorfismo não influencia a gravidade da doença (Löfgren et al., 2010).
Os autores concluem que a gravidade da BVA por VSR parece estar associada
a fatores constitucionais e ambientais. Um estudo avaliando 50 crianças
internadas com BVA também não encontrou associação (Goutaki et al., 2014).
Zhou e colaboradores (2016) em recente metanálise avaliando 6 estudos com
rs4986790 (TLR4) e 3 estudos com rs4986791 (TLR4) concluíram que não
existe associação desses polimorfismos com a gravidade da BVA; os autores
concluem porém, que são necessários novos estudos multicêntricos para
avaliar essas possíveis associações (Zhou et al., 2016). Em um estudo recente
na China foi demonstrado uma associação de outro polimorfismo, rs41426344
(TLR4), com infecção pelo VSR (Zhu et al., 2015).
Um estudo recente demonstrou que fatores ambientais interagem com o
genótipo do TLR4 para modular a gravidade da infecção pelo VSR (Caballero
et al., 2015).
Nosso estudo encontrou que a evolução a óbito por BVA está associada
ao SNP rs4986790 (TLR4), mas nenhuma associação foi observada entre a
gravidade da bronquiolite e o SNP rs1927911 (TLR4). O SNP rs1927911 foi
recentemente associado ao aumento do risco de desenvolvimento de asma em
crianças com história de bronquiolite (Lee et al., 2015). Atualmente estamos
acompanhando ambulatorialmente nossos pacientes para verificar associações
entre a gravidade da bronquiolite, o tipo de vírus e os polimorfismos com o
desenvolvimento de asma.
TOLL-LIKE 2
O TLR2 é expresso na superfície das células imunes e de tecidos, como
um complexo com o TLR1 ou com o TLR6. Em um estudo com camundongos,
demonstrou-se que o TLR2 e TLR6 em leucócitos ativavam a resposta imune
contra o VSR estimulando o Fator de Necrose Tumoral Alpha, Interleucina 6,
RANTES e outras quimiocinas, sendo importante para controlar a replicação
112
viral e promover a migração de neutrófilos e a ativação de células dendríticas in
vivo (Murawski et al., 2009). Além disso, demonstrou-se que a sinalização
através do TLR4 influencia a expressão do TLR2 a certos estímulos, sugerindo
um papel para ambos, TLR4 e TLR2, na resposta ao VSR (Fan et al., 2003).
Por outro lado, Nuolivirta e colaboradores (2013) estudando 129 crianças
internadas com BVA não encontrou associação entre polimorfismos no TLR2 e
a gravidade da BVA (Nuolivirta et al., 2013).
Em nosso estudo a evolução a óbito por bronquiolite demonstrou
associação com o SNPs rs898830 (TLR2) em pacientes sem comorbidades.
TOLL-LIKE 9
O TLR9 foi previamente associado com diferentes doenças, entre elas
asma (Lazarus et al., 2003). Adicionalmente, demonstrou-se que o VSR inibe a
produção de interferon-γ em células dendríticas plasmocíticas humanas por
sinalização através do TLR9 (Schlender et al., 2005), e aumento da resposta
Th2, o que é característico das doenças graves associadas ao VSR. Desta
forma, um envolvimento do TLR9 na genética da bronquiolite parece razoável.
Mailaparambil e colaboradores (2008) avaliaram se polimorfismos em outros
receptores Toll-like, além do TLR4, poderiam estar relacionados a
susceptibilidade a BVA por VSR, desta forma avaliaram 19 polimorfismos nos
receptores Toll-like 1, 2, 3, 5, 6, 9 e 10. Houve associação entre o SNP
rs5743836 (TLR9) e infecção pelo VSR (Mailaparambil et al., 2008).
No presente estudo os SNPs rs352162 (TLR9) e rs187084 (TLR9) foram
associados à necessidade de admissão na UTI, e o SNP rs352162 também foi
associado à necessidade de ventilação mecânica.
RANTES
Durante a infecção pelo VSR o aumento da atividade das quimiocinas
estimula o recrutamento e a infiltração de células para o local da inflamação.
RANTES é uma quimioquina produzida por linfócitos T CD8, macrófagos,
plaquetas e células epiteliais que atrai monócitos, eosinófilos, basófilos e
113
linfócitos T de memória para a área da infecção. É altamente expresso em
células epiteliais respiratórias, secreções nasais, e lavado bronco-alveolar de
indivíduos infectados com VSR.
Um estudo relatou uma associação entre SNPs rs2107538 e rs2280788
na região promotora e rs2280789 no intron 1 do RANTES com bronquiolite por
VSR (Hattori et al., 2011). Amanatidou e colaboradores (2008) avaliaram 106
crianças hospitalizadas por BVA por VSR e 120 controles (adultos saudáveis
sem histórico de infeção respiratória grave) para verificar a associação desses
3 polimorfismos com a gravidade da doença. Não houve associação entre a
gravidade da doença e os polimorfismos isoladamente, mas os 3 polimorfismos
combinados, formando haplótipo gênico, eram mais comuns nos casos que
nos controles, desta forma os autores concluem que existe associação entre
polimorfismos no gene RANTES e a gravidade da BVA por VSR (Amantidou et
al., 2008).
No presente estudo o SNP rs2107538 (RANTES) foi associado com a
necessidade de ventilação mecânica.
RECEPTOR DE VITAMINA D
A vitamina D modula a proliferação de leucócitos e a maturação e
expressão de citocinas através do receptor de vitamina D (VDR) em linfócitos e
macrófagos. A sinalização através do VDR também contribui para a expressão
de peptídeos anti-microbianos, que são importantes para a defesa inata contra
vírus e bactérias (Liu et al., 2007). Níveis baixos de vitamina D têm sido
descritos como fator de risco para doenças respiratórias baseado na
sazonalidade bem estabelecida de infecções respiratórias que ocorrem durante
o inverno, quando a produção de vitamina D pelos raios ultravioletas B é baixa.
Pesquisa com bronquiolite em países desenvolvidos que investigaram a
deficiência subclínica de vitamina D confirmam essa hipótese (Roth et al.,
2010). Além disso, três estudos de coorte prospectivos com recém-nascidos
identificaram que níveis baixos de vitamina D no sangue de cordão umbilical
representam um fator preditivo independente de infecção por VSR durante o
114
primeiro ano de vida (Mohamed et al., 2013; Belderbos et al., 2011; Camargo et
al., 2011).
As alterações genéticas do VDR têm o potencial de afetar a sinalização
da vitamina D através da transcrição genética deficiente, a estabilidade e a
transcrição do RNA mensageiro, e a atividade e estabilidade da proteína. O
SNP rs2228570 (VDR), foi previamente associado com baixa atividade de
transcrição do VDR, e uma metanálise recente concluiu que a presença do
alelo minor rs2228570 aumentou significativamente o risco de bronquiolite por
VSR (McNally et al., 2014).
Nas células epiteliais das vias respiratórias, a vitamina D controla a
expressão do transdutor de sinal e ativador de transcrição (STAT) 1. Um
estudo demonstrou que a predisposição de pacientes com SNP rs2228570
(VDR) para bronquiolite grave por VSR pode envolver a diminuição da
capacidade da vitamina D conter sinalização antiviral no epitélio das vias
aéreas, e que a vitamina D não consegue regular a fosforilação de STAT1 e
diminuir a expressão gênica nas células que expressam esta variante do VDR.
Ativação intensa da via de STAT1 em células infectadas com VSR pode,
portanto, contribuir para a imunopatogenese da infecção pelo VSR
(Stoppelenburg et al., 2014). Dois estudos verificaram que o SNP no receptor
da Vitamina D (rs10735810) estava associado com a propensão a ter BVA,
sendo que os portadores do polimorfismo do alelo T minor tinham maior
propensão a desenvolver essa doença (Kresfelder et al., 2011; Roth et al.,
2008). Janssen e colaboradores (2007) analisaram 384 polimorfismos de
nucleotídeos únicos em 470 crianças hospitalizadas por BVA por VSR e 1008
controles e verificaram que os polimorfismos nos genes da resposta imune
inata no receptor da Vitamina D (rs10735810), JUN (rs11688), IFNA5
(rs10757212) e NOS2 (rs1060826) demonstraram forte associação com BVA,
os autores concluíram que SNPs nos genes da resposta imune inata são
importantes em determinar a susceptibilidade para essa doença (Janssen et
al., 2007).
O presente estudo demonstrou que o SNP rs2228570 foi associado à
evolução à óbito nos pacientes com bronquiolite.
115
ETIOLOGIA
Sanches-Luna e colaboradores (2016) em um estudo retrospectivo com
122.832 pacientes internados com BVA demonstraram que a mortalidade foi
maior nos pacientes com VSR quando comparados a pacientes com outras
etiologias (Sanches-Luna et al., 2016). Um estudo multicêntrico prospectivo
demonstrou que o escore de gravidade da BVA e o tempo de internação foi
maior nos pacientes com VSR do que naqueles com outros vírus (Bamberger
et al., 2012). Outros estudos tem demonstrado que na BVA o VSR leva a maior
risco de internação (Al-Shawwa et al., 2007), maior tempo de internação e de
oxigenoterapia (Hervás et al., 2012; Garcia et al., 2010), maior risco de
admissão em UTI (Hervás et al., 2012; Calvo et al., 2010; Garcia et al., 2010) e
maior risco de necessitar de ventilação mecânica (Papoff et al., 2011; Garcia et
al., 2010) quando comparado a outros vírus. Um estudo em nosso meio
demonstrou que uma oximetria de pulso menor que 90% na admissão
hospitalar por infecção de vias aéreas inferiores estava associada a infecção
por VSR (Riccetto et al., 2006).
Algumas pesquisas porém, demonstraram que o VSR não leva a maior
gravidade do quadro se comparado a outros vírus, como o estudo prospectivo
com 484 internadas por BVA de Ricart e colaboradores (2013), onde foi
demonstrado que o tipo de vírus não influenciava na gravidade. O estudo de
Weigl e colaboradores (2004) chegou às mesmas conclusões (Weigl et al.,
2004). Em nosso meio um estudo com 89 pacientes internados demonstrou
que não houve diferença na gravidade entre os pacientes que apresentaram
VSR e os que não apresentaram esse vírus (D’elia et al., 2005).
Em relação a diferença da gravidade da BVA causada pelo VSR subtipo
A quando comparada ao VSR subtipo B um estudo recente analisou 60
crianças hospitalizadas com bronquiolite e não encontrou diferenças
significativas nos fatores demográficos, características clínicas, ou gravidade
da doença entre crianças com esses 2 subtipos (Zhou et al., 2015). Outro
estudo avaliou 81 pacientes internados por BVA por VSR e não encontrou
diferença entre o VSR subtipo A e subtipo B em relação à frequência
116
respiratória, duração da internação, necessidade de admissão na UTI e
necessidade de ventilação mecânica (Fodha et al., 2007). Por outro lado, um
estudo em nosso meio com 128 pacientes com BVA demonstrou que os
pacientes com VSR subtipo A tinham maior risco de necessitar de internação
do que os pacientes com VSR subtipo B (Oliveira et al., 2008). Outro estudo
não encontrou diferença na duração da hospitalização ou necessidade de UTI
em crianças infectadas com VSR subtipo A comparadas aos infectados com
VSR subtipo B, mas crianças com VSR subtipo A tinham um escore clínico
significativamente maior, apoiando a noção de que a bronquiolite causada pelo
VSR subtipo A é mais grave do que a causada pelo VSR subtipo B
(Papadopoulos et al., 2004).
Nosso estudo demonstrou que a infecção causada pelo VSR subtipo B,
quando comparada a outros vírus, foi associada a uma menor duração da
internação e menor duração da oxigenoterapia, indicando uma menor
gravidade da doença para este subtipo de vírus.
CODETECÇÃO VIRAL
Existe controvérsia na literatura em relação à codetecção viral
representar um fator de risco para a gravidade da BVA. Um estudo
retrospectivo com 2.147 crianças internadas por BVA por VSR demonstrou que
a presença de coinfecção viral por VSR e Adenovírus estava associada a maior
gravidade (Rodriguez et al., 2014). Outro estudo avaliou 180 pacientes
internados por BVA e verificou que o risco de ser admitido na UTI era maior
para os pacientes que apresentavam coinfecção viral (Richard et al., 2008). Em
nosso meio, um estudo com 260 pacientes com BVA encontrou codeteccão em
65% dos casos e os pacientes que apresentavam codetecção do VSR e
Rinovírus tiveram maior tempo de internação e de oxigenoterapia (da Silva et
al., 2013). Uma pesquisa demonstrou que o risco de ser admitido em UTI e
necessitar ventilação mecânica era maior nos pacientes que apresentavam
coinfecção por VSR e Metapneumovírus (Semple et al., 2005).
117
Por outro lado, Ricart e colaboradores (2013) em um estudo prospectivo
com 484 internadas por BVA demonstraram que a coinfecção viral não estava
associada a maior gravidade (Ricart et al., 2013). Um estudo em nosso meio
avaliou 176 pacientes com infecção por VSR, dos quais 121 apresentavam
infecção única por VSR e 55 apresentavam coinfecção do VSR com algum
outro vírus, os desfechos avaliados foram tempo total de internação, duração
da oxigenoterapia, admissão em UTI e uso de ventilação mecânica. Os quatro
desfechos de gravidade avaliados foram semelhantes entre o grupo com
infecção única por VSR e os grupos com coinfecções, independente do tipo de
vírus associado com o VSR, os autores concluem que as coinfecções virais
não parecem alterar o prognóstico de lactentes hospitalizados com infecção
aguda por VSR (De Paulis et al., 2011). Outro estudo avaliou 142 pacientes
com diagnóstico de BVA, em 41% dos casos houve identificação de mais de
um vírus no aspirado nasofaríngeo, não houve porém, associação entre a
identificação de múltiplos vírus e a gravidade da doença (Brand et al., 2012).
Da mesma forma, outro estudo em nosso meio, com 77 lactentes com BVA,
dos quais 40% apresentaram coinfecção, demonstrou que a presença de mais
de um vírus não estava relacionada a um desfecho pior (Nascimento et al.,
2010).
Nosso estudo demonstrou que a codetecção viral não foi associada a
uma evolução mais grave da BVA.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Compreender a influência dos polimorfismos dos genes da resposta
imune na patogênese da BVA causada pelo VSR poderá trazer diversas
contribuições. Entre elas podemos destacar a possibilidade de identificar de
maneira mais eficiente os lactentes que apresentam risco para evolução mais
grave da BVA e de desenvolver formas mais eficientes de tratamento (Rämet et
al., 2011). Além disso, esse conhecimento é essencial para o desenvolvimento
de novas vacinas contra o VSR, o que é uma alta prioridade para a saúde
pública, mas cujas tentativas até agora tem sido frustrantes (Higgins et al.,
118
2016; Farrag et al., 2016; Esposito et al., 2016; Jorquera et al., 2016, Graham
et al., 2016, Heikkinen, 2016; Arruvito et al., 2015). Por último, o conhecimento
das características genéticas que estão relacionadas a gravidade das infecções
por VSR pode contribuir no entendimento dos motivos pelos quais essas
infecções aumentam o risco de desenvolvimento de Asma, e ajudar a
esclarecer se as infecções pelo VSR e a Asma apresentam uma etiologia
genética comum (Larkin et al., 2015).
119
CONCLUSÃO
Nossos achados indicam que a variabilidade nos genes da resposta
imune contribui para a gravidade da BVA. A determinação dos polimorfismos
nos genes da resposta imune poderá ser utilizada em pesquisas futuras para
ajudar a determinar quais são os lactentes de maior risco e que poderiam se
beneficiar de medidas preventivas. O conhecimento dos polimorfismos
associados à gravidade da BVA vai contribuir para entender melhor a
patogênese da doença e da resposta imune a essa infecção, o que poderá ser
útil em guiar esforços para desenvolver terapias mais efetivas para essa
infecção potencialmente fatal e vacinas eficazes contra o VSR.
120
REFERÊNCIAS
Albernaz EP, Menezes AM, César JA, Victora CG, Barros FC, Halpern R. Risk
factors associated with hospitalization for bronchiolitis in the post-neonatal
period. Rev Saude Publica. 2003;37(4):485-93.
Al-Shawwa B, Al-Huniti N, Weinberger M, Abu-Hasan M. Clinical and
therapeutic variables influencing hospitalisation for bronchiolitis in a community-
based paediatric group practice. Prim Care Respir J. 2007;16(2):93-7.
Al-Shehri MA, Sadeq A, Quli K. Bronchiolitis in Abha, Southwest Saudi Arabia:
viral etiology and predictors for hospital admission. West Afr J Med.
2005;24(4):299-304.
Alvarez AE, Marson FA, Bertuzzo CS, Arns CW, Ribeiro JD. Epidemiological
and genetic characteristics associated with the severity of acute viral
bronchiolitis by respiratory syncytial virus. J Pediatr (Rio J) 2013;89:531-543.
Amanatidou V, Sourvinos G, Apostolakis S, Neonaki P, Tsilimigaki A,
Krambovitis E, Spandidos DA. RANTES promoter gene polymorphisms and
susceptibility to severe respiratory syncytial virus-induced bronchiolitis. Pediatr
Infect Dis J. 2008;27(1):38-42.
Arruvito L, Raiden S, Geffner J. Host response to respiratory syncytial virus
infection. Curr Opin Infect Dis 2015;28:259-266.
Azkur D, Özaydın E, Dibek-Mısırlıoğlu E, Vezir E, Tombuloğlu D, Köse G,
Kocabaş CN. Viral etiology in infants hospitalized for acute bronchiolitis. Turk J
Pediatr. 2014;56(6):592-6.
121
Balekian DS, Linnemann RW, Castro VM, Perlis R, Thadhani R, Camargo CA
Jr . Pre-birth cohort study of atopic dermatitis and severe bronchiolitis. Pediatr
Allergy Immunol. 2016;27(4):413-8.
Bamberger E, Srugo I, Abu Raya B, Segal E, Chaim B, Kassis I, Kugelman A,
Miron D. What is the clinical relevance of respiratory syncytial virus
bronchiolitis?: findings from a multi-center, prospective study. Eur J Clin
Microbiol Infect Dis. 2012;31:3323–3330.
Belderbos ME, Houben ML, Wilbrink B, Lentjes E, Bloemen EM, Kimpen JL,
Rovers M, Bont L. Cord blood vitamin D deficiency is associated with
respiratory syncytial virus bronchiolitis. Pediatrics 2011;127: e1513-e1520.
Bloemers BL, van Furth AM, Weijerman ME, Gemke RJ, Broers CJ, van den
Ende K, Kimpen JL, Strengers JL, Bont LJ. Down syndrome: a novel risk factor
for respiratory syncytial virus bronchiolitis--a prospective birth-cohort study.
Pediatrics. 2007;120(4):e1076-81.
Bonillo Perales A, DíezDelgado Rubio J, Ortega Montes A, Infante Márquez P,
Jiménez Liria M, Batlles Garrido J, López Muñoz J. [Perinatal history and
hospitalization for bronchiolitis. A comparison with the impact-RSV Study
Group]. An Esp Pediatr. 2000;53(6):527-32.
Bradley JP, Bacharier LB, Bonfiglio J, Schechtman KB, Strunk R, Storch G,
Castro M. Severity of respiratory syncytial virus bronchiolitis is affected by
cigarette smoke exposure and atopy. Pediatrics. 2005;115(1):e7-14.
Brand HK, de Groot R, Galama JM, Brouwer ML, Teuwen K, Hermans PW,
Melchers WJ, Warris A. Infection with multiple viruses is not associated with
increased disease severity in children with bronchiolitis. Pediatr Pulmonol.
2012;47(4):393-400.
122
Caballero MT, Serra ME, Acosta PL, Marzec J, Gibbons L, Salim M, Rodriguez
A, Reynaldi A, Garcia A, Bado D, Buchholz UJ, Hijano DR, Coviello S,
Newcomb D, Bellabarba M, Ferolla FM, Libster R, Berenstein A, Siniawaski S,
Blumetti V, Echavarria M, Pinto L, Lawrence A, Ossorio MF, Grosman A, Mateu
CG, Bayle C, Dericco A, Pellegrini M, Igarza I, Repetto HA, Grimaldi LA,
Gudapati P, Polack NR, Althabe F, Shi M, Ferrero F, Bergel E, Stein RT,
Peebles RS, Boothby M, Kleeberger SR, Polack FP. TLR4 genotype and
environmental LPS mediate RSV bronchiolitis through Th2 polarization. J Clin
Invest 2015;125:571-582.
Calvo C, Pozo F, García-García ML, Sanchez M, Lopez-Valero M, Pérez-Breña
P, Casas I. Detection of new respiratory viruses in hospitalized infants with
bronchiolitis: a three-year prospective study. Acta Paediatr. 2010;99(6):883-7.
Camargo CA, Ingham T, Wickens K, et al. Cord-blood 25-hydroxyvitamin D
levels and risk of respiratory infection, wheezing, and asthma. Pediatrics
2011;127:e180–e187.
Carroll KN, Gebretsadik T, Griffin MR, Dupont WD, Mitchel EF, Wu P, Enriquez
R, Hartert TV. Maternal asthma and maternal smoking are associated with
increased risk of bronchiolitis during infancy. Pediatrics. 2007;119(6):1104-12.
Carroll KN, Gebretsadik T, Griffin MR, Wu P, Dupont WD, Mitchel EF, Enriquez
R, Hartert TV. Increasing burden and risk factors for bronchiolitis-related
medical visits in infants enrolled in a state health care insurance plan.
Pediatrics. 2008;122(1):58-64.
Carroll KN , Gebretsadik T, Minton P, Woodward K, Liu Z, Miller EK, Williams
JV, Dupont WD, Hartert TV. Influence of maternal asthma on the cause and
severity of infant acute respiratory tract infections. J Allergy Clin Immunol.
2012;129(5):1236-42.
123
Chan PW, Lok FY, Khatijah SB. Risk factors for hypoxemia and respiratory
failure in respiratory syncytial virus bronchiolitis. Southeast Asian J Trop Med
Public Health. 2002;33(4):806-10.
Chatzimichael A, Tsalkidis A, Cassimos D, Gardikis S, Tripsianis G, Deftereos
S, Ktenidou-Kartali S, Tsanakas I. The role of breastfeeding and passive
smoking on the development of severe bronchiolitis in infants. Minerva Pediatr.
2007;59(3):199-206.
Che D, Nicolau J, Bergounioux J, Perez T, Bitar D. Bronchiolitis among infants
under 1 year of age in France: Epidemiology and factors associated with
mortality. Arch Pediatr. 2012;19(7):700-6.
Choi EH, Lee HJ, Chanock SJ. Human genetics and respiratory syncytial virus
disease: current findings and future approaches. Curr Top Microbiol Immunol
2013;372:121-137.
Choudhuri JA, Ogden LG, Ruttenber AJ, Thomas DS, Todd JK, Simoes EA.
Effect of altitude on hospitalizations for respiratory syncytial virus infection.
Pediatrics. 2006;117(2):349-56.
Chu PY, Hornik CP, Li JS, Campbell MJ, Hill KD . Respiratory syncytial virus
hospitalisation trends in children with haemodynamically significant heart
disease, 1997-2012. Cardiol Young. 2016;10:1-10.
Constantopoulos AG, Kafetzis DA, Syrogiannopoulos GA, Roilides EJ, Malaka-
Zafiriu EE, Sbyrakis SS, Marcopoulos ML. Burden of respiratory syncytial viral
infections on paediatric hospitals: a two-year prospective epidemiological study.
Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2002;21(2):102-7.
da Silva ER, Pitrez MC, Arruda E, Mattiello R, Sarria EE, de Paula FE,
Proença-Modena JL, Delcaro LS, Cintra O, Jones MH, Ribeiro JD, Stein RT.
124
Severe lower respiratory tract infection in infants and toddlers from a non-
affluent population: viral etiology and co-detection as risk factors. BMC Infect
Dis. 2013;13:41.
Damore D, Mansbach JM, Clark S, Ramundo M, Camargo CA Jr. Prospective
multicenter bronchiolitis study: predicting intensive care unit admissions. Acad
Emerg Med. 2008;15(10):887-94.
D'Elia C, Siqueira MM, Portes SA, Sant'Anna CC. [Respiratory syncytial virus --
associated lower respiratory tract infections in hospitalized infants]. Rev Soc
Bras Med Trop. 2005;38(1):7-10.
De Paulis M, Gilio AE, Ferraro AA, Ferronato AE, do Sacramento PR, Botosso
VF, de Oliveira DB, Marinheiro JC, Hársi CM, Durigon EL, Vieira SE. Severity of
viral coinfection in hospitalized infants with respiratory syncytial virus infection. J
Pediatr (Rio J). 2011;87(4):307-13.
Dornelles CT, Piva JP, Marostica PJ. Nutritional status, breastfeeding, and
evolution of Infants with acute viral bronchiolitis. J Health Popul Nutr.
2007;25(3):336-43.
Douville RN, Lissitsyn Y, Hirschfeld AF, Becker AB, Kozyrskyj AL, Liem J,
Bastien N, Li Y, Victor RE, Sekhon M, Turvey SE, HayGlass KT. TLR4
Asp299Gly and Thr399Ile polymorphisms: no impact on human immune
responsiveness to LPS or respiratory syncytial virus. PLoS One.
2010;5(8):e12087.
Esposito S, Scarselli E, Lelii M, Scala A, Vitelli A, Capone S, Fornili M, Biganzoli
E, Orenti A, Nicosia A, Cortese R, Principi N. Antibody response to respiratory
syncytial virus infection in children <18 months old. Hum Vaccin Immunother.
2016;22:1-7.
125
Fan J., R. S. Frey, A. B. Malik. TLR4 signaling induces TLR2 expression in
endothelial cells via neutrophil NADPH oxidase. J. Clin. Investig
2003;112:1234-1243.
Farrag MA, Almajhdi FN. Human Respiratory Syncytial Virus: Role of Innate
Immunity in Clearance and Disease Progression. Viral Immunol 2016;29:11-26.
Fjaerli HO, Farstad T, Bratlid D. Hospitalisations for respiratory syncytial virus
bronchiolitis in Akershus, Norway, 1993-2000: a population-based retrospective
study. BMC Pediatr. 2004;4(1):25.
Flores P, Rebelo-de-Andrade H, Gonçalves P, Guiomar R, Carvalho C, Sousa
EN, Noronha FT, Palminha JM. Bronchiolitis caused by respiratory syncytial
virus in an area of portugal: epidemiology, clinical features, and risk factors. Eur
J Clin Microbiol Infect Dis. 2004;23(1):39-45.
Fodha I, Vabret A, Ghedira L, Seboui H, Chouchane S, Dewar J, Gueddiche N,
Trabelsi A, Boujaafar N, Freymuth F. Respiratory syncytial virus infections in
hospitalized infants: association between viral load, virus subgroup, and
disease severity. J Med Virol. 2007;79(12):1951-8.
Fryzek JP, Martone WJ, Groothuis JR. Trends in chronologic age and infant
respiratory syncytial virus hospitalization: an 8-year cohort study. Adv Ther.
2011;28(3):195-201.
Funchal GA, Jaeger N, Czepielewski RS, Machado MS, Muraro SP, Stein RT,
Bonorino CB, Porto BN. Respiratory syncytial virus fusion protein promotes
TLR-4-dependent neutrophil extracellular trap formation by human neutrophils.
PLoS One 2015;10(4):e0124082.
126
Garcia CG, Bhore R, Soriano-Fallas A, Trost M, Chason R, Ramilo O, Mejias A.
Risk factors in children hospitalized with RSV bronchiolitis versus non-RSV
bronchiolitis. Pediatrics. 2010;126(6):e1453-60.
García ML, Ordobás Gabin M, Calvo Reya C, González Alvarez M, Aguilar Ruiz
J, Arregui Sierra A, Pérez Breña P. [Viral infection of the lower respiratory tract
in hospitalized infants: etiology, clinical features and risk factors]. An Esp
Pediatr. 2001;55(2):101-7.
Gola D, Mahachie John JM, van Steen K, König IR. A roadmap to multifactor
dimensionality reduction methods. Brief Bioinform. 2016;17:293-308.
Goutaki M, Haidopoulou K, Pappa S, Tsakiridis P, Frydas E, Eboriadou M,
Hatzistylianou M. The role of TLR4 and CD14 polymorphisms in the
pathogenesis of respiratory syncytial virus bronchiolitis in greek infants. Int J
Immunopathol Pharmacol 2014;27:563-572.
Gouyon JB, Rozé JC, Guillermet-Fromentin C, Glorieux I, Adamon L, DI Maio
M, Miloradovich T, Anghelescu D, Pinquier D, Escande B, Elleau C.
Hospitalizations for respiratory syncytial virus bronchiolitis in preterm infants at
<33 weeks gestation without bronchopulmonary dysplasia: the CASTOR study.
Epidemiol Infect. 2012;15:1-11.
Graham BS. Vaccines against respiratory syncytial virus: The time has finally
come. Vaccine. 2016;34(30):3535-41.
Granbom E, Fernlund E, Sunnegårdh J, Lundell B, Naumburg E. Respiratory
Tract Infection and Risk of Hospitalization in Children with Congenital Heart
Defects During Season and Off-Season: A Swedish National Study. Pediatr
Cardiol. 2016 Apr 19. [Epub ahead of print]
127
Green CA, Yeates D, Goldacre A, Sande C, Parslow RC, McShane P, Pollard
AJ, Goldacre MJ. Admission to hospital for bronchiolitis in England: trends over
five decades, geographical variation and association with perinatal
characteristics and subsequent asthma. Arch Dis Child. 2016;101(2):140-6.
Grimwood K, Cohet C, Rich FJ, Cheng S, Wood C, Redshaw N, Cunningham
CW, Pearce N, Kirman JR. Risk factors for respiratory syncytial virus
bronchiolitis hospital admission in New Zealand. Epidemiol Infect.
2008;136(10):1333-41.
Groothuis JR, Fryzek JP, Makari D, Steffey D, Martone WJ. Respiratory
syncytial virus hospitalization trends in infants with chronic lung disease of
infancy, 1998-2008. Clin Epidemiol. 2011;3:245-50.
Gurgel RQ , Bezerra PG, Duarte Mdo C, Moura AÁ, Souza EL, Silva LS, Suzuki
CE, Peixoto RB. Relative frequency, Possible Risk Factors, Viral Codetection
Rates, and Seasonality of Respiratory Syncytial Virus Among Children With
Lower Respiratory Tract Infection in Northeastern Brazil. Medicine (Baltimore).
2016;95(15):e3090.
Haerskjold A, Kristensen K, Kamper-Jørgensen M, Nybo Andersen AM, Ravn
H, Graff Stensballe L. Risk Factors for Hospitalization for Respiratory Syncytial
Virus. Pediatr Infect Dis J. 2016;35(1):61-5.
Hall CB, Weinberg GA, Iwane MK, Blumkin AK, Edwards KM, Staat MA,
Auinger P, Griffin MR, Poehling KA, Erdman D, Grijalva CG, Zhu Y, Szilagyi P.
The burden of respiratory syncytial virus infection in young children. N Engl J
Med 2009;360:588-598.
Harris KC, Anis AH, Crosby MC, Cender LM, Potts JE, Human DG. Economic
evaluation of palivizumab in children with congenital heart disease: a Canadian
perspective. Can J Cardiol. 2011;27(4):523.e11-5.
128
Hasegawa K, Pate BM, Mansbach JM, Macias CG, Fisher ES, Piedra PA,
Espinola JA, Sullivan AF, Camargo CA Jr. Risk factors for requiring intensive
care among children admitted to ward with bronchiolitis. Acad Pediatr.
2015;15(1):77-81.
Hattori S, Shimojo N, Mashimo T, Inoue Y, Ono Y, Kohno Y, Okamoto Y, Hata
A, Suzuki Y. Relationship between RANTES polymorphisms and respiratory
syncytial virus bronchiolitis in a Japanese infant population. Jpn J Infect Dis
2011;64:242-245.
Heikkinen T. Respiratory viruses and children. J Infect. 2016;72 Suppl:S29-33
Helfrich AM, Nylund CM, Eberly MD, Eide MB, Stagliano DR . Healthy Late-
preterm infants born 33-36+6 weeks gestational age have higher risk for
respiratory syncytial virus hospitalization. Early Hum Dev. 2015;91(9):541-6.
Hervás D, Reina J, Yañez A, Del Valle JM, Figuerola J, Hervás JA.
Epidemiology of hospitalization for acute bronchiolitis in children: differences
between RSV and non-RSV bronchiolitis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis.
2012;31(8):1975-81.
Higgins D, Trujillo C, Keech C. Advances in RSV vaccine research and
development - A global agenda. Vaccine. 2016;34(26):2870-5.
Janssen R, Bont L, Siezen CL, Hodemaekers HM, Ermers MJ, Doornbos G,
van 't Slot R, Wijmenga C, Goeman JJ, Kimpen JL, van Houwelingen HC,
Kimman TG, Hoebee B. Genetic susceptibility to respiratory syncytial virus
bronchiolitis is predominantly associated with innate immune genes. J Infect
Dis. 2007;196(6):826-34.
129
Jansson L, Nilsson P, Olsson M. Socioeconomic environmental factors and
hospitalization for acute bronchiolitis during infancy. Acta Paediatr.
2002;91(3):335-8.
Jeena PM, Ayannusi OE, Annamalai K, Naidoo P, Coovadia HM, Guldner P.
Risk factors for admission and the role of respiratory syncytial virus-specific
cytotoxic T-lymphocyte responses in children with acute bronchiolitis. S Afr Med
J. 2003;93(4):291-4.
Jones LL, Hashim A, McKeever T, Cook DG, Britton J, Leonardi-Bee J. Parental
and household smoking and the increased risk of bronchitis, bronchiolitis and
other lower respiratory infections in infancy: systematic review and meta-
analysis. Respir Res. 2011;12:5.
Jorquera PA, Anderson L, Tripp RA. Understanding respiratory syncytial virus
(RSV) vaccine development and aspects of disease pathogenesis. Expert Rev
Vaccines 2016;15:173-187.
Jung JW. Respiratory syncytial virus infection in children with congenital heart
disease: global data and interim results of Korean RSV-CHD survey. Korean J
Pediatr. 2011;54(5):192-6.
Karr C, Lumley T, Schreuder A, Davis R, Larson T, Ritz B, Kaufman J. Effects
of subchronic and chronic exposure to ambient air pollutants on infant
bronchiolitis. Am J Epidemiol. 2007;165(5):553-60.
Koehoorn M, Karr CJ, Demers PA, Lencar C, Tamburic L, Brauer M. Descriptive
epidemiological features of bronchiolitis in a population-based cohort.
Pediatrics. 2008;122(6):1196-203.
Kresfelder TL, Janssen R, Bont L, Venter M. Confirmation of an association
between single nucleotide polymorphisms in the VDR gene with respiratory
130
syncytial virus related disease in South African children. J Med Virol.
2011;83(10):1834-40.
Lambert L, Sagfors AM, Openshaw PJ, Culley FJ. Immunity to RSV in Early-
Life. Front Immunol 2014;5:466.
Lanari M, Prinelli F, Adorni F, Di Santo S, Vandini S, Silvestri M, Musicco M;
Study Group of Italian Society of Neonatology on Risk Factors for RSV
Hospitalization. Risk factors for bronchiolitis hospitalization during the first year
of life in a multicenter Italian birth cohort. Ital J Pediatr. 2015 May;41:40.
Lanari M, Vandini S, Prinelli F, Adorni F, Di Santo S, Silvestri M, Musicco M.
Exposure to vehicular traffic is associated to a higher risk of hospitalization for
bronchiolitis during the first year of life. Minerva Pediatr. 2015 Sep 18. [Epub
ahead of print]
Lanari M, Vandini S, Adorni F, Prinelli F, Di Santo S, Silvestri M, Musicco M;
Study Group of Italian Society of Neonatology on Risk Factors for RSV
Hospitalization. Prenatal tobacco smoke exposure increases hospitalizations for
bronchiolitis in infants. Respir Res. 2015 Dec;16:152.
Larkin EK, Hartert TV. Genes associated with RSV lower respiratory tract
infection and asthma: the application of genetic epidemiological methods to
understand causality. Future Virol. 2015;10(7):883-897.
Lazarus R, Klimecki WT, Raby BA, Vercelli D, Palmer LJ, Kwiatkowski DJ,
Silverman EK, Martinez F, Weiss ST. Single-nucleotide polymorphisms in the
Toll-like receptor 9 gene (TLR9): frequencies, pairwise linkage disequilibrium,
and haplotypes in three US ethnic groups and exploratory case-control disease
association studies. Genomics 2003;81:85-91.
131
Leader S, Kohlhase K. Recent trends in severe respiratory syncytial virus (RSV)
among US infants, 1997 to 2000. J Pediatr. 2003;143(5 Suppl):S127-32.
Lee E, Kwon JW, Kim HB, Yu HS, Kang MJ, Hong K, Yang SI, Jung YH, Lee
SH, Choi KY, Shin HL, Hong SA, Kim HY, Seo JH, Kim BJ, Lee SY, Song DJ,
Kim WK, Jang GC, Shim JY, Hong SJ. Association Between Antibiotic
Exposure, Bronchiolitis, and TLR4 (rs1927911) Polymorphisms in Childhood
Asthma. Allergy Asthma Immunol Res 2015;7:167-174.
Liu PT, Stenger S, Tang DH, Modlin RL. Cutting edge: vitamin D mediated
human antimicrobial activity against myocbacterium tuberculosis is dependent
on the induction of cathelicidin. J Immunol 2007;179:2060.
Löfgren J, Marttila R, Renko M, Rämet M, Hallman M. Toll-like receptor 4
Asp299Gly polymorphism in respiratory syncytial virus epidemics. Pediatr
Pulmonol. 2010;45(7):687-92.
López Guinea A, Casado Flores J, Martín Sobrino MA, Espínola Docio B, de la
Calle Cabrera T, Serrano A, García Teresa MA. [Severe bronchiolitis.
Epidemiology and clinical course of 284 patients]. An Pediatr (Barc).
2007;67(2):116-22.
Lucion MF, Juarez Mdel V, Viegas M, Castellano V, Romanin VS, Grobaporto
M, Bakir J, Mistchenko AS, Gentile A . Respiratory syncytial virus: clinical and
epidemiological pattern in pediatric patients admitted to a children's hospital
between 2000 and 2013. Arch Argent Pediatr. 2014;112(5):397-404.
Mailaparambil B, Krueger M, Heinze J, Forster J, Heinzmann A. Polymorphisms
of toll like receptors in the genetics of severe RSV associated diseases. Dis
Markers. 2008;25(1):59-65.
132
Mandelberg A, Tal G, Naugolny L, Cesar K, Oron A, Houri S, Gilad E, Somekh
E. Lipopolysaccharide hyporesponsiveness as a risk factor for intensive care
unit hospitalization in infants with respiratory syncitial virus bronchiolitis. Clin
Exp Immunol. 2006;144(1):48-52.
McConnochie K.M. Bronchiolitis. What's in the name?. Am J Dis Child.
1983;137:11-3.
McNally JD, Sampson M, Matheson LA, Hutton B, Little J. Vitamin D receptor
(VDR) polymorphisms and severe RSV bronchiolitis: a systematic review and
meta-analysis. Pediatr Pulmonol 2014;49:790-799.
Meissner HC. Selected populations at increased risk from respiratory syncytial
virus infection. Pediatr Infect Dis J. 2003;22(2 Suppl):S40-4; discussion S44-5.
Meissner HC. Viral Bronchiolitis in Children. N Engl J Med 2016;374:62-72.
Midulla F, Scagnolari C, Bonci E, Pierangeli A, Antonelli G, De Angelis D,
Berardi R, Moretti C. Respiratory syncytial virus, human bocavirus and
rhinovirus bronchiolitis in infants. Arch Dis Child. 2010;95:35-41.
Miller EK, Williams JV, Gebretsadik T, Carroll KN, Dupont WD, Mohamed YA,
Morin LL, Heil L, Minton PA, Woodward K, Liu Z, Hartert TV. Host and viral
factors associated with severity of human rhinovirus-associated infant
respiratory tract illness. J Allergy Clin Immunol. 2011;127(4):883-91.
Mohamed WA, Al-Shehri MA. Cord blood 25-hydroxyvitamin D levels and the
risk of acute lower respiratory tract infection in early childhood. J Trop Pediatr.
2013;59(1):29-35.
133
Moore HC, de Klerk N, Holt P, Richmond PC, Lehmann D. Hospitalisation for
bronchiolitis in infants is more common after elective caesarean delivery. Arch
Dis Child. 2012;97(5):410-4.
Murawski MR, Bowen GN, Cerny AM, Anderson LJ, Haynes LM, Tripp RA,
Kurt-Jones EA, Finberg RW. Respiratory syncytial virus activates innate
immunity through Toll-like receptor 2. J Virol 2009;83:1492-1500.
Murray J, Bottle A, Sharland M, Modi N, Aylin P, Majeed A, Saxena S;
Medicines for Neonates Investigator Group. Risk factors for hospital admission
with RSV bronchiolitis in England: a population-based birth cohort study. PLoS
One. 2014;9(2):e89186.
National Collaborating Centre for Women's and Children's Health (UK).
Bronchiolitis: Diagnosis and Management of Bronchiolitis in Children. London:
National Institute for Health and Clinical Excellence, 2015.
Nascimento MS, Souza AV, Ferreira AV, Rodrigues JC, Abramovici S, Silva
Filho LV. High rate of viral identification and coinfections in infants with acute
bronchiolitis. Clinics (Sao Paulo). 2010;65(11):1133-7.
Nuolivirta K, Vuononvirta J, Peltola V, Koponen P, Helminen M, He Q, Korppi
M. Toll-like receptor 2 subfamily genotypes are not associated with severity of
bronchiolitis or postbronchiolitis wheezing in infants. Acta Paediatr
2013;102:1160-1164.
Ochoa Sangrador C, González de Dios J; Grupo de Revisión del Proyecto
aBREVIADo (BRonquiolitis-Estudio de Variabilidad, Idoneidad y ADecuación).
[Consensus conference on acute bronchiolitis (II): epidemiology of acute
bronchiolitis. Review of the scientific evidence]. An Pediatr (Barc).
2010;72(3):222.e1-222.e26.
134
Oliveira TF, Freitas GR, Ribeiro LZ, Yokosawa J, Siqueira MM, Portes SA,
Silveira HL, Calegari T, Costa L, Mantese OC, Queiróz DA. Prevalence and
clinical aspects of respiratory syncytial virus A and B groups in children seen at
Hospital de Clínicas of Uberlândia, MG, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz.
2008;103(5):417-22.
Oñoro G, Pérez Suárez E, Iglesias Bouzas MI, Serrano A, Martínez De Azagra
A, García-Teresa MA, Casado Flores J. Severe bronchiolitis. Changes in
epidemiology and respiratory support. An Pediatr (Barc). 2011;74(6):371-6.
Paes BA, Mitchell I, Banerji A, Lanctot KL, Langley JM. A decade of respiratory
syncytial virus epidemiology and prophylaxis: Translating evidence into
everyday clinical practice. Can Respir J. 2011;18(2):e10-9.
Papadopoulos NG, Gourgiotis D, Javadyan A, Bossios A, Kallergi K, Psarras S,
Tsolia MN, Kafetzis D. Does respiratory syncytial virus subtype influences the
severity of acute bronchiolitis in hospitalized infants? Respir Med 2004;98:879-
882.
Papoff P, Moretti C, Cangiano G, Bonci E, Roggini M, Pierangeli A, Scagnolari
C, Antonelli G, Midulla F. Incidence and predisposing factors for severe disease
in previously healthy term infants experiencing their first episode of bronchiolitis.
Acta Paediatr. 2011;100(7):e17-23.
Pezzotti P, Mantovani J, Benincori N, Mucchino E, Di Lallo D. Incidence and
risk factors of hospitalization for bronchiolitis in preterm children: a retrospective
longitudinal study in Italy. BMC Pediatr. 2009;9:56.
Pilger DA, Cantarelli VV, Amantea SL, Leistner-Segal S. Detection of human
bocavirus and human metapneumovirus by real-time PCR from patients with
respiratory symptoms in Southern Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz.
2011;106(1):56-60.
135
Puthothu B, Forster J, Heinzmann A, Krueger M. TLR-4 and CD14
polymorphisms in respiratory syncytial virus associated disease. Dis Markers
2006;22:303-308.
Ralston SL, Lieberthal AS, Meissner HC, Alverson BK, Baley JE, Gadomski
AM, Johnson DW, Light MJ, Maraqa NF, Mendonca EA, Phelan KJ, Zorc JJ,
Stanko-Lopp D, Brown MA, Nathanson I, Rosenblum E, Sayles S 3rd,
Hernandez-Cancio S; American Academy of Pediatrics. Clinical practice
guideline: the diagnosis, management, and prevention of bronchiolitis.
Pediatrics 2014;134(5):e1474-1502.
Rämet M, Korppi M, Hallman M. Pattern recognition receptors and genetic risk
for rsv infection: value for clinical decision-making? Pediatr Pulmonol.
2011;46(2):101-10.
Ranmuthugala G, Brown L, Lidbury BA. Respiratory syncytial virus--the
unrecognised cause of health and economic burden among young children in
Australia. Commun Dis Intell. 2011;35(2):177-84.
Reeves RM, Hardelid P, Gilbert R, Ellis J, Zhao H, Donati M, Pebody R.
Epidemiology of laboratory-confirmed respiratory syncytial virus infection in
young children in England, 2010-2014: the importance of birth month. Epidemiol
Infect. 2016;144(10):2049-56.
Resch B, Kurath-Koller S, Hahn J, Raith W, Köstenberger M, Gamillscheg A .
Respiratory syncytial virus-associated hospitalizations over three consecutive
seasons in children with congenital heart disease. Eur J Clin Microbiol Infect
Dis. 2016;35(7):1165-9.
136
Ricart S, Marcos MA, Sarda M, Anton A, Muñoz-Almagro C, Pumarola T, Pons
M, Garcia-Garcia JJ. Clinical risk factors are more relevant than respiratory
viruses in predicting bronchiolitis severity. Pediatr Pulmonol. 2013;48(5):456-63.
Riccetto AG, Ribeiro JD, Silva MT, Almeida RS, Arns CW, Baracat EC.
Respiratory syncytial virus (RSV) in infants hospitalized for acute lower
respiratory tract disease: incidence and associated risks. Braz J Infect Dis.
2006;10(5):357-61.
Riccetto AG, Silva LH, Spilki FR, Morcillo AM, Arns CW, Baracat EC.
Genotypes and clinical data of respiratory syncytial virus and metapneumovirus
in brazilian infants: a new perspective. Braz J Infect Dis. 2009;13(1):35-9.
Richard N, Komurian-Pradel F, Javouhey E, Perret M, Rajoharison A, Bagnaud
A, Billaud G, Vernet G, Lina B, Floret D, Paranhos-Baccalà G. The impact of
dual viral infection in infants admitted to a pediatric intensive care unit
associated with severe bronchiolitis. Pediatr Infect Dis J. 2008;27(3):213-7.
Rodríguez DA, Rodríguez-Martínez CE, Cárdenas AC, Quilaguy IE, Mayorga
LY, Falla LM, Nino G. Predictors of severity and mortality in children
hospitalized with respiratory syncytial virus infection in a tropical region. Pediatr
Pulmonol. 2014;49(3):269-76.
Roth DE, Jones AB, Prosser C, Robinson JL, Vohra S. Vitamin D receptor
polymorphisms and the risk of acute lower respiratory tract infection in early
childhood. J Infect Dis. 2008;197(5):676-80.
Roth DE, Shah R, Black RE, Baqui AH. Vitamin D status and acute lower
respiratory infection in early childhood in Sylhet, Bangladesh. Acta Paediatr
2010;99:389-393.
137
Ruiz-Charles MG, Castillo-Rendón R, Bermúdez-Felizardo F. [Risk factors
associated with bronchiolitis in children under 2 years of age]. Rev Invest Clin.
2002;54(2):125-32.
Salomão Junior JB, Gardinassi LG, Simas PV, Bittar CO, Souza FP, Rahal P,
Zanetta DM. Human respiratory syncytial virus in children hospitalized for acute
lower respiratory infection. J Pediatr (Rio J). 2011;87(3):219-24.
Sanchez-Luna M, Elola FJ, Fernandez-Perez C, Bernal JL, Lopez-Pineda A.
Trends in respiratory syncytial virus bronchiolitis hospitalizations in children less
than 1 year: 2004-2012. Curr Med Res Opin. 2016;32(4):693-8.
Sanghavi SK, Bullotta A, Husain Shahid, Rinaldo CR. Clinical evaluation of
multiplex real-time PCR panels for rapid detection of respiratory viral infections.
Journal of Medical Virology. 2012;84(1):162-169.
Schlender J, Hornung V, Finke S, Günthner-Biller M, Marozin S, Brzózka K,
Moghim S, Endres S, Hartmann G, Conzelmann KK. Inhibition of toll-like
receptor 7- and 9-mediated alpha/beta interferon production in human
plasmacytoid dendritic cells by respiratory syncytial virus and measles virus. J
Virol 2005;79:5507-5515.
Semple MG, Cowell A, Dove W, Greensill J, McNamara PS, Halfhide C, Shears
P, Smyth RL, Hart CA. Dual infection of infants by human metapneumovirus
and human respiratory syncytial virus is strongly associated with severe
bronchiolitis. J Infect Dis. 2005;191(3):382-6.
Semple MG, Taylor-Robinson DC, Lane S, Smyth RL. Household tobacco
smoke and admission weight predict severe bronchiolitis in infants independent
of deprivation: prospective cohort study. PLoS One. 2011;6(7):e22425.
138
Shang X, Liabsuetrakul T, Sangsupawanich P, Xia X, He P, Cao H. Elective
cesarean delivery as a predisposing factor of respiratory syncytial virus
bronchiolitis in children. J Med Assoc Thai. 2014;97(8):827-34.
Simões EA, Carbonell-Estrany X. Impact of severe disease caused by
respiratory syncytial virus in children living in developed countries. Pediatr Infect
Dis J. 2003;22(2 Suppl):S13-8; discussion S18-20.
Stevenson MD, Mansbach JM, Mowad E, Dunn M, Clark S, Piedra PA, Sullivan
AF, Camargo CA Jr. Prenatal Versus Postnatal Tobacco Smoke Exposure and
Intensive Care Use in Children Hospitalized With Bronchiolitis. Acad Pediatr.
2016;16(5):446-52.
Stockman LJ, Curns AT, Anderson LJ, Fischer-Langley G. Respiratory Syncytial
Virus-associated Hospitalizations Among Infants and Young Children in the
United States, 1997-2006. Pediatr Infect Dis J. 2012;31(1):5-9.
Stoppelenburg AJ, von Hegedus JH, Huis in't Veld R, Bont L, Boes M. Defective
control of vitamin D receptor-mediated epithelial STAT1 signalling predisposes
to severe respiratory syncytial virus bronchiolitis. J Pathol 2014;232:57-64.
Sung CC, Chi H, Chiu NC, Huang DT, Weng LC, Wang NY, Huang FY. Viral
etiology of acute lower respiratory tract infections in hospitalized young children
in Northern Taiwan. J Microbiol Immunol Infect. 2011;44(3):184-90.
Tal G, Mandelberg A, Dalal I, Cesar K, Somekh E, Tal A, Oron A, Itskovich S,
Ballin A, Houri S, Beigelman A, Lider O, Rechavi G, Amariglio N. Association
between common Toll-like receptor 4 mutations and severe respiratory syncytial
virus disease. J Infect Dis. 2004;189(11):2057-63.
139
Thomsen SF, Stensballe LG, Skytthe A, Kyvic KO, Backer V, Bisgaard H.
Increased concordance of severe respiratory syncytial virus infection in identical
twins. Pediatrics. 2008;121:493–6.
Tulic MK, Hurrelbrink RJ, Prêle CM, Laing IA, Upham JW, Le Souef P, Sly PD,
Holt PG. TLR4 polymorphisms mediate impaired responses to respiratory
syncytial virus and lipopolysaccharide. J Immunol. 2007;179(1):132-40.
Van de Steen O, Miri F, Gunjaca M, Klepac V, Gross B, Notario G, Wegzyn CM.
The Burden of Severe Respiratory Syncytial Virus Disease Among Children
Younger than 1 Year in Central and Eastern Europe. Infect Dis Ther.
2016;5(2):125-37.
Vidaurreta SM, Marcone DN, Ellis A, Ekstrom J, Cukier D, Videla C, Carballal
G, Echavarría M. Acute viral respiratory infection in children under 5 years:
Epidemiological study in two centers in Buenos Aires, Argentina. Arch Argent
Pediatr. 2011;109(4):296-304.
Vizcarra-Ugalde S, Rico-Hernández M, Monjarás-Ávila C, Bernal-Silva S,
Garrocho-Rangel ME, Ochoa-Pérez UR, Noyola DE. Intensive Care Unit
Admission and Death Rates of Infants Admitted with Respiratory Syncytial Virus
Lower Respiratory Tract Infection in Mexico. Pediatr Infect Dis J. 2016 Jun 7.
[Epub ahead of print]
Wang VJ, Cavagnaro CS, Clark S, Camargo CA Jr, Mansbach JM. Altitude and
environmental climate effects on bronchiolitis severity among children
presenting to the emergency department. J Environ Health. 2012;75(3):8-15;
quiz 54.
Weigl JA, Puppe W, Schmitt HJ. Variables explaining the duration of
hospitalization in children under two years of age admitted with acute airway
140
infections: does respiratory syncytial virus have a direct impact? Klin Padiatr.
2004;216(1):7-15.
Wong-Chew RM, Farfán-Quiroz R, Sánchez-Huerta JL, Nava-Frías M,
Casasola-Flores J, Santos-Preciado JI. Frequency of respiratory viruses and
clinical characteristics in children attending a care center in Mexico City. Salud
Publica Mex. 2010;52(6):528-32.
Zhou L, Xiao Q, Zhao Y, Huang A, Ren L, Liu E. The impact of viral dynamics
on the clinical severity of infants with respiratory syncytial virus bronchiolitis. J
Med Virol 2015;87:1276-1284.
Zhou J, Zhang X, Liu S, Wang Z, Chen Q, Wu Y, He Z, Huang Z. Genetic
association of TLR4 Asp299Gly, TLR4 Thr399Ile, and CD14 C-159T
polymorphisms with the risk of severe RSV infection: a metaanalysis. Influenza
Other Respir Viruses. 2016;10(3):224-33.
Zhu H, Fu Z, Gao L, Wang L, Liu E, Tian D. Genetic Polymorphisms of Toll-like
Receptor 4 are Associated with Respiratory Syncytial Virus Infection in a
Chinese Infant Population. Clin Lab. 2015;61(10):1391-9.
141
ANEXO 1
QUESTIONÁRIO PARA GRUPO CONTROLE
Nome:__________________________________________________________
Data de Nascimento:____/____/____
Sexo: (___) Feminino (___) Masculino
Etnia: (___) Branca (___) Negra (mulato, pardo) (___) Asiática (japonês e
chinês,etc...)
Endereço:_______________________________________________________
_______________________________________________________________
Telefone:________________________________________________________
Data de hoje:____/____/____
1. Alguma vez você teve chiado no peito ou bronquite ou sibilâncias:
(___) SIM (___) NÃO
2. Você alguma vez recebeu tratamento com medicamentos inalados por
nebulizadores ou sprays inalatórios (bombinhas), por exemplo: Salbutamol,
Aerolin®, Berotec®, Atrovent®, Brycanil®?
(___) SIM (___) NÃO (___) NÃO SEI
3. Você alguma vez recebeu tratamento com corticóides (cortisonas) em sprays
inalatórios (bombinhas) , por exemplo, Symbicort®, Flixotide®, Seretide®,
Clenil®, Beclosol®, Budesonida, Busonid®, Pulmicort®, Beclometasona,
Fluticasona ?
142
(___) SIM (___) NÃO (___) NÃO SEI
4. Você alguma vez recebeu tratamento com: Antileucotrienos (Singulair® ou
Montelair®)?
(___) SIM (___) NÃO (___) NÃO SEI
5. Você alguma vez recebeu tratamento com corticóides orais (Predsim®,
Prelone®, Decadron®)?
(___) SIM (___) NÃO (___) NÃO SEI
6. Você alguma vez acordou durante a noite devido à tosse?
(___) Nunca
(___) Raras vezes (menos de uma vez ao mês)
(___) Algumas vezes (algumas semanas em alguns meses)
(___) Freqüentemente (duas ou mais noites por semana, quase todos os
meses)
7. Algum médico lhe disse alguma vez que você tem asma ou bronquite?
(___) SIM (___) NÃO
8. Você tem familiares com asma ou bronquite?
(___) SIM (___) mãe (___) pai (___) Irmãos � NÃO
9. Você tem alergia no nariz ou rinite alérgica?
(___) SIM (___) NÃO
10. Você tem alergia de pele (dermatite alérgica)?
(___) SIM (___) NÃO
11. Marque qual o seu grau de escolaridade:
(___) Educação básica, primária ou nenhuma (8 anos ou menos).
(___) Educação média ou secundária incompleta (nove a 11 anos).
143
(___) Educação média ou secundária completa e nível superior (doze ou mais
anos)
144
ANEXO 2
QUESTIONÁRIO PARA COLETA DOS DADOS DOS PACIENTES
INTERNADOS
Nome:__________________________________________________________
Data de Nascimento:____/____/____
Idade (em meses):_______________________________________________
Sexo: (___) Feminino (___) Masculino
Etnia: (___) Branca (___) Negra (mulato, pardo) (___) Asiática (japonês e
chinês,etc...)
Endereço:_______________________________________________________
_______________________________________________________________
____________
Nome da Mãe:___________________________________________________
Nome do Pai: ____________________________________________________
Telefones para Contato: Fixo: ______________ Celular: __________________
Data de hoje:____/____/____
Alguma vez seu bebê teve chiado no peito ou bronquite ou sibilâncias:
(___) SIM (___) NÃO
145
Seu bebê alguma vez recebeu tratamento com medicamentos inalados por
nebulizadores ou sprays inalatórios (bombinhas), por exemplo: Salbutamol,
Aerolin®, Berotec®, Atrovent®, Brycanil®?
(___) SIM (___) NÃO (___) NÃO SEI
Seu bebê alguma vez recebeu tratamento com corticóides (cortisonas) em
sprays inalatórios (bombinhas) , por exemplo, Symbicort®, Flixotide®,
Seretide®, Clenil®, Beclosol®, Budesonida, Busonid®, Pulmicort®,
Beclometasona, Fluticasona ?
(___) SIM (___) NÃO (___) NÃO SEI
Seu bebê alguma vez recebeu tratamento com: Antileucotrienos (Singulair® ou
Montelair®)?
(___) SIM (___) NÃO (___) NÃO SEI
Seu bebê alguma vez recebeu tratamento com corticóides orais (Predsim®,
Prelone®, Decadron®)?
(___) SIM (___) NÃO (___) NÃO SEI
Seu bebê alguma vez acordou durante a noite devido à tosse?
(___) Nunca
(___) Raras vezes (menos de uma vez ao mês)
(___) Algumas vezes (algumas semanas em alguns meses)
(___) Freqüentemente (duas ou mais noites por semana, quase todos os
meses)
Algum médico lhe disse alguma vez que Seu bebê tem asma ou bronquite?
(___) SIM (___) NÃO
Seu bebê já teve pneumonia? (___) SIM (___) NÃO
Seu bebê já foi hospitalizado por pneumonia? (___) SIM (___) NÃO
146
Mês do ano em que nasceu: __________
Idade Gestacional pelo método de Capurro:
(___) Menos que 32 semanas gestacionais
(___) Entre 32 e 36 semanas e 6 dias de idade gestacional
(___) 37 ou mais semanas de idade gestacional
Seu bebê nasceu por cesariana (parto cesárea)? (___) SIM (___) NÃO
Peso ao nascer (exemplo 3 kg 100 gramas): __________
Estatura ao nascer em cm: __________
Peso agora: __________
Estatura agora em cm: __________
Duração do aleitamento materno exclusivo (em meses): __________
Duração do aleitamento materno total (em meses): __________
Alguma pessoa fuma dentro da sua casa (pai, mãe, avós, tios)? (___) SIM
(___) NÃO
A mãe do bebê fumou durante a gravidez? (___) SIM (___) NÃO
Seu bebê tem familiares com asma? (___) SIM (___) mãe (___) pai (___)
Irmãos (___) NÃO
Seu bebê tem familiares com alergia no nariz ou rinite alérgica (___) SIM (___)
mãe (___) pai (___) Irmãos (___) NÃO
147
Seu bebê tem familiares com alergia de pele (dermatite alérgica)? (___) SIM
(___) mãe (___) pai (___) Irmãos (___) NÃO
Seu bebê tem ou teve alguma alergia de pele durante o primeiro ano de vida?
(manchas vermelhas na pele com coceira, alergia à fralda, alergia à picada de
mosquito, comida, metais, etc.). (___) SIM (___) NÃO
Existe mofo (bolor) ou manchas de umidade em sua casa? (___) SIM (___)
NÃO
Você tem ar condicionado em sua casa? (___) SIM (___) NÃO
Você tem algum bicho de estimação na sua casa atualmente? (cachorro, gato,
passarinho, coelho)?
(___) SIM (___) cachorro (___) gato (___) passarinho (___) coelho (___)
NÃO
Você tem carpete na sua casa? (___) SIM (___) NÃO
Existem bichos de pelúcia no quarto de seu bebê? (___) SIM (___) NÃO
Seu bebê vai à escola ou creche?
(___) Sim – Desde qual idade:___________________________
(___) Não
Seu bebê tem alguma Doença Pulmonar Crônica:
(___) SIM – Qual doença?
_____________________________________________
(___) NÃO
Seu bebê tem alguma Cardiopatia Congênita:
148
(___) SIM – Qual cardiopatia congênita?
__________________________________
(___) NÃO
Número de irmãos: __________
Número de pessoas que vivem na mesma casa: __________
Escolaridade materna:
(___) Ensino Fundamental incompleto
(___) Ensino Fundamental
(___) Ensino Médio
(___) Terceiro grau
(___) Pós-graduação
EVOLUÇÃO DA INTERNAÇÃO:
Duração da internação: __________
Duração da oxigenoterapia: __________
Necessitou de Ventilação mecânica:
(___) Sim – Quantos dias:____________________________________
(___) Não
Evoluiu à óbito:
(___) Sim
(___) Não
149
ANEXO 3
APROVAÇÃO DO PROJETO PELA COMISSÃO NACIONAL DE ÉTICA EM
PESQUISA (CAAE: 00869612.7.0000.5404)
150
COMISSÃO NACIONAL DEÉTICA EM PESQUISA
Pesquisador:
Título:
Instituição:
Versão:
CAAE:
PARECER CONSUBSTANCIADO DA CONEP
Número do Parecer:
Data da Relatoria:
AVALIAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS EPIDEMIOLÓGICAS E GENÉTICAS ASSOCIADASÀ BRONQUIOLITE VIRAL AGUDA GRAVE
Alfonso Eduardo Alvarez Bragunde
Faculdade de Ciências Medicas - UNICAMP(Campus Campinas)
3
00869612.7.0000.5404
113.819
29/08/2012
PROJETO DE PESQUISA
Área Temática:
Área 1. Genética Humana.
Introdução: A Bronquiolite Viral Aguda (BVA) pelo Vírus Sincicial Respiratório (VSR) é a principal infecção dasvias aéreas inferiores em crianças menores de 2 anos de idade no mundo e a principal causa de internaçãonessa faixa etária em países desenvolvidos. O VSR é o principal agente causador da BVA e suacorrespondendo a 41,7 a 83,6% dos caso. Devido a possibilidade da doença evoluir de forma grave éimportante tentar identificar os fatores de risco que contribuem para uma evolução desfavorável. Diversostrabalhos na literatura têm tentado demonstrar quais são esses fatores de risco, sendo que alguns fatores jáforam bem elucidados, como prematuridade, tabagismo passivo, baixa idade, ausência de aleitamento materno,doença pulmonar crônica e cardiopatia congênita.Outros fatores relacionados com a gravidade da BVA são baixo peso na admissão, ter irmãos mais velhos,morar em casa com muitas pessoas, tabagismo materno na gestação, ser do sexo masculino, época do ano emque nasceram, frequentar escola, baixa idade materna, baixa escolaridade materna e baixo nívelsocioeconômico.A evolução da BVA apresenta gravidade tão variável que os pesquisadores começaram a suspeitar que osfatores epidemiológicos não seriam os únicos responsáveis pela determinação da gravidade do quadro. Destaforma alguns estudos avaliaram se características genéticas estariam associados a evolução mais grave para aenfermidade. Pattern recognition receptors (PRRs) são os mediadores chave da resposta imune inata contra oVSR. No trato respiratório inferior o VSR é reconhecido pelo receptor transmembrana Toll-like 4 (TLR4)presente em macrófagos e células dendítricas, e ocorre a produção de citocinas pro-inflamatórias e asubsequente ativação da resposta imune adaptativa. Variações genéticas do TLR4 foram associadas com orisco de BVA grave por VSR.Hipótese: A gravidade da Bronquiolite Viral Aguda está associada a fatores epidemiológicos e a ocorrência depolimorfismos genéticos.Metodologia: Delineamento do estudo: Serão avaliados os pacientes internados com quadro de BVA quenecessitarem de oxigenoterapia, com ou sem necessidade de ventilação mecânica. O grupo controle serácomposto por pacientes com diagnóstico de BVA que forem atendidos na emergência e que não necessitareminternação. Os pacientes serão avaliados em relação a variáveis epidemiológicas, presença de vírus epresença de polimorfismos gênicos, conforme descrição a seguir.Variáveis epidemiológicas que serão avaliadas: Gênero: masculino ou feminino. Etnia: caucasóide, negróide oumongolóide. Idade (em meses). Prematuridade: nascimento com menos que 32 semanas gestacionais, entre32 e 36 semanas e 6 dias de idade gestacional ou com 37 ou mais semanas de idade gestacional. Época doano em que nasceram. Duração do aleitamento materno (em meses). Tabagismo passivo: presença ouausência de fumante morando na casa da criança. Doença pulmonar crônica: presente ou ausente. Cardiopatiacongênita: presente ou ausente. Número de irmãos. Número de pessoas que vivem na mesma casa.Escolaridade
Apresentação do Projeto:
E-mail:
Endereço:Bairro: CEP:
Telefone:UF: Município:
151
COMISSÃO NACIONAL DEÉTICA EM PESQUISA
materna. Antecedente materno para atopia: presente ou ausente. Antecedente paterno para atopia: presente ouausente. Frequência à escola: presente ou ausente. Presença dos vírus: VSR Adenovírus, Bocavírus, InfluenzaA, Influenza B, Parainfluenza 1, Parainfluenza 2,Parainfluenza 3, Rinovírus e Metapneumovírus. A determinação dos vírus será realizada com material obtidoatravés de lavado de nasofaringe e a técnica para detecção viral será PCR-Real Time, conforme técnicapadrão. Presença dos polimorfismos gênicos: Toll-Like Receptor 4 (polimorfismos Asp299Gly - rs4986790,Thr399Ile - rs4986791, +896A/G, rs1927911) Toll-Like Receptor 2 (polimorfismos rs1898830, rs7656411) Toll-Like Receptor 9 (polimorfismos rs352162, rs187084) Rantes (polimorfismos -403 G/A, -28C/G, In1.1T/C)Receptor da vitamina D (polimorfismo Thr1Meth - rs10735810) JUN (polimorfismo -rs11688) IFNA5(polimorfismo - rs10757212) NOS2 (polimorfismo - rs1060826). A análise genética será realizada pela técnicado open array, seguindo os passos propostos pelo fabricante (Applied Biosystems by Life Technologies®).Critérios de Inclusão/ Exclusão: Critério de Inclusão: Serão incluídos os pacientes que apresentarem quadro deBronquiolite Viral Aguda e necessitarem de internação e utilização de oxigenoterapia. O grupo controle seráconstituído de pacientes que apresentarem Bronquiolite Viral Aguda atendidos na emergência e que nãonecessitarem internação.
O objetivo do projeto é determinar quais são as características epidemiológicas e genéticas associadas àevolução grave da BVA.Objetivos Secundários:1. Descrição da população de pacientes incluídos no estudo pela caracterização das seguintes variáveisepidemiológicas: Gênero, etnia, idade, presença de prematuridade, época do ano em que nasceram, duraçãodo aleitamento materno, presença de tabagismo passivo, presença de doença pulmonar crônica, presença decardiopatia congênita, número de irmãos, número de pessoas que vivem na mesma casa, escolaridadematerna, antecedente materno e paterno para atopia, frequência à escola.2. Determinação da presença dos seguintes vírus nos pacientes incluídos no estudo: VSR, Adenovírus,Bocavírus, Influenza A, Influenza B, Parainfluenza 1, Parainfluenza 2, Parainfluenza 3, Rinovírus eMetapneumovírus.3. Verificar a presença nos pacientes incluídos no estudo dos polimorfismos nos seguintes genes: Toll-LikeReceptor 4 (polimorfismos Asp299Gly - rs4986790, Thr399Ile - rs4986791, +896A/G, rs1927911), Toll-LikeReceptor 2 (polimorfismos rs1898830, rs7656411), Toll-Like Receptor 9 (polimorfismos rs352162, rs187084),Rantes (polimorfismos -403G/A, -28C/G, In1.1T/C), receptor da vitamina D (polimorfismo Thr1Meth -rs10735810), JUN (polimorfismo - rs11688), IFNA5 (polimorfismo - rs10757212) e NOS2 (polimorfismo -rs1060826).4. Verificar a associação da gravidade da BVA com as características epidemiológicas descritas no item 1, coma presença dos vírus descritos no item 2 e com a presença dos polimorfismos descritos no item 3.
Objetivo da Pesquisa:
Benefícios: A BVA é uma doença com alta incidência, responsável por grande número de internações,acarretando em custo elevado. Pode evoluir de forma grave e levar a óbito, sendo então responsável tambémpor um enorme sofrimento para os pais e pacientes. É importante tentar identificar quais são os fatoresepidemiológicos que contribuem para a maior gravidade da doença. No Brasil, estudos epidemiológicos com aBVA são escassos e pouco se sabe sobre quais fatores interagem para sua maior gravidade e para suaincidência. A causa genética da BVA ainda não é esclarecida. Múltiplos genes em vias metabólicas distintas,têm sido relatados como fatores associados a presença e maior gravidade da BVA em diferentes populações.Porém, esses estudos são escassos na literatura cientifica, e não existem relatados descritos para a populaçãobrasileira na literatura referenciada. Os estudos também demonstram controvérsia quanto aos resultadosobtidospara um mesmo polimorfismo em relação à doença, além de dificuldade metodológica envolvendo tamanhoamostral e caracterização dos pacientes incluídos. O conhecimento de polimorfismo em genes associados àpresença e maior gravidade na BVA poderá possibilitar maior entendimento da doença e identificação depopulações de risco. Novas terapias condicionadas por farmacogenética poderão ser introduzidas por meio denovos estudos realizados a partir dos dados obtidos neste
Avaliação dos Riscos e Benefícios:
E-mail:
Endereço:Bairro: CEP:
Telefone:UF: Município:
152
COMISSÃO NACIONAL DEÉTICA EM PESQUISA
projeto.
Serão avaliados os pacientes internados com quadro de BVA que necessitarem de oxigenoterapia, com ou semnecessidade de ventilação mecânica. O grupo controle será composto por pacientes com diagnóstico de BVAque forem atendidos na emergência e que não necessitarem internação. Os pacientes serão avaliados emrelação a variáveis epidemiológicas, presença de vírus e presença de polimorfismos gênicos. O estudo épatrocinado pela Fundação de Amparo a Pesquisa de São Paulo (FAPESP).
Comentários e Considerações sobre a Pesquisa:
Os documentos de apresentação obrigatória foram incluídos.
Considerações sobre os Termos de apresentação obrigatória:
Incluídas no item "Conclusões ou Pendências e Lista de Inadequações".
Recomendações:
1. O projeto de pesquisa tem como instituição proponente a Universidade Estadual de Campinas, através daFaculdade de Ciências Médicas. Solicita-se esclarecer a vinculação do pesquisador responsável com ainstituição e qual a equipe que integrará o referido projeto de pesquisa.Resposta: O pesquisador é aluno de doutorado da instituição, sendo que o projeto em questão é o projeto dedoutorado do pesquisador e será orientado pelo Prof. Dr. José Dirceu Ribeiro. A equipe que integrará o projetoe as atribuições de cada pesquisador estão descritas no projeto, sendo que estas informações foramacrescentadas ao Delineamento do Estudo.Análise: Pendência atendida.
2. No projeto de pesquisa não foram apresentados critérios de exclusão do estudo. De acordo com o itemVI.3.d da Resolução CNS 196/96, todo protocolo de pesquisa deve descrever os planos para recrutamento deindivíduos e os procedimentos a serem seguidos e fornecer critérios de inclusão e exclusão. Solicita-se,portanto, que sejam descritos os planos para recrutamentos de indivíduos, os profissionais responsáveis eque sejam apresentados os critérios de exclusão.Resposta: Foram acrescentados no projeto a descrição de como serão recrutados os indivíduos, os critérios deinclusão e os critérios de exclusão. O recrutamento dos indivíduos e a coleta de dados serão realizadas pelopróprio pesquisador. O texto do projeto ficou desta forma: Serão avaliados os pacientes internados no Hospitalde Clínicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) comquadro de BVA que necessitarem de oxigenoterapia, com ou sem necessidade de ventilação mecânica.O grupo controle será composto por pacientes com diagnóstico de BVA que forem atendidos na emergência doHospital de Clínicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) eque não necessitarem internação. O diagnóstico da BVA será baseado em dados clínicos. Serão excluídos ospacientes que tiverem apresentado quadro anterior de sibilância. Também serão excluídos os pacientes cujospais ou responsáveis solicitarem a revogação do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.Análise: Pendência atendida.
3. Com relação aos riscos de participação do estudo, é informado que "Não há riscos previsíveis na realizaçãodo exame genético e do exame para detecção de vírus." (grifo nosso). Cabe ressaltar que, de acordo com oitem V da Resolução CNS 196/96, "considera-se que toda pesquisa envolvendo seres humanos envolve risco.O dano eventual poderá ser imediato ou tardio, comprometendo o indivíduo ou a coletividade". Ressalte-seainda o item II.8 da mesma resolução que define como "Risco da pesquisa - possibilidade de danos à dimensãofísica, psíquica, moral, intelectual, social, cultural ou espiritual do ser humano, em qualquer fase de umapesquisa e dela decorrente". Solicita-se adequação.Resposta: Foi retirada a frase ¿Não há riscos previsíveis para a realização deste exame¿ e
Conclusões ou Pendências e Lista de Inadequações:
E-mail:
Endereço:Bairro: CEP:
Telefone:UF: Município:
153
COMISSÃO NACIONAL DEÉTICA EM PESQUISA
acrescentada a frase¿Os riscos associados à coleta de sangue são edema local, hematoma porextravasamento de sangue e infecções no local da punção¿Análise: Pendência atendida.
4. O orçamento do projeto deve ser apresentado conforme item VI.2.j da Resolução CNS 196/96, esclarecendoos recursos, fontes e destinação (o que será pago à instituição e ao pesquisador). Não é suficiente aapresentação de uma tabela informando que o estudo terá um custo de R$ 230.000,00, para "Material deConsumo para exames". Ademais, na primeira versão submetida para análise, foi informado que o estudo teriaum custo de R$ 0,00. Solicitam-se esclarecimentos e adequação.Resposta: Comunicamos ao revisor que na versão inicial o relato de custo R$ 0,00 se deveu ao fato dapossibilidade de realizarmos o projeto com verba interna. Após a constatação da impossibilidade de realizaçãodo projeto com verba interna, foi previamente calculado um montante de R$ 230.000,00. Agora, após reuniãode toda a equipe, realizamos e obtivemos um novo orçamento e o montante para a realização da pesquisa foiestipulado em 107.000,00. Este montante foi adequado à sugestão da Fapesp após adequação dosprocedimentos necessários junto a equipe de pesquisa. Os pesquisadores não receberão nenhumaremuneração pela pesquisa, sendo que os recursos serão destinados para a realização da detecção dos víruse da análise genética. Conforme solicitado, o orçamento foi detalhado no projeto seguindo a resolução 196/96.Análise: Pendência atendida.
5. O protocolo de pesquisa não informa o laboratório responsável pela identificação viral e nem o laboratórioque realizará a técnica de open array para os polimorfismos gênicos. Solicita-se esclarecimento e adequação,com apresentação dos custos conforme citado no item 3.Resposta: Foi acrescentado no protocolo de pesquisa os laboratórios responsáveis pela realização dosexames. A identificação viral será realizada no Laboratório de Virologia do Instituto de Biologia da UNICAMP,pela Prof. Dra. Clarice Weis Arns, a qual faz parte desta pesquisa. A análise dos polimorfismos gênicos serárealizada no Laboratório de Genética Médica da UNICAMP, pela Prof. Dra. Carmen Sílvia Bertuzzo e porFernando Augusto de Lima Marson, os quais fazem parte desta pesquisa.Análise: Pendência atendida.
6. Com relação ao Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE):a. O TCLE não está apresentado em forma de convite e com linguagem clara e acessível, conforme expressona Resolução CNS 196/96. Solicita-se adequação.Resposta: O TCLE foi adequado para a forma de convite e com linguagem clara e acessível. Foi incluída aseguinte frase: "Gostaríamos de convidá-los a participar de uma pesquisa médica, na qual pretendemosinvestigar quais são os fatores que levam a maior gravidade da Bronquiolite Viral Aguda.".Análise: Pendência atendida.
b. No TCLE, quando se refere ao procedimento de coleta de sangue, é informado que "3. Exame de sangue:trata-se de um exame do sangue da criança onde serão avaliados se existem características genéticas quepossam contribuir com a incidência e gravidade da bronquiolite. Cabe lembrar que esse exame será colhido namesma punção realizada no momento da coleta de outros exames que fazem parte da rotina no atendimentoaos pacientes com bronquiolite, não sendo necessário então uma punção diferente da que normalmente seriarealizada. São necessários 2ml de sangue. Não há riscos previsíveis na realização deste exame."(grifo nosso).O procedimento de coleta de sangue tem diversos riscos previsíveis já conhecidos, especialmente seconsiderarmos edemas e infecções. Solicita-se que o texto do TCLE seja alterado de forma a apresentar todosos riscos relacionados à coleta de sangue.Resposta: Foi retirada a frase "Não há riscos previsíveis na realização deste exame" e acrescentada a seguintefrase: "Os riscos associados à coleta de sangue são edema (inchaço) local, hematoma por extravasamento desangue e infecções no local da punção.".Análise: Pendência atendida.
c. De acordo com a Carta Circular N°. 003/2011/CONEP/CNS, tendo em vista sua vulnerabilidade no
E-mail:
Endereço:Bairro: CEP:
Telefone:UF: Município:
154
COMISSÃO NACIONAL DEÉTICA EM PESQUISA
momento de adesão a um protocolo de pesquisa, o sujeito de pesquisa ou seu representante, quando for ocaso, bem como o pesquisador responsável, deverão rubricar todas as folhas do Termo de ConsentimentoLivre e Esclarecido - TCLE, apondo suas assinaturas na última página do referido Termo. Ratifica-se que deveser informado que o mesmo será elaborado em duas vias, sendo uma retida com o pesquisador responsável eoutracom o sujeito de pesquisa (Resolução CNS 196/96 item IV.2.d, VI.2.g). Solicitam-se adequações.Resposta: Foi realizada a adequação sendo colocada a seguinte frase: O responsável pelo paciente e opesquisador deverão rubricar todas as folhas do ¿Termo de Consentimento Livre e Esclarecido¿ e assinar aúltima página. O documento será elaborado em duas vias, sendo que uma ficará com o responsável pelopaciente e a outra com o pesquisador.Análise: Pendência atendida.
d. Não há garantia de indenização em caso de danos relacionados ao estudo. De acordo com o preconizadopelos itens III.3.q, IV.1.d e V.6 da Resolução CNS 196/96, os sujeitos de pesquisa têm o direito de assistênciaintegral e indenização e exige-se que no TCLE constem as formas de acompanhamento e assistência, assimcomo seus responsáveis. É necessário que seja expresso de modo claro e afirmativo o direito de assistênciaintegral gratuita, sob responsabilidade do patrocinador, ao sujeito de pesquisa, pelo temponecessário, em caso de danos decorrentes de sua participação no projeto de pesquisa. Solicita-se adequação.Resposta: Foi realizada a adequação sendo colocada a seguinte frase: Os pacientes que participarem dapesquisa terão direito a assistência integral gratuita pelo tempo necessário em casos de danos decorrentes dosprocedimentos realizados para a pesquisa. Este acompanhamento será realizado pelo responsável pelapesquisa e inclui o tratamento clínico e eventuais exames ou medicamentos que forem necessários.Análise: Pendência atendida.
e. O estudo prevê a realização de testes genéticos, no entanto, no TCLE não constam tais informações. Deacordo com o item V.1 da Resolução CNS 340/2004, o TCLE de estudos pertencentes à área temática especial"Genética humana" devem apresentar:i) explicitação clara dos exames e testes que serão realizados, indicando genes/segmentos do DNA ou do RNAou produtos gênicos que serão estudados e sua relação com eventual condição do sujeito da pesquisa. Deacordo com a Carta Circular N°. 011/2012/CONEP/CNS/GB/MS, deve-se elencar as famílias dos genes aserem investigados, citando os genes e/ou loci específicos que efetivamente serão analisados, devendoconstar o compromisso de, se outros genes vierem a ser estudados, pertencerem à mesma família;ii) garantia de sigilo, privacidade e, quando for o caso, anonimato;iii) plano de aconselhamento genético e acompanhamento clínico, com a indicação dos responsáveis, semcustos para os sujeitos da pesquisa;iv) tipo e grau de acesso aos resultados por parte do sujeito, com opção de tomar ou não conhecimento dessasinformações;v) informação quanto a medidas de proteção de dados individuais, resultados de exames e testes, bem comodo prontuário, que somente serão acessíveis aos pesquisadores envolvidos e que não será permitido o acessoa terceiros (seguradoras, empregadores, supervisores hierárquicos. etc.);vi) informação quando a medidas de proteção individual contra qualquer tipo de discriminação e/ouestigmatização, individual ou coletiva. Solicitam-se adequações.Resposta: Foi realizada a adequação sendo colocada o seguinte texto: Será realizado um exame genético paraavaliar a presença de polimorfismos (alterações genéticas) que contribuam com a gravidade do quadro deBronquiolite. Serão estudados os dos polimorfismos nos seguintes genes: Toll-Like Receptor 4 (polimorfismosAsp299Gly - rs4986790, Thr399Ile - rs4986791, +896A/G, rs1927911), Toll-Like Receptor 2 (polimorfismosrs1898830, rs7656411), Toll-Like Receptor 9 (polimorfismos rs352162, rs187084), Rantes (polimorfismos -403G/A, -28C/G, In1.1T/C), receptor da vitamin D (polimorfismo Thr1Meth - rs10735810), JUN (polimorfismo -rs11688), IFNA5 (polimorfismo - rs10757212) e NOS2 (polimorfismo - rs1060826). Os dados serão tratados deforma sigilosa, com privacidade e apenas o pesquisador responsável terá acesso ao nome dos participantes.Os resultados dos exames serão acessíveis apenas aos pesquisadores envolvidos, e não será
E-mail:
Endereço:Bairro: CEP:
Telefone:UF: Município:
155
COMISSÃO NACIONAL DEÉTICA EM PESQUISA
permitido o acesso desses resultados a terceiros (seguradoras, empregadores, supervisores hierárquicos. etc.).Não será divulgado em nenhum momento o nome das crianças que participaram do estudo. Não haveráqualquer tipo de discriminação e/ou estigmatização, individual ou coletiva, em relação aos participantes dapesquisa. O pesquisador responsável, quando for o caso, fará o aconselhamento genético e acompanhamentoclínico, sem custo para o paciente participante da pesquisa. Os responsáveis pelo paciente terão acesso aosresultados dos exames, e poderão optar por tomar ou não conhecimento dessas informações.Análise: Pendência atendida.
Aprovado
Situação do Parecer:
Diante do exposto, a Comissão Nacional de Ética em Pesquisa - CONEP, de acordo com as atribuiçõesdefinidas na Resolução CNS 196/96, manifesta-se pela aprovação do projeto de pesquisa proposto.
Situação: Protocolo aprovado.
Considerações Finais a critério da CONEP:
03 de Outubro de 2012
Assinado por:
Aníbal Gil Lopes
(Coordenador)
E-mail:
Endereço:Bairro: CEP:
Telefone:UF: Município:
156
ANEXO 4
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Título da pesquisa: Avaliação das características epidemiológicas e genéticas
associadas à bronquiolite viral aguda grave
Responsável pela pesquisa: Alfonso Eduardo Alvarez – CRM: 80599
Instituição: Faculdade de Ciências Médicas - UNICAMP
Gostaríamos de convidá-los a participar de uma pesquisa médica, na qual
pretendemos investigar quais são os fatores que levam a maior gravidade da
Bronquiolite Viral Aguda. A importância desta pesquisa e os objetivos estão
descritos a seguir:
Justificativa: A Bronquiolite é uma doença com alta incidência que pode
evoluir de forma variável, desde leve até grave. Não se sabe ainda quais são
as características relacionadas ao paciente que determinam a gravidade da
doença. Algumas características clínicas e da história do paciente, bem como
do ambiente em que ela vive podem determinar a gravidade. Por outro lado,
tenta-se descobrir se alguma característica genética do paciente pode
contribuir para a gravidade do quadro. No Brasil são poucos os estudos que
determinaram as características clínicas, de história e do ambiente que
determinam a evolução da doença e não existe nenhum estudo avaliando as
características genéticas desses pacientes.
Por outro lado é importante o conhecimento de quais são os vírus responsáveis
pela Bronquiolite. Atualmente existem poucos estudos no Brasil que
determinaram quais são os vírus que acometem nossos pacientes.
Objetivos da pesquisa: O objetivo desta pesquisa é avaliar quais são as
características clínicas, da história, do ambiente e genéticas dos pacientes que
157
contribuem para a gravidade da Bronquiolite, bem como determinar quais são
os vírus responsáveis por essa doença em nosso país.
Procedimentos que serão utilizados para a realização da pesquisa:
1. Entrevista com os pais: consiste de uma entrevista com os pais sobre
a história do paciente, avaliando dados sobre o nascimento, tempo de
amamentação, quantidade de irmãos, doença que eventualmente a
criança apresente, presença de fumantes na casa, etc...
2. Exame da secreção de vias aéreas superiores: consiste em exame
onde é aplicado soro fisiológico na narina da criança e depois aspirado
esse material, para determinar quais os vírus que estão causando a
Bronquiolite. Cabe lembrar que esse é um exame de rotina nos
pacientes que apresentam Bronquiolite, sendo que o que muda é que
será realizado um exame mais completo e que determina com maior
precisão quais os vírus implicados, bem como avalia um maior numero
de vírus quando comparado ao exame tradicional. Não há riscos
previsíveis na realização deste exame.
3. Exame de sangue: trata-se de um exame do sangue da criança onde
serão avaliados se existem características genéticas que possam
contribuir com a incidência e gravidade da bronquiolite. Cabe lembrar
que esse exame será colhido na mesma punção realizada no momento
da coleta de outros exames que fazem parte da rotina no atendimento
aos pacientes com bronquiolite, não sendo necessário uma punção
diferente da que normalmente seria realizada. São necessários 2 ml de
sangue. Os riscos associados à coleta de sangue são edema (inchaço)
local, hematoma por extravasamento de sangue e infecções no local da
punção.
Benefícios esperados: o benefício esperado dessa pesquisa é o
conhecimento de quais são as características clínicas, de história, do ambiente
e genéticas dos pacientes que contribuem para a incidência e gravidade da
Bronquiolite. Com o conhecimento desses dados será possível determinar
158
quais são as crianças com maior risco de apresentar Bronquiolite bem como de
evoluir de forma grave. Outro benefício esperado é a determinação de quais
são os vírus responsáveis pela Bronquiolite em nosso meio.
Métodos alternativos para a obtenção das informações desejadas: não
existem outras maneiras de se obter as informações descritas acima que não
sejam através do exame da secreção das vias aéreas superiores e do exame
de sangue.
A não participação na pesquisa não acarretará em nenhuma mudança no
tratamento que a criança irá receber e no acompanhamento que será
realizado.
Os pacientes que participarem da pesquisa terão direito a assistência
integral gratuita pelo tempo necessário em casos de danos decorrentes
dos procedimentos realizados para a pesquisa. Este acompanhamento
será realizado pelo responsável pela pesquisa e inclui o tratamento
clínico e eventuais exames ou medicamentos que forem necessários.
Será realizado um exame genético para avaliar a presença de
polimorfismos (alterações genéticas) que contribuam com a gravidade do
quadro de Bronquiolite. Serão estudados os dos polimorfismos nos
seguintes genes: Toll-Like Receptor 4 (polimorfismos Asp299Gly -
rs4986790, Thr399Ile - rs4986791, +896A/G, rs1927911), Toll-Like Receptor
2 (polimorfismos rs1898830, rs7656411), Toll-Like Receptor 9
(polimorfismos rs352162, rs187084), Rantes (polimorfismos -403G/A, -
28C/G, In1.1T/C), receptor da vitamin D (polimorfismo Thr1Meth -
rs10735810), JUN (polimorfismo - rs11688), IFNA5 (polimorfismo -
rs10757212) e NOS2 (polimorfismo - rs1060826).
Os dados serão tratados de forma sigilosa, com privacidade e apenas o
pesquisador responsável terá acesso ao nome dos participantes. Os
resultados dos exames serão acessíveis apenas aos pesquisadores
159
envolvidos, e não será permitido o acesso desses resultados a terceiros
(seguradoras, empregadores, supervisores hierárquicos. etc.). Não será
divulgado em nenhum momento o nome das crianças que participaram do
estudo. Não haverá qualquer tipo de discriminação e/ou estigmatização,
individual ou coletiva, em relação aos participantes da pesquisa.
O pesquisador responsável, quando for o caso, fará o aconselhamento
genético e acompanhamento clínico, sem custo para o paciente
participante da pesquisa.
Os responsáveis pelo paciente terão acesso aos resultados dos exames,
e poderão optar por tomar ou não conhecimento dessas informações.
A participação na pesquisa não acarretará nenhum custo para o paciente,
não havendo portanto necessidade de reembolso.
O responsável pelo paciente e o pesquisador deverão rubricar todas as
folhas do “Termo de Consentimento Livre e Esclarecido” e assinar a
última página. O documento será elaborado em duas vias, sendo que uma
ficará com o responsável pelo paciente e a outra com o pesquisador.
Dados do Pesquisador:
Nome: Alfonso Eduardo Alvarez
Endereço: Av. Brasil, 1702 – Guanabara – CEP: 13070-178 – Campinas – SP
Telefone: (19) 32437227
E-mail: [email protected]
Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da
UNICAMP (para sugestões ou reclamações):
Endereço: Rua: Tessália Vieira de Camargo, 126 – CEP 13083-887 –
Campinas – SP
Telefone: (019) 3521-8936 ou 3521-7187
160
E-mail: [email protected]
Nome do paciente:_______________________________________________
Nome do responsável:____________________________________________
_____________________________ __________________________
Assinatura do responsável Assinatura do responsável
pelo paciente pela pesquisa
161
ANEXO 5
APROVAÇÃO PELO JORNAL DE PEDIATRIA PARA INCLUSÃO NA TESE
DO ARTIGO PUBLICADO
162
163
ANEXO 6
ATIVIDADES ACADÊMICAS REALIZADAS DURANTE O DOUTORADO
I) CARGOS EXERCIDOS
II) ARTIGOS COMPLETOS PUBLICADOS EM PERIÓDICOS
III) CAPÍTULOS DE LIVROS PUBLICADOS
IV) APRESENTAÇÕES DE TRABALHO EM CONGRESSOS
V) APRESENTAÇÃO DE PALESTRAS
VI) PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS CIENTÍFICOS
VII) ORGANIZAÇÃO DE EVENTOS CIENTÍFICOS
164
I) CARGOS EXERCIDOS
1) Presidente do Departamento de Pediatria da Sociedade de Medicina e Cirurgia de
Campinas (gestão 2011-2014).
2) Vice presidente do Comitê de Pneumologia da Sociedade de Pediatria de São Paulo
(gestão 2016-2019).
165
II) ARTIGOS COMPLETOS PUBLICADOS EM PERIÓDICOS
1) MARSON FAL; HORTENCIO TD; AGUIAR KT; RIBEIRO JD; CYFIUC Group.
Demographic, clinical, and laboratory parameters of cystic fibrosis during the last two
decades: a comparative analysis. BMC Pulm Med. 2015;15:3.
2) ADDE FV; ALVAREZ AE; BARBISAN BN; GUIMARAES BR. Recommendations
for long-term home oxygen therapy in children and adolescents. J Pediatr (Rio J).
2013;89(1):6-17.
3) ALVAREZ AE; MARSON FALM; BERTUZZO CS; ARNS CW; RIBEIRO JD.
Epidemiological and genetic characteristics associated with the severity of acute viral
bronchiolitis by respiratory syncytial virus. J Pediatr (Rio J). 2013;89(6):531-43.
166
III) CAPÍTULOS DE LIVROS PUBLICADOS
1) ALVAREZ AE; BARBISAN BN; GUIMARAES BR; ADDE FV. Oxigenoterapia
Domiciliar Prolongada. In: Adyléia A. Dalbo C. Toro; Lucia Harumi Muramato; Ana
Maria Cocozza. (Org.). Doenças Pulmonares em Pediatria. 2ed. São Paulo: Atheneu,
2014, p. 23-36.
2) ALVAREZ AE; SILVA FILHO LVRF. Asma: tratamento da crise. In: Adyléia A.
Dalbo C. Toro; Lucia Harumi Muramato; Ana Maria Cocozza. (Org.). Doenças
Pulmonares em Pediatria. 2ed. São Paulo: Atheneu, 2014, p. 119-130.
3) ALVAREZ AE; TORO ADC; RIBEIRO JD; GUGLIELMI AAG. Terapêutica
Corticosteroide na Patologia Pulmonar. In: Tatiana Rozov. (Org.). Doenças Pulmonares
em Pediatria. 2ed. São Paulo: Atheneu, 2012, p. 947-973.
4) ALVAREZ AE; TORO ADC; RIBEIRO JD; GUGLIELMI AAG. Oxigenoterapia e
Ventilação Não Invasiva Domiciliar Prolongada. In: Tatiana Rozov. (Org.). Doenças
Pulmonares em Pediatria. 2ed. São Paulo: Atheneu, 2012, p. 975-987.
167
IV) APRESENTAÇÕES DE TRABALHO EM CONGRESSOS
1) WOLLMEISTER E; BASTOS JCS; SILVA LHA; MARSON FAL; ALVAREZ AE;
BARACAT CE; RIBEIRO JD; ARNS CW; RICCETTO AGL. Vírus Sincicial
Respiratório em Lactentes Brasileiros – Dez anos, Duas Cootes / Dados
Epidemiológicos. IX Semana de Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da
UNICAMP – Maio de 2016.
2) WOLLMEISTER E; BASTOS JCS; SILVA LHA; MARSON FAL; ALVAREZ AE;
BARACAT CE; RIBEIRO JD; ARNS CW; RICCETTO AGL. Vírus Sincicial
Respiratório em Lactentes Brasileiros – Dez anos, Duas Cootes / Dados Clínicos. IX
Semana de Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP – Maio de 2016.
3) ALVAREZ AE; MARSON FAL; BASTOS JCS; BERTUZZO CS; ARNS CW;
RIBEIRO JD. Influence of Single Nucleotide Polymorphisms in Wheezing after Acute
Viral Bronchiolitis. XI Congreso de la Sociedad Latinoamericana de Neumologia
Pediátrica / XV Congresso Brasileiro de Pneumologia Pediátrica – Abril de 2016.
4) ALVAREZ AE; MARSON FAL; BASTOS JCS; BERTUZZO CS; ARNS CW;
RIBEIRO JD. Severe Acute Viral Bronchiolitis: A Genetic Entity. XI Congreso de la
Sociedad Latinoamericana de Neumologia Pediátrica / XV Congresso Brasileiro de
Pneumologia Pediátrica – Abril de 2016.
5) ALVAREZ AE; MARSON FAL; BASTOS JCS; BERTUZZO CS; ARNS CW;
RIBEIRO JD. One-Year follow-up of Infants hospitalized for Severe Acute Viral
Bronchiolitis. XI Congreso de la Sociedad Latinoamericana de Neumologia Pediátrica /
XV Congresso Brasileiro de Pneumologia Pediátrica – Abril de 2016.
6) ALVAREZ AE; MARSON FAL; BASTOS JCS; BERTUZZO CS; ARNS CW;
RIBEIRO JD. Severe Acute Viral Bronchiolitis in Infants: Clinical Features, Etiology
and Outcomes. XI Congreso de la Sociedad Latinoamericana de Neumologia Pediátrica
/ XV Congresso Brasileiro de Pneumologia Pediátrica – Abril de 2016.
168
7) MARSON FAL; BERTUZZO CS; ALVAREZ AE; RIBEIRO JD. Severe Acute
Viral Bronchiolitis and Allergic Asthma: a possible genetic response common. XI
Congreso de la Sociedad Latinoamericana de Neumologia Pediátrica / XV Congresso
Brasileiro de Pneumologia Pediátrica – Abril de 2016.
8) MARSON FAL; BERTUZZO CS; ALVAREZ AE; RIBEIRO JD. Severe Acute
Viral Bronchiolitis: a Genetic Profile. XI Congreso de la Sociedad Latinoamericana de
Neumologia Pediátrica / XV Congresso Brasileiro de Pneumologia Pediátrica – Abril de
2016.
9) ALVAREZ AE; MARSON FAL; ARNS CW; BERTUZZO CS; RIBEIRO JD.
Bronquiloite Viral Aguda Grave em Lactentes: Características Clínicas, Etiológicas e
Evolutivas. 37 Congresso Brasileiro de Pediatria - Outubro 2015.
10) ALVAREZ AE; MARSON FAL; BERTUZZO CS; ARNS CW; RIBEIRO JD.
Bronquiloite Viral Aguda Grave associada com a variabilidade em genes da resposta
inflamatória. 37 Congresso Brasileiro de Pediatria - Outubro 2015.
11) MARSON FAL; BERTUZZO CS; ALVAREZ AE; RIBEIRO JD. Uma possível
resposta genética para o risco de Asma em pacientes que tiveram Bronquiolite Viral
Aguda Grave. 37 Congresso Brasileiro de Pediatria - Outubro 2015.
12) MARSON FAL; ALVAREZ AE; BERTUZZO CS; RIBEIRO JD. The Genetics
Profile in the Allergic Asthma and Severe Acute Viral Bronchiolitis: Multiples
Phenotypes, the same Genes?. 61 Congresso Brasileiro de Genética – Setembro de
2015.
13) MARSON FAL; ALVAREZ AE; RIBEIRO JD. A Bronquiolite Viral Aguda Grave
é uma 'abertura' para a Asma Alérgica: uma possível resposta genética. X Congresso
Brasileiro de Asma / XVI Congresso Paulista de Pneumologia e Tisiologia - Agosto de
2015.
169
14) MARSON FAL; ALVAREZ AE; RIBEIRO JD. A Bronquiolite Viral Aguda Grave
e os fatores de risco e gravidade genética associados a resposta inflamatória. X
Congresso Brasileiro de Asma / XVI Congresso Paulista de Pneumologia e Tisiologia -
Agosto de 2015.
TRABALHOS ACEITOS QUE AINDA SERÃO APRESENTADOS EM
CONGRESSOS
15) ALVAREZ AE; MARSON FAL; BASTOS JCS; BERTUZZO CS; ARNS CW;
RIBEIRO JD. Influence of single nucleotide polymorphisms in post-bronchiolitis
wheezings. European Respiratory Society International Congress – Setembro de 2016.
16) ALVAREZ AE; MARSON FAL; BASTOS JCS; BERTUZZO CS; ARNS CW;
RIBEIRO JD. Severe Acute Viral Bronchiolitis: A Genetic Entity. European
Respiratory Society International Congress – Setembro de 2016.
170
V) APRESENTAÇÃO DE PALESTRAS
1) Lactente sibilante: Evolução a longo prazo dos lactentes internados com Bronquiolite
Viral Aguda Grave: até quando vão chiar?. 14 Congresso Paulista de Pediatria - Março
2016.
2) Utilização Correta dos Dispositivos Inalatórios: Teoria e Prática. Reunião Geral do
Departamento de Pediatria da UNICAMP – Novembro de 2015.
3) Atualização em asma em Pediatria – Vitória. 2015.
4) Atualização em asma em Pediatria - Campinas. 2015.
5) Atualização em asma em Pediatria – São Carlos. 2015.
6) Atualização em asma em Pediatria – Rio Claro. 2015.
7) Atualização em asma em Pediatria – Americana. 2015.
8) Atualização em asma em Pediatria – Lorena. 2015.
9) Caso Clínico em Pneumologia. III Jornada de Alergia e Imunologia no Consultório.
III Jornada de Alergia e Imunologia em Consultório - Abril de 2015.
10) Prática de Dispositivos Inalatórios. III Jornada de Alergia e Imunologia no
Consultório. III Jornada de Alergia e Imunologia em Consultório - Abril de 2015.
11) Dispositivos Inalatórios: Teoria e Prática. Reunião Geral do Departamento de
Pediatria do Hospital Vera Cruz – 2015.
12) Atualização em Pneumologia Pediátrica. Curso de Atualização em Pediatria da
Sociedade de Medicina e Cirurgia de Campinas – Maio de 2014.
171
13) Protocolo diagnóstico-terapêutico em sibilantes persistentes na idade pré-escolar –
Barretos. Jornada de Pneumologia de Barretos – Agosto de 2013.
14) Bronquiloite Viral Aguda – APM de Piracicaba – Julho de 2013.
15) Atualização em asma em Pediatria - Campinas. 2013.
16) Atualização em asma em Pediatria - Piracicaba. 2013.
17) Febre sem sinais localizatórios e antitérmicos em Pediatria - Sorocaba. 2013.
18) Febre sem sinais localizatórios e antitérmicos em Pediatria - Ribeirão Preto. 2013.
19) Febre sem sinais localizatórios e antitérmicos em Pediatria - Campinas. 2013.
20) Atualização em asma em Pediatria - Campinas. 2012.
21) Atualização em asma em Pediatria - Jundiaí. 2012.
22) Atualização em asma em Pediatria - Indaiatuba. 2012.
172
VII) PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS CIENTÍFICOS
1) XI Congreso de la Sociedad Latinoamericana de Neumologia Pediátrica / XV
Congresso Brasileiro de Pneumologia Pediátrica. Abril de 2016.
2) 14 Congresso Paulista de Pediatria - Março 2016.
3) 37 Congresso Brasileiro de Pediatria - Outubro 2015.
4) Acompanhamento da Síndrome de Down - Curso de Atualização em Pediatria da
Sociedade de Medicina e Cirurgia de Campinas – Setembro de 2015.
5) Doença do Refluxo X Regurgitação - Curso de Atualização em Pediatria da
Sociedade de Medicina e Cirurgia de Campinas – Agosto de 2015.
6) III Jornada de Alergia e Imunologia no Consultório. III Jornada de Alergia e
Imunologia em Consultório - Abril de 2015.
7) X Congresso Brasileiro de Asma / XVI Congresso Paulista de Pneumologia e
Tisiologia - Agosto de 2015.
8) Curso de Atualização em Pediatria da Sociedade de Medicina e Cirurgia de
Campinas - 2014.
9) Curso de Atualização em Gastroenterologia Pediátrica – Novembro de 2013.
10) Curso de Atualização em Gastroenterologia Pediátrica. Presidente de mesa:
Diagnóstico diferencial da icterícia no primeiro mês de vida – Novembro de 2013.
11) Curso de Atualização em Gastroenterologia Pediátrica. Secretario de mesa: Desafios
frequentes na prática pediátrica – Novembro de 2013.
173
12) Curso de Atualização em Pediatria da Sociedade de Medicina e Cirurgia de
Campinas - 2013.
13) Intergastro 2013 - Projeto Interdisciplinar de Atualização em Aparelho Digestivo e
Trauma. Vômitos no Lactente. Moderador da Palestra: Vômitos no Lactente – Maio de
2013.
14) Intergastro 2013 - Projeto Interdisciplinar de Atualização em Aparelho Digestivo e
Trauma – Maio de 2013.
15) IV Encontro de Atualização em Vírus Respiratórios – Abril de 2013.
16) Jornada de Pneumologia de Barretos – Agosto de 2013.
17) Curso de Atualização em Pediatria da Sociedade de Medicina e Cirurgia de
Campinas - 2012.
18) II Curso de Atualização em Pediatria do Hospital Vera Cruz - 2012.
19) XXXVI Congresso Brasileiro de Pneumologia e Tisiologia – Dezembro de 2012.
174
VII) ORGANIZAÇÃO DE EVENTOS CIENTÍFICOS
1) Curso de Atualização em Pediatria da Sociedade de Medicina e Cirurgia de
Campinas - 2014.
2) Curso de Atualização em Pediatria da Sociedade de Medicina e Cirurgia de
Campinas - 2013.
3) Curso de Atualização em Pediatria da Sociedade de Medicina e Cirurgia de
Campinas - 2012.
175