farmakogenetikte kullan temel yöntemlertfd.org.tr/sites/all/themes/corporateclean/subweb/...zagaroz...
TRANSCRIPT
1
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 1
Farmakogenetikte Kullanılan Temel Yöntemler
Dr. Melih Ö. Babaoğlu
Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Farmakoloji A.D.
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 2
Kültürelfaktörler
Çevresel etkiler
Hastalıkderecesi
Genetikfaktörler
İlaç yanıtındabireyler arasıdeğişkenlik
Fizyolojikdurum
İlaçetkileşmeleri
2
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 3
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 4
Genetik faktörler
İlaç yanıtındaki bireylerarasındaki değişkenliğin,
%20-40’ından
advers etkilerin yaklaşık%50’sinden sorumlu
3
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 5
Farmakogenetik
İlaç yanıtında bireyler arasındagözlenen farklılıkların oluşumunda
genetik faktörlerin katkısınıinceleyen bilim dalı
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 6
GenetikGenetikpolimorfizmpolimorfizm
FarmakokinetikFarmakokinetik FarmakodinamikFarmakodinamik••Taşıyıcı proteinlerTaşıyıcı proteinler••Plazma proteinleriPlazma proteinleri••MetabMetabolizmaolizma
••ReseptörlerReseptörler••İyon kanallarıİyon kanalları••Enzimler Enzimler
Farmakogenetik
4
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 7
Farmakogenomik
Daha geniş bir kavram
Birçok genetik faktörün ve genomik yapınınhastalık oluşumu ve ilaç yanıtı üzerindeki
etkilerini inceleyerek yeni ilaç hedeflerisaptama çalışmaları
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 8
İİnsan genomunsan genomu
22..900900..000000..000 000 baz çiftibaz çifti1010..000000..000 000 tek nükleotid tek nükleotid
polimorfizmipolimorfizmi300300..000 000 haplotiphaplotip1010..000 000 farmakogenetik ile farmakogenetik ile
ilişkiliilişkili
Tek nükleotid polimorfizmi (SNP)
5
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 9
EmilimYavaş Hızlı
İlaç-ilaç, ilaç-besinetkileşmeleri
Metabolizma•Yavaş•Hızlı•Çok hızlı
İlaç-ilaç, ilaç-besinetkileşmeleri
İlaç-ilaçetkileşmeleri
İlaç etki yeri(reseptörler)
•Tam•Yetersiz
Atılış(itrah)
•Yavaş•Hızlı
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 10
• Aile ve ikiz çalışmaları (dominant, resesif)
Farmakogenetik: Yöntemler
• Fenotipik polimorfizmi (> %1) saptamak için uygun bir belirteç ilaç ile popülasyondağılımı
• Genotip ve fenotip karşılaştırılması
• Klinik gözlem: ilaca verilen cevapta farklılık
•Genin ve mutasyonların belirlenmesi
6
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 11
Normal DNormal Dağılımağılım
Frek
ans
Frek
ans
AktiviteAktivite
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 12
Polimorfik DağılımPolimorfik Dağılım
Frek
ans
Frek
ans
Aktivite
7
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 13
Farmakogenetiğin amacı
Her bir hasta için en uygundozun uygulanması ve en uygun ilacın seçimi.
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 14
8
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 15
TPMT Genotip-Fenotip Korelasyonu
TPMT genotipleri
TPM
T a
ktiv
itesi
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 16
9
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 17
İlaç metabolizması- Fenotipik polimorfizm
Yavaş Metabolizör (YM)
Hızlı Metabolizör (HM)
(Çok Hızlı Metabolizör - ÇHM)
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 18
Debrizokin/metabolit oranı
Yavaş yıkanbireyler
Bir
e ysa
yısı
Şekil: Alvan G ve diğ. , Drug Metab Dispos 29: 580
Türkiye: % 4
Türkiye: %6
Çok hızlı yıkanbireyler
Kırılmanoktası
10
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 19
Diğer CYP polimorfizmleri
2D6 Yavaş metabolizör Kodein Ağrı kesici etkioluşmaması
2C9 Yavaş metabolizör Varfarin ↑ Kanama
2C19 Yavaş metabolizör Omeprazol Tedavininhızlanması
Diazepam ↑ Sedasyon
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 20
CYP enzimleri
Evans ve Relling, Science, 286, 487
*
**
Faz I
11
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 21
CYP2D6*1*2
alel
familya
alt-familya
enzim/gen
Faz I enzimleri
22
Polimeraz zincir reaksiyonuPCR
Genetik sinyalin amplifikasyonu
12
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 23
PCR- Amaç
Nükleik asitleri in vitro çoğaltma yöntemi
Kopyalama ile DNA amplifikasyonu
Genelde genom üzerindeki görece küçük bir bölgeyi (100-3000 baz çifti -bp-) milyonlarca kez çoğaltma
Sinyalin tanınmasını kolaylaştırma (sekanslama, nokta mutasyon analizi, v.b.)
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 24
PCR- Avantajları
Kısa zaman içinde (birkaç saat) milyonlarca kopya oluşması
Hücresiz ortam
13
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 25
PCR- Üç basamak
Denatürasyon: DNA’nın iki zincirinin birbirinden ayrılması
(94-95°C’de)
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 26
PCR- Üç basamak
Primer bağlanması (Annealing):Kısa komplementer nükleik asitlerin hedeflerini tanıması
•(55-65°C’de)
14
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 27
DNA polimerazın primerleri uzatması (uzama)
PCR- Üç basamak
•(70-75°C’de)
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 28
PCR
95°C, 5 dak72°C, 10 dak
16
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 31
Amplifikasyon
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 32
PCR bileşenleri
Tipik bir PCR tüpünün içeriği
Bileşen
Reaksiyon tüpündeki
(50 μl) konsantrasyon
5 μl 10X Taq buffer 1X
2-10 μl MgCl2 (25 mM stok çözelti) 1-5 mM
5 μl dNTP karışımı (her birinden 2 mM) 200 μM (her biri)
0.5-1.25 μl Primer 1 (20 μM stok çözelti) 0.2-0.5 μM
0.5-1.25 μl Primer 2 (20 μM stok çözelti) 0.2-0.5 μM
0.25-0.50 μl Taq polimeraz 1.25-2.5 ünite
1-4 μl genomik DNA (1-1000 ng)
Distile su (hacmi 50 μl’ye tamamlayacak miktar)
17
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 33
PCR bileşenleri
Bileşen Reaksiyon tüpündeki
(50 μl) konsantrasyon
5 μl 10X Taq buffer 1X
Magnezyum içerebilir veya içermeyebilir
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 34
PCR bileşenleri
Tipik bir PCR tüpünün içeriği
Bileşen Reaksiyon tüpündeki
(50 μl) konsantrasyon
2-10 μl MgCl2
(25 mM stok çözelti) 1-5 mM
Magnezyum konsantrasyonu ürün kalitesini etkileyen en
önemli unsurlardan biri
18
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 35
PCR bileşenleri
Bileşen Reaksiyon tüpündeki
(50 μl) konsantrasyon
5 μl dNTP karışımı
(her birinden 2 mM)
200 μM
(her biri)
Genelde dATP, dCTP, dGTP, dTTP karışımı olarak 10-25 mM
olarak sağlanır.
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 36
PCR bileşenleri
0.5-1.25 μl Primer 1
(20 μM stok çözelti)
0.2-0.5 μM
0.5-1.25 μl Primer 2
(20 μM stok çözelti) 0.2-0.5 μM
Liyofilize olarak hazırlanır (ticari), su veya TE tamponu ile çözülür
19
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 37
PCR bileşenleri
0.25-0.50 μl Taq polimeraz 1.25-2.5 ünite
•Gliserollü tampon içinde sağlanır
•Kendi tamponu ile kullanılmalı
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 38
PCR bileşenleri
1-4 μl genomik DNA (1-1000 ng) •Yoğun tuz ile çöktürme yöntemi klasik bir yöntem, ucuz, her kitapta
ve internet sitelerinde var
•Filtre kullanan kitler pahalı ama zamandan kazandırabilir, kalitede
biraz ödün veriliyor
20
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 39
PCR bileşenleri
Tipik bir PCR tüpünün içeriği
Bileşen Reaksiyon tüpündeki
(50 μl) konsantrasyon
5 μl 10X Taq buffer 1X
2-10 μl MgCl2 (25 mM stok çözelti) 1-5 mM
5 μl dNTP karışımı (her birinden 2 mM) 200 μM (her biri)
0.5-1.25 μl Primer 1 (20 μM stok çözelti) 0.2-0.5 μM
0.5-1.25 μl Primer 2 (20 μM stok çözelti) 0.2-0.5 μM
0.25-0.50 μl Taq polimeraz 1.25-2.5 ünite
1-4 μl genomik DNA (1-1000 ng)
Distile su (hacmi 50 μl’ye tamamlayacak miktar)
Karışımın üzerine bir damla mineral yağı
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 40
Kapağı ısıtmalı modeller veya mineral yağı kullanılması
21
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 41
PCR
DİKKAT!!Kontaminasyon (Çapraz kontaminasyon)
Negatif kontrol tüp konmalı
Önleme yolları (kitapçık)
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 42
İyi bir primerin özellikleri18-30 nükleotid uzunluğunda olmalı
Dört baz (A, C, G, T) olabildiğince eşit ve heterojen sırada olmalı
Peş peşe aynı bazın uzun tekrarlarından kaçınılmalı
Primerin kendi içinde komplementer bazlar içermemesine dikkat edilmelidir.
Primer çiftinin 3′-uçlarının birbirlerine komplementer olmamasına dikkat edilmeli (aksi halde primer-dimer oluşumu)
Primerin insan genomu üzerinde yalnızca tek bir bölgeyi tanıdığından emin olunması (BLAST)
22
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 43
TaqUcuz, yaygın kullanım, hızlı reaksiyon
Yanlış eşleşmeyi düzeltme (3′- 5′ekzonükleaz)aktivitesi yok
1/9000 oranında yanlış eşleştirme yapar.
Ancak PCRda nadiren bir sorun olur (yüzlerce kalıptan başlayan çoğalma). Toplam ürünün binde bir kaçı.
Tli / Pfu / Vent tama yakın doğruluk. Pahalı.
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 44
Genetik sinyalin görüntülenmesi
Agaroz jel elektroforeziDaha düşük rezolüsyon ama hazırlanması daha kolay (%0.8-6)%6’dan daha yoğun hazırlanması zor, ürünler arasındaki fark küçüldükçe ayrımları zorlaşır.
Poliakrilamid jel elektroforeziDaha yüksek rezolüsyonÇok yoğun hazırlanabilir (%>10)
23
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 45
Tampon çözeltilerTAE (tris-asetik asit-EDTA): Daha düşük tampon kapasitesi
TBE (tris- borik asit-EDTA): (kitapçık)
PCR ürünlerini görüntülemek
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 46
PCR ürünlerini görebilmek
DNA’yı görebilmek için flüoresan ışık yayan boyalar:Etidyum bromür
Çift zincirde bazlar arasına girerek sıkışırUV altında flüoresan ışık yayar
25
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 49
Agaroz jel hazırlanması
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 50
% kaçlık?
örn:%2 = 2g/100 ml TBE
Agaroz
TBE¬
Flask for boiling∧
26
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 51
Jel tepsisiJel tarağı
Güç kaynağı
Tank Kapak
Elektroforez tankı
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 52
Jel tarakları
27
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 53
Seal the edges of the casting tray and put in the combs. Place the casting tray on a level surface. None of the gel combs should be touching the surface of the casting tray.
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 54
28
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 55
Kısa aralıklarla karıştırarak taşmasına izin vermeden yüksek ısıda kaynatılır
Agarozun eritilmesi
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 56
Jel üzerinde veya içinde hava kabarcığı olmamasına dikkat edilmeli
Jelin dökülmesi
31
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 61
TBE
Add enough electrophoresis buffer to cover the gel to a depth ofat least 1 mm. Make sure each well is filled with buffer.
Katot(negatif)
Anot(pozitif)
kuyucuklar
DNA
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 62
6X yükleme tamponu: • Bromofenol mavisi• Gliserol
PCR ürünlerinin yüklenmesi
6X yükleme tamponu kullanılır, boyalar jel yürümesini izlemeyi sağlar.
32
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 63
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 64
Örneklerin yüklenmesi
Pipet ucunu jelin içine batırmamaya dikkat edilmeli
33
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 65
Place the cover on the electrophoresis chamber, connecting the electrical leads. Connect the electrical leads to the power supply. Be sure the leads are attached correctly - DNA migrates toward the anode (red). When the power is turned on, bubbles should form on the electrodes in theelectrophoresis chamber.
Jelin yürütülmesi
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 66
wells
Bromofenol mavisi
Katot(-)
Anode(+)
Gel
Boyanın doğru yöne (!) yürüdüğüne dikkat etmeli
DNA(-)
34
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 67
100200300
1,650
1,000
500
850650
400
12,000 bp
5,000
2,000
-
+
elektroforez yönü
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 68
PCR ürününün gözlenmesi
***CAUTION! Ethidium bromide is a powerful mutagen and is moderately toxic. Gloves should be worn at all times.
• Etidyum bromür
35
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 69
Jelin boyanması
• Jelin 20-30 dakika EtBr içeren çözeltide tutulması•Birkaç defa yıkanması
70
UV transiluminatör ile gözlenmesi
36
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 71
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 72
100200300
1,6501,000
500
850650
400
5,000 bp2,000
PCR ürünü
1 2 3 4 5 6 7 8kuyucuklar
Primer dimerleri
37
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 73
Mutasyonun belirlenmesi
Dizi analizi (sekanslama)
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 74
SSCPHeteroduplex oluşumu...v.b.
Mutasyonun belirlenmesi
38
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 75
Restriksiyon Enzimleriyle Kesme İşlemi (RFLP)
PratikUcuzTemel donanım yeterli
Mutasyonun belirlenmesi
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 76
PCR ürününün kesimi
39
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 77
PCR ürününün kesimi
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 78
Endonükleaz kesimi – ABCB1 3435C>T
CT TT CC
%3’lük agaroz jel
nk
......GATC..
MboI
.......GATT...
197 bp158 bp
39 bp
m
Babaoglu et al., Clin Pharmacol Ther, 2005
40
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 79
Endonükleaz kesimi – ADH3
Babaoglu et al., Methods Find Exp Clin Pharmacol 2006
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 80
Endonükleaz kesimi – ABCB1 3435C>T
CT TT CC
%3’lük agaroz jel
nk
......GATC..
MboI
.......GATT...
197 bp158 bp
39 bp
m
Babaoglu et al., Clin Pharmacol Ther, 2005
41
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 81
Akut Antiemetik Etkinlik
0
20
40
60
80
100
Aku
t ant
iem
etik
etk
inlik
(%
)
CC CT TT CC CT TT CC CT TT
Tropisetron Ondansetron Granisetron
*
Babaoglu et al., Clin Pharmacol Ther, 2005
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 82
5-HT3 Antagonistlerinin Antiemetik Etkinliği
Sonuç:Granisetron ile tedavi edilen ABCB1
3435C>T homozigot hastalarda kemoterapiye bağlı daha az bulantı ve kusma görülüyor
42
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 83
Endonükleaz kesimi – BChE
Babaoglu et al., Eur J Clin Pharmacol (2004) 59: 875–877
PCR based endonuclease (Mae III) method (Jensen et. al. 1996).
Genotyping for BChE K-variant
222 bp
179 bp
126 bp
75 bp
222 bp
179 bp
126 bp
75 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 84
Endonükleaz kesimi – BChE
Babaoglu et al., Eur J Clin Pharmacol (2004) 59: 875–877
43
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 85
Neler gerekli?
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 86
Neler gerekli?
44
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 87
Neler gerekli?
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 88
Neler gerekli?
46
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 91
Neler gerekli?
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 92
Neler gerekli?
47
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 93
Neler gerekli?
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 94
Neler gerekli?
48
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 95
SNP.CSHL.ORGSNP.CSHL.ORG
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 96Goodman Gilman 2006
50
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 99
XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 100
Amplichip CYP450TM
2003 İlk İlk P450 P450 mimikrodizinikrodizini