faculteit bio-ingenieurswetenschappen academiejaar 2011 2012 · bovendien zijn de stomata van de...
TRANSCRIPT
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2011 – 2012
Donkerstress bij orchideeën (Phalaenopsis sp.)
Jarinda Viaene Promotoren: Prof. dr. ir. Kathy Steppe en dr. ir. Veerle De Schepper
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Bos- en Natuurbeheer
Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen
Academiejaar 2011 – 2012
Donkerstress bij orchideeën (Phalaenopsis sp.)
Jarinda Viaene Promotoren: Prof. dr. ir. Kathy Steppe en dr. ir. Veerle De Schepper
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Bos- en Natuurbeheer
De auteur en de promotoren geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te
stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de
beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting
uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.
The author and promotors give the permission to use this thesis for consultation and to copy
parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright law, more specifically
the source must be extensively specified when using results from this thesis.
Gent, 1 juni 2012
De promotor, De promotor, De auteur,
Prof. dr. ir. K. Steppe dr. ir. V. De Schepper Jarinda Viaene
i
WOORD VOORAF
Toen Prof. Steppe vorig jaar het onderwerp van deze masterthesis op het laatste moment in de
keuzelijst opnam, was ik zo gelukkig dat er toch nog een thesisonderwerp was waar ik
vlinders van in mijn buik kreeg. ‘Donkerstress bij orchideeën’, het leek mij een heel boeiend
onderzoek waarbij de praktische implicaties van groot belang waren. En dat was het ook. De
uitvoering van de experimenten verliep echter niet altijd van een leien dakje, vooral de
continue fotosynthese- en transpiratiemetingen met de bladcuvette en branchbags kostten mij
letterlijk bloed, zweet en tranen. Gelukkig kon ik steeds op de steun van vele mensen rekenen,
zonder hen had ik deze opdracht nooit kunnen volbrengen. Bij deze wil ik hen dan ook
bedanken.
Een eerste dankwoord gaat uit naar mijn promotor Prof. Kathy Steppe voor de vele hulp
tijdens mijn eerste proeven en het eindeloze enthousiasme. Ik ken werkelijk niemand die zo
motiverend is als jij Kathy, een bezoekje bij jou zorgde elke keer voor nieuwe energie.
Ik wil ook mijn tweede promotor, dr. ir. Veerle Deschepper met heel mijn hart bedanken.
Veerle, zonder jou had ik deze thesis nooit tot zo een goed einde kunnen brengen. Je hebt mij
vele wetenschappelijke inzichten bijgebracht en ik kon steeds bij je terecht met al mijn
vragen. Ook bedankt om mijn thesis zo grondig na te lezen.
Een speciaal woord van dank gaat uit naar Veerle Lamote van Microflor voor het leveren van
de orchideeën. Ook van harte bedankt om mijn literatuurstudie kritisch na te lezen.
Ik mag hier ook zeker onze ‘manusjes-van-alles’ Philip, Geert, Erik en Thomas niet vergeten.
Zonder hun technische hulp zou dit onderzoek nooit tot stand zijn gekomen. Ook de andere
medewerkers van het labo wil ik bedanken voor hun motivatie, goede raad en de lekkere
taartjes. Mijn mede-thesisstudenten ben ik zeer dankbaar voor de leuke en ontspannende
momenten in ons ‘thesiskot’.
Mijn broer verdient ook een speciaal dankwoordje om mij te helpen met de verwerking van de
figuren. Mijn ouders, grootouders en vrienden wil ik bedanken om er altijd voor mij te zijn
wanneer het nodig was. Hun luisterend oor, relativeringsvermogen en optimisme waren voor
mij van onschatbare waarde om door de moeilijke momenten te raken.
Last but not least, mijn allerliefste schat Jonas. Ik kan nooit verwoorden wat je voor mij
betekent en hoe dankbaar ik je ben voor alles wat je al voor mij hebt gedaan.
Jarinda Viaene,
juni 2012
iii
SAMENVATTING
De laatste decennia is de populariteit van Phalaenopsis orchideeën als kamperplanten sterk
toegenomen. Door het grote economische belang willen orchideeëntelers voortdurend het
productieproces optimaliseren. Tijdens dit productieproces wordt Phalaenopsis vaak
(intercontinentaal) getransporteerd waarbij de planten continu in het donker worden
gehouden. Deze transportomstandigheden veroorzaken bij bepaalde hybriden knopval na het
transport. De knopval brengt een daling in de kwaliteit en de commerciële waarde van de
orchideeën teweeg. Uit de literatuur blijkt dat ethyleen een sleutelrol speelt bij het afvallen
van de knoppen aangezien ethyleeninhibitoren de knopval verhinderen. De precieze oorzaak
is echter nog niet achterhaald. Vanwege de vele onduidelijkheden over de negatieve invloed
van donkertransport bij Phalaenopsis, wordt in deze masterthesis de link tussen knopval en
donkertransport bij Phalaenopsis onderzocht.
Tijdens het onderzoek werd het donkertransport gesimuleerd bij vier verschillende
Phalaenopsis hybriden. Ze werden aan een donkerperiode van vijf dagen blootgesteld, waarna
ze 14 dagen een dag/nachtregime (12u licht/12u donker) kregen dat zes à zeven uur
verschoven was ten opzichte van het oorspronkelijke regime. De knopval na de donkerperiode
werd opgevolgd om de knopvalgevoeligheid van de hybriden in te schatten. De fotosynthese-,
transpiratie- en chlorofyl fluorescentiemetingen op de bladeren en bloemstengels werden
gelinkt aan de geobserveerde knopval.
Uit de waargenomen knopval kwam naar voor dat alle hybriden knopvalgevoelig waren na
een donkerperiode van vijf dagen. Enkel knoppen kleiner dan 2,0 cm vielen af. Aangezien
geen uniforme methode beschikbaar is om de mate van knopvalgevoeligheid te bepalen,
werden enkele suggesties gegeven. De knopval wordt best procentueel ten opzichte van het
oorspronkelijk aantal knoppen uitgedrukt. Bovendien is het belangrijk dat de knopval
gemiddeld per hybride wordt bepaald. Ook moet een keuze gemaakt worden tussen enkel
grote knoppen (commercieel belangrijker) of alle knoppen in rekening brengen.
Een bijkomend aspect van dit onderzoek was het voorstellen van een screeningmethode om de
knopvalgevoeligheid van een hybride snel te kunnen inschatten. De maximale efficiëntie van
de fotochemische reacties van PS II in het licht-geadapteerde blad (Fv’/Fm
’) en de niet-
fotochemische quenching (NPQ) in het donker tijdens de herstelperiode bleken hiervoor
geschikte parameters. Een significant lagere Fv’/Fm
’ en een hogere NPQ wezen namelijk op
meer knopvalgevoeligere hybriden.
Door het linken van de fluorescentie-, fotosynthese- en transpiratiemetingen met de knopval
werd de oorzaak van de knopval beredeneerd. Een langdurige donkerperiode zorgt voor stress
ter hoogte van PS II in de bladeren waardoor de planten stresshormonen zoals ethyleen willen
produceren. 1-ACC, de precursor van ethyleen, kan echter niet worden omgezet in ethyleen
door zuurstoftekort. De lichtreacties, die voor zuurstof zorgen, gaan namelijk niet door.
Bovendien zijn de stomata van de bladeren gesloten waardoor geen exogeen zuurstof wordt
opgenomen. Knopvalgevoelige hybriden ondervinden meer stress aan PS II en produceren dus
meer 1-ACC. Via de transpiratie kan 1-ACC naar de bloemen en knoppen worden
getransporteerd. De bladeren van de knopvalgevoelige hybriden transpireren minder in de
iv
donkerperiode waardoor het transport van 1-ACC naar de bloemen en knoppen groter is.
Wanneer de orchideeën terug licht krijgen, kan 1-ACC in de knoppen worden omgezet naar
ethyleen, wat knopval induceert. Bij de gevoeligere hybriden zal de knopval dus groter zijn
aangezien de concentratie 1-ACC in de knoppen hoger is.
v
ABSTRACT
Over the last few decades, the popularity of Phalaenopsis as an indoor plant has been
strongly increasing. Because of the great economic importance, orchid growers want to
continuously optimize its production process. During this process Phalaenopsis is often
(intercontinentally) transported while the plants are constantly kept in the dark. Because of
these transport conditions, certain hybrids show bud drop after the transport. The abortion of
the buds makes the orchids less commercially valuable due to quality loss. The literature
shows that ethylene plays a key role in the abortion of the buds because ethylene inhibitors
prevent the bud drop. The exact cause however, is not yet clear. Because of the many
ambiguities about the negative impact of dark transportation of Phalaenopsis, the link
between bud drop and transportation of Phalaenopsis in the dark is investigated in this
masterthesis.
During the investigation the transportation in the dark was simulated with four different
Phalaenopsis hybrids. They were exposed to a dark period of five days. Afterwards they got a
day/night regime (12h light/12h dark) that was shifted six to seven hours relative to the
original regime during 14 days. The bud drop after the dark period was followed to estimate
the sensitivity to bud drop of the four hybrids. The photosynthesis, transpiration and
chlorofyll fluorescence measurements on the leaves and flower stalks were linked to the
observed bud drop.
The observed bud drop proved that all hybrids were sensitive to bud drop after a dark period
of five days. Only buds smaller than 2,0 cm fell off. Since there is no uniform method
available to determine the degree of bud drop sensitivity, a few recommendations were
proposed. The bud drop is best expressed as a percentage of the original amount of buds.
Moreover, it is important that the bud drop is determined as an average per hybrid. Also the
grower has to make a choice between only taking the great buds (commercially more
important) or all buds into account to determine bud drop sensitivity.
An additional aspect of this experiment was the proposal of a quick screening method to
verify the sensitivity of a hybrid to bud drop. The maximum quantum efficiency of PS II
photochemistry in the light adapted state (Fv’/Fm
’) and the non-photochemical quenching
(NPQ) in the dark during the recovery period seemed to be adequate parameters. A
significantly lower Fv’/Fm
’ and higher NPQ indicated more bud drop sensitive hybrids.
The cause of bud abortion could be deduced by linking the fluorescence, photosynthesis and
transpiration measurements with the bud drop. A prolonged dark period creates stress at the
level of PS II in the leaves causing the plants to produce stress hormones such as ethylene.
However, 1-ACC (the precursor of ethylene) can’t be converted in ethylene because the lack
of oxygen. The light-dependent reactions, which provide oxygen, can’t take place. In addition,
the stomata in the leaves are closed so no exogenous oxygen is taken in. Bud drop sensitive
hybrids encounter more stress at the level of PS II and thus produce more 1-ACC. Through
the transpiration 1-ACC can be transported to the flowers and buds. The leaves of the bud
drop sensitive hybrids transpirate less during the dark period resulting in a greater transport of
1-ACC to the flowers and buds. When the orchids are exposed to light again, 1-ACC could be
vi
converted into ethylene in the buds which induces bud drop. The more bud drop sensitive
hybrids will have a greater bud drop because of the larger concentration 1-ACC in the buds.
vii
INHOUDSOPGAVE
Hoofdstuk 1 Probleemstelling en doel van het onderzoek 1.1. Probleemstelling ........................................................................................................... 1 1.2. Klimaatcondities als stressfactoren tijdens Phalaenopsis transport ............................. 1 1.3. Bloemeigenschappen van Phalaenopsis relevant voor knopval .................................. 2 1.4. Ethyleen induceert bloem- en knopval ......................................................................... 3
1.5. Voorkomen van bloem- en knopval met 1-MCP ......................................................... 4 1.6. Hypothese en doel van het onderzoek .......................................................................... 5
Hoofdstuk 2 Algemene eigenschappen van orchideeën en hun CAM cyclus 2.1. Economisch belang van orchideeën en Phalaenopsis .................................................. 7 2.2. Het geslacht Phalaenopsis............................................................................................ 8
2.2.1 Historiek, herkomst en anatomie van orchideeën .................................................... 8 2.2.2 Teelt ....................................................................................................................... 10
2.3. Crassulacean Acid Metabolism .................................................................................. 12
2.3.1 Wat is CAM? ......................................................................................................... 13 2.3.2 Vier fasen ............................................................................................................... 13 2.3.3 Invloed van omgevingsfactoren op de CAM cyclus en bloemontwikkeling ......... 15
Hoofdstuk 3 Materiaal en methoden 3.1. Plantmateriaal ............................................................................................................. 19 3.2. Proefopzet ................................................................................................................... 19 3.3. Bloemen en knoppen .................................................................................................. 20 3.4. Microklimaat .............................................................................................................. 20
3.5. Continue bepaling van de CO2 en H2O uitwisseling .................................................. 20 3.5.1 Meetprincipe .......................................................................................................... 22
3.5.2 Kalibratie ............................................................................................................... 23 3.6. Discontinue bepaling van de CO2 en H2O uitwisseling ............................................. 24 3.7. Chlorofyl-a fluorescentieparameters .......................................................................... 25
3.7.1 Theoretische achtergrond ...................................................................................... 26 3.8. Statistische analyse ..................................................................................................... 30
Hoofdstuk 4 Resultaten 4.1. Microklimaat .............................................................................................................. 31
4.2. Knopval ...................................................................................................................... 32 4.3. Fluorescentieparameters ............................................................................................. 33 4.4. Fotosynthese en transpiratie ....................................................................................... 37
4.4.1 Bladeren ................................................................................................................. 37
4.4.2 Bloemstengels ........................................................................................................ 40
Hoofdstuk 5 Discussie 5.1. Definitie knopvalgevoeligheid ................................................................................... 43 5.2. Fluorescentieparameters als screeningparameters ...................................................... 44
5.2.1 Hogere efficiëntie van PS II en grote flexibiliteit als reactie op donkerstress ...... 44
5.2.2 Dalende efficiëntie van PS II wanneer de donkerperiode vorderde ...................... 46 5.2.3 Sommige fluorescentieparameters zijn gerelateerd aan de knopvalgevoeligheid . 46
5.3. De rol van fotosynthese en transpiratie bij verhoogde knopval na donkerstress ....... 47 5.3.1 Bladeren ................................................................................................................. 47 5.3.2 Bloemstengels ........................................................................................................ 48 5.3.3 Link met knopval ................................................................................................... 48
Hoofdstuk 6 Conclusies en perspectieven 6.1. Algemene besluiten .................................................................................................... 51 6.2. Suggesties voor verder onderzoek .............................................................................. 53
Hoofdstuk 7 Referenties
ix
LIJST VAN AFKORTINGEN
1-ACC 1-aminocyclopropaan-1-carbonzuur
A Bladoppervlakte
AdoMet S-adenosyl-L-methionine
AOA ACC synthase inhibitor aminooxy azijnzuur
ATP Adenosinetrifosfaat
AVG Aminoethoxyvinylglycine
CAM Crassulacean Acid Metabolism
CITES ‘The Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna
and Flora’
D Luchtdebiet
DACP Diazocyclopropeen
DOY ‘Day Of the Year’
E Netto H20 uitwisselingssnelheid
ETR Elektronentransportsnelheid
F ‘Steady-state’ fluorescentieniveau in de donker-geadapteerde fase
F’ ‘Steady-state’ fluorescentieniveau in de licht-geadapteerde fase
Fm Maximaal fluorescentieniveau in de donker-geadapteerde fase
Fm’ Maximaal fluorescentieniveau in de licht-geadapteerde fase
F0 Minimaal fluorescentieniveau in de donker-geadapteerde fase
F0’ Minimaal fluorescentieniveau in de licht-geadapteerde fase
Fv Variabel fluorescentieniveau in de donker-geadapteerde fase
Fv’ Variabel fluorescentieniveau in de licht-geadapteerde fase
Fv/Fm Maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II in de donker-
geadapteerde fase
Fv’/Fm
’ Maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II in de licht-
geadapteerde fase
Fq’ Verschil in fluorescentie tussen Fm
’ en F
’
Fq’/Fm
’ Actuele efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II
IR Infraroodstraling
LHC ‘Light harvesting complex’
1-MCP 1-methylcyclopropeen
MM Molaire massa
NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (gereduceerde vorm)
NUE ‘Nitrogen Use Efficiency’
NPQ Niet-fotochemische quenching
P Druk
PAR Fotosynthetisch actieve straling
PEP Fosfoenolpyruvaat
PEPC Fosfoenolpyruvaat-carboxylase
Pn Netto CO2 uitwisselingssnelheid
PPFD ‘Fotosynthetic Photon Flux Density’
PS I Fotosysteem I
PS II Fotosysteem II
x
QA Primaire elektronenacceptor van PS II
qP Fotochemische quenching
R Universele gasconstante
RH Relatieve luchtvochtigheid
Rubisco Ribulose-1,5-bifosfaat carboxylase/oxygenase
STS Zilverthiosulfaat
T Temperatuur
VPD Waterdampdrukdeficiet
WUE ‘Water use efficiency’
Hoofdstuk 1
Probleemstelling en doel van
het onderzoek
Probleemstelling en doel van het onderzoek
1
In dit hoofdstuk wordt de probleemstelling en het doel van deze masterthesis beschreven,
samen met de hieromtrent relevante literatuur. Voor lezers die niet gespecialiseerd zijn in
orchideeën en hun fotosynthese mechanisme wordt verwezen naar het volgende hoofdstuk
waar het Crassulacean Acid Metabolism (CAM) en de algemene eigenschappen van
orchideeën worden beschreven.
1.1. Probleemstelling
Phalaenopsis orchideeën zijn één van de belangrijkste sierplanten van deze eeuw. Daarom
wordt er veel belangstelling gehecht aan de optimalisatie van het productieproces.
Phalaenopsis orchideeën worden geïmporteerd in onze streken om het assortiment uit te
breiden en om de hoge energiekosten, vereist voor de teelt, te drukken. Dit nationaal tot
intercontinentaal transport gebeurt tijdens de verschillende stadia van de teelt. Bijvoorbeeld,
de cultivarontwikkeling vindt plaats in de VS, de geselecteerde klonen worden vervolgens via
weefselcultuur gekweekt in Japan, waarna massaproliferatie van de weefselculturen gebeurt in
China. Ten slotte worden de niet-bloeiende planten opgegroeid in Europa (vb. Nederland en
België) (Griesbach, 2002). Na opkweek worden ze getransporteerd naar binnen- en
buitenlandse bedrijven voor verdere groei en verkoop.
Tijdens het transport, dat vaak langer dan drie dagen duurt, bevinden de planten zich in
suboptimale condities: ze worden continu in het donker gehouden, geschud en blootgesteld
aan variërende temperaturen. Uit de praktijk blijkt dat deze transportcondities voor bepaalde
hybriden knopval induceren. Het wordt geschat dat ongeveer vier à vijf procent van de
verhandelde Phalaenopsis planten knopval vertoont (persoonlijke communicatie met veiling
Aalsmeer). Deze knopval is een groot probleem voor de orchideeënkwekerijen omdat ze de
kwaliteit en de commerciële waarde van de planten negatief beïnvloedt. De planten worden
namelijk tweede keuze op de veiling vanals er één knop is afgevallen. Het verlies voor de
sector wordt geraamd op 10 miljoen euro per jaar (persoonlijke communicatie met V. Lamote,
Microflor). In de literatuur is echter weinig beschreven over de oorzaken van deze knopval.
1.2. Klimaatcondities als stressfactoren tijdens Phalaenopsis
transport
Zolang slechts één klimaatfactor limiterend is tijdens het transport van Phalaenopsis zal geen
fotosynthetische stress worden geïnduceerd (Su et al., 2001). Een combinatie van
verschillende limiterende factoren (dehydratatie en donkerbehandeling) leidt echter wel tot
een sterke onderdrukking van de fotosynthetische activiteit. Hierdoor verloopt het
donkertransport best bij een relatief lage temperatuur en een hoge relatieve luchtvochtigheid
(RH). Zo kunnen de Phalaenopsis planten hun waterinhoud en fotosynthetische activiteit
behouden. Meer specifiek wordt Phalaenopsis het best getransporteerd bij 25°C tijdens de
zomerperiode en tussen de 25°C en 15°C vanaf de late herfst tot de vroege lente (Wang,
2007). Hogere temperaturen induceren namelijk gewichtsverlies (warmte stress), terwijl
lagere temperaturen de kiltegevoeligheid (vlekken op het blad) vergroten. Het tijdstip van
scheutvorming werd tijdens een donkertransport van 14 dagen niet beïnvloed wanneer
Phalaenopsis planten werden opgeslagen bij een temperatuur tussen 15 en 25°C, maar bij
30°C werd de scheutgroei echter wel vijf tot acht dagen vertraagd (Wang, 2007). Het
Probleemstelling en doel van het onderzoek
2
transport gebeurt ook best met een potmedium, aangezien de opslag van Phalaenopsis zonder
potmedium resulteert in meer vergeelde bladeren en een groter waterverlies (Hou et al.,
2010). Na het transport wordt een acclimatisatieperiode van zes tot negen dagen aangeraden
om de fotosynthetische activiteit te verhogen (Hou et al., 2010). Tijdens deze periode wordt
aangeraden het lichtniveau gradueel te doen stijgen van 34 tot 200 μmol m-2
s-1
‘Photosynthetic Photon Flux Density’ (PPFD) of een constant lichtniveau van 140 μmol m-2
s-
1 PPFD te behouden.
1.3. Bloemeigenschappen van Phalaenopsis relevant voor knopval
Fotosynthese kan plaatsvinden in de bloemen van Phalaenopsis planten. Hierdoor kunnen de
bloemen groeien met zelf geproduceerde assimilaten (Aschan & Pfanz, 2003). De
chlorofylinhoud van orchideeënbloemen bedraagt ongeveer 10% van de bladeren (Goh,
1983). De fotosynthesesnelheden van de bloemen zijn afhankelijk van het
ontwikkelingsstadium en de bloemstructuur. Bijvoorbeeld, bij de Dendrobium soort daalt het
gebruik van de fotosynthetische stralingsenergie met de leeftijd van de bloemen (Aschan &
Pfanz, 2003) en bij Cymbidium orchideeën is de CO2 fixatie het hoogst in de kelkbladeren,
lager in de kroonbladeren en het laagst in het vruchtbeginsel (Dueker & Arditti, 1968). Een
groot voordeel van de bloemfotosynthese is de gunstige positie voor licht. Tijdens het
knopstadium zijn de kelk- en kroonbladeren namelijk de buitenste, bedekkende delen van de
reproductieve delen. Hierdoor wordt de efficiëntie van het gebruik van de stralingsenergie
gemaximaliseerd waardoor een hogere koolstofassimilatie kan plaatsvinden (Dueker &
Arditti, 1968). Bij Cymbidium bloemen wordt er in het licht meer CO2 gefixeerd dan in het
donker, maar het fotosynthese mechanisme in de bloemen kan bij sommige orchideeënsoorten
ook een zwak CAM metabolisme vertonen (Dueker & Arditti, 1968; Endo & Ikusima, 1989,
1992; Goh, 1983). De zuurfluctuaties die typisch zijn voor het CAM metabolisme werden in
de bloemen van sommige orchideeënsoorten (Arachnis, Aranda, Dendrobium en Vanda
hybriden) waargenomen (Goh, 1983). Deze fluctuaties waren kleiner maar vergelijkbaar met
die in de bladeren.
De epidermale laag van de kroonbladeren bevat stomata langswaar de CO2 uitwisseling, nodig
voor fotosynthese, plaatsvindt. De stomatale densiteit in de bloemen is vaak kleiner dan in de
bladeren (Aschan & Pfanz, 2003). De stomatale densiteit is het aantal stomata per
oppervlakte-eenheid en geeft een indicatie van de fotosynthetische capaciteit. Een hoge
densiteit geeft aanleiding tot efficiënte CO2 uitwisseling tussen de plant en de atmosfeer. De
stomatale geleidbaarheid geeft aan in welke mate de stomata geopend zijn, bij een hoge
geleidbaarheid zijn ze open. De bloemstomata van orchideeën blijken niet-functioneel,
aangezien de stomatale geleidbaarheid en transpiratie niet wordt beïnvloed door
veranderingen in CO2 concentratie, stralingsintensiteit, RH en abscissinezuur. Een continue
CO2 uitwisseling tijdens de dag en nacht is waargenomen en vereist bijgevolg een permanente
of op zijn minst partiële stomatale opening (Hew et al., 1980). Algemeen, zijn de bestaande
studies over CO2 uitwisseling bij Phalaenopsis (Lin & Hsu, 2004; Guo & Lee, 2006;
Ichihashi et al., 2008; Shin et al., 2009; Hou et al., 2010; Pollet et al., 2010, 2011) bijna altijd
gericht op de bladeren en is bijgevolg de bestaande data over fotosynthese bij stengels,
bloemen of knoppen zeldzaam. Ook de transpiratie van bladeren, bloemen, knoppen en
stengels bij Phalaenopsis is nagenoeg onbeschreven in de literatuur.
Probleemstelling en doel van het onderzoek
3
Licht heeft een sterk effect op de bloei van Phalaenopsis. Hoge lichtintensiteiten (12% van
het zonlicht, ongeveer 276 µmol m-2
s-1
) leiden bij Phalaenopsis tot vroegere bloei en meer,
grotere bloemen (Konow & Wang, 2001). Waarschijnlijk leidt een verhoogde fotosynthese tot
hogere suikerconcentraties en grotere groeisnelheden. De blootstelling van Phalaenopsis
hybriden (TAM Butterfly) aan lage lichtintensiteiten (zoals tijdens het transport) leidt tot
bloeivertraging (Wang, 1998). De donkeropslag, onafhankelijk van de temperatuur en de tijd,
resulteert steeds in minder bloemen, maar beïnvloedt de grootte van de bloemen niet (Wang,
2007). De donkerperiode kan ook het aantal zijtakken en het aantal bloemen op de primaire
stengel doen dalen (Hou et al., 2010).
1.4. Ethyleen induceert bloem- en knopval
Ethyleen speelt een sleutelrol in het reguleren van de biochemische en anatomische
veranderingen die het verouderen van de orchideebloemen induceren (Woltering & van
Doorn, 1988; Nadeau et al., 1993; Ketsa & Thampitakorn, 1995). Het plantenhormoon
ethyleen is een algemene groeiregulator die verschillende ontwikkelingsprocessen in de plant
beïnvloedt, zoals het rijpen van vruchten, veroudering en reactie op stress. Onder normale
omstandigheden produceren planten slechts zeer weinig ethyleen (Klee et al., 1991; Woltering
& Westra, 2010). Ethyleenbiosynthese wordt gestimuleerd door verschillende factoren zoals
ontwikkelingsstadium, omgevingscondities, andere planthormonen en fysische/chemische
stress. Ethyleenbiosynthese varieert ook in een circadiaans patroon, hoger gedurende de dag
en minimaal ’s nachts. De biosynthese van ethyleen in planten verloopt als volgt (Figuur 1.1).
L-methionine wordt geactiveerd door adenosinetrifosfaat (ATP) tot S-adenosyl-L-methionine
(AdoMet). AdoMet wordt vervolgens omgezet in 1-aminocyclopropaan-1-carbonzuur (1-
ACC) via het enzym ACC-synthase. De concentratie van dit enzym wordt gecontroleerd door
omgevings- en interne factoren zoals verwondingen, koudestress, droogtestress,
overstromingen, vruchtrijping, bloemveroudering en auxine. Tot slot wordt 1-ACC met
behulp van het enzym ACC-oxidase, dat zuurstof vereist, omgezet naar ethyleen. Niet al het
1-ACC wordt omgezet naar ethyleen, een deel kan ook omgezet worden naar een
geconjugeerde vorm: N-malonyl ACC. De conjugatie van 1-ACC kan een belangrijke rol
spelen in de controle van ethyleenbiosynthese. Methionine wordt gerecycleerd via de Yang
cyclus (Taiz & Zeiger, 2006).
Meer specifiek, wordt in orchideeën de veroudering van de bloem ingezet door een stijging in
ethyleenproductie en 1-ACC oxidase activiteit, wat autokatalytische productie van ethyleen
suggereert (Mapeli et al., 2009). Bloemknoppen blijken hogere ethyleenconcentraties te
produceren dan open bloemen (Ketsa & Thampitakorn, 1995). De bloemen en knoppen van
orchideeën blijken ook gevoelig te zijn aan exogeen ethyleen (Raffeiner, 2009; Sun et al.,
2009). Wanneer exogeen ethyleen werd toegediend aan Oncidium en Odontoglossum planten,
openden enkel de volledig ontwikkelde knoppen en stagneerde de ontwikkeling van
onvolgroeide knoppen die vervolgens afvielen (Raffeiner et al., 2009). Bij mini Phalaenopsis
planten induceert exogeen ethyleen knopval. De ethyleengevoeligheid verschilt echter wel
volgens cultivar (Sun et al., 2009). De knopval zou te wijten zijn aan beschadiging en
veroudering van de kroonbladeren, geïnduceerd door ethyleen. Zelfs zeer lage
ethyleenconcentraties van 0,1 ppm kunnen binnen enkele dagen bloem- en knopval
veroorzaken (Runkle et al., 2005d). Het mechanisme dat de invloed van ethyleen op knoppen
Probleemstelling en doel van het onderzoek
4
en bloemen bij Phalaenopsis orchideeën drijft, is momenteel nog niet achterhaald. Eveneens
wordt de link tussen donkertransport en knopval in de literatuur nagenoeg niet bestudeerd.
1.5. Voorkomen van bloem- en knopval met 1-MCP
Het verwelken/afvallen van bloemen en knoppen bij orchideeën wordt momenteel verhinderd
door gebruik te maken van de goed gekende ethyleenbiosynthese (Figuur 1.1) en van
ethyleeninhibitoren zoals zilverthiosulfaat (STS), diazocyclopropeen (DACP),
aminoethoxyvinylglycine (AVG) of ACC synthase inhibitor aminooxy azijnzuur (AOA) (Taiz
& Zeiger, 2006; Raffeiner et al., 2009). DACP en AOA zijn minder efficiënte inhibitoren dan
STS, maar STS brengt milieurisico’s met zich mee en is bijgevolg in vele landen verboden.
Recent werd het niet-toxische gas 1-methylcyclopropeen (1-MCP) geïntroduceerd dat het
effect van ethyleen kan tegengaan (Raffeiner et al., 2009). Behandelingen met 1-MCP vinden
plaats in een afgesloten ruimte en duren een aantal uren (Woltering & Westra, 2010). 1-MCP
zou binden met de ethyleenreceptor waardoor het reeds bij lage concentraties zeer specifiek
en actief is. Het succes van de 1-MCP behandeling is afhankelijk van het genotype, de
concentratie 1-MCP, de blootstellingstijd, de temperatuur en het ontwikkelingsstadium van de
plant (Raffeiner et al., 2009). Fumigatie van Phalaenopsis met 1-MCP (0,2 ppm) voor 6 uur
bij 25°C beschermt de bloemen voor ethyleenconcentraties tot 10 ppm. De periode van
bescherming is echter kort (zeven dagen bij 25°C) en daalt bij hogere temperaturen (Runkle et
Figuur 1.1 - Ethyleenbiosynthese en Yang cyclus. Methionine is de precursor van ethyleen. De snelheidsbepalende stap is de omzetting van S-adenosyl-L-methionine (AdoMet) naar 1-aminocyclopropaan-1-carbonzuur (1-ACC) met behulp van het enzym ACC-synthase. De omzetting van 1-ACC naar ethyleen wordt gekatalyseerd door het enzym ACC-oxidase, dat zuurstof vereist. De CH3-S groep van methionine wordt gerecycleerd via de Yang cyclus zodat continue synthese wordt verzekerd. 1-ACC kan ook ge-conjugeerd worden tot N-malonyl ACC. AOA = ACC synthase inhibitor aminooxy azijnzuur; STS = zilverthiosulfaat; AVG = ami-noethoxyvinylglycine; DACP = diazocyclopropeen (aangepast uit: Taiz & Zeiger, 2006).
Probleemstelling en doel van het onderzoek
5
al., 2005d). De effecten van ethyleen en 1-MCP op veroudering van de bloemen van de
genera Oncidium en Odontoglossum werden onderzocht door Raffeiner et al. (2009). 1-MCP
verlengde de houdbaarheid van de bloemen en voorkwam knopval bij Oncidium en
Odontoglossum. Drie tot zeven dagen na de behandeling met 1-MCP eindigde de
bescherming. 1-MCP verminderde ook de ethyleengeïnduceerde knopval bij mini
Phalaenopsis, cultivar Sogo ‘Yenlin’. Voorbehandeling met 1-MCP zou de
ethyleengeïnduceerde stijging van abscissinezuur in de bloemknoppen verhinderen
(Uthaichay et al., 2007) en zou de ACC-synthase activiteit in open bloemen en ACC-oxidase
activiteit in de bloemknoppen verlagen.
1.6. Hypothese en doel van het onderzoek
Vanwege de vele vragen omtrent de negatieve invloed van donkertransport bij Phalaenopsis,
spitst deze masterthesis zich toe op de link tussen knopval en donkerstress bij Phalaenopsis.
Er zal nagegaan worden of knopval na donkerstress, gepaard gaande met een
tijdsverschuiving ten gevolge van transport, kan verklaard worden door de volgende
hypothese. Tijdens een lange donkerperiode valt de fotosynthese stil in de bladeren. Door de
afwezigheid van licht wordt er geen ATP geproduceerd waardoor CO2 niet kan worden
ingebouwd in suikers tijdens de Calvincyclus. Deze geremde Calvincyclus doet de productie
van fosfoenolpyruvaat (PEP) stilvallen. Aangezien PEP bindt met de opgenomen CO2 uit de
lucht, doet een PEP tekort de interne CO2 concentratie stijgen waardoor de stomata sluiten en
de CO2 opname wordt beperkt. Een lichtperiode is bijgevolg noodzakelijk om de stomata ’s
nachts te openen (Klunge & Ting, 1978). Bij een langere donkerperiode vindt er dus geen
fotosynthese plaats. Hierdoor treedt er een tekort op aan zuurstof en hoopt 1-ACC op in de
bladeren en/of wortels omdat het niet kan worden omgezet naar ethyleen. Wanneer de planten
vervolgens terug in het licht worden geplaatst, beginnen de bloemen meer te transpireren en
vindt er een opwaartse beweging plaats van 1-ACC vanuit de bladeren naar de
bloemknoppen. Aangezien er op dat ogenblik wel voldoende zuurstof is, wordt 1-ACC
massaal omgezet naar ethyleen in de knoppen waardoor ze verkleuren en afvallen. Om deze
hypothese te verifiëren, zal tijdens een donkerperiode van één week en een herstelperiode van
14 dagen de fotosynthese, chlorofylfluorescentie en transpiratie van bladeren en
bloemstengels worden opgemeten. De verschillende variabelen zullen gerelateerd worden aan
de geobserveerde knopval. De waargenomen relaties zullen besproken worden in het kader
van de vooropgestelde hypothese.
Hoofdstuk 2
Algemene eigenschappen van
orchideeën en hun CAM cyclus
Algemene eigenschappen van orchideeën en hun CAM cyclus
7
In dit hoofdstuk wordt het economisch belang, de algemene kenmerken en het fotosynthese
mechanisme van Phalaenopsis besproken.
2.1. Economisch belang van orchideeën en Phalaenopsis
Orchideeën behoren wereldwijd tot één van de grootste segmenten van de sierteelt. De meeste
ochideeën worden gekweekt voor hun prachtige bloemen. Ze worden globaal vermarkt als
potplanten, snijbloemen en zelfs als perkplanten in tropische regio’s. Grootschalige
orchideeënproductie vindt plaats in China, Duitsland, Japan, Nederland, Taiwan, Thailand en
de Verenigde Staten (Lopez & Runkle, 2005; Cha-um et al., 2010).
De orchideeënteelt is de laatste 25 jaar sterk in opmars. In Nederland is van 1983 tot 2009 het
aantal verkochte orchideeën op veilingen gestegen van 50000 naar 96,4 miljoen potten. De
veilingopbrengst bedroeg in 2009 meer dan 331,5 miljoen euro, bijna het tiendubbele dan in
2000. In de VS is de productiewaarde van orchideeën van 1996 tot 2004 gestegen met 170%.
In 2009 werd de groothandelswaarde geschat op 159,6 miljoen dollar. Dit cijfer berust enkel
op de omzet van de grootste commerciële bedrijven en is dus zelfs een onderschatting.
Vandaag zijn orchideeën (waarvan 70 tot 90% Phalaenopsis) de tweede meest waardevolle
potplant in de VS (Griesbach, 2002; Lopez & Runkle, 2005; Ronse, 2008; Vakblad voor de
Bloemisterij, 2005, 2010).
Phalaenopsis domineert de orchideeënmarkt om verschillende redenen. De bloemen hebben
een lange levensduur en een brede waaier aan kleuren. Ze zijn ook gemakkelijk te verzorgen
en het is mogelijk om de bloei te plannen (Runkle et al., 2005a). Na een explosieve groei in
de Phalaenopsis teelt, volgden er echter enkele moeilijke jaren. In 2008 was er een overschot
op de aanbodmarkt waardoor de prijzen sterk daalden, hierdoor raakten vele kwekers in de
problemen. In 2009 bereikte de prijs een dieptepunt. In 2010 zorgde vooral het positieve
voorjaar voor een stijging van de gemiddelde jaarprijs. Om te kunnen overleven, trachten de
bedrijven de kostprijs zo laag mogelijk te houden. Een groot deel van de kwekers teelt daarom
Phalaenopsis in kragen en kokers. Deze zorgen ervoor dat het blad zich omhoog ontwikkelt in
plaats van opzij waardoor er meer planten op een vierkante meter kunnen staan. Ook wordt
gezocht naar rassen met een kortere teeltduur, beter gebruik van energie en verdergaande
automatisering. Een ander gevolg van het instorten van de Phalaenopsis markt was een
omslag in het assortiment. Er ontstond een spreiding van potmaten, een toename van
meertakkers en een breder assortiment van bijzondere kleuren en vormen (Vakblad voor de
Bloemisterij, 2011).
Het grote economische belang van orchideeën en meer specifiek van Phalaenopsis ligt aan de
basis van dit onderzoek. De orchideeënkwekers willen hun productieproces continu
optimaliseren. De nodige kennis over de invloed van verschillende milieufactoren op de groei
en ontwikkeling van Phalaenopsis halen ze uit wetenschappelijk onderzoek.
Algemene eigenschappen van orchideeën en hun CAM cyclus
8
2.2. Het geslacht Phalaenopsis
2.2.1 Historiek, herkomst en anatomie van orchideeën
Orchideeën werden in China al beschreven in meer dan drieduizend jaar oude boeken over
kruidengeneeskunde. Naast hun medicinale eigenschappen stonden ze symbool voor
elegantie, verfijning, nobelheid, zuiverheid en spirituele volmaaktheid. De eerste vermelding
van orchideeën in de Westerse geschiedenis gebeurde door de Griekse filosoof Theophrastus
(370 tot 285 voor Christus). Hij schreef over ‘Orkhis’, het Griekse woord voor teelbal. Deze
benaming verwijst naar de twee olijfvormige knollen waarvan de ene glad en hard en de
andere verschrompeld en zachter is. Ondertussen is geweten dat de harde knol overeenkomt
met de knol die tijdens het lopende jaar gevormd is en de zachtere knol met die van het jaar
ervoor. Deze knollen bevatten reservevoedsel voor de plant. Hoewel slechts een kleine
minderheid binnen de orchideeënfamilie deze bolvormige wortels bezitten, hebben de soorten
van het genus Orchis hun naam gegeven aan de volledige orchideeënfamilie, de Orchidaceae
(Ronse, 2008).
Vandaag vormen de orchideeën na de samengesteldbloemigen (Asteraceae) de tweede
grootste plantenfamilie ter wereld (Runkle et al., 2005a; Ronse, 2008). De orchideeënfamilie
bevat meer dan 25000 beschreven soorten, verdeeld in 859 genera en vijf subfamilies:
Apostasioideae, Cypripedioideae, Vanilloideae, Orchidoideae en Epidendroideae (Pollet,
2010). Orchideeën zijn niet alleen bijzonder omdat er zo veel verschillende soorten bestaan,
ze vallen ook op door hun grote variatie. In geen enkele andere plantenfamilie vind je zoveel
diversiteit qua kleur, geur, vorm en afmetingen (Ronse, 2008). Ondanks de grote diversiteit
aan orchideeën worden slechts een aantal genera in grote hoeveelheden commercieel geteeld.
De belangrijkste zijn Cymbidium, Dendrobium, Oncidium en Phalaenopsis (Pollet, 2010). In
deze thesis ligt de focus op het genus Phalaenopsis, de populairste kamerplant van Europa
(Ronse, 2008). In Nederland bijvoorbeeld behoort 75-80% van alle geproduceerde orchideeën
tot het genus Phalaenopsis (Oudshoorn, 2007). Sinds de jaren ’80 worden Phalaenopsis-
planten in Europa te koop aangeboden als bloeiende potplanten (Ronse, 2008). Volgens
Oudshoorn (2007) is de term Phalaenopsis-groep eigenlijk geschikter, want naast
Phalaenopsis zelf hebben ook andere geslachten een rol gespeeld bij de talrijke kruisingen.
Het succes van Phalaenopsis als kamerplant is te danken aan zijn bloemen die bijna het hele
jaar door kunnen bloeien. De afzonderlijke bloemen blijven meerdere maanden goed en als
een bloemstengel uitgebloeid is, kan deze aan de basis terug uitschieten en verder bloeien. De
naam Phalaenopsis is samengesteld uit het Griekse phalaina, dat ‘nachtvlinder’ betekent, en
opsis, wat ‘gelijkend op’ wil zeggen. De naam Phalaenopsis betekent dus letterlijk ‘gelijkend
op een nachtvlinder’ en werd aan de plant gegeven door ontdekkingsreizigers toen ze de
grote, witte bloemen van Phalaenopsis in het schemerduister van het oerwoud zagen bloeien
(Oudshoorn, 2007).
De orchideeënfamilie heeft een zeer groot verspreidingsgebied. Ongeveer overal waar
plantengroei is, komen ze voor. De standplaatsen variëren van zeeniveau tot hooggebergten,
vochtige gebieden en open, droge vegetaties (Ronse, 2008). Phalaenopsis is van oorsprong uit
de tropische en subtropische gebieden van de Zuid Pacifische eilanden en Azië (Runkle et al.,
2005c; Wang, 2007). Hun verspreidingsgebied omvat China, Japan, Nepal, Papoe-Nieuw-
Algemene eigenschappen van orchideeën en hun CAM cyclus
9
Guinea, Taiwan, de Filippijnen en tropisch Australië. De Filippijnen herbergen de grootste
concentraties aan soorten en veel daarvan hebben een zeer voorname rol gespeeld bij de
talloze kruisingen die zijn ontstaan (Oudshoorn, 2007; Pinske, 2009). Orchideeën kunnen in
drie groepen verdeeld worden naargelang hun manier van leven. Van alle orchideeënsoorten
leven 72% epifytisch, het gaat hier voornamelijk over tropische orchideeën (Silvera et al.,
2009). Epifyten gebruiken bomen als steun om meer licht op te vangen en leven van het vocht
en de humus op de boomtakken. Het zijn echter geen parasieten, ze beschadigen de bomen
niet. De meeste orchideeën uit de gematigde streken zijn terrestrisch en wortelen dus in de
grond. Sommige orchideeën bezitten geen bladgroen, maar zijn saprofyten. Dit zijn planten
die leven van dood organisch materiaal (Ronse, 2008).
Phalaenopsis behoort tot de epifytische orchideeën. Ze groeien dus vaak op aanzienlijke
hoogte. De RH is steeds hoger dan 80% en er valt ter plekke relatief veel neerslag, die
regelmatig over het jaar verdeeld is. De lichtintensiteit op de groeiplaatsen is niet erg groot,
enerzijds doordat de planten door de bladeren van de bomen tegen direct zonlicht worden
beschermd en anderzijds door de vele dagen waarop het bewolkt is (Oudshoorn, 2007). Dit
betekent dat orchideeën zuinig moeten zijn met water en voedingsstoffen. Het water dat ze
krijgen is meestal afkomstig van regen en in sommige gebieden ook van dauw of mist. Hun
voedingsstoffen halen ze uit afgevallen bladeren en stof of aarde die door de wind aangevoerd
worden. Vandaar dat orchideeën zeer traag groeien (Ronse, 2008). De epifytische groeiwijze
houdt ook in dat de wortels worden blootgesteld aan luchtbeweging. Met deze specifieke
kenmerken moet rekenening worden gehouden bij de samenstelling van het potmengsel.
Verluchting, capillaire krachten, water- en nutriëntenvasthoudende capaciteit, stabiliteit en
gewicht van het potmengsel zijn hierbij belangrijke parameters (Runkle et al., 2005b).
Phalaenopsis orchideeën behoren tot de monopodiale orchideeën. De stammen zijn meestal
slechts 30 cm lang. De bladeren zijn min of meer vlezig, meestal eivormig ovaal en 10 tot 40
cm groot. Naargelang de soort kunnen ze naar beneden hangen of zijwaarts afstaan. Bij
sommige soorten zijn ze bijna succulent. De bloeiwijzen ontspruiten telkens aan de onderste
bladoksels. Vaak zijn ze vertakt en afhankelijk van de soort tussen enkele centimeters en één
meter lang (Pinske, 2009). Orchideeën hebben specifieke kenmerken die niet bij andere
plantenfamilies voorkomen. Ze hebben maar één vruchtbare meeldraad. Meeldraad en
stempel zijn soms deels, maar meestal volledig vergroeid tot een orgaan, de zogenaamde zuil
of gynostemium. Bovendien vormen orchideeën talloze extreem kleine zaadjes zonder
reservevoedselorgaan. Naast deze specifieke kenmerken bezitten orchideeën ook nog
kenmerken die bij andere families kunnen voorkomen (Pinske, 2009). De bloemen van
orchideeën zijn vrijwel altijd tweeslachtig (Oudshoorn, 2007), ze bezitten drie kelkbladen
(sepalen) en drie kroonbladen (petalen). Het middelste kroonblad is afwijkend in vorm, kleur
en/of afmeting en wordt de lip of labellum genoemd (Figuur 2.1). Aangezien de lip meestal
dienst doet als landingsplatform voor de bestuivende insecten speelt ze een niet te
onderschatten rol in de voortplanting van de orchideeën. De meeste orchideeën hebben voor
de bestuiving hulp nodig van dieren, voornamelijk insecten. Deze worden gelokt door de
kleur en de geur van de bloemen (Ronse, 2008).
Algemene eigenschappen van orchideeën en hun CAM cyclus
10
2.2.2 Teelt
Phalaenopsis is de laatste decennia enorm in opkomst. Door betere vermeerderings- en
kweekmethoden is het een plant geworden die door iedereen kan worden aangeschaft. Van
hoge prijzen is geen sprake meer en omdat de plant lang meegaat, is hij in feite goedkoop. De
kwekers voeren ze het hele jaar aan, maar de natuurlijke bloeiperiode ligt in de maanden
februari, maart en april (Runkle et al., 2005; Oudshoorn, 2007).
Eén van de belangrijkste stappen in het teeltproces was de uitvinding van technieken om
orchideeën op grote schaal te zaaien. In het begin van de 20e eeuw ontdekten de Fransman
Noël Bernard (1909) en de Duitser Burgeff (1909) onafhankelijk dat orchideeënzaden kunnen
kiemen in de nabijheid van een Rhizoctoniaschimmel. Deze schimmel werd toegevoegd aan
een gesteriliseerd substraat van turf waarop orchideeënzaden waren gezaaid, wat resulteerde
in een goede kieming. Deze techniek liet toe om orchideeën in grote hoeveelheden te
vermeerderen, iets wat voordien onmogelijk was. Waarom en hoe deze schimmel de kieming
van orchideeën bevorderde, werd ontdekt door Knudson (1922). Hij verklaarde dat
orchideeënzaden in de natuur alleen kiemen nadat ze geïnfecteerd zijn door deze schimmel.
De schimmel geeft namelijk suikers door, wat de zaden van de nodige energie voorziet om te
kiemen. Uit zichzelf hebben de zaden immers onvoldoende kiemkracht aangezien ze stoffijn
zijn. Ze wegen tussen 0,3 en 14 milligram en zijn te klein om endosperm te bevatten. Het
voordeel van hun kleine afmetingen is wel dat ze verspreid kunnen worden door de wind, tot
over tientallen kilometers afstand. De ontdekking van Knudson liet ook toe om een meer
efficiënte zaaitechniek te ontwikkelen, namelijk de ‘asymbiotische methode’. Knudson (1922)
ontwikkelde een volledig synthetische voedingsbodem met suikers, minerale zouten,
vitamines en andere essentiële groeistoffen. Vanaf dan werden orchideeën gezaaid in
kweekbuizen op een complexe voedingsbodem. Het zaaien van orchideeën versnelde de
orchideeënteelt aanzienlijk, maar voor de meeste orchideeën bleef toch vier tot zeven jaar
nodig om uit zaad bloeiende planten te verkrijgen. Dit werd verholpen met het ontwikkelen
Figuur 2.1 - Delen van de bloem van een orchidee
Algemene eigenschappen van orchideeën en hun CAM cyclus
11
van methoden om planten te kloneren. Rond 1960 ontwikkelde de Fransman Morel (1965)
een meristeemcultuur van Cymbidiums waardoor het mogelijk werd om uit een slapende knop
in glazen kolven of proefbuizen duizenden planten op te kweken die identiek zijn aan de
ouderplant. Deze weefselcultuur kon echter niet worden toegepast bij Phalaenopsis omdat er
te veel genetische variatie ontstond. In die tijd werd Phalaenopsis dus vooral uit zaad
voortgeplant. Momenteel zijn er wel specifieke protocols opgesteld voor de weefselcultuur
van Phalaenopsis. Deze methoden zijn over het algemeen succesvol, maar kunnen niet
gebruikt worden voor alle cultivars omdat er soms toch te veel variatie ontstaat (Griesbach,
2002; Ronse, 2008).
Meristeemcultuur, ook wel weefselkweek genoemd gaat als volgt te werk. Onder de
microscoop wordt uit het groeipunt van de plant, meestal van een nieuwe scheut, een heel
klein stukje weefsel gehaald. Dit klein stukje weefsel wordt in flesjes of buisjes gedaan met
een voedingsoplossing. Om de celdeling te bevorderen worden de flesjes geschud of gedraaid.
Hierdoor raken de delende cellen gedesoriënteerd en blijven ze zich delen. De cellen vormen
klompjes ongedifferentieerd weefsel, het zogenaamde protocorm. De belichting is intensief en
er wordt een dag- en nachtritme aangehouden van telkens 12 uur. De temperatuur varieert van
20 tot 29°C, afhankelijk van de soort. Per protocorm worden er meestal een paar duizend
plantjes gemaakt. Om scheut- en later ook wortelvorming te krijgen, worden de protocormen
op een vaste voedingsbodem gezet. Er zijn na ongeveer anderhalf jaar jonge plantjes
voorradig die in orchideeëngrond groeien en aan hun taak kunnen beginnen om bloemstengels
te vormen (Oudshoorn, 2007). Sommige Phalaenopsis worden gekweekt vanuit zaad, maar
door de stijgende vraag naar uniformiteit is de massamarkt van Phalaenopsis vooral
gebaseerd op deze meristeemcultuur. Het kloneringsproces vermindert namelijk de
variabiliteit tussen de planten, zodat populaties dezelfde groei- en bloeikarakteristieken
hebben (Runkle et al., 2005a). Vermeerdering via protocormen geeft echter meer risico op
mutaties. Daarom wordt in de meeste laboratoria de ‘shoot-by-shoot methode’ gebruikt
(persoonlijke communicatie met V. Lamote, Microflor). Hierbij wordt vertrokken van een
scheut die op een vermeerderingsmedium één of meerdere zijscheuten vormt. Deze kunnen
vervolgens worden afgesneden en terug zijscheuten vormen.
De serreteelt van Phalaenopsis kan onderverdeeld worden in drie fasen: de vegetatieve groei,
de koelingsfase en de afwerkingsfase. Elke fase vereist verschillende
omgevingsomstandigheden, voornamelijk qua temperatuur en licht (Tabel 2.1). In hun
natuurlijke habitat heersen er tropische condities gedurende het hele jaar met dagtemperaturen
tussen de 28 en 35°C en nachttemperaturen tussen de 20 en 24°C. Aangezien epifytische
orchideeën zoals Phalaenopsis groeien op boomstammen en –takken worden ze beschaduwd
door het dense kruinendak. Daarom vereist succesvolle commerciële productie warme en
beschaduwde omgevingen, zeker gedurende de vegetatieve groei (Runkle et al., 2005c). De
vegetatieve groei vereist gemiddeld een dagelijkse temperatuur tussen 28 en 32°C om
bladproductie te stimuleren en bloei initiatie te verhinderen. Warme dag- en koude
nachttemperaturen zijn bevorderlijk voor de reproductieve ontwikkeling. Fotosynthese
verzadigt bij een PPFD van 180 µmol fotonen m-2
s-1
, dus deze relatief lage lichtintensiteit
volstaat. De vegetatieve groei duurt 22 tot 27 weken, afhankelijk van de gerealiseerde
temperatuur, de initiële bladbreedte en de gewenste plantgrootte voor het induceren van de
bloei (Lopez & Runkle, 2004; Runkle et al., 2005a). Wanneer de planten vier tot zes bladeren
Algemene eigenschappen van orchideeën en hun CAM cyclus
12
hebben en een minimum bladbreedte van 25 cm, wordt de koelingsfase gestart om bloei te
induceren. Gedurende vier tot zes weken worden de planten gekoeld bij temperaturen van 17
tot 25°C en de lichtintensiteit wordt gereduceerd tot 60 à 160 µmol m-2
s-1
PPFD. Deze
relatief koude temperaturen en lage lichtintensiteiten vertragen de bladontwikkeling en
kunnen bloei in jonge planten induceren. Lage temperaturen zijn noodzakelijk voor de
accumulatie van cytokinine en gibberelline (plantenhormonen betrokken bij de celgroei) en de
verbetering van fotosynthese dat leidt tot verzameling van suikers. Dit resulteert in de initiatie
van bloemknoppen en de verlenging van de stengel (Lopez & Runkle, 2004; Runkle et al.,
2005a; Cha-um et al., 2010). De periode van de verschijning van de scheut tot de
scheutontwikkeling en bloei wordt de afwerkingsfase genoemd. De temperatuur varieert dan
best van 17°C tot 26°C, terwijl de lichtintensiteit gelijkaardig is aan die van de vegetatieve
groei. De gemiddelde dagelijkse temperatuur controleert de ontwikkelingssnelheid van de
scheut, waardoor de temperatuur kan aangepast worden aan een specifieke verkoopdatum.
Deze fase duurt acht tot twaalf weken. De planten zijn klaar voor verkoop wanneer ze
minstens één of twee open bloemen hebben. Op dat ogenblik worden ze verpakt voor
transport (Lopez & Runkle, 2004; Runkle et al., 2005a).
Tabel 2.1 - Overzicht van de duur, temperatuur en lichtintensiteit tijdens de vegetatieve groei, koelingsfase en afwer-kingsfase in het kweekproces van Phalaenopsis.
Vegetatieve groei Koelingsfase Afwerkingsfase
Duur (weken) 22-27 4-6 8-12
Temperatuur (°C) 28-32 17-25 17-26
Lichtintensiteit (µmol m-2
s-1
) 180-400 60-160 180-400
Transport van orchideeën wordt internationaal sterk gecontroleerd. ‘The Convention on
International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora’ (CITES) verzekert dat de
handel van wilde dieren en planten hun bestaan niet bedreigd. Wilde orchideeën mogen niet
zonder toestemming verhandeld worden, enkel kunstmatig voortgeplante orchideeën. De
leverancier moet een kopie van de CITES documenten bij zich hebben die aantonen dat de
orchideeën kunstmatig voortgeplant zijn (Koninklijk besluit van 9 april 2003 inzake de
bescherming van in het wild levende dier- en plantensoorten door controle op het
desbetreffende handelsverkeer).
Het transport verloopt volledig in het donker. Als de planten na een aantal dagen hun
bestemming bereiken, worden ze opnieuw aan licht blootgesteld. Deze blootstelling na
donkerperiode veroorzaakt vaak knopabortie bij een aantal hybriden (persoonlijke
communicatie met V. Lamote, Microflor).
2.3. Crassulacean Acid Metabolism
Fotosynthese bij orchideeën kan volgens twee mechanismen verlopen: C3 fotosynthese of
CAM. Neales & Hew (1975) vonden een sterke correlatie tussen het fotosynthesemechanisme
en de bladdikte. De bladeren van orchideeën met dikke, succulente bladeren (> 1 mm) volgen
meestal het CAM mechanisme, terwijl orchideeën met dunnere bladeren aan C3 fotosynthese
doen. Phalaenopsis maakt gebruik van het CAM metabolisme. Omgevingsomstandigheden
Algemene eigenschappen van orchideeën en hun CAM cyclus
13
zoals licht, CO2 en temperatuur hebben een belangrijk effect op dit fotosynthese mechanisme
en worden vervolgens besproken.
2.3.1 Wat is CAM?
CAM is een gespecialiseerde manier van fotosynthetische koolstofassimilatie die geëvolueerd
is als respons op uitzonderlijke omgevingsomstandigheden (Borland & Taybi, 2004). CAM is
namelijk een complexe adaptatie waardoor fotosynthese in de tijd gescheiden verloopt van
water- en CO2 uitwisseling (Black & Osmond, 2003). Deze adapatie is mogelijk opgetreden
in het Mioceen (23 tot 5 miljoen jaar geleden) als een gevolg van verminderde CO2
concentratie in de atmosfeer (Dodd et al., 2002).
2.3.2 Vier fasen
Eenvoudig gesteld is CAM een fotosynthetisch systeem waarbij de enzymactiviteit van C3 en
C4 carboxylases in de tijd gescheiden is. CAM wordt beschouwd als een proces bestaande uit
vier fasen (Figuur 2.2). Deze fasen onderscheiden zich door de netto CO2 opname en de
concentratie sleutelmetabolieten, die verantwoordelijk zijn voor koolstofvoorziening en
-vraag (Dodd et al., 2002; Ceusters et al., 2011).
Enkel ’s nachts (Fase I), wanneer evapotranspiratiesnelheden laag zijn, zijn de stomata open
en wordt bijgevolg atmosferische CO2 opgenomen. Atmosferische en eventueel gerespireerd
CO2 worden enzymatisch omgezet in bicarbonaat (HCO3-), zoals te zien in Figuur 2.3. Dit
HCO3-
wordt vervolgens gefixeerd aan fosfoenolpyruvaat (PEP) door het C4 enzym
fosfoenolpyruvaat-carboxylase (PEPC), wat resulteert in de vorming van malaat. Het enzym
PEPC wordt namelijk geactiveerd tijdens de nacht door fosforylatie. PEP wordt gevormd uit
suikers die geproduceerd werden tijdens de vorige dag. Het gevormde malaat (4C product)
Figuur 2.2 - Dag/nachtpatroon van de CO2 fixatie, malaatzuur- en suikerconcentraties in een CAM plant. PEPC = Fosfoenolpyruvaat-carboxylase; RUBISCO = Ribulose-1,5-bifosfaat carboxylase/oxygenase. De donkerperiode is aangeduid door de zwarte balk (aangepast uit: Black & Osmond, 2003).
Algemene eigenschappen van orchideeën en hun CAM cyclus
14
wordt dan getransporteerd naar de vacuole waar het opgeslagen wordt als malaatzuur. De
vacuoles van succulente weefsels kunnen meer dan 90% van het celvolume innemen. De
opslagcapaciteit van de vacuole en de beschikbaarheid van suikers zijn bepalende factoren
voor de capaciteit van de nachtelijke CO2 opname in CAM planten. In Figuur 2.2 wordt de
toename in CO2 fixatie en malaatzuur en de afname in suikers weergegeven tijdens fase I.
Bij het aanbreken van de dag (Fase II) neemt de activiteit van PEPC geleidelijk af. Dit
feedbackmechanisme verhindert nutteloze cycling van CO2 tussen PEP en malaat gedurende
de dag en wordt als essentieel beschouwd voor de efficiënte functionering van de CAM
cyclus. Tegelijkertijd neemt de activiteit van het C3 enzym ribulose-1,5-bifosfaat
carboxylase/oxygenase (Rubisco) toe. Fase II wordt dus gekarakteriseerd door PEPC
gedomineerde CO2 opname, terwijl de Rubisco activiteit gelijdelijk aan stijgt. Tijdens fase II
wordt vaak een piek (Figuur 2.2) in de CO2 opname waargenomen door de fixatie van CO2
door PEPC en de directe assimilatie door Rubisco.
Tijdens de dag (Fase III) verlaat malaat de vacuole waarna het gedecarboxyleerd wordt in
pyruvaat en CO2 (Figuur 2.3). Dit veroorzaakt een hoge interne partiële CO2 druk waardoor
de stomata sluiten en fotorespiratie wordt gelimiteerd. In de chloroplast wordt CO2
vrijgesteld, geherfixeerd via Rubisco en geïncorporeerd in de Calvincyclus (sterke toename in
suikers in Figuur 2.2).
Op het einde van de lichtperiode (Fase IV) raakt malaatzuur uitgeput (Figuur 2.2) waardoor
de interne CO2 druk daalt en de stomata heropenen. CO2 wordt opnieuw opgenomen uit de
atmosfeer en wordt voornamelijk gefixeerd door Rubisco, de activiteit van PEPC stijgt
opnieuw geleidelijk.
Energetisch gezien verhoogt CAM de metabolische kost met 10% in vergelijking met de
standaard C3 fotosynthese. Deze hogere kosten zijn te wijten aan de stockage van malaat in
de vacuole en aan de dynamische suikeropslag die noodzakelijk is voor de PEP-regeneratie
(Lawlor, 1993; Dodd et al., 2002; Borland & Taybi, 2004; Ogburn & Edwards, 2010; Borland
Figuur 2.3 - CAM: temporele scheiding van CO2 opname en fotosynthetische reacties (aangepast uit: Taiz & Zeiger, 2006).
Algemene eigenschappen van orchideeën en hun CAM cyclus
15
et al., 2011; Ceusters et al., 2011). Het competitievermogen of de trade-off tussen
stresstolerantie en groei zorgt ervoor dat CAM planten een lage groeisnelheid en
productiviteit hebben. Nobel et al. (1992) argumenteren echter dat de lage groeisnelheden en
productiviteit niet intrinsiek zijn voor CAM planten, maar eerder het gevolg zijn van de
stressvolle situaties waarin ze groeien (Ogburn & Edwards, 2010).
2.3.3 Invloed van omgevingsfactoren op de CAM cyclus en
bloemontwikkeling
De CAM fasen zijn geen vaste compartimentering, maar laten plasticiteit toe in respons op
omgevingsfactoren (Dodd et al., 2002). Volgens Lüttge (2004) zijn de zes belangrijkste
omgevingsfactoren die CAM beïnvloeden CO2, water, licht, temperatuur, zoutgehalte en
nutriënten. Deze factoren zijn direct of indirect met elkaar verbonden waardoor een complex
netwerk van interacties van omgevingsfactoren op CAM ontstaat (Figuur 2.4). De individuele
impact van deze factoren op de CAM cyclus wordt hieronder kort toegelicht.
Licht
Fotosynthetisch actieve straling (PAR) is de energiebron voor fotosynthese. Met toenemende
lichtintensiteiten overdag, verhoogt de netto CO2 fixatie gedurende de volgende nacht (Kluge
& Ting, 1978; Konow & Wang, 2001). Dit is te wijten aan de verhoogde suikerbiosynthese in
het licht en dus een grotere beschikbaarheid aan PEP, maar ook de grotere opslagcapaciteit
van de vacuole na de uitputting aan malaatzuur overdag. Een hogere lichtintensiteit
resulteerde in dikkere bladeren, grotere bladoppervlaktes, vroegere bloei en meer, grotere
bloemen. Waarschijnlijk leidde een verhoogde fotosynthese tot hogere suikerconcentraties en
grotere groeisnelheden (Konow & Wang, 2001).
Figuur 2.4 - Netwerk van de belangrijkste omgevingsfactoren en hun effecten op CAM. T = temperatuur; hν = de energie van een foton (h = constante van Planck; ν = frequentie) (aangepast uit: Lüttge, 2004).
Algemene eigenschappen van orchideeën en hun CAM cyclus
16
Volgens Kluge & Ting (1978) is er ook een lichtperiode nodig om de stomata ’s nachts te
kunnen openen. De duur en maximale graad van opening zijn fluctuaties van de lengte van de
lichtperiode van de vorige dag. Tijdens het transport van Phalaenopsis is er geen lichtperiode
en kunnen de stomata waarschijnlijk ’s nachts niet openen.
Een overmaat aan licht daarentegen, zorgt voor een overmaat aan energie en kan het
fotosynthese apparaat beschadigen. Dit leidt tot foto-inhibitie, waarbij de
fotosynthesesnelheid afneemt. De netto-fotosynthesesnelheid van Phalaenopsis bij 20°C
satureert bij 130-180 µmol m-2
s-1
(Hou et al., 2010). Lage lichtintensiteiten hebben ook
nadelige effecten op epifyten.
Haslam et al. (2003) onderzochten de lange termijn effecten van acclimatisatie aan
verschillende lichtregimes in de CAM epifyt Tillandsia usneoides (Bromeliaceae). De
chlorofylinhoud was groter in planten geacclimatiseerd aan lagere lichtintensiteiten (PPFD
van 50 µmol m-1
s-1
). De actuele efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II werd
behouden bij planten geacclimatiseerd aan hoge lichtintensiteiten. De netto-fotosynthese nam
toe bij acclimatisatie aan hogere lichtintensiteit, doordat de carboxylatiecapaciteit van PEPC
en Rubisco toenam. Lin & Hsu (2004) bestudeerden bij Phalaenopsis amabilis de invloed van
lage lichtintensiteit op de fotosynthetische capaciteit van de onderste, beschaduwde bladeren
aan de hand van chlorofylfluorescentie. In dit onderzoek daalde de fotosynthetische capaciteit
van de bladeren wanneer ze geacclimatiseerd zijn aan lagere lichtintensiteiten. Phalaenopsis
is echter in staat om terug te reacclimatisateren aan hogere lichtintensiteiten wanneer de
onderste bladeren aan meer licht worden blootgesteld.
Ceusters et al. (2011) onderzochten de impact van lichtlimitatie op Aechmea ‘Maya’
(Bromeliaceae). Op korte termijn waren de planten niet tolerant aan sterke lichtlimitatie
(gemiddeld 0,46 mol fotonen m-2
d-1
). De afwezigheid van CO2 opname en veranderingen in
de sleutelmetabolieten zoals malaat, zetmeel of opgeloste suikers, wezen op een afgezwakt
metabolisme in de schaduw. Door verzuring van het cytoplasma stierven cellen af in de
fotosynthetisch actieve bladeren (bruine plekken). Na een drietal maand waren de Aechmea
planten geacclimatiseerd aan de extreem lage lichtniveaus. Dit was te wijten aan drie
verschillende processen. Ten eerste vond er een omschakeling plaats van zetmeel naar sucrose
als de belangrijkste suikerbron voor PEP-synthese. Deze verandering zorgt voor het
onderhoud van het metabolisme met zo weinig mogelijk energievereisten. Ten tweede werd
een relatieve toename in de ‘light harvesting complexen’ (LHC) waargenomen. Eveneens trad
er een verandering op in de verschillende gasuitwisselingsfasen. In fase I was de netto CO2
opname voornamelijk te wijten aan PEPC, fase II werd ingekort en fase IV werd vertraagd
met vier uur. De directe CO2 fixatie via Rubisco werd zo verwaarloosbaar klein. Skillman en
Winter (1997) suggereerden dat de hoge interne partieeldruk van CO2, typisch voor fase III,
resulteert in een relatief hoge activatiegraad van Rubisco, zelfs bij weinig licht. Voor de
lichtgelimiteerde Aechmea planten werd dan ook een maximum quantumefficiëntie van
fotosynthese waargenomen die dubbel zo hoog was als bij de controleplanten. Dus de
verlenging van fase III ten koste van de overgangsfasen II en IV lijkt belangrijk te zijn voor
de lange termijn acclimatisatie aan lage lichtintensiteiten.
Algemene eigenschappen van orchideeën en hun CAM cyclus
17
Atmosferische CO2
Het is belangrijk onderscheid te maken tussen de atmosferische partieeldruk van CO2, de
milieufactor sensu stricto, en de interne partieeldruk aan CO2, die sterk gerelateerd zijn met
elkaar via het openen en sluiten van de stomata.
De CO2 opname gebeurt via stomatale openingen in de cuticula van het blad. Speciale
sluitcellen begrenzen de opening en zijn in staat om te bewegen waardoor de grootte van de
porie aangepast kan worden aan de omgevingsomstandigheden (Lawlor, 1993). Bij
Phalaenopsis komen er enkel stomata voor aan de abaxiale (onderzijde) van het blad en de
bladeren worden daarom amfistomatisch genoemd (Steppe, 2011). Dit draagt bij tot het
waterbehoud in de plant (Goh et al., 1977). Stomataal gedrag wordt gecontroleerd door de
interne CO2 concentratie in de substomatale ruimten. Bij C3 planten openen de stomata
overdag als respons op een verlaagde CO2 concentratie door fotosynthese. Bij CAM planten is
het openen van de stomata ’s nachts te wijten aan verlaagde CO2 concentratie door de
donkerfixatie. In het licht wordt de CO2 concentratie hoog gehouden door
malaatdecarboxylatie en blijven de stomata dus gesloten (Kluge & Ting, 1978). Indien
exogeen CO2, met dezelfde concentratie als tijdens het licht, wordt toegediend in het donker,
verhoogt de stomatale weerstand (Cockburn et al., 1979). De stomatale opening verkleint dus
bij hogere CO2 concentraties.
Water
De grootste drijvende factor voor CAM is de watervoorraad (Lüttge, 2002). Het grootste
voordeel voor CAM planten is namelijk een verhoogde ‘water use efficiency’ (WUE). De
WUE is de ratio van de hoeveelheid opgenomen CO2 tot de hoeveelheid waterverlies door
transpiratie. Deze is hoog voor CAM planten aangezien ze in staat zijn om ’s nachts hun
stomata te openen en overdag te sluiten. Hierdoor wordt veel minder water getranspireerd
(Kluge & Ting, 1978). Overdag zijn de stomata van orchideeën namelijk bijna gesloten
waardoor ze weinig warmte kunnen dissiperen via transpiratie. Zelfs wanneer de stomata
overdag deels open zijn, hebben ze de neiging om minder te transpireren dan andere planten
(Ogburn & Edwards, 2010).
De WUE in CAM planten wordt ’s nachts geschat op 6-30.10-3
mol gefixeerd CO2 op mol
getranspireerd H2O. Voor C3 planten is dit slechts 0,6-1,3.10-3
en voor C4 planten
1,7-2,4.10-3
. De WUE varieert tijdens de verschillende CAM fasen. Zo is de WUE slechts
1-4.10-3
tijdens fase IV. Fasen II en IV zijn het meest gevoelig aan waterstress. Bij
watertekort sluiten de stomata ’s morgens sneller en ’s avonds openen ze later zodat de
transpiratie verminderd, maar ook de CO2 opname (Lüttge, 2002; Ceusters et al., 2009).
Daarnaast beperken de dikke cuticula en lage stomatale densiteiten in het blad het
waterverlies (Woerner & Martin, 1999; Ogburn & Edwards, 2010). Aangezien orchideeën
slechts één keer per week water nodig hebben, treedt er normaal geen watertekort op tijdens
het transport en is deze factor van minder belang.
Temperatuur
De temperatuur zorgt zowel voor een biochemisch als een fysisch effect bij orchideeën. Het
biochemisch effect heeft te maken met de invloed van temperatuur op de verschillende
enzymen. Optimale groei- en bloeicondities van CAM planten vereisen relatief lage
Algemene eigenschappen van orchideeën en hun CAM cyclus
18
nachttemperaturen en hoge dagtemperaturen. Carboxylatie enzymen voor nachtelijke
malaatsynthese en het decarboxylatie enzyme bereiken in vitro respectievelijk een optimum
bij 35°C en 53°C. De lage nachttemperatuur zorgt voor een stabiele actieve gefosforyleerde
vorm van PEPC, waardoor minder malaatinhibitie voorkomt en de nachtelijke CO2 assimilatie
toeneemt. Hogere dagtemperaturen activeren de decarboxylatie enzymen en promoten de
defosforylatie van PEPC, waardoor de gevoeligheid voor malaatinhibitie toeneemt. Toch is er
ook veel bewijs dat CAM planten goed functioneren bij constante temperaturen (Kluge &
Ting, 1978; Lüttge, 2004). De temperatuur heeft naast de impact op enzymen ook een impact
ter hoogte van de vacuole. Hoge temperaturen zorgen namelijk voor een betere fluïdisatie van
de tonoplast waardoor de membraanpermeabiliteit voor malaat verhoogt en een grotere efflux
plaatsvindt. Dit heeft tot gevolg dat PEPC en nachtelijke CO2 opname worden geïnhibeerd.
De stomata zullen bovendien minder lang gesloten blijven door de verhoogde interne CO2
concentraties, waardoor ook minder CO2 wordt opgenomen (Lüttge, 2004).
Tot slot heeft de temperatuur ook een fysisch effect, namelijk de luchtvochtigheid beïnvloedt
de relaties tussen temperatuur en stomatale opening. Bij hogere temperaturen daalt de RH en
stijgt het waterdampdrukdeficiet (VPD). Het VPD is het verschil tussen de hoeveelheid
waterdamp in de lucht en de hoeveelheid vocht die de lucht kan bevatten in verzadigde
toestand. Door het toenemende VPD daalt de stomatale geleidbaarheid waardoor de CO2
opname daalt (Lüttge, 2004).
Nutriënten
In vele CAM planten worden verhoogde concentraties calcium (Ca2+
) aangetroffen. Samen
met kalium (K+), natrium (Na
+) en magnesium (Mg
2+) dient Ca
2+ als tegenion voor de
carboxylaten en draagt dus bij tot de osmotische stabilisatie. Ca2+
bindt bovendien met
negatief geladen eiwitten en vetten, zo zorgt het voor een daling in de
membraanpermeabiliteit (Lüttge, 2004). In C3 planten maakt Rubisco 50% uit van de totale
bladeiwitten, voor de synthese ervan wordt veel stikstof vereist. CAM planten worden
verwacht minder stikstof nodig te hebben dan C3 planten en dus een hogere ‘nitrogen use
efficiency’ (NUE) te hebben. De NUE is een maat voor de geproduceerde hoeveelheid
biomassa per eenheid stikstof (Dawson et al., 2008). CAM soorten hebben namelijk minder
Rubisco nodig en zouden dus minder stikstof moeten binden. Uit studies bleek echter dat de
NUE in CAM planten zeer soortspecifiek is en varieert met leeftijd en milieuomstandigheden.
Het toedienen van stikstof zorgde altijd voor positieve gevolgen (Lüttge et al., 1991a, b).
Zoutgehalte
Zout brengt voornamelijk osmotische stress met zich mee en is dus sterk gerelateerd aan
droogtestress. Aangezien CAM wordt gezien als een waterbesparend mechanisme, kan
verwacht worden dat CAM een eigenschap is van halofyten. Nochtans, uit observaties blijkt
dat halofyten niet altijd CAM planten zijn. Algemeen gesteld zijn CAM planten zelfs zeer
gevoelig aan zoutstress (Lüttge, 2004).
Hoofdstuk 3
Materiaal en methoden
Materiaal en methoden
19
3.1. Plantmateriaal
Tijdens dit onderzoek werd gebruik gemaakt van Phalaenopsis orchideeën. Zes hybriden
werden verkregen via Microflor te Lochristi. Deze onderneming omvat een
weefselteeltlaboratorium voor de vermeerdering van plantmateriaal, acclimatieserres voor de
productie van jonge planten en serres voor de veredeling en het testen van nieuwe soorten. De
orchideeën werden opgekweekt bij een natuurlijk dag/nachtregime, een temperatuur van 21°C
en een gemiddelde PPFD van 110 µmol m-2
s-1
. De RH werd gestuurd naar 65%. Alle
hybriden waren tweetakkig.
3.2. Proefopzet
De experimenten werden uitgevoerd aan het Laboratorium voor Plantecologie op de Faculteit
Bio-Ingenieurswetenschappen van de Universiteit Gent.
Het onderzoek kan opgedeeld worden in een preliminaire fase en twee proeven. Tijdens de
preliminaire fase werden bij twee hybriden ‘Blue Sensitive 1’ (BS1) en ‘Red Lip Non-
Sensitive 1’ (RLN1) de fluorescentieparameters en discontinue fotosynthese- en
transpiratiesnelheid opgemeten tijdens een donkerperiode van zeven dagen en een
herstelperiode van vijf dagen. Hierdoor werd een beter inzicht verkregen in de fotosynthese-
eigenschappen van Phalaenopsis en kon de proefopzet worden geoptimaliseerd.
Tijdens proef 1 werden tien Phalaenopsis hybriden ‘White Sensitive 1’ (WS1) en tien
hybriden ‘White Non-Sensitive 1’ (WN1) vijf dagen in het donker gehouden (=
donkerperiode) in een groeikamer onder gecontroleerde omstandigheden. Vervolgens werden
de planten 14 dagen opgevolgd bij een dag/nachtregime van 12u (= herstelperiode). Twaalf
uur donker werd afgewisseld met een lichtperiode van 1u tot 13u. Daardoor werd het
oorspronkelijk dag/nachtregime vervroegd met 6 uur en 51 minuten. WN1 en WS1 worden
verder aangeduid als hybride 1 en hybride 2. Hybride 1 werd als knopvalongevoelig
beschouwd, terwijl hybride 2 als knopvalgevoelig werd aangegeven door de kweker. De
knopval na de donkerperiode werd elke dag opgevolgd. Naast de fluorescentieparameters en
discontinue fotosynthese- en transpiratiemetingen werden ook continue fotosynthese- en
transpiratiemetingen uitgevoerd. De planten kregen één keer per week water, zodat
droogtestress zeker geen invloed had op de resultaten.
Tijdens proef 2 werden tien Phalaenopsis hybriden ‘Purple Sensitive 1’ (PS1) en tien
hybriden ‘Red Lip Non-Sensitive 1’ (RLN1) aan dezelfde donker- en herstelperiode
onderworpen als tijdens proef 1. Het oorspronkelijk dag/nachtregime werd tijdens deze proef
met 5 uur en 54 minuten vervroegd. De volledige donkerperiode duurde 8u langer in
vergelijking met proef 1. PS1 en RLN1 worden verder aangeduid als hybride 3 en hybride 4.
Hybride 3 werd als knopvalgevoelig beschouwd, terwijl hybride 4 als knopvalongevoelig
werd aangegeven door de kweker.
Materiaal en methoden
20
3.3. Bloemen en knoppen
De evolutie van de bloemen en knoppen werd in kaart gebracht door ongeveer om de vijf
dagen het aantal bloemen, het aantal knoppen en hun knoplengte op te meten per
bloemstengel. De knoplengtes werden opgedeeld in negen klassen met gelijke intervallen
(Tabel 3.1). Tijdens de herstelperiode werd elke dag het aantal afgevallen knoppen geteld en
en werd de knoplengte ervan opgemeten, dit voor alle tien planten per hybride. In de praktijk
blijkt vooral de knopval in de grotere lengteklassen van commercieel belang te zijn. Microflor
deelt vandaar de knoppen in volgens subjectieve lengteklassen: grote knoppen, midden
knoppen en eindknoppen. De grote knoppen bevinden zich onderaan de stengel, volgend op
de eerste bloem. De eindknoppen zijn de laatste knoppen op de stengel en de midden knoppen
bevinden zich hiertussen. De subjectieve indeling werd in deze experimenten ook
meegenomen.
Tabel 3.1 - Verdeling van knoplengte in klassen.
Klasse Interval (cm)
1 [0,0-0,4]
2 ]0,4-0,8]
3 ]0,8-1,2]
4 ]1,2-1,6]
5 ]1,6-2,0]
6 ]2,0-2,4]
7 ]2,4-2,8]
8 ]2,8-3,2]
9 ]3,2-3,6]
3.4. Microklimaat
Tijdens de experimenten werd het microklimaat in de groeikamer continu opgemeten. De
PPFD werd opgemeten met een PAR sensor (LI-190 S, LI-COR Biosciences, Nebraska, VS),
de temperatuur door middel van een thermokoppel (T, Omega Engineering, Stamford, VS) en
de RH met een relatieve vochtigheidssensor (EE08, E+E Elektronik, Engerwitzdorf,
Oostenrijk). De sensoren waren gekoppeld aan een datalogger (34970A + 34901A, Agilent
Technologies, Diegem, België) die de data om de 20 seconden registreerde en wegschreef.
3.5. Continue bepaling van de CO2 en H2O uitwisseling
In proef 1 en 2 werd gebruik gemaakt van de LI-840 niet-dispersieve infrarood (IR) gas
analysator (LI-840 CO2/H2O Gas Analyzer, LI-COR Biosciences, Nebraska, VS) om de CO2
en H2O uitwisseling van de bladeren en bloemstengels continu op te volgen. De LI-840 IR gas
analysator is een open differentieel gasuitwisselingssysteem. Het systeem wordt ‘open’
genoemd omdat er continu verse lucht wordt aangezogen vanuit de omgeving en er dus geen
hergebruik van lucht plaatsvindt. De IR gas analysator bestaat uit een referentie- en
meetkamer. De concentratiemetingen zijn gebaseerd op de verschilratio in de IR absorptie
Materiaal en methoden
21
tussen het referentie- en meetsignaal, daarom wordt het een differentieel systeem genoemd.
De LI-840 IR gasanalysator heeft een meetbereik voor CO2 concentraties tussen 0 en 1000
ppm (µmol mol-1
) en voor H2O concentraties tussen 0 en 80 ppt (mmol mol-1
).
Vooraf werd bij een knopvalgevoelige en een knopvalongevoelige plant bepaald welke
stengel per plant het meest transpireerde. Voor beide hybriden werd de stengel die de meeste
transpiratie vertoonde, geselecteerd als meetstengel tijdens de donker- en herstelperiode. Per
hybride werd dus één bloemstengel opgemeten (Figuur 3.1A). Tijdens de proeven werd ook
telkens het tweede blad van de door de kweker aangegeven knopvalgevoelige hybride
opgemeten (Figuur 3.1B).
Figuur 3.1 – (A) Branchbag met een bloemstengel en (B) bladcuvette met een blad.
A
B
Materiaal en methoden
22
3.5.1 Meetprincipe
Lucht werd vanuit de omgeving aangezogen met behulp van een pompsysteem (N 035.1.2
AN.18, KNF Neuberger, Freiburg, Duitsland). De lucht kwam eerst terecht in een buffervat
(50 liter) om eventuele debietfluctuaties te minimaliseren. De luchtstroom werd opgesplitst en
gestuurd naar één bladcuvette (Figuur 3.1B), twee meetbranchbags en één
referentiebranchbag (Figuur 3.2). Het debiet van alle ingaande luchtstromen (behalve van de
referentiebranchbag) werd opgemeten met debietmeters (58605, Brooks Instrument, Hatfield,
VS). De branchbags werden gemaakt van plastiek zakken en werden rond een bloemstengel
vastgebonden en goed afgesloten met spanbandjes (Figuur 3.1A). Eén branchbag omsloot dus
de knoppen en bloemen van één stengel. Ventilatoren in de bladcuvette en branchbags
zorgden voor een homogeen luchtmengsel. De bladcuvette en branchbags werden verbonden
met een gasmultiplexer (Universiteit Gent, België). De luchtstroom die door de lege
branchbag (referentiebranchbag) ging, werd daarentegen verbonden met de gasmultiplexer en
met de referentiekamer van de IR gasanalysator (lijn 5 op Figuur 3.2). Door de werking van
de gasmultiplexer ontving de meetkamer van de IR gasanalysator achtereenvolgens lucht van
de bladcuvette van de gesuggereerde knopvalgevoelige soort (lijn 1 op Figuur 3.2), branchbag
1 met de meest transpirerende stengel van de gesuggereerde knopvalgevoelige soort (lijn 2 op
Figuur 3.2), branchbag 2 met de meest transpirerende stengel van de gesuggereerde
knopvalongevoelige soort (lijn 3 op Figuur 3.2) en de referentiebranchbag (lijn 4 op Figuur
3.2). Wanneer de referentielucht werd geanalyseerd door de meetkamer, kon deze vergeleken
worden met de referentielucht die door de referentiekamer werd opgemeten. Dit zorgde voor
een nulmeting waardoor eventuele afwijkingen konden gecorrigeerd worden. Om de 20
minuten werd er omgeschakeld tussen de verschillende metingen met behulp van de
gasmultiplexer. De meetresultaten werden om de 20 seconden opgeslagen op de datalogger
(34970A + 34901A, Agilent Technologies, Diegem, België). Bij de opstelling werd ervoor
gezorgd dat de lengte van de leidingen even lang waren, zodat de afstand die de lucht moest
afleggen geen invloed had op de meetresultaten.
Figuur 3.2 - Schematische voorstelling van het gasuitwisselingssysteem. De weg die het gas aflegt wordt weergegeven: lucht wordt aangezogen door een pomp en homogeen gemengd in een buffervat. De lucht gaat vervolgens naar een bladcuvette, twee meetbranchbags en een referentiebranchbag. Het debiet van de lucht wordt opgemeten met debietmeters. De bladcu-vette en branchbags worden verbonden met een gasmultiplexer. De luchtstroom die door de referentiebranchbag gaat, wordt verbonden met de gasmultiplexer en ook rechtstreeks met de referentiekamer van de infrarood gasanalysator (IRGA). Met behulp van het concentratieverschil tussen de meet- en referentiekamer worden de netto CO2 en netto H2O uitwisseling be-paald.
Materiaal en methoden
23
Omdat de multiplexer steeds wisselde tussen de bladcuvette en branchbags diende er zich tel-
kens een nieuw evenwicht in te stellen. Daarom werd voor de verdere dataverwerking steeds
gewerkt met het gemiddelde van de laatste drie metingen.
De netto CO2 en H2O uitwisselingssnelheid van het blad en de bloemstengels kunnen dan als
volgt worden bepaald:
𝑃𝑛 =∆𝐶𝑂2.𝐷
𝐴.𝑃
𝑅.𝑇.103
60 𝐸 =
∆𝐻2𝑂.𝐷
𝐴.𝑃
𝑅.𝑇.𝑀𝑀𝐻2𝑂 . 103
60
met
Pn: de netto CO2 uitwisselingssnelheid (µmol CO2 m-2
s-1
)
∆CO2: het CO2 concentratieverschil tussen de inkomende en uitgaande lucht in de
cuvette/branchbag (ppm)
D: het luchtdebiet doorheen de cuvette/branchbag (L min-1
)
A: de oppervlakte ingesloten in de cuvette/branchbag (m2)
P: de druk (atm)
R: de universele gasconstante (82,06 atm ml mol-1
K-1
)
T: luchttemperatuur (K)
103
60: eenheidsconversiefactor
E: de netto H2O uitwisselingssnelheid (mg H2O m-2
s-1
)
∆H2O: het H2O concentratieverschil tussen de inkomende en uitgaande lucht in de
cuvette/branchbag (ppt)
MMH2O: de molaire massa van H2O (18 g mol-1
)
De bladoppervlakte A in de bladcuvette werd bepaald door het blad over te tekenen op papier
en op te meten met een bladoppervlaktemeter (LI‐3000 + LI‐3050, LI‐COR Biosciences,
Nebraska, VS). Voor de oppervlakte van de bloemblaadjes werd een bloem van gemiddelde
grootte gekozen en werd analoog tewerk gegaan. Om de oppervlakte van een bloemknop en
bloemstengel te berekenen werden deze benaderd door respectievelijk een bol en een cilinder.
3.5.2 Kalibratie
Debietmeters
Voor de kalibratie van de debietmeters werden met behulp van een gasfles en een draagbare
laboratorium debietmeter (GTLK, Platon, Wemmel, België) luchtstromen met een
verschillend debiet (4 L min-1
, 6,1 L min-1
, 8,2 L min-1
en 10 L min-1
) doorheen de
debietmeters gestuurd. Na evenwicht werden de overeenkomstige spanningen afgelezen op de
datalogger. Om de kalibratievergelijking op te stellen, werden de afgelezen spanningssignalen
uitgezet ten opzichte van de overeenkomstige debieten (Tabel 3.2). Door een stroompanne op
DOY 318 (proef 1), werkten de debietmeters niet meer. Daarom werd in de dataverwerking
gewerkt met de gemiddelde debieten van DOY 315 tot 318.
Materiaal en methoden
24
Tabel 3.2 - De kalibratievergelijkingen van de debietmeters in het gasuitwisselingssysteem met het debiet (y, L min-1
) in functie van de afgelezen spanning (x, V).
Debietmeter Kalibratievergelijking Correlatiecoëfficiënt
1 y = 18,141x - 7,2601 0,9998
2 y = 17,626x - 7,0282 0,9997
3 y = 17,251x - 7,0137 0,9997
IR gas analysator
Ook de referentie- en meetkamer van de IR gas analysator werden op een dergelijke manier
gekalibreerd voor gebruik. Achtereenvolgens werd een gas (N2) met 0 ppm CO2 (zero) en 489
ppm CO2 (span) door de beide kamers gestuurd. Een kalibratie werd uitgevoerd door de
interne software.
De CO2 concentratie kan uit het spanningssignaal van de output berekend worden via
volgende formule:
𝐶𝑂2 = 𝑉 𝐶𝑟𝑎𝑛𝑔𝑒
𝑉𝑟𝑎𝑛𝑔𝑒
met V de geregistreerde spanning, Crange het maximum bereik voor CO2 en Vrange de maximum
output voor het geselecteerde bereik. In dit geval moet het gemeten spanningssignaal dus
vermenigvuldigd worden met 400.
De H2O concentratie wordt analoog bepaald met onderstaande formule:
𝐻2𝑂 = 𝑉 𝐻𝑟𝑎𝑛𝑔𝑒
𝑉𝑟𝑎𝑛𝑔𝑒
met Hrange het maximum bereik voor H2O. Het afgelezen spanningssignaal moet aldus
vermenigvuldigd worden met factor 32.
3.6. Discontinue bepaling van de CO2 en H2O uitwisseling
Met behulp van de LI-6400XT (LI-COR Biosciences, Nebraska, VS), afgebeeld in Figuur
3.3A, werden discontinu fotosynthesemetingen uitgevoerd. De principes zijn analoog aan het
gasuitwisselingssysteem met IR gasanalysator (sectie 3.5.1.), aangezien de LI-COR 6400XT
ook een open differentieel gasuitwisselingssysteem is. Het grote voordeel is echter de
automatisatie en compactheid bij de LI-6400. De gas analysators bevinden zich in het
sensorhoofdje, waardoor tijdsvertragingen door leidingen worden geëlimineerd en een snelle
respons van de bladeren kan worden waargenomen (LI-COR, 2004; Steppe, 2011).
Alle metingen werden uitgevoerd op het tweede blad geteld vanaf de apex, dit is het jongste
volledig ontwikkeld blad (Figuur 3.3B). Er werd gemeten in het midden van het blad op
voldoende afstand van de hoofdnerf. De bladeren van zes gesuggereerde gevoelige en zes
gesuggereerde niet-gevoelige planten per hybride werden opgemeten om vervolgens een
gemiddelde te nemen van zes waarden. Tijdens de donkerperiode werden de planten elke dag
opgemeten, achtereenvolgens een gevoelige en een niet-gevoelige hybride. Tijdens de
herstelperiode werden de planten zowel in het licht als in het donker opgemeten. De 12
Materiaal en methoden
25
planten werden over twee dagen opgemeten, waardoor de parameters van twee dagen werden
samengenomen voor de berekeningen.
De ingestelde parameters tijdens de metingen worden weergegeven in Tabel 3.3. De
instroomsnelheid van verse lucht werd vrij laag gehouden omdat de CO2
uitwisselingssnelheid van orchideeën gering is (Pollet, 2010). Voor elke meting werd
‘gematcht’ om afwijkingen tussen de meet- en referentieanalysators te vermijden. Tijdens het
‘matchen’ wordt hetzelfde gas door de meet- en referentiekamer gestuurd en worden de
gemeten CO2 en H2O waarden van beide cellen aan elkaar gelijkgesteld. Dit verhoogt de
accuraatheid van de metingen, zeker bij lage fotosynthesesnelheden.
Tabel 3.3 - Instelling van de parameters in de LI-COR 6400XT.
Parameter Instelling
Oppervlakte bladcuvette 2 cm²
Instroomsnelheid van verse lucht 200 µmol s-1
Referentieconcentratie CO2 400 ppm
Bloktemperatuur 25 °C
Stomatale ratio 0 (stomata slechts aan één zijde)
Optimum measurement intensity 1,5
Optimum flash intensity 10
3.7. Chlorofyl-a fluorescentieparameters
Met de LI-6400XT kunnen naast fotosynthese- ook fluorescentiemetingen worden uitgevoerd.
De Leaf Chamber Fluorometer van de LI-6400XT bevat een LED gebaseerde lichtbron en
twee detectoren om fluorescentie te meten. De metingen werden simultaan met de
fotosynthesemetingen uitgevoerd op dezelfde planten en bladeren.
Het gebruik van chlorofyl-a fluorescentiemetingen is momenteel een veel gebruikte niet-
destructieve methode om de fotosynthetische status en stress in planten te onderzoeken. Dit is
te wijten aan de ontwikkeling van relaties tussen fluorescentieparameters en fotosynthetisch
elektronentransport en aan de beschikbaarheid van een reeks draagbare en betaalbare
fluorometers (Baker, 2008).
B A
Figuur 3.3 - (A) De LI-6400XT en (B) het sensorhoofdje op het tweede blad geteld vanaf de apex.
Materiaal en methoden
26
3.7.1 Theoretische achtergrond
3.7.1.1 Principe van fluorescentie
De lichtreacties van de fotosynthese vinden plaats in de thylakoidmembranen van de
chloroplasten. Tijdens de lichtreacties wordt via de elektronentransportketen lichtenergie
omgezet in chemische energie die gebruikt wordt tijdens de donkerreacties om CO2 vast te
leggen in suikers. In de thylakoidmembranen bevinden zich fotosystemen (PS) die bestaan uit
een kerncomplex met een reactiecentrum en een LHC. Het LHC bestaat uit verschillende
pigmenten die lichtenergie absorberen en doorgeven aan een doelwitpigment in het
reactiecentrum (Figuur 3.4). In dit reactiecentrum vindt de uiteindelijke omzetting van
lichtenergie naar chemische energie plaats.
Er wordt onderscheidt gemaakt tussen fotosysteem II (PS II) dat voornamelijk licht absorbeert
bij 700 nm en fotosysteem I (PS I) dat voornamelijk licht absorbeert bij 680 nm. Via
elektronentransport van PS II naar PS I worden ATP en de gereduceerde vorm van
nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADPH) gevormd die dan aangewend worden in
de donkerreacties.
Figuur 3.4 - De transfer van elektronen (e-) en protonen (H
+) in het thylakoidmembraan. Water (H20) wordt geoxideerd
en protonen worden vrijgesteld in het lumen door PS II. PS I reduceert nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat
(NADP+) tot NADPH in het stroma via ferredoxine (Fd) en het flavoproteïne ferredoxine-NADP reductase (FNR). Protonen
worden ook getransporteerd in het lumen door de actie van het cytochroom b6f complex. Deze protonen dragen bij tot de opbouw van de elektrochemische protongradiënt. De protonen moeten dan diffuseren door het adenosinetrifosfaat (ATP) synthase enzyme waarbij ATP in het stroma wordt gevormd. Gereduceerd plastoquinon (PQH2) en plastocyanine (PC) zorgen respectievelijk voor de transfer van elektronen naar cytochroom b6f en PS I. Gestippelde lijnen verwijzen naar de transfer van elektronen, volle lijnen naar de beweging van protonen (aangepast uit: Taiz & Zeiger, 2006).
Lichtenergie dat geabsorbeerd wordt door chlorofylmoleculen kan drie reacties ondergaan: (1)
het kan gebruikt worden om fotosynthese aan te drijven via de elektronentransportketen
(fotochemie), (2) overmatige energie kan gedissipeerd worden als warmte of (3) de
overmatige energie kan heruitgezonden worden als licht (chlorofyl fluorescentie). Deze drie
processen (Figuur 3.5) staan in competitie met elkaar, zodanig dat een stijging in de
efficiëntie van het ene, resulteert in een daling in de efficiënte van de andere twee processen.
Dus door het meten van de chlorofyl fluorescentie kan informatie gewonnen worden over de
efficiëntie van fotochemie en warmteverlies. Ondanks dat de totale hoeveelheid chlorofyl
fluorescentie klein is (slechts 1 tot 2% van de geabsorbeerde straling) zijn de metingen vrij
eenvoudig. Het spectrum van de fluorescentie is verschillend dan dat van het geabsorbeerde
Materiaal en methoden
27
licht. Fluorescentie straling heeft namelijk een langere golflengte dan die van de
geabsorbeerde straling. Bijgevolg kan fluorescentie gekwantificeerd worden door een blad
bloot te stellen aan licht met een gekende golflengte en de hoeveelheid terug uitgestraald licht
met een langere golflengte op te meten (Maxwell & Johnson, 2000; Steppe, 2011).
Figuur 3.5 - De verschillende energetische pathways die een geabsorbeerd foton kan volgen: elektronentransportketen, warmte en fluorescentie (aangepast uit: LI-COR, 2004).
3.7.1.2 Chlorofyl-a fluorescentie quenching
Chlorofyl-a fluorescentie quenching betekent onderdrukking van de uitgezonden fluorescentie
straling, de excitatie-energie wordt dus onbeschikbaar voor fluorescentie. Bij fysiologische
temperaturen wordt 90% van de fluorescentie uitgezonden door chlorofylmoleculen in PS II.
Daarom wordt quenching gelinkt aan de status en de efficiëntie van de reactiecentra van PS II.
Een reactiecentrum wordt geöxideerd of ‘open’ genoemd wanneer de primaire
elektronenacceptor nieuwe elektronen kan accepteren voor gebruik in de
elektronentransportketen. Wanneer een reactiecentrum gereduceerd of ‘gesloten’ is, kan het
geen elektronen accepteren en moet de ongebruikte excitatie-energie op een andere manier
verwijderd worden. Quenching wordt opgesplitst in fotochemische (qP) en niet-
fotochemische quenching (NPQ). Zolang het reactiecentrum van PS II open is en elektronen
kan doorgeven naar PS I, wordt er van qP gesproken. qP zal maximaal zijn wanneer het blad
enkele minuten in het donker wordt gehouden. Deze donkerperiode zorgt voor volledige
oxidatie van alle elektronenacceptors waardoor alle reactiecentra van PS II open zullen zijn.
qP daalt wanneer planten stress hebben (hitte, koude, droogte, herbiciden). Het
elektronentransport wordt door deze stressfactoren geblokkeerd en de fluorescentie straling
neemt toe (Maxwell and Johnson, 2000; LI-COR, 2004; Baker, 2008; Steppe, 2011).
Efficiënte quenching van geëxciteerde energie is noodzakelijk om het fotosynthese apparaat te
beschermen. Indien fotosynthese om een bepaalde reden niet doorgaat, verlengt de levensduur
van de excitatie en kan er schade aan het fotosynthese apparaat ontstaan (Laisk & Oja, 1998).
3.7.1.3 ‘Saturation Pulse Method’
Door gebruik te maken van verzadigde lichtpulsen kan een scheiding van de twee quenching
mechanismen qP en NPQ mogelijk worden gemaakt.
De ‘saturation pulse method’ maakt gebruik van vier lichtbronnen die elk een kwantitatief en
kwalitatief verschillende lichtstraling uitzenden.
Materiaal en methoden
28
De eerste lichtbron produceert een meetlicht met een zeer lage intensiteit zodat geen
fotosynthese plaatsvindt, maar wel fluorescentie wordt opgewekt. De tweede lichtbron zendt
actinische straling uit voor het aandrijven van de fotosynthese. De derde lichtbron sluit alle
reactiecentra van PS II door verzadigde lichtpulsen met zeer hoge intensiteit te produceren.
Door de vierde lichtbron wordt PS I geactiveerd met verrood licht zodat de reactiecentra van
PS II snel kunnen openen.
De fluorescentieparameters tijdens de experimenten worden opgemeten wanneer het blad
gedurende 20 minuten is geadapteerd aan het donker. Dit gebeurt door de bladcuvette op het
blad te plaatsen terwijl alle lichtbronnen uitgeschakeld zijn. De primaire electronenacceptor
(QA) is dan maximaal geoxideerd en de reactiecentra van PS II zijn open. Vervolgens wordt
het donkergeadapteerd blad blootgesteld aan een zwak gemoduleerd meetlicht (ongeveer 0,1
μmol m-2
s-1
). Door de zeer lage intensiteit van het meetlicht vinden geen fotochemische
reacties plaats. Alle reactiecentra zijn dus open en qP is maximaal (qP=1). Dit resulteert in het
minimaal fluorescentieniveau F0. Daarna wordt het blad blootgesteld aan een korte actinische
puls met een hoge lichtintensiteit (> 1500 µmol m-2
s-1
). QA zal nu volledig gereduceerd zijn
en er vindt geen fotochemie plaats (qP=0). Het maximaal fluorescentieniveau Fm wordt
bereikt. Het verschil tussen Fm en F0 wordt het variabel fluorescentieniveau Fv genoemd.
Vervolgens wordt bovenop het meetlicht ook het actinisch licht aangeschakeld zodat de
fotosynthese kan doorgaan, samen met herhaaldelijke korte verzadigingspulsen. Hierdoor kan
het ‘steady-state’ fluorescentieniveau F en het maximaal fluorescentieniveau in de licht-
geadapteerde fase Fm’ worden opgemeten. Wanneer het actinisch licht wordt uitgeschakeld en
het verrood licht wordt aangezet, worden de reactiecentra van PS II geforceerd om te openen,
hierdoor kan het minimaal fluorescentieniveau in het licht-geadapteerde blad worden
berekend F0’. In Figuur 3.6 worden de ‘saturation pulse method’ en de
fluorescentieparameters schematisch voorgesteld.
Figuur 3.6 - Verloop van de fluorescentiemeting. Op donker-geadapteerde bladeren wordt het minimaal en maximaal fluo-rescentieniveau F0 en Fm gemeten. Op licht-geadapteerde bladeren wordt het ‘steady-state’ fluorescentieniveau F, het maximaal fluorescentieniveau Fm
’ en het minimaal fluorescentieniveau F0’ opgemeten. Een naar boven gerichte, rechte pijl
staat voor het gemoduleerd meetlicht en een naar boven gerichte, kronkelende pijl staat voor een verzadigingspuls. De naar beneden gerichte pijl staat voor het uitschakelen van het actinisch licht (aangepast uit: LI-COR, 2004).
Materiaal en methoden
29
Uit deze basisparameters kunnen verschillende fluorescentieparameters berekend worden, elk
met een specifieke fysiologische betekenis. Hieronder worden de relevante
fluorescentieparameters voor dit onderzoek opgesomd (Maxwell and Johnson, 2000; LI-COR,
2004; Roháček, 2002; Baker 2008; Steppe, 2011).
Fv/Fm wordt gebruikt om de maximale efficiëntie van de fotochemische reacties in PS II te
schatten. Wanneer planten abiotische of biotische stress ondervinden wordt vaak een daling in
Fv/Fm waargenomen. Vandaar wordt deze parameter gebruikt als een simpele en snelle manier
om stress te monitoren (Baker, 2008). Waarden voor Fv/Fm tussen 0,74 en 0,85 wijzen op niet-
gestresseerde planten (Lichtenthaler et al., 2005).
𝐹𝑣𝐹𝑚
=𝐹𝑚 − 𝐹0
𝐹𝑚
NPQ varieert tussen 0 en 1 en geeft de mate van onderdrukking van fluorescentie door
warmteverlies weer.
𝑁𝑃𝑄 =𝐹𝑚 − 𝐹𝑚
′
𝐹𝑚′
qP is een maat voor de onderdrukking van fluorescentie door fotosynthese en varieert
eveneens tussen 0 en 1. qP geeft een indicatie voor de hoeveelheid open reactiecentra in PS II.
𝑞𝑃 =𝐹𝑚′ − 𝐹′
𝐹𝑚′ − 𝐹0
De maximale efficiëntie van PS II in het lichtgeadapteerde blad (Fv’/Fm
’) is de efficiëntie
wanneer alle reactiecentra van PS II open zijn. De factor geeft een schatting van de fractie van
de PS II maximum efficiëntie die gerealiseerd is.
𝐹𝑣′
𝐹𝑚′=𝐹𝑚′ − 𝐹0
𝐹𝑚′
De actuele efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II (Fq’/Fm
’) is een maat voor de
proportie van het licht geabsorbeerd door chlorofylmoleculen in PS II die gebruikt wordt voor
fotochemie. Fq’ is het verschil tussen Fm
’ en F
’.
𝐹𝑞′
𝐹𝑚′=𝐹𝑣′
𝐹𝑚′. 𝑞𝑃 =
𝐹𝑚′ − 𝐹
𝐹𝑚′
De elektronen transportsnelheid (ETR) is de actuele flux aan fotonen die PS II aandrijven, met
Ablad het aandeel van het invallende licht (PPFD) dat geabsorbeerd wordt door de bladeren en
0,5 de fractie aan PS II.
𝐸𝑇𝑅 =𝐹𝑞′
𝐹𝑚′.𝐴𝑏𝑙𝑎𝑑 .𝑃𝐴𝑅. 0,5
Materiaal en methoden
30
3.8. Statistische analyse
De statistische verwerking werd uitgevoerd in S-PLUS (v8.2, Insightful Corporation,
California, USA) via een ANOVA-analyse (Fixed Effects). Er werd geopteerd voor een
Tuckey aanpassing met een 5% significantieniveau (p < 0,05) om te zien welke opgemeten
parameters significant verschillend waren tussen de vier hybriden.
Hoofdstuk 4
Resultaten
Resultaten
31
4.1. Microklimaat
Alle metingen werden uitgevoerd in een groeikamer onder gecontroleerde omstandigheden
(Tabel 4.1). In Figuur 4.1 wordt het verloop van de luchttemperatuur, de RH, het lichtregime
en het VPD voor beide proeven weergegeven. De herhaalde pieken in de temperatuur (Figuur
4.1A, C) zijn te wijten aan een probleem met de koelinstallatie in de groeikamer. Uit deze
gegevens wordt geconcludeerd dat het microklimaat tijdens beide proeven gelijkaardig was en
dat variaties in lichtintensiteit, temperatuur en RH van minimale invloed waren op de
metingen. Hierdoor kunnen dus de resultaten van de vier hybriden met elkaar worden
vergeleken.
Tabel 4.1 – Microklimaat: photosynthetic photon flux density (PPFD), temperatuur (T), relatieve vochtigheid (RH) en wa-terdampdrukdeficiet (VPD) in de groeikamer tijdens proef 1 en 2.
PPFD T RH VPD
(µmol m-2
s-1
) (°C) (%) (kPa)
Proef 1 Donkerperiode 0 21.11 48.50 1.30
Herstelperiode 84.01 (licht) 22.33 45.71 1.46
Proef 2 Donkerperiode 0 19.11 44.12 1.06
Herstelperiode 93.49 (licht) 20.03 41.44 1.17
Figuur 4.1 – Verloop van de temperatuur (T) (zwarte lijn) en de relatieve vochtigheid (RH) (grijze lijn) tijdens proef 1 (A) en proef 2 (C) en het waterdampdrukdeficiet (VPD) tijdens proef 1 (B) en proef 2 (D). De zwarte blokken duiden de don-kerperiode aan (DOY = Dag van het jaar).
Resultaten
32
4.2. Knopval
In Figuur 4.2A worden voor de vier hybriden het gemiddeld aantal knoppen per lengteklasse
getoond. Hieruit blijkt dat hybride 2 het minst aantal knoppen bezat en hybride 3 het meest. In
Figuur 4.2B wordt voor elke hybride het relatief gemiddeld aantal afgevallen knoppen per
lengteklasse weergegeven relatief ten opzichte van het aantal oorspronkelijke knoppen. Enkel
knoppen kleiner dan 2,0 cm verkleurden en vielen af, de grotere knoppen konden zich verder
ontwikkelen. Voor hybride 3 viel ook 50% van de knoppen af in de klasse ]2,0 – 2,4] cm. Dit
was echter slechts één knop van 2,1 cm groot, waardoor algemeen kan gesteld worden dat er
geen knopval boven de 2,0 cm plaatsvond. De meeste knopval vond bij de vier hybriden
plaats in de lengteklasse ]0,4 – 0,8] cm. Uit observaties (data niet getoond) bleek er geen trend
te zijn in de knopval van eerst grotere knoppen en dan kleinere of omgekeerd. In Figuur 4.2C
wordt het relatief gemiddeld aantal afgevallen knoppen per subjectieve lengteklasse getoond,
zoals in de praktijk bij het bedrijf Microflor wordt toegepast. Hieruit blijkt dat hybride 2 en 4
procentueel meer eindknoppen ten opzichte van de andere knoppen verloren. Hybride 3
verloor de meeste grotere knoppen. Indien deze classificatie wordt toegepast om de
knopvalgevoeligheid te bepalen, zal hybride 3 dus als de meest gevoelige soort naar voor
komen. In Figuur 4.2D wordt per dag na de donkerperiode getoond hoeveel knoppen er
gemiddeld cummulatief afvielen van het totaal aantal knoppen per plant. Het procentueel
aandeel knoppen dat afviel na de donkerperiode lag bij alle hybriden rond dezelfde grootte-
orde (gemiddeld 47,60%). Hybride 4 was het meest gevoelig aan knopval na een
donkerperiode van vijf dagen (57,31%), gevolgd door hybride 3 (47,51%). Hybride 2
(42,86%) en hybride 1 (42,54%) waren het minst gevoelig. De knopval bij hybride 1 verliep
sigmoïdaal, met een plotse knopval tussen dag zeven en dag tien. De knopval bij de andere
hybriden verliep geleidelijker aan. De knoppen van hybriden 2, 3 en 4 vielen geleidelijk af na
één of twee dagen na de donkerperiode. De knopval stagneerde bij alle hybriden tussen 10 en
12 dagen na de donkerperiode. De tamelijk grote standaardafwijkingen wijzen op een grote
variabiliteit tussen de planten van één hybride. Sommige planten verloren helemaal geen
knoppen, terwijl andere planten van dezelfde hybride bijna al hun knoppen verloren.
Resultaten
33
4.3. Fluorescentieparameters
Figuur 4.3 toont per dag de gemiddelde fluorescentieparameters voor zes opgemeten planten
per hybride. Dag 0 stelt de controledag voor, dag 1 tot 5 de donkerperiode en dag 6 tot 19 de
herstelperiode. In Figuur 4.4 wordt de gemiddelde waarde en standaardafwijking van de
fluorescentieparameters voor de donker- en herstelperiode per hybride weergegeven. Wanneer
de letters boven de balken verschillend zijn voor de verschillende hybriden duidt dit op een
significant verschil (p < 0,05).
Algemeen wordt uit de resultaten afgeleid dat voor alle hybriden Fv/Fm, Fv’/Fm
’, Fq
’/Fm
’, qP en
ETR toenamen en dat NPQ daalde in de donkerperiode. Echter, naarmate de donkerperiode
vorderde, daalden Fv’/Fm
’, Fq
’/Fm
’, qP en steeg ETR. Wanneer de planten opnieuw werden
blootgesteld aan een normaal dag/nachtregime namen de fluorescentieparameters
onmiddellijk ongeveer dezelfde waarde aan als op de controledag. Het aanpassingsvermogen
van de vier hybriden was dus groot.
Figuur 4.2 - (A) Het gemiddeld aantal knoppen per lengteklasse na de donkerperiode voor 10 planten per hybride (n=10), (B) Het gemiddeld (n=10) aantal afgevallen knoppen t.o.v. het oorspronkelijk aantal knoppen per lengteklasse, (C) Het gemiddeld (n=10) aantal afgevallen knoppen t.o.v. het oorspronkelijk aantal knoppen per subjectieve lengteklasse en (D) Het cummulatief gemiddeld aantal afgevallen knoppen relatief t.o.v. het oorspronkelijk aantal knoppen in de tijd. Op het einde van de herstelperiode wordt voor hybride 1 (H1), hybride 2 (H2), hybride 3 (H3) en hybride 4 (H4) de gemiddelde procentuele knopval t.o.v. het totaal aantal knoppen weergegeven.
Resultaten
34
Figuur 4.3 - Tijdsverloop van de gemiddelde fluorescentieparameters berekend voor zes planten (n=6) per hybride in de donker- en herstelperiode (enkel ’s nachts): (A) Maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II in de donker-geadapteerde fase (Fv/Fm), (B) Maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II in de licht-geadapteerde fase (Fv
’/Fm
’), (C) Actuele efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II (Fq
’/Fm
’), (D) Fotochemi-
sche quenching (qP), (E) Niet-fotochemische quenching (NPQ) en (F) Elektronentransportsnelheid (ETR). De zwarte blokken geven de donkerperiode weer.
Resultaten
35
Figuur 4.4 - De gemiddelde waarde en standaardafwijking van de fluorescentieparameters tijdens de donker- (zwarte balk) en herstelperiode (grijze balk) voor zes planten (n=6) per hybride: (A) Maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II in de donker-geadapteerde fase (Fv/Fm), (B) Maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II in de licht-geadapteerde fase (Fv
’/Fm
’), (C) Actuele efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II (Fq
’/Fm
’), (D) Fotochemische quen-
ching (qP), (E) Niet-fotochemische quenching (NPQ) en (F) Elektronentransportsnelheid (ETR). Wanneer twee parameters significant verschillend zijn, worden ze aangeduid met een verschillende letter (Tuckey, p < 0,05); kleine letters worden ge-bruikt voor de donkerperiode en hoofdletters voor de herstelperiode.
Resultaten
36
Uit Figuur 4.3A wordt afgeleid dat Fv/Fm voor alle hybriden relatief constant bleef gedurende
de hele proef, de waarde lag tussen de 0,81 en 0,82. Er werd een lichte stijging waargenomen
op het einde van de donkerperiode. Figuur 4.4A toont dat Fv/Fm significant verschillend was
tussen hybride 3 en de andere hybriden in de donkerperiode. Dit was de tweede meest
gevoelige hybride. Tijdens de herstelperiode was Fv/Fm van hybride 3 significant verschillend
met hybride 4. Dit waren de hybriden met de meeste waargenomen knopval.
Uit het verloop van Fv’/Fm
’ blijkt dat hybride 1 en 2 (minst knopval) een hogere waarde voor
Fv’/Fm
’ bezaten tijdens de donker- en herstelperiode (Figuur 4.3B). Dit wordt bevestigd in
Figuur 4.4B. Fv’/Fm
’ was namelijk zowel in de donker- als de herstelperiode gemiddeld het
hoogst voor de minst knopvalgevoelige hybriden (hybride 1 en 2) en het laagst voor de meest
knopvalgevoelige hybriden (hybride 3 en 4). Fv’/Fm
’ nam tijdens de donkerperiode geleidelijk
aan af (Figuur 4.3B), wat wil zeggen dat de maximale efficiëntie van de fotochemische
reacties van PS II daalde wanneer de donkerperiode langer aanhield. Voor hybride 4 (meest
gevoelig) was deze daling meer uitgesproken. Fv’/Fm
’ van hybride 2 was significant
verschillend met de andere hybriden in de donkerperiode (Figuur 4.4B). Dit was de hybride
met het tweede minst knopval. Fv’/Fm
’ van hybride 3 (tweede meest knopval) was ook
significant verschillend met hybride 1 (minst knopval) in de donkerperiode. In de
herstelperiode was Fv’/Fm
’ van hybride 1 en 2 (minst knopval) significant verschillend met
hybride 3 en 4 (meest knopval).
Het verloop van Fq’/Fm
’ van hybride 1 en 2 (minst gevoelig) was hoger dan van hybride 3 en
4, zowel tijdens de donker- als herstelperiode (Figuur 4.3C). Fq’/Fm
’ was ook gemiddeld hoger
voor hybride 1 en 2, zowel in de donker- als herstelperiode (Figuur 4.4C). Fq’/Fm
’ daalde
naarmate de donkerperiode langer duurde (Figuur 4.3C), wat wijst op een daling van de
actuele efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II. Net zoals bij Fv’/Fm
’ was deze
daling meer uitgesproken voor hybride 4 (meest gevoelig). Fq’/Fm
’ van alle hybriden waren
significant verschillend in de donker- en herstelperiode, met uitzondering van hybride 3 en 4
die onderling niet significant verschilden (Figuur 4.4C). In de donkerperiode was Fq’/Fm
’ van
hybride 4 (meest knopval) ook significant verschillend met hybride 1 (minst knopval).
Het verloop van qP van hybride 1 en 2 (minst knopval) was tijdens de donkerperiode hoger,
met andere woorden het aandeel open reactiecentra was bij deze hybriden dus groter (Figuur
4.3D). Dit wordt bevestigd in Figuur 4.4D, de gemiddelde qP van hybride 1 en 2 was in de
donkerperiode hoger dan qP van hybride 3 en 4. Bovendien had hybride 4 (meest knopval)
gemiddeld de laagste qP, zowel in de donker- als de herstelperiode. Ook hier wordt
waargenomen dat qP daalde naarmate de donkerperiode vorderde en dat deze daling meer
uitgesproken was voor hybride 4 (meest gevoelig) (Figuur 4.3D). qP van hybride 4 (meest
knopval) was significant verschillend met de andere hybriden in de donkerperiode. qP van
hybride 2 (tweede minst knopval) was significant verschillend met de andere hybriden in de
herstelperiode (Figuur 4.4D).
Het verloop van NPQ (Figuur 4.3E) en de gemiddelde NPQ (Figuur 4.4E) waren beide lager
voor hybride 1 en 2 (minst knopval) in vergelijking met hybride 3 en 4 (meest knopval),
zowel tijdens de donker- als herstelperiode. De minder gevoelige hybriden onderdrukten de
fluorescente straling dus minder via warmteverlies. NPQ nam toe naarmate de donkerperiode
langer duurde, het aandeel fluorescente straling dat onderdrukt werd via warmteverlies steeg
Resultaten
37
dus. Deze stijging was het grootst bij hybride 4 (meest gevoelig) (Figuur 4.3E). Uit Figuur
4.4E wordt afgeleid dat NPQ van hybride 2 (tweede minst knopval) in de donkerperiode
significant verschillend was met NPQ van de andere hybriden. NPQ in de herstelperiode was
gemiddeld het hoogst voor de meest knopvalgevoelige hybride (hybride 4) en het laagst voor
de minst knopvalgevoelige hybride (hybride 1). NPQ was significant verschillend in de
herstelperiode tussen hybride 1 (minst knopval) en de andere hybriden. NPQ van hybride 4
(meest knopval) was ook significant verschillend met NPQ van hybride 2 (tweede minst
knopval) en 3 (tweede meest knopval) (Figuur 4.3E).
Uit Figuur 4.3F en 4.4F wordt afgeleid dat zowel het verloop als het gemiddelde van ETR in
de donker- en herstelperiode hoger was voor hybride 1 en 2 (minst gevoelig). Deze hybriden
hadden dus een grotere actuele fotonenflux die PS II aandreef. ETR van hybride 2 (tweede
minst knopval) was zowel in de donker- als herstelperiode significant verschillend met ETR
van de andere hybriden (Figuur 4.4F).
4.4. Fotosynthese en transpiratie
4.4.1 Bladeren
4.4.1.1 Discontinue metingen van fotosynthese, transpiratie en stomatale
geleidbaarheid
Figuur 4.5 toont de gemiddelde (n=6) netto-fotosynthesesnelheid, transpiratiesnelheid en
stomatale geleidbaarheid voor het blad van de vier hybriden. Dag 0 stelt de controledag voor,
dag 1 tot 5 de donkerperiode en dag 6 tot 19 de herstelperiode. De netto-fotosynthesesnelheid
werd negatief gedurende de hele donkerperiode in tegenstelling tot wat verwacht wordt van
CAM planten. De bladeren respireerden dus continu gedurende de donkerperiode, wat duidt
op stress. Ook de transpiratiesnelheid daalde tijdens de donkerperiode, de stomata waren dus
meer gesloten. Wanneer de planten opnieuw blootgesteld werden aan een dag/nachtregime,
herstelden ze zich. Er werd opnieuw een CAM patroon waargenomen: CO2 fixatie in het
donker (stomata open) en respiratie tijdens het licht (stomata dicht). De transpiratiesnelheid
was eveneens hoger gedurende de nachten in de herstelperiode, maar werd niet 0 tijdens het
licht. De stomata waren dus niet volledig gesloten (ook te zien in de stomatale
geleidbaarheid). Hybriden 3 en 4 (Figuur 4.5C, D) herstelden het traagst na de donkerperiode
(meest gevoelige hybriden) en hybride 1 en 2 herstelden het snelst (minst gevoelige). De CO2
fixatie, transpiratiesnelheid en stomatale geleidbaarheid daalden in het donker tijdens de
herstelperiode voor alle hybriden rond dag 10. Dit valt samen met de meeste knopval. De
respiratie bij hybride 1 (Figuur 4.5A) steeg op dag 5 van de donkerperiode (meer stress), de
stomatale geleidbaarheid was dan ook 0. Uit Figuur 4.5B wordt geconcludeerd dat de
respiratie van hybride 2 tijdens de donkerperiode afnam tot dag 3 en daarna toenam van dag 4
tot 5. Vanaf dag 4 werd de stomatale geleidbaarheid bovendien 0, de stomata waren dus
volledig gesloten. Bij hybride 3 (Figuur 4.5C) steeg de respiratie vanaf dag 3 en was de
stomatale geleidbaarheid reeds van dag 1 min of meer nul. Uit Figuur 4.5D wordt afgeleid dat
hybride 4 verschillend reageerde dan de andere hybriden. De respiratie tijdens de
donkerperiode vertoonde een zigzagpatroon, waarbij de stomatale geleidbaarheid rond nul
fluctueerde. Hybride 1, 2 en 3 vertoonden de eerste drie dagen in de donkerperiode een
toename in de transpiratiesnelheid (Figuur 4.5A-C). Op dag 4 of 5 van de donkerperiode
Resultaten
38
daalde de transpiratiesnelheid weer (stomata sloten volledig). Hybride 4 vertoonde opnieuw
een zigzagpatroon in de transpiratiesnelheid tijdens de donkerperiode (Figuur 4.5D).
Uit alle grafieken blijkt dat de stomatale geleidbaarheid het transpiratiepatroon verklaarde. Dit
blijkt ook uit Figuur 4.6. De transpiratiesnelheid volgde zowel tijdens proef 1 (4.6A) als
tijdens proef 2 (4.6B) het VPD patroon niet en werd dus stomataal geregeld.
Figuur 4.7A toont de gemiddelde (n=6) netto-fotosynthesesnelheid in de donker- en
herstelperiode voor de vier hybriden en Figuur 4.7B de gemiddelde transpiratiesnelheid. De
netto-fotosynthesesnelheid was niet significant verschillend tussen de vier hybriden. In de
donkerperiode was de transpiratiesnelheid van hybride 1 (minst knopval) significant
verschillend met de andere hybriden. De transpiratiesnelheid van hybride 1 was bovendien het
hoogst tijdens de donkerperiode en was lager voor de knopvalgevoelige soorten (hybride 3 en
4). De transpiratiesnelheid in de herstelperiode was enkel significant verschillend tussen
hybride 2 (tweede minst knopval) en 4 (meest knopval).
Figuur 4.5 – Gemiddelde netto-fotosynthesesnelheid, transpiratiesnelheid en stomatale geleidbaarheid (n=6) voor de bladeren van hybride 1 (A), hybride 2 (B), hybride 3 (C) en hybride 4 (D) tijdens de donker- en herstelperiode. De zwarte blokken tonen de donkerperiode aan en de grijze blokken de periode met de meeste knopval.
Resultaten
39
4.4.1.2 Continue metingen van fotosynthese en transpiratie
Figuur 4.8 toont de netto-fotosynthesesnelheid, transpiratiesnelheid en het VPD voor het blad
van hybride 2 (Figuur 4.8A) en hybride 3 (Figuur 4.8C). Figuur 4.8B en D tonen een detail
van de overgang van de donkerperiode naar de herstelperiode voor hybride 2 en 3. Tijdens het
uitvoeren van de discontinue metingen steeg de CO2 concentratie telkens wanneer een
persoon in de groeikamer ging vanwege zijn ademhaling. Hierdoor waren de
omgevingscondities niet meer stabiel voor de continue fotosynthese- en transpiratiemetingen.
De ruis op de data werd beperkt door alle waarden bij verhoogde CO2 concentraties weg te
filteren (referentie CO2 concentratie hoger dan 600 ppm). Uit Figuur 4.8B en D is duidelijk af
te leiden dat het blad continu respireerde en in beperkte mate transpireerde in de
donkerperiode. Tijdens de herstelperiode is de netto-fotosynthesesnelheid en
transpiratiesnelheid ’s nachts hoger dan overdag. Dit wijst erop dat de stomata in de bladeren
’s nachts open staan en dat ze terug aan CO2 fixatie doen in het donker (CAM). Net zoals bij
de discontinue metingen (Figuur 4.5C) werd waargenomen dat de fotosynthese en transpiratie
zich minder snel herstelden na de donkerperiode bij hybride 3.
Figuur 4.6 – Gemiddelde transpiratiesnelheid (n=6) van de bladeren tijdens de donker- en herstelperiode en het waterdampdrukdeficiet (VPD) voor proef 1 (A) en proef 2 (B).
Figuur 4.7 – Gemiddelde netto-fotosynthesesnelheid (n=6) in de donker- en herstelperiode voor de bladeren van de vier hybriden en (B) gemiddelde (n=6) transpiratiesnelheid in de donker- en herstelperiode voor de vier hybriden. Wanneer twee parameters significant verschillend zijn, worden ze aangeduid met een verschillende letter (Tuckey, p < 0,05); kleine letters worden gebruikt voor de donkerperiode en hoofdletters voor de herstelperiode.
Resultaten
40
4.4.2 Bloemstengels
De bloemstengels respireerden continu tijdens de hele meetperiode (Figuur 4.9A-D). Tijdens
de donkerperiode was er geen dag/nachtpatroon waar te nemen. Uit de detailfiguren (Figuur
4.9E-H) blijkt dat in de herstelperiode de respiratie ’s nachts toenam en overdag afnam. Dit
kan verklaard worden doordat de bloemen en stengels in het licht een beetje aan fotosynthese
deden, waardoor de totale respiratie kleiner werd overdag.
Figuur 4.10A-D tonen respectievelijk het continu verloop van de transpiratiesnelheid en het
VPD van hybride 1, 2, 3 en 4. In Figuur 4.10E-H wordt een detail weergegeven van de
donkerperiode. De daling in de transpiratiesnelheid bij hybride 1 en 2 (Figuur 4.10A, B) op
DOY 326 wordt verklaard doordat de bladcuvette werd aangespannen om ze meer luchtdicht
te maken. De transpiratiesnelheid was continu positief en volgde het VPD, wat erop wijst dat
de stomata van de bloemen altijd open waren, zowel in de donker- als herstelperiode. De
pieken in de transpiratiesnelheid worden verklaard door de pieken in het VPD voor de vier
hybriden. De stomata van de bloemen van deze hybriden zijn dus niet-functioneel aangezien
de stomata niet openen en sluiten. Uit de detailfiguren (Figuur 4.10E-H) blijkt dat hybride 3
en 4 (meest gevoelige) tijdens de donkerperiode oscillaties in de transpiratie vertoonden.
Hybride 1 en 2 hadden deze oscillaties minder. Er moet echter voorzichtigheid geboden
worden met de interpretatie van deze oscillaties. Deze kunnen namelijk ook het gevolg zijn
van de niet opgemeten en dus ingeschatte luchtdebieten. Er werd tijdens proef 2 namelijk een
gemiddelde waarde van de debieten van proef 1 genomen.
Figuur 4.8 - (A) Netto-fotosynthesesnelheid en transpiratiesnelheid van het blad en het waterdampdrukdeficiet (VPD) in de donker- en herstelperiode voor hybride 2 en (C) voor hybride 3. (B) Detail van de overgang van donker- naar herstelperiode voor hybride 2 en (D) voor hybride 3. De zwarte blokken duiden de donkerperiode aan (DOY = Dag van het jaar).
Resultaten
41
Figuur 4.9 - Netto-fotosynthesesnelheid (zwarte cirkels) en waterdampdrukdeficiet (VPD) (zwarte lijn) voor de meest transpirerende bloemstengel van hybride 1, 2, 3 en 4 (A-D) en detail van de overgang van donker- naar herstelperio-de van hybride 1, 2, 3 en 4 (E-F). De zwarte blokken duiden de donkerperiode aan (DOY = Dag van het jaar).
Resultaten
42
Figuur 4.10 - Transpiratiesnelheid (witte cirkels) en waterdampdrukdeficiet (VPD) (zwarte lijn) voor de meest transpirerende bloemstengel van hybride 1, 2, 3 en 4 (A-D) en detail van de donkerperiode van hybride 1, 2, 3 en 4 (E-F). De zwarte blokken duiden de donkerperiode aan (DOY = Dag van het jaar).
Hoofdstuk 5
Discussie
Discussie
43
5.1. Definitie knopvalgevoeligheid
Het is van belang voor de orchideeënindustrie om (snel) te kunnen achterhalen welke
hybriden knopvalgevoelig zijn en welke niet. Knopvalgevoelige hybriden kunnen namelijk
minder lang in het donker getransporteerd worden waardoor ze soms niet meer gebruikt
worden bij verdere veredeling. Om de gevoeligheid te definiëren is het van groot belang dat er
een eenduidige methode wordt opgesteld. Tijdens dit onderzoek werden vier verschillende
hybriden getest op hun gevoeligheid aan knopval.
Het oorspronkelijk aantal knoppen verschilde sterk tussen de verschillende hybriden en was
bij hybride 2 het laagst (Figuur 4.2A). Dit is mogelijk te wijten aan het minder groeikrachtig
zijn van hybride 2. Hieruit kan worden besloten dat het oorspronkelijk aantal knoppen in
rekening moet worden gebracht om de knopvalgevoeligheid van de hybriden te bepalen.
Daarom wordt de knopval verder procentueel ten opzichte van het oorspronkelijk aantal
knoppen bepaald (Figuur 4.2B-D). Uit deze resultaten blijkt dat alle vier de hybriden gevoelig
zijn aan knopval na een donkerperiode van vijf dagen en dat de knopvalgevoeligheid
toeneemt van hybride 1 naar hybride 4. Uit de standaardafwijkingen blijkt bovendien dat er
een grote variabiliteit is tussen de planten van één hybride. Vandaar is het aangewezen om de
knopval op basis van gemiddelde waarden te definiëren. Verder is het voor de kweker van
belang dat de planten gemiddeld weinig knopval hebben. Het is niet zo erg als er één plant op
een volledige batch knopval vertoont.
Knoppen groter dan 2,0 cm waren blijkbaar groeikrachtig genoeg om zich verder te
ontwikkelen na een donkerperiode aangezien deze zelden afvielen (Figuur 4.2B). De
donkerperiode van vijf dagen heeft dus enkel een invloed op knoppen met een lengte onder de
2,0 cm. De knopval in de kleinere klassen (< 0,8 cm) zijn van geringer economisch belang
voor de kweker. Vooral de knopval van grote knoppen is schadelijk voor de inkomsten van de
kwekerijen. Tijdens deze studie werd ook dit economisch belang meegenomen. Wanneer voor
de bepaling van de knopvalgevoeligheid van de hybriden enkel rekening wordt gehouden met
de knopval van grote knoppen, wordt echter een andere volgorde van gevoeligheid bekomen
dan wanneer met alle knoppen werd rekening gehouden (Figuur 4.2C). Hybride 3 blijkt dan
de meest gevoelige hybride te zijn, gevolgd door hybride 4, 1 en 2. Net zoals wanneer alle
knoppen in rekening worden gebracht, komen hybride 1 en 2 naar voor als de minder
gevoelige, terwijl hybride 3 en 4 gevoeliger zijn. Er is echter wel een verschil in de volgorde.
Aangezien de indeling in lengteklassen bij deze methode subjectief gebeurd, is deze
wetenschappelijk minder aangewezen.
De waargenomen gevoeligheid van de hybriden tijdens deze proef verschilt met de
gevoeligheid die Microflor suggereerde. Microflor stelde de planten echter twee dagen langer
bloot aan een donkerperiode om de gevoeligheid te testen. De knopvalgevoeligheid blijkt
bovendien soms afhankelijk te zijn van de omgevingsomstandigheden tijdens de opgroei van
de verschillende hybriden. Het verschil in gevoeligheid kan ook te wijten zijn aan een extra
stressfactor tijdens deze proef. Het dag/nachtregime werd namelijk verschoven om de
metingen in het donker te kunnen realiseren. In de groeikamer was het licht van 1u tot 13u
waardoor de lichtperiode ongeveer zes tot zeven uur werd vervroegd in tegenstelling tot de
normale lichtperiode. Deze verschuiving van het dag/nachtregime heeft een invloed op het
Discussie
44
circadiaans ritme. Organismen worden normaal blootgesteld aan dagelijkse cycli van licht en
donker waardoor ze een ritmisch gedrag vertonen in associatie met deze cycli. Wanneer
planten getransporteerd worden, gaat de dagelijkse dag/nacht cycli over in continu donker.
Tijdens de donkerperiode blijven vele planten het oorspronkelijk ritme behouden, toch op zijn
minst voor enkele dagen. Onder uniforme omstandigheden is de periode van het ritme
ongeveer 24 uur waardoor de term ‘circadiaans ritme’ wordt gebruikt. Omdat de planten
continu in het donker zitten, zijn deze circadiaanse ritmes geen directe respons op de aan- of
afwezigheid van licht. Ze moeten gebaseerd zijn op een interne klok, een endogene oscillator.
De ritmes worden intern gegenereerd, maar ze vereisen een signaal uit de omgeving om hun
expressie te initiëren (bv. blootstelling aan licht of verandering in temperatuur). Vandaar
vermindert de amplitude van het ritme vaak wanneer de plant gedurende een paar cycli aan
constante omstandigheden wordt blootgesteld. Deze endogene oscillator is gekoppeld aan
verschillende fysiologische processen zoals fotosynthese (Taiz & Zeiger, 2006). Groeiend
bewijs suggereert dat er twee fundamentele niveaus van controle verantwoordelijk zijn voor
het koppelen van de vier CAM-fasen. De circadiaanse controle van de koolstofflux door
PEPC wordt algemeen gezien als de sleutelcomponent in de dag/nachtscheiding van de
carboxylatieprocessen. Een tweede, metabolische controle moduleert de output van de
circadiaanse oscillator op fluctuaties in interne en externe CO2 voorraad (Dodd et al., 2002).
De opgelegde verschuiving van het dag/nachtregime in de twee proeven is echter analoog aan
het intercontinentaal transport over zes tot zeven tijdzones, bijvoorbeeld plantentransport van
Europa naar Azië of van de VS naar Europa. Wanneer de orchideeën na het donkertransport
terug in het licht komen in de serres, is hun dagritme namelijk ook met zes tot zeven uur
verschoven.
Algemeen kan geconcludeerd worden dat het voor de kwekerijen van belang is om een
gestandaardiseerde methode op te stellen om de gevoeligheid voor knopval te bepalen. Hierbij
moet voldoende aandacht besteed worden aan gelijke omgevingscondities, aandeel knopval
op het totaal aantal knoppen, gemiddelde knopval per hybride en een consistente manier om
de lengte van de knoppen in rekening te brengen. Wanneer voor het bepalen van de
knopvalgevoeligheid enkel rekening wordt gehouden met een donkerperiode, kan de
selectiemethode tekorten vertonen bij intercontinentaal transport waarbij verschillende
tijdzones worden doorkruist. In dit geval zou ook het verschuiven van het dag/nachtregime in
rekening moeten worden gebracht.
5.2. Fluorescentieparameters als screeningparameters
5.2.1 Hogere efficiëntie van PS II en grote flexibiliteit als reactie op
donkerstress
Tijdens de donkerperiode namen alle fluorescentieparameters, behalve NPQ, toe (Figuur 4.3).
Dit wijst er algemeen op dat de hybriden veel efficiënter omgingen met het beperkte licht dat
ze kregen in de donkerperiode (afkomstig van de lichtpulsen van de LI-COR).
De maximale efficiëntie van de fotochemische reacties van PS II (Fv/Fm) bleef voor alle
hybriden relatief constant gedurende de hele proef (Figuur 4.3A) rond een waarde van 0,8 die
erop wijst dat de planten geen stress ondervonden aan PS II (Lichtenthaler et al., 2005). Fv/Fm
Discussie
45
wordt namelijk vaak gebruikt als indicator voor schade aan PS II door foto-inhibitie, omdat
deze ratio sterk daalt bij gestresseerde planten (Roháček, 2002). Dit stemt overeen met het
onderzoek van Lin & Hsu (2004) op Phalaenopsis amabilis waaruit bleek dat Fv/Fm
(gemiddeld 0,8) niet werd beïnvloed door lage lichtintensiteiten. Na donkertransport was
Fv/Fm ook niet verschillend bij Phalaenopsis Sogo Yukidian ‘V3’ (Hou et al., 2010) en
Phalaenopsis equestris (Su et al., 2001). Pollet et al. (2010) nam bij Phalaenopsis ’s nachts
ook een constante Fv/Fm waar met een gemiddelde waarde van 0,82. Er kan geconcludeerd
worden dat een donkerperiode van vijf dagen geen effect had op Fv/Fm en dat deze
fluorescentieparameter dus niet geschikt is om het effect van donkerstress na te gaan. Dit
bevestigt het onderzoek van Hou et al. (2010). Waarschijnlijk is dit te wijten aan het feit dat
Fv/Fm voornamelijk gelinkt wordt aan stress door foto-inhibitie (overmaat aan licht), wat hier
niet het geval is. De toename van de overige fluorescentieparameters (met uitzondering van
NPQ) tijdens de donkerperiode duidt op een grotere gebruikte fractie van de maximale
efficiëntie van PS II (Fv’/Fm
’), een grotere proportie van het geabsorbeerde licht dat werd
gebruikt voor fotochemie (Fq’/Fm
’), een grotere hoeveelheid open reactiecentra (qP) en een
grotere actuele fotonenflux die PS II aandreven (ETR). Tijdens de donkerperiode
onderdrukten de planten de fluorescentie minder via warmteverlies (lagere NPQ). Bovendien
bleek er een inverse relatie te zijn tussen NPQ en Fq’/Fm
’, wat het onderzoek van Pollet et al.
(2010) bevestigt. De verandering van deze fluorescentieparameters wijzen dus met andere
woorden op een grotere efficiëntie van PS II tijdens de donkerperiode.
De toename van de fluorescentieparameters (en de afname van NPQ) tijdens de aanhoudende
donkerperiode zijn in tegenstelling tot lagere fluorescentieparameters (en een hogere NPQ) in
het donker tijdens een normale dag/nachtcyclus (data niet getoond). ’s Nachts werd ook een
lagere Fq’/Fm
’ en qP en een hogere NPQ waargenomen door Pollet et al. (2010). Een lagere
waarde voor de fluorescentieparameters (en een hogere waarde voor NPQ) tijdens het donker
bij een normale dag/nachtcyclus wordt als volgt verklaard (Figuur 3.5). Overdag draait de
elektronentransportketen op volle toeren, er wordt NADPH en ATP aangemaakt en verbruikt
om CO2 om te zetten in suikers via de Calvincyclus. Er is dus geen ophoping van NADPH en
ATP in het stroma en de efficiëntie van PS II is hoog. Wanneer de planten ’s nachts een
lichtpuls krijgen, raakt de elektronentransportketen verzadigd. De Calvincyclus gaat namelijk
niet door in het donker waardoor geen NADPH en ATP wordt verbruikt. Door de ophoping
van NADPH en ATP in het stroma, wordt de synthese ervan geïnhibeerd. Hierdoor hopen de
elektronen in de elektronentransportketen en de protonen in het thylakoïdlumen op waardoor
de efficiëntie van PS II daalt (lagere waarde voor de fluorescentieparameters). Een grote
transmembrane protongradiënt zorgt bovendien voor de reversibele omzetting van
violaxanthine naar zeaxanthine (pigmenten die een rol spelen bij de dissipatie van een
overmaat aan energie). De binding van protonen en zeaxanthine aan het LHC zorgt voor
veranderingen in de ruimtelijke schikking die leiden tot warmteverlies, hierdoor neemt NPQ
dus toe (Steppe, 2011). Wanneer de planten worden blootgesteld aan een langere
donkerperiode vindt er echter geen CO2 fixatie meer plaats en wordt ook geen NADPH en
ATP gevormd in de lichtreacties. De Calvincyclus valt dus stil. Wanneer de
elektronentransportketen nu elektronen krijgt (van een lichtpuls), zou deze dus weer
verzadigd moeten raken om bovenvermelde redenen. Het is mogelijk dat de planten ‘weten’
dat ze al lang geen licht hebben gekregen (bv. door het circadiaans ritme/de endogene
oscillator). Door de lichtpuls van de LI-COR kunnen ze het idee krijgen dat er een nieuwe
Discussie
46
lichtperiode zal aanbreken waardoor ze zo snel mogelijk NADPH en ATP willen aanmaken
om de CO2 (die nog eventueel aanwezig is in de vacuole in het begin van de donkerperiode) te
kunnen omzetten in suikers. Dit kan de verhoogde efficiëntie van PS II verklaren tijdens de
donkerperiode.
Wanneer de hybriden terug blootgesteld werden aan een dag/nachtregime namen de
fluorescentieparameters onmiddelijk ongeveer dezelfde waarde aan als op de controledag
(Figuur 4.3). De geteste Phalaenopsis hybriden reageerden dus veerkrachtig op de
donkerstress van vijf dagen. Hieruit wordt eveneens besloten dat PS II niet beschadigd werd
door de donkerperiode van vijf dagen. De waarden voor en na de donkerperiode zijn
gelijkaardig. Dit bevestigt het onderzoek van Hou et al. (2010) op Phalaenopsis Sogo
Yukidian ‘V3’.
Uit de belichtingsstudies van Lin & Hsu (2004) en He & Teo (2007) bleek dat qP en ETR
daalden en NPQ steeg met dalende belichting. De Phalaenopsis planten werden niet continu
in het donker gehouden zoals tijdens ons onderzoek, wat de verschillende resultaten kan
verklaren. Hou et al. (2010) vonden geen significant verschil tussen de qP van Phalaenopsis
Sogo Yukidian ‘V3’ na 21 dagen donkertransport en de qP van controleplanten die geen
donkertransport ondergingen. Dit komt overeen met ons onderzoek. Er werd echter geen
vergelijking met controleplanten gemaakt, maar de qP nam na de donkerperiode wel ongeveer
eenzelfde waarde aan als ervoor (Figuur 4.3D). Su et al. (2001) stelden daarentegen een
daling van qP vast, maar geen invloed op NPQ na 10, 20 en 30 dagen donkertransport. Dit
lijkt op het eerste zicht tegenstrijding met onze resultaten, maar in dit onderzoek werd geen
vijf dagen donkertransport gesimuleerd waardoor een vergelijking met onze proef niet
eenduidig is.
5.2.2 Dalende efficiëntie van PS II wanneer de donkerperiode vorderde
Naarmate de donkerperiode vorderde, daalden alle gestegen fluorescentieparameters opnieuw,
met uitzonder van de gedaalde NPQ die opnieuw steeg (Figuur 4.3). Dit wijst erop dat de
verhoogde efficiëntie om met het licht om te springen, afnam naarmate de donkerperiode
langer duurde. PS II werkte dus minder efficiënt naarmate de donkerperiode vorderde. Het is
mogelijk dat de amplitude van de circadiaanse ritmes afzwakten omdat er geen extern signaal
meer was om de expressie van de ritmes te initiëren. De afname van de
fluorescentieparameters (en toename van NPQ) tijdens de laatste dagen van de donkerperiode
was het grootst voor de meest knopvalgevoelige hybride. Het PS II van de
knopvalgevoeligere planten werkte dus minder efficiënt wanneer de planten langdurig aan
donker werden blootgesteld. Het kan gesuggereerd worden dat de productie van
stresshormonen en dus 1-ACC toeneemt wanneer PS II minder efficiënt werkt.
5.2.3 Sommige fluorescentieparameters zijn gerelateerd aan de
knopvalgevoeligheid
Fv’/Fm
’ (Figuur 4.4B) en NPQ (Figuur 4.4E) konden tijdens het donker in de herstelperiode
gerelateerd worden aan de volgorde van de knopvalgevoeligheid. Fv’/Fm
’ was gemiddeld het
hoogst voor de minst knopvalgevoelige hybride (hybride 1) en nam af naarmate de hybriden
meer knopvalgevoelig waren, terwijl NPQ het laagst was voor de minst knopvalgevoelige
Discussie
47
hybride (hybride 1) en steeg naarmate de hybriden meer knopvalgevoelig waren. Fv’/Fm
’ van
de gevoelige hybriden (hybride 3 en 4) was in de herstelperiode bovendien significant
verschillend met deze van de minder gevoeligere hybriden (hybride 1 en 2). Fv’/Fm
’ en NPQ
kunnen dus als screeningparameters worden voorgesteld: hoe hoger en lager deze waarden in
het donker tijdens de herstelperiode, hoe minder knopvalgevoelig de hybride zal zijn. Een
combinatie van Fv’/Fm
’ en NPQ lijkt het meest aangewezen om de hybriden te selecteren op
hun knopvalgevoeligheid.
Ook de andere fluorescentieparameters kunnen gerelateerd worden aan de
knopvalgevoeligheid ondanks het feit dat de significanties niet helemaal overeenstemmen.
Aangezien Fq’/Fm
’ en ETR zowel tijdens de donker- als de herstelperiode gemiddeld lager
waren voor de knopvalgevoelige hybriden (Figuur 4.4C en F), zullen de meer gevoeligere
soorten een lagere efficiëntie van PS II hebben en een kleinere actuele fotonenflux die PS II
aandrijft. Deze redenering gaat ook op voor qP in de donkerperiode: een lagere waarde tijdens
de donkerperiode wijst op meer knopvalgevoelige soorten (Figuur 4.4D). Ze bezitten dus een
kleiner aandeel open reactiecentra in de donkerperiode.
Uit de lagere Fv’/Fm
’, Fq
’/Fm
’, qP en ETR en de hogere NPQ van de meer knopvalgevoelige
soorten wordt afgeleid dat de efficiëntie van PS II lager was bij de gevoeligere soorten. De
werking van PS II was dus meer gelimiteerd bij de knopvalgevoeligere hybriden door de vijf
dagen donker. Als reactie op deze grotere donkerstress kan de aanmaak van het
stresshormoon ethyleen worden bevorderd. Het is dus mogelijk dat er meer 1-ACC
geproduceerd werd bij de meer gevoelige hybriden omdat ze meer stress ondervonden van de
donkerperiode.
5.3. De rol van fotosynthese en transpiratie bij verhoogde knopval
na donkerstress
5.3.1 Bladeren
Na één dag donkerstress vond er in de bladeren geen dagelijkse CAM-cyclus meer plaats en
respireerden de bladeren continu (Figuur 4.5). Door de afwezigheid van licht konden geen
lichtreacties doorgaan en werd er geen NADPH en ATP aangemaakt via de
elektronentransportketen. Door dit tekort aan NADPH en ATP kon CO2 via de Calvincyclus
niet worden omgezet naar suikers, waardoor ook geen PEPC kon worden gevormd uit de
afbraak van suikers. Aangezien PEPC het basissubstraat is om CO2 te binden, steeg de interne
CO2 concentratie. Waarschijnlijk sloten de stomata hierdoor (Figuur 4.5) en werd er geen
atmosferische CO2 en zuurstof meer opgenomen. Ceusters et al. (2011) stelden eveneens een
negatieve totale CO2 balans over de volledige CAM-cyclus vast in beschaduwde Aechmea
planten (zes dagen schaduw). Ook in het onderzoek van Hou et al. (2010) was de netto CO2
opnamesnelheid en stomatale geleidbaarheid nul na een donkerperiode van 21 dagen. Ze
herstelden tot een normaal niveau zes tot acht dagen na het donkertransport. Door het sluiten
van de stomata tijdens de donkerperiode is er een gebrek aan exogene CO2 opname. Hierdoor
kan het hergebruik van CO2 uit respiratie optreden, wat ‘CAM-idling mode’ wordt genoemd.
Dit effect is reeds beschreven bij droogtestress (Su et al., 2001; Ceusters et al., 2009) en kan
mogelijks ook optreden wanneer de stomata sluiten bij donkerstress. De transpiratie in de
Discussie
48
donkerperiode was lager voor de knopvalgevoelige hybriden (Figuur 4.7). De stomata waren
dus meer gesloten. Het sluiten van de stomata lijkt gerelateerd te zijn aan de hogere
fotosynthetische stress veroorzaakt door de donkerperiode bij de gevoeligere hybriden. De
respiratie nam toe en de transpiratie daalde, met uitzondering van hybride 4, naarmate de
donkerperiode langer aanhield. De stomata sloten dus meer. Bij hybride 4 was vanaf de eerste
dag donkerstress de respiratie al groot en de transpiratie al praktisch nul. Hieruit wordt
besloten dat de bladeren meer stress ondervonden bij een langere donkerperiode. Deze
resultaten zijn analoog aan het verloop van de fluorescentieparameters (Figuur 4.3).
Wanneer de planten terug werden blootgesteld aan een normaal dag/nachtregime herstelde de
CAM-cyclus zich in de bladeren (Figuren 4.5 en 4.8). Dit wijst er opnieuw op dat de planten
zeer flexibel konden omgaan met donkerstress en dat het fotosynthese-apparaat niet
beschadigd werd tijdens de donkerperiode en bevestigt de bevindingen die uit de
fluorescentieparameters werden geconcludeerd. Hybride 4, die het meest gevoelig was aan
knopval, herstelde echter trager dan de andere hybriden (Figuur 4.5). Dit blijkt ook uit het
verloop van de fluorescentieparameters (Figuur 4.3). Het kan dus gesuggereerd worden dat de
knopvalgevoeligere hybriden meer fotosynthetische stress ondervonden van de donkerperiode
en minder flexibel reageerden bij de overgang naar een normaal dag/nachtregime. Aangezien
ze meer stress ondervonden, nam mogelijks de 1-ACC productie toe.
5.3.2 Bloemstengels
De bloemen en bloemstengels respireerden tijdens de donkerperiode continu (Figuur 4.9). Dit
was ook zo in de herstelperiode waarbij bovendien een dag/nachtpatroon werd waargenomen
met overdag een kleinere respiratie dan ‘s nachts. De lagere respiratie overdag kan verklaard
worden doordat de bloemen en stengels in het licht een beetje aan fotosynthese deden,
waardoor de totale respiratie kleiner werd overdag in vergelijking met ‘s nachts. De bloemen
en stengels vertoonden dus (samen) een C3 fotosynthesemechanisme. Dit komt overeen met
het onderzoek van Hew & Yong (1997) waarbij de bloemen van Phalaenopsis geen CAM
metabolisme vertoonden. In hun onderzoek lieten de bloemstengels daarentegen wel een zwak
CAM metabolisme zien. Aangezien in onze proef de bloemen en stengels in één branchbag
werden opgemeten, kan het zijn dat de C3 fotosynthese van de bloemen het zwakke CAM
metabolisme van de stengels overheerste. De studies van Endo & Ikusima (1989, 1992) en
Goh (1983) namen echter wel een zwak CAM metabolisme waar in de bloemen van
Phalaenopsis, Arachnis, Aranda, Dendrobium en Vanda hybriden. In onze proef was de
transpiratiesnelheid continu positief en volgde het VPD, wat erop wijst dat de stomata van de
bloemen altijd open waren, zowel in de donker- als de herstelperiode (Figuur 4.10). De
stomata van de bloemen van deze hybriden zijn dus niet-functioneel aangezien de stomata niet
openen en sluiten. Dit stemt overeen met het onderzoek van Hew et al. (1980).
5.3.3 Link met knopval
Op basis van de resultaten waargenomen tijdens dit onderzoek, wordt onze hypothese
(Hoofdstuk 1) voor knopval genuanceerd. Wanneer er geen lichtreacties plaatsvinden in de
bladeren tijdens de donkerperiode, wordt er geen zuurstof gevormd en aangezien de stomata
gesloten zijn, wordt er ook geen atmosferische zuurstof opgenomen. Hierdoor kan 1-ACC niet
Discussie
49
geconverteerd worden in ethyleen, omdat het ACC-oxidase zuurstof vereist, en hoopt het op
in de bladeren. Aangezien de gevoeligere hybriden meer stress ondervinden ter hoogte van PS
II, wordt er mogelijks een grotere hoeveelheid 1-ACC geproduceerd dat niet kan worden
omgezet naar ethyleen. De bloemstengels blijven continu transpireren tijdens de
donkerperiode waardoor 1-ACC vanuit de bladeren naar de bloemen en knoppen kan worden
getransporteerd met de xyleem sapstroom. Dit deel van de hypothese sluit aan bij het
onderzoek van Bradford & Yang (1980) die aantoonden dat 1-ACC transport plaatsvond via
de xyleem sapstroom in tomaat. In hun onderzoek zorgden anaërobe condities rond de wortels
ervoor dat 1-ACC niet kon geconverteerd worden naar ethyleen. Het 1-ACC hoopte hierdoor
op in de wortels en werd via de transpiratiestroom naar de scheut getransporteerd, waar het
wel werd omgezet naar ethyleen. Dit veroorzaakte in het geval van tomaat epinastie
(ombuigen) van de bladeren.
Bij de gevoeligere hybriden wordt waarschijnlijk meer 1-ACC naar de knoppen en bloemen
getransporteerd doordat de bladeren minder transpireren (stomata meer gesloten) en het
aandeel van de bloemtranspiratie tijdens de donkerperiode dus groter is. De fractie van de
bloemtranspiratie op de totale transpiratie (blad + bloem) nam namelijk toe tijdens
donkerperiode naarmate de hybriden meer knopvalgevoelig waren (deze fracties waren voor
hybride 1, 2, 3 en 4 respectievelijk 0,85, 0,93, 0,97 en 0,97). Naast het transport van 1-ACC
naar de bloemen kan 1-ACC eventueel ook naar de wortels worden getransporteerd waar het
wordt gedetoxificeerd tot N-malonyl ACC. Wanneer de planten terug licht krijgen tijdens de
herstelperiode, komen de lichtreacties terug op gang en wordt er weer zuurstof gevormd.
Daardoor kan de omzetting van 1-ACC naar ethyleen plots terug plaatsvinden. Aangezien het
aannemelijk is dat er meer 1-ACC accumuleert tijdens de donkerperiode in de bloemstengels
van de gevoeligere soorten (door meer fotosynthetische stress en minder bladtranspiratie), is
er dus meer ethyleenproductie in hun knoppen tijdens de herstelperiode waardoor een grotere
knopval wordt geïnduceerd.
Hoofdstuk 6
Conclusies en perspectieven
Conclusies en perspectieven
51
Vanwege het grote economische belang van Phalaenopsis voor de sierteelt, was het doel van
deze masterthesis om de link tussen knopval en donkertransport te achterhalen. In dit laatste
hoofdstuk worden de voornaamste besluiten van dit onderzoek samengevat en worden
suggesties gegeven voor toekomstig onderzoek.
6.1. Algemene besluiten
Uit de praktijk blijkt dat het donkertransport van sommige Phalaenopsis hybriden knopval
induceert: de knoppen vallen af wanneer ze terug in het licht worden geplaatst. In de literatuur
(Hoofdstuk 1) is echter weinig beschreven over de oorzaken van deze knopval. Het wordt
algemeen aanvaard dat ethyleen knopval induceert en dat de knopval verhinderd wordt door
ethyleeninhibitoren. Ethyleen heeft dus een sleutelrol in het proces dat knopval veroorzaakt.
Om de vooropgestelde hypothese te verifiëren (Hoofdstuk 1), werden vier Phalaenopsis
hybriden getest op hun gevoeligheid aan knopval na vijf dagen donker. Hieronder worden de
belangrijkste resultaten samengevat.
Aangezien er geen gestandaardiseerde methode bestaat om de knopvalgevoeligheid van een
hybride te definiëren, werden tijdens dit onderzoek verschillende mogelijkheden getest. Uit de
resultaten bleek dat rekening moet worden gehouden met het aantal oorspronkelijke knoppen
die de planten bezitten. De knopval na de donkerperiode wordt best procentueel ten opzichte
van dit oorspronkelijk aantal knoppen uitgedrukt. Bovendien is het belangrijk dat de knopval
gemiddeld per hybride wordt bepaald aangezien er een grote variabiliteit is tussen de planten
van één hybride. Ook moet een keuze gemaakt worden tussen enkel grote knoppen
(commercieel belangrijker) of alle knoppen in rekening brengen. Indien de
knopvalgevoeligheid enkel op de grotere knoppen gebaseerd wordt, is het noodzakelijk om
een consistente ondergrens voor de knopgrootte vast te leggen. Uit de resultaten bleek dat de
vier Phalaenopsis hybriden allemaal gevoelig waren aan knopval na een donkerperiode van
vijf dagen. De donkerperiode had enkel een invloed op knoppen kleiner dan 2,0 cm, terwijl de
grotere knoppen zich verder ontwikkelden.
Het is echter tijdrovend voor de orchideeënkwekers indien na een donkerperiode elke dag de
knopval van de verschillende hybriden moet worden opgevolgd om te bepalen welke hybriden
knopvalgevoelig zijn. Vandaar werd in dit onderzoek ook gefocust op de ontwikkeling van
een snelle screeningmethode. Via het opmeten van fluorescentieparameters met behulp van de
LI-6400XT wordt zo een screening mogelijk. Uit dit onderzoek kwamen namelijk twee
fluorescentieparameters naar voor die samen kunnen gebruikt worden om snel te screenen op
knopvalgevoeligheid, namelijk Fv’/Fm
’ en NPQ. Hoe hoger Fv
’/Fm
’ en hoe lager NPQ in het
donker tijdens de herstelperiode, hoe minder knopvalgevoelig de hybride zal zijn.
Door een combinatie van fluorescentie-, fotosynthese- en transpiratiemetingen op de bladeren
tijdens de donker- en herstelperiode werd getracht de oorzaak van de knopval te achterhalen.
Na één dag donker vond er geen dagelijkse CAM-cyclus meer plaats en respireerden de
bladeren continu. Door de afwezigheid van licht konden namelijk geen lichtreacties doorgaan
en werd er geen NADPH en ATP aangemaakt via de elektronentransportketen. Door dit tekort
aan NADPH en ATP kon CO2 via de Calvincyclus niet worden omgezet naar suikers,
waardoor ook geen PEPC kon worden gevormd uit de afbraak van suikers. Aangezien PEPC
Conclusies en perspectieven
52
het basissubstraat is om CO2 te binden, steeg de interne CO2 concentratie. Hierdoor sloten de
stomata en kon er geen atmosferische CO2 meer worden opgenomen. Wanneer de planten
terug werden blootgesteld aan een normaal dag/nachtregime herstelde de CAM-cyclus in de
bladeren zich en namen de fluorescentieparameters ongeveer dezelfde waarde aan als voor de
donkerperiode. Dit wijst erop dat de planten zeer flexibel konden omgaan met donkerstress en
dat het fotosynthese-apparaat niet werd beschadigd tijdens de donkerperiode. De hybriden
gingen tijdens de donkerperiode ook veel efficiënter om met licht waarbij de gevoeligere
hybriden een lagere efficiëntie van PS II hadden in vergelijking met de minder gevoelige
hybriden. De bladeren ondervonden meer stress naarmate de donkerperiode vorderde
aangezien de respiratie toenam, de stomata meer sloten en de verhoogde efficiëntie van PS II
geleidelijk afnam. Deze daling van de fotosynthetische efficiëntie tijdens de laatste dagen van
de donkerperiode was het grootst voor de meest knopvalgevoelige hybride. Het PS II van de
knopvalgevoeligere hybriden werkte dus minder efficiënt wanneer de planten langdurig aan
donker werden blootgesteld. Knopvalgevoelige hybriden ondervonden bijgevolg meer stress
ter hoogte van PS II tijdens de donkerperiode en naarmate de donkerperiode vorderde. Ze
bezaten bovendien een kleiner aanpassingsvermogen bij de overgang naar een normaal
dag/nachtregime. Aangezien deze hybriden meer stress ondervonden, is het waarschijnlijk dat
meer stresshormonen (1-ACC) werden geproduceerd. Uit de fotosynthese- en
transpiratiemetingen uitgevoerd op de bloemstengels bleek dat de bloemen en stengels een C3
fotosynthesemechanisme vertoonden. De stomata waren bovendien niet-functioneel aangezien
er continu transpiratie plaatsvond en het transpiratiepatroon het VPD volgde. Aangezien er
geen lichtreacties plaatsvonden in de bladeren tijdens de donkerperiode en er geen exogeen
zuurstof kon worden opgenomen door de gesloten stomata, was er geen zuurstof aanwezig in
de bladeren. Hierdoor kon 1-ACC niet geconverteerd worden in ethyleen, aangezien het
ACC-oxidase zuurstof vereist, en werd het opgehoopt in de bladeren. Doordat de bloemen
continu transpireerden, zowel tijdens de donker- als de herstelperiode, kon 1-ACC vanuit het
blad via de xyleem sapstroom naar de bloemen en knoppen worden getransporteerd.
Aangezien de gevoeligere hybriden meer stress ondervonden ter hoogte van PS II, werd er
hoogstwaarschijnlijk meer 1-ACC geproduceerd dat niet kon worden omgezet naar ethyleen.
Bovendien was de bladtranspiratie van deze hybriden tijdens de donkerperiode lager.
Hierdoor was het aandeel van de transpiratiestroom die naar de bloemen en knoppen ging
groter en is het dus mogelijk dat er meer 1-ACC met de xyleem sapstroom naar de knoppen
ging. Het is bijgevolg plausibel dat bij de gevoeligere hybriden meer 1-ACC naar de knoppen
en bloemen werd getransporteerd. Wanneer de planten terug licht kregen tijdens de
herstelperiode, kwamen de lichtreacties terug op gang en werd er weer zuurstof gevormd.
Daardoor kon de omzetting van 1-ACC naar ethyleen terug plaatsvinden. Aangezien er
vermoedelijk meer 1-ACC accumuleerde tijdens de donkerperiode in de bloemstengels van de
gevoeligere soorten, was er dus ook meer ethyleenproductie in de knoppen waardoor een
grotere knopval werd geïnduceerd.
Conclusies en perspectieven
53
6.2. Suggesties voor verder onderzoek
De link tussen knopval bij Phalaenopsis na donkertransport, fotosynthese en ethyleen werd
nog nooit eerder gemaakt. Vandaar is verder onderzoek aangewezen waarbij zeker rekening
moet worden gehouden met onderstaande aandachtspunten.
Aangezien Phalaenopsis vaak intercontinentaal wordt getransporteerd, zou moeten getest
worden of er een bijkomend effect is van het verschuiven van het dag/nachtregime bij
intercontinentaal transport op de knopval. Hierbij kan de knopval na een donkerperiode op
controleplanten zonder verschuiving van het dag/nachtregime worden vergeleken met de
knopval bij hybriden die na de donkerperiode wel worden blootgesteld aan deze verschuiving.
Indien het verschuiven van het dag/nachtregime een significante extra stressfactor blijkt te
zijn voor de knopval, zal dit moeten worden meegenomen in de selectie van de
knopvalongevoelige hybriden.
Aan de hand van chlorofyl fluorescentiemetingen op vier Phalaenopis hybriden konden
Fv’/Fm
’ en NPQ tijdens de herstelperiode als screeningparameters worden voorgesteld. Het is
echter wenselijk om de proefopzet uit te breiden met een hoger aantal hybriden om in te
schatten of deze screeningparameters algemeen bij Phalaenopsis kunnen worden gebruikt.
Bovendien kan getest worden of deze parameters significant verschillen tussen gevoelige en
niet-gevoelige soorten zonder dat eerst een donkerperiode moet worden opgelegd. Indien dit
het geval is, kan de screening nog sneller verlopen omdat de planten dan niet eerst een
donkerperiode moeten ondergaan.
Om de oorzaak van de knopval met zekerheid te bevestigen, zouden enkele bijkomende
metingen kunnen worden uitgevoerd. Het opmeten van het verloop van de 1-ACC
concentratie in de knoppen tijdens de donkerperiode kan de hypothese bevestigen dat
knopvalgevoeligere hybriden meer 1-ACC accumuleren in de knoppen in vergelijking met
minder gevoelige hybriden. Door de ethyleenproductie in de bloemen tijdens de
donkerperiode en de herstelperiode op te meten, kan met zekerheid geconcludeerd worden dat
deze verwaarloosbaar is tijdens de donkerperiode door gebrek aan zuurstof. Hierdoor kan 1-
ACC niet omgezet worden in ethyleen omdat het ACC-oxidase zuurstof vereist. In het begin
van de herstelperiode zou dan een plotse piek in de ethyleenproductie moeten worden
waargenomen omdat er dan wel terug lichtreacties doorgaan die zuurstof leveren. De
ethyleenconcentratie kan worden opgemeten via gaschromatografie met een
vlamionisatiedetector. Het gebrek aan zuurstof tijdens de donkerperiode zou ook kunnen
bevestigd worden door de interne zuurstofconcentratie in de bladeren op te meten. Dit kan aan
de hand van een infrarood gas analysator met een absorptieband voor zuurstof of een ‘leaf
disc electrode’ (Hansatech-instruments, Norfolk, England).
Om de knopval te voorkomen zouden, naast ethyleeninhibitoren, ook andere alternatieven
kunnen worden onderzocht. Een eerste mogelijkheid is het verhinderen van de transpiratie.
Wanneer een afgesloten plastieken zak rond de bloemstengels wordt gedaan tijdens het
donkertransport, zal de transpiratie stilvallen (door de hoge RH). Hierdoor kan 1-ACC niet
naar de knoppen worden getransporteerd. Als de planten na het transport terug in het licht
komen te staan, is het waarschijnlijk dat de omzetting van 1-ACC naar ethyleen voornamelijk
Conclusies en perspectieven
54
in de bladeren plaatsvindt. Het gasvormige ethyleen kan dan via de bladeren ontsnappen. Na
enkele dagen bij een normaal dag/nachtregime, als het opgehoopte 1-ACC verdwenen is, zou
de plastieken zak dan kunnen worden verwijderd. Een tweede toekomstmogelijkheid is de
donkerstress voorkomen door een lichtbron in de vrachtwagen te plaatsen. Dit zorgt ervoor
dat de planten een hogere economische waarde hebben aangezien geen knopval plaatsvindt.
De meerkost van het extra energiegebruik van de lichtbron kan mogelijks gecompenseerd
worden door de hogere verkoopwaarde van de orchideeën. Bovendien kunnen de
energiekosten gereduceerd worden via het gebruik van alternatieve energiebronnen zoals
zonne-energie. Hiervoor is verder onderzoek aangewezen.
Hoofdstuk 7
Referenties
Referenties
55
Aschan G. & Pfanz H. (2003). Non‐foliar photosynthesis ‐ a strategy of additional carbon
acquisition. Flora, 198, 81‐97.
Baker N.R. (2008). Chlorophyll fluorescence: A probe of photosynthesis in vivo. Annual
Review of Plant Biology, 59, 89-113.
Bernard N. (1909). L’évolution dans la symbiose. Les orchidées et leurs champignons
commensaux. Annales Des Sciences Naturelles Botanique, 9, 1-196.
Black C.C. & Osmond C.B. (2003). Crassulacean acid metabolism photosynthesis: 'working
the night shift'. Photosynthesis Research, 76, 329-341.
Borland A.M. & Taybi T. (2004). Synchronization of metabolic processes in plants with
Crassulacean acid metabolism. Journal of Experimental Botany, 55, 1255-1265.
Borland A.M., Zambrano V.A.B., Ceusters J. & Shorrock K. (2011). The photosynthetic
plasticity of crassulacean acid metabolism: an evolutionary innovation for sustainable
productivity in a changing world. New Phytologist, 191, 619-633.
Bradford K.J. & Yang S.F. (1980). Stress-induced ethylene production in the ethylene-
requiring tomato mutant diageotropica. Plant Physiology, 65, 327-330.
Burgeff H. (1909). Die Wurzelpilze der Orchideen, ihre Kultur und ihr Leben in der Pflanze.
Jena: Gustav Fischer Verlag.
Ceusters J., Borland A.M., Londers E., Verdoodt V., Godts C. & De Proft M.P. (2009).
Differential usage of storage carbohydrates in the CAM bromeliad Aechmea 'Maya' during
acclimation to drought and recovery from dehydration. Physiologia Plantarum, 135, 174‐184.
Ceusters J., Borland A.M., Godts C., Londers E., Croonenborghs S., Van Goethem D. & De
Proft M.P. (2011). Crassulacean acid metabolism under severe light limitation: a matter of
plasticity in the shadows? Journal of Experimental Botany, 62, 283-291.
Cha-um S., Ulziibat B. & Kirdmanee C. (2010). Effects of temperature and relative humidity
during in vitro acclimatization, on physiological changes and growth characters of
Phalaenopsis adapted to in vivo. Australian Journal of Crop Science, 4, 750-756.
Cockburn W., Ting I.P. & Sternberg L.O. (1979). Relationships between stomatal behavior
and internal carbon dioxide concentration in crassulacean acid metabolism plants. Plant
Physiology, 63, 1029‐1032.
Dawson J.C., Huggins D.R. & Jones S.S. (2008). Characterizing nitrogen use efficiency in
natural and agricultural ecosystems to improve the performance of cereal crops in low-input
and organic agricultural systems. Field Crops Research, 107, 89-101.
Dodd A.N., Borland A.M., Haslam R.P., Griffiths H. & Maxwell K. (2002). Crassulacean
acid metabolism: plastic, fantastic. Journal of Experimental Botany, 53, 569-580.
Referenties
56
Dueker J. & Arditti J. (1968). Photosynthetic 14
CO2 fixation by green Cymbidium
(Orchidaceae) flowers. Plant Physiology, 43, 130-132.
Endo M. & Ikusima I. (1989). Diurnal rhythm and characteristics of photosynthesis and
respiration in the leaf and root of a Phalaenopsis plant. Plant and Cell Physiology, 30, 43-47.
Endo M. & Ikusima I. (1992). Changes in concentrations of sugars and organic acids in the
long-lasting flower clusters of Phalaenopsis. Plant Cell Physiology, 33, 7-12.
Goh C.J. (1983). Rhythms of acidity and CO2 production in orchid flowers. New Phytologist,
93, 25-32.
Goh C.J., Avadhani P.N., Loh C.S., Hanegraaf C. & Arditti J. (1977). Diurnal stomatal and
acidity rhythms in orchid leaves. New Phytologist, 78, 365‐372.
Griesbach R.J. (2002). Development of Phalaenopsis orchids for the mass-market. In: Janick
J. & Whipkey A. (eds.), Trends in new crops and new uses. Alexandria: ASHS Press, 458-
465.
Guo W.J. & Lee N. (2006). Effect of leaf and plant age, and day/night temperature on net CO2
uptake in Phalaenopsis amabilis var. formosa. Journal of the American Society for
Horticultural Science, 131, 320-326.
Haslam R., Borland A., Maxwell K. & Griffiths H. (2003). Physiological responses of the
CAM epiphyte Tillandsia usneoides L. (Bromeliaceae) to variations in light and water supply.
Journal of Plant Physiology, 160, 627-634.
He J. & Teo L.C.D. (2007). Susceptibility of green leaves and green flower petals of CAM
orchid Dendrobium cv. Burana Jade to high irradiance under natural tropical conditions.
Photosynthetica, 45, 214-221.
Hew C.S., Lee G.L. & Wong S.C. (1980). Occurance of non-functional stomata in the flowers
of tropical orchids. Annals of Botany, 46, 195-201.
Hew C.S. & Yong J.W.H. (1997). The physiology of tropical orchids in relation to the
industry. Singapore: World Scientific.
Hou J.-Y., Setter T.L. & Chang Y.-C.A. (2010). Effects of simulated dark-shipping on
photosynthetic status and post-shipping performance in Phalaenopsis Sogo Yukidian ‘V3’.
Journal of the American Society of Horticultural Science, 135, 183-190.
Ichihashi S., Higuchi T., Shibayama H., Tesima Y., Nishiwaki Y. & Ota K. (2008). Aspects
of CO2 uptake in the crassulacean acid metabolism orchid Phalaenopsis. Acta Horticulturae,
766, 245-256.
K.B. inzake de bescherming van in het wild levende dier- en plantensoorten door controle op
het desbetreffende handelsverkeer (9 april 2003), Belgisch Staatsblad, 31045-31061.
Referenties
57
Ketsa S. & Thampitakorn F. (1995). Characteristics of ethylene production of Dendrobium
orchid flowers. Acta Horticulturae, 405, 253-263.
Klee H.J., Hayford M.B., Kretzmer K.A., Barry G.F. & Kishore G.M. (1991). Control of
ethylene synthesis by expression of a bacterial enzyme in transgenic tomata plants. The Plant
Cell, 3, 1187-1193.
Kluge M. & Ting I.P. (1978). Crassulacean Acid Metabolism: Analysis of an ecological
adaptation. Berlin: Springer Verlag.
Knudson L. (1922). Nonsymbiotic germination of orchid seeds. Botanical gazette, 73, 1-25.
Konow E.A. & Wang Y.-T. (2001). Irradiance levels affect in vitro and greenhouse growth,
flowering and photosynthetic behavior of a hybrid Phalaenopsis orchid. Journal of the
American Society of Horticultural Science, 126, 531-536.
Laisk A. & Oja V. (1998). Dynamic gas exchange of leaf photosynthesis. Measurement and
interpretation. Canberra: CSIRO Publishing.
Lawlor D.W. (1993). Photosynthesis: Molecular, physiological and environmental processes.
2nd
ed. Essex, UK: Longman Scientific & Technical.
Lichtenthaler H.K., Buschmann C. & Knapp M. (2005). How to correctly determine the
different chlorophyll fluorescence parameters and the chlorophyll fluorescence decrease ratio
R-Fd of leaves with the PAM fluorometer. Photosynthetica, 43, 379-393.
LI-COR (2004). Using the LI-6400/LI-6400XT Portable Photosynthesis System. 5th
ed. LI-
COR Biosciences, Inc, Lincoln Nebraska.
Lin M.-J. & Hsu B.-D. (2004). Photosynthetic plasticity of Phalaenopsis in response to
different light environments. Journal of Plant Physiology, 161, 1259-1268.
Lopez R. & Runkle E. (2004). The flowering of orchids. A reality check. Orchids, 196-203.
www.aos.org.
Lopez R.G. & Runkle E.S. (2005). Environmental physiology of growth and flowering of
orchids. Hortscience, 40, 1969-1973.
Lüttge U. (2002). CO2-concentrating: consequences in Crassulacean acid metabolism. Journal
of Experimental Botany, 53, 2131-2142.
Lüttge U. (2004). Ecophysiology of Crassulacean Acid Metabolism (CAM). Annals of
Botany, 93, 629-652.
Lüttge U., Ball E., Fetene M. & Medina E. (1991a). Flexibility of crassulacean acid
metabolism in Kalanchoë pinnata (Lam.) Pers. I. Response to irradiance and supply of
nitrogen and water. Journal of Plant Physiology, 137, 259-267.
Referenties
58
Lüttge U., Ball E. & Fetene M. (1991b). Flexibility of crassulacean acid metabolism in
Kalanchoë pinnata (Lam.) Pers. II. Light-use characteristics of plants grown in low or high
light. Journal of Plant Physiology, 137, 268-272.
Mapeli A.M., de Oliveira L.S., Megguer C.A., Barbosa J.G., Barros R.S. & Finger F.L.
(2009). Characterisation of respiration, ethylene production, and carbohydrate contents during
flower opening in Epidendrum ibaguense. Journal of Horticultural Science & Biotechnology,
84, 609-612.
Maxwell K. & Johnson G.N. (2000). Chlorophyll fluorescence - a practical guide. Journal of
Experimental Botany, 51, 659-668.
Morel G.M. (1965). Clonal propagation of orchids by meristem culture. Cymbidium Society
News, 20, 3-11.
Nadeau J.A., Zhang X.S., Nair H. & O'Neill S.D. (1993). Temporal and spatial regulation of
1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase in the pollination-induced senescence of orchid
flowers. Plant Physiology, 103, 31-39.
Neales T.F. & Hew C.S. (1975). 2 types of carbon fixation in tropical orchids. Planta, 123,
303-306.
Nobel, P. S., García-Moya E. & Quero E. (1992). High annual productivity of certain agaves
and cacti under cultivation. Plant, Cell and Environment, 15, 329-335.
Ogburn R.M. & Edwards E.J. (2010). The ecological water-use strategies of succulent plants.
In: Kader J.-C. & Delseny M. (eds.), Advances in Botanical Research, Vol. 55. Burlington:
Academic Press, 179-255.
Oudshoorn W. (2007). Orchideeën. Utrecht: Kosmos Uitgevers.
Pinske J. (2009). Phalaenopsis. De lievelingsorchidee. Aartselaar: Deltas.
Pollet B. (2010). Impact of cool night temperatures on Phalaenopsis photosynthetic activity
and psysiology to support an energy conscious greenhouse heating. PhD thesis, Ghent
University, Belgium.
Pollet B., Steppe K., Dambre P., Van Labeke M.-C. & Lemeur R. (2010). Seasonal variation
of photosynthesis and photosynthetic efficiency in Phalaenopsis. Photosynthetica, 48, 580-
588.
Pollet B., Vanhaecke L., Dambre P., Lootens P. & Steppe K. (2011). Low night temperature
acclimation of Phalaenopsis. Plant Cell Reports, 30, 1125-1134.
Raffeiner B., Serek M. & Winkelmann T. (2009). 1-Methylcyclopropene inhibits ethylene
effects in cut inflorescences and potted plants of Oncidium and Odontoglossum orchid
species. European Journal of Horticultural Science, 74, 10-15.
Referenties
59
Roháček, K. (2002). Chlorophyll fluorescence parameters: the definitions, photosynthetic
meaning, and mutual relationships. Photosynthetica, 40, 13-29.
Ronse A. (2008). Orchideeën. Sublieme Verleiders. Oostkamp: Stichting Kunstboek bvba.
Runkle E., Wang Y., Blanchard M. & Lopez R. (2005a). The Orchid Grower, part 1.
Greenhouse Grower, 1, 64‐67.
Runkle E., Wang Y., Blanchard M. & Lopez R. (2005b). The Orchid Grower, part 2.
Greenhouse Grower, 2, 70‐72.
Runkle E., Wang Y., Blanchard M. & Lopez R. (2005c). The Orchid Grower, part 3.
Greenhouse Grower, 3, 96‐100.
Runkle E., Wang Y., Blanchard M. & Lopez R. (2005d). The Orchid Grower, part 4.
Greenhouse Grower, 4, 86‐89.
Shin Y.-K., Yoon Y.-J., Hahn E.-J. & Paek K.-Y. (2009). Photosynthetic Photon Flux (PPF)
affects growth, photosynthesis and acclimatization of Phalaenopsis 'Amaglade' plantlets.
Korean Journal of Horticultural Science & Technology, 27, 476-481.
Silvera K., Santiago L.S., Cushman J.C. & Winter K. (2009). Crassulacean acid metabolism
and epiphytism linked to adaptive radiations in the Orchidaceae. Plant Physiology, 149, 1838-
1847.
Skillman J.B. & Winter K. (1997). High photosynthetic capacity in a shade-tolerant
crassulacean acid metabolism plant. Plant Physiology, 113, 441-450.
Steppe K. (2011). Ecofysiologie. Cursus, Universiteit Gent, Faculteit
Bio‐Ingenieurswetenschappen.
Su V., Hsu B.-D. & Chen W.-H. (2001). The photosynthetic activities of bare rooted
Phalaenopsis during storage. Scientia Horticulturae, 87, 311-318.
Sun Y., Christensen B., Liu F., Wang H. & Müller R. (2009). Effects of ethylene and 1-MCP
(1-methylcyclopropene) on bud and flower drop in mini Phalaenopsis cultivars. Plant Growth
Regulation, 59, 83-91.
Taiz L. & Zeiger E. (2006). Plant physiology. 4th
ed. Massachusetts: Sinauer.
Uthaichay N., Ketsa S. & van Doorn W.G. (2007). 1-MCP pretreatment prevents bud and
flower abscission in Dendrobium orchids. Postharvest Biology and Technology, 43, 374-380.
Vakblad voor de Bloemisterij. (2005). 27, 46-48.
Vakblad voor de Bloemisterij. (2010). 23a, 92-94.
Vakblad voor de Bloemisterij. (2011). 22, 44-45.
Referenties
60
Wang Y.-T. (1998). Deferring flowering of greenhouse-grown Phalaenopsis orchids by
alternating dark and light. Journal of the American Society of Horticultural Science, 123, 56-
60.
Wang Y.-T. (2007). Temperature, duration in simulated shipping, and thermal acclimatization
on the development of chilling injury and subsequent flowering of Phalaenopsis. Journal of
the American Society of Horticultural Science, 132, 202-207.
Woltering E.J. & van Doorn W.G. (1988). Role of ethylene in senescence of petals -
Morphological and taxonomical relationships. Journal of Experimental Botany, 39, 1605-
1616.
Woltering E.J. & Westra E.H. (2010). Ethyleenvisie GreenRail: ethyleen bij treintransport van
potplanten. Food & Biobased Research N° 1158, 1-19.
Woerner A.C. & Martin C.E. (1999). Mechanistic basis of differences in water-use efficiency
between a CAM and a C3 species of Peperomia (Piperaceae). New Phytologist, 144, 307-312.