farmacodinamica (pd): descrive ciò che il farmaco fa allorganismo (obiettivo terapeutico, rapporto...
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FARMACODINAMICA (PD):descrive ciò che il farmaco fa all’organismo (obiettivo terapeutico, rapporto rischio/ beneficio)
FARMACOCINETICA (PK):descrive ciò che l’organismo fa al farmaco (e in quanto tempo)
ADMEAssorbimento
Distribuzione
Metabolismo
Escrezione
ADME : definizioni
ASSORBIMENTO
Velocità: dipende da diversi fattori; per un dato farmaco è proporzionale alla sua concentrazione a livello del sito di assorbimento
Entità: è definita dalla competizione tra velocità di assorbimento e velocità con cui il farmaco viene perso (p.e per degradazione chimico-fisica, metabolizzazione o passaggio attraverso il tratto GI)
VALUTAZIONE DELL’ ASSORBIMENTO INTESTINALE
FATTORI CHE INFLUENZANO L’ ASSORBIMENTO INTESTINALE
ESPRESSIONE DI ENZIMI FARMACO-METABOLIZZANTI NEI DIVERSI SEGMENTI DEL TRATTO INTESTINALE
Modelli in vivoModelli in situModelli in vitro
Modelli organotipiciSacco intestinale rovesciato (everted
drug sac)Segmenti intestinali isolati e perfusiCamere di Ussing
Modelli cellulariParallel artificial membrane permeability assay (PAMPA)Test di permeabilità
MODELLI PER LO STUDIO DELL’ASSORBIMENTO INTESTINALE
Sistemi non intestinali: MDCK (Madin Darby canine kidney cells)Linee cellulari di ratto derivate da intestino tenue fetale o neonataleCaco-2
MODELLI CELLULARI PER LO STUDIO DELL’ASSORBIMENTO INTESTINALE
Area * time
Papp (cm sec−1) =amount transported
initial concentration
1*
OrigineAdenocarcinoma colorettale umano cellule epiteliali in monostrato
Crescita cellule epiteliali in monostrato
Differenziamento 14-21 dopo la confluenza
morfologiaCellule polarizzate, con giunzioni serrate e orletto a spazzola apicale
Parametri elettrici Resistenza elettrica elevata
Enzimi digestivi Peptidasi e disaccaridasi specifiche dell’intestino tenue
Trasporto attivo Aminoacidi, zuccheri, vitamine, ormoni….
Trasporto ionico di membrana
Na+,K+ ATPasi, H+,K+ ATPasi, scambiatore Na+,H+, cotrasportatore Na+,K+, Cl-, canali apicali per Cl-
Trasportatori non ionici di membrana
P-glicoproteina, MRPs, LRP
RecettoriVitamina B12, vitamina D3, EGF, trasportatori per il glucosio (GLUT1,3,5 e SGLT1)
CARATTERISTICHE DELLA LINEA CELLULARE Caco-2
CONDIZIONI DI COLTURA PER L’USO DELLA LINEA CELLULARE Caco-2
Siero inattivato nel terreno sul versante apicale
20%
Siero inattivato nel terreno sul versante basolaterale
20%
rivestimento Collagene di tipo I (non richiesto con filtri dal 0.4 μm)
Additivi
Aminoacidi non essenziali (1%)
Glucosio (25 mM)
Glutamina (2 mM)
Antibiotici (streptomicina 100 μg/l; penicillina (100mU/ml)
CO2 10 o 5%
pHGeneralmente 7.4 su entrambi i versanti, o 7.4 sul versante basolaterale e 6.4 su quello apicale
Densità cellulare alla semina 2.5 x 103 – 4 x 103
Numero di passaggi 25 – 100
PRINCIPALI CONTROLLI DA EFFETTUARE SU CELLULE IN MONOSTRATO
Resistenza elettrica transepiteliale (TEER) 260 – 420 Ω/cm2
Può indicare tossicità o perdita ddi funzionalità delle tight junctions
Markers di differenziamento Attività enzimatiche: saccarosio isomaltasi, aminopeptidasi, fosfatasi alcalina
Differenziamento morfologico Microscopia elettronica
Espressione della Pgp Immunoistochimica, Western blot o misura dell’attività della Pgp
Assenza di contaminazione da micoplasmi Metodi microbiologici standard
Integrità del monostrato cellulare mediante misura della permeabilità a composti standard
Mannitolo, PEG
Meccanismo Agenti Effetti
Ruolo della P-gpInibitori
Verapamil Chinidina Ciclosporina A
0.5 mM sul versante apicale (A) e basolaterale (B)0.5-1 mM in A e B50 μM in A e B
Aumento del trasposrto dal versante A al B (se il farmaco è posto sul versante A)
Substrati Rodamina 123 1 mM
Ruolo delle MRP
Inibitori Come i substrati
Substrati
Leucotriene C4S-2,4‑dinitrofenilglutationePAHDoxorubicinaEtoposideVinblastinaMetotrexate
Ruolo della LRPInibitori
Substrati Antracicline
Trasporto paracellulare
EGTAcitocalasina
Aumento del trasporto, se è paracellulare
PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERA EMATO-ENCEFALICA
PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERA EMATO-ENCEFALICA
BCEC (brain capillary endothelial cells) immortalizzate condizionali ottenute da animali transgenici
PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERA EMATO-ENCEFALICA
PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERA EMATO-ENCEFALICA
PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERA EMATO-ENCEFALICA
PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERASANGUE-CSF
PASSAGGIO ATTRAVERSO LA BARRIERAPLACENTARE
VALUTAZIONE DEL LEGAME ALLE PROTEINE PLASMATICHE
Spiazzamento di farmaci che legano specifici siti
IbuprofeneWarfarin
ALBUMINA >>> altre proteine (p.e. α-glicoproteina acida)
ADME : definizioni
ELIMINAZIONE: perdita irreversibile di farmaco dall’organismo
Velocità: proporzionale alla concentrazione del farmaco
Entità: dipende dalla competizione tra vie di eliminazione diverse
ADME : definizioni
METABOLISMO: Perdita irreversibile di farmaco dovuta alla formazione di nuove specie chimiche
Detossificazione/attivazioneFase I:ossidazione (CYP-dipendente)
riduzione, idrolisiFase II:coniugazione
ADME : definizioni
METABOLISMO (cont.)
Principalmente a livello epatico (ma anche intestinale, polmonare e cutaneo)
Complessità:InduzioneInibizione
Polimorfismi
INTERAZIONI CON ALTRI FARMACI
VARIABILITÀ
ADME : definizioni
ESCREZIONE: perdita irreversibile del composto originale
Renale: dipende dalla struttura chimica (carattere idrofilo) e dal peso molecolare
Biliare: dipende dalla struttura chimica (è necessaria la presenza di un gruppo non polare) e dal peso molecolare
Altre vie, generalmente meno importanti
CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP2C19,CYP2D6,CYP2E1
CYP3A4
PRIINCIPALI ENZIMI IMPLICATI NEL METABOLISMO DEI FARMACI NELL’UOMO
Fase I: enzimi citocromo P450-dipendenti (CYP)
Fase II: UDP-dependent glucuronosyl transferase (UGT), phenol sulfotranferase (PST)estrogen sulfotransferase (EST)glutathione-S-transferase (GST).
STUDI METABOLICI IN VITRO
FRAZIONE EPATICA S9
MICROSOMI
EPATOCITI
in sospensione
in coltura
SUPERSOMI
parent compound concentration (before incubation)
% parent compound disappearance
1 −
. 100
parent compound concentration (after incubation)
= X 100
Molecola candidata
per lo sviluppo
Tossicità acuta(somministrazione singola
a dosi elevate)
Tossicità persomministrazioni ripetute
(da 1 a 6 mesi)
Mutagenesi in vitro
Sperimentazione clinica(Fasi I e II)
Tossicità dello sviluppo(fertilità, sviluppo peri- e
post-natale, teratogenicità)
Mutagenesi in vivo
Cancerogenesi(studio per due anni nel topo e nel ratto)
Tossicità speciali
TEST DI TOSSICITÀ ACUTA
valutano effetti avversi che si verificano entro un tempo breve dalla somministrazione di una dose singola della sostanza in esame
devono essere effettuati almeno su due specie animali, di cui una non roditrice;
il farmaco deve essere somministrato secondo almeno due vie di somministrazione
gli animali vengono osservati per 14 gg
DL50
Dose singola, derivata statisticamente, di una sostanza, per la quale ci si attende una mortalità pari al 50% degli animali trattati
TEST DI TOSSICITÀ PER SOMMINISTRAZIONI RIPETUTE
SCOPI ottenere informazioni sulla tossicità di un prodotto medicinale prevedibilmente destinato ad essere somministrato ripetutamente
valutare i rischi connessi con l’impiego terapeutico del prodotto stesso, tenendo anche conto dei suoi prodotti di biotrasformazione
Durata proposta per il trattamento nell’uomo
Durata suggerita per gli studi di tossicità
Una o più dosi nell’arco di 24h
2 settimane(studi di tossicità acuta)
Fino a 7 gg 4 settimane(studi di tossicità subacuta)
Fino a 30 gg 3 mesi(studi di tossicità subcronica)
Oltre 30 gg 6 mesi(studi di tossicità cronica)
TEST DI TOSSICITÀ PER SOMMINISTRAZIONI RIPETUTE
Test di tossicità dello sviluppo
i. Modifiche della fertilità o procreazione anormale ii. Interferenza con le fasi del pre-impianto e dell’impianto
dello sviluppo fetaleiii. Effetti tossici sull’embrioneiv. Effetti tossici sul fetov. Modifiche della fisiologia materna con conseguenti
effetti tossici secondari sull’embrione o sul fetovi. Effetti sulla crescita e sullo sviluppo dell’utero o della
placenta vii. Interferenza con il partoviii. Effetti sullo sviluppo post-natale, sull’allattamento e
sulla capacità di prendere il latte da parte dei natiix. Effetti tardivi sulla discendenza
Test di tossicità dello sviluppo
Segmento I - Test di performance riproduttiva e fertilità generaleSegmento II – TeratogenesiSegmento III – Tossicità peri- e post-nataleSegmento IV – Studi multigenerazionali
Test di cancerogenesi
Sono di norma indispensabili
a) Quando appare possibile che un farmaco sia somministrato con regolarità per un periodo di tempo abbastanza lungo
b) Quando la struttura chimica del farmaco fa sospettare un potenziale effetto cancerogeno
c) Quando il farmaco può suscitare dubbi a causa dii. Aspetti specifici della sua azione biologicaii. Quadro di tossicità o ritenzione a lungotermine rilevati
da studi precedentiiii. Positività in prove di mutagenesi e/o di cancerogenesi
a breve termine
1. Quality system concerned with the organisational
process and the conditions under which non-clinical health
and environmental safety studies are planned, performed,
monitored, recorded, archived and reported.
Good Laboratory Practice (GLP)
SVILUPPO CHIMICO
Sintesi chimica: come produrre il farmaco in modo efficiente
“Commercial manufacturing”: come produrre il farmaco in modo economico
Formulazione: come preparare il farmaco in una forma adatta per la somministrazione