fatores de transcrição foxo e indução de células t reguladoras djalma jonilson jaqueline
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Fatores de transcrição Foxo e indução de células T reguladoras
Djalma
Jonilson
Jaqueline
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Origem de células T reguladoras no timo e na periferia
Workman et al. Cell Mol Life Sci (2010) 66, 2603-2622
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Vias de sinalização que convergem para a indução de Foxp3
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Existe uma rede transcricional que determina a expressão de foxp3 e outros genes relacionados
às células T reguladoras?
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Identificação molecular, estrutura e padrão de expressão do gene fkh (fox)
As proteínas expressas pelo gene fkh estão localizadas no núcleo
e portanto podem agir como um reguladores transcricionais
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6
Subfamílias das protíenas Fox
15 Subfamílias classificadas de acordo com sua homologia
Kaestner, K. H., et al. Genes Dev. 2000 14: 142-146
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Modificações pós-traducionais nos fatores de trancrição Foxo
Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288
NES: Sequência de exportação nuclearNLS: sinal de localização nuclear
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Funções dos fatores de transcrição FoxO nas células e organismos
Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288
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Regulação dos fatores de transcrição FoxO
Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288
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Regulação dos fatores de transcrição FoxO
Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33
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Interação entre FoxO e outros fatores de transcrição
Indução de genes pró-apoptóticos Inibição de genes relacionados ao ciclo celular
Indução da expressão de genes supressores de tumor
ER: Receptor nuclear de estrógenoCalnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288
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Remodelamento da cromatina por proteínas FoxO
Calnan, D.R., et al. Oncogene (2008) 27, 2276–2288
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Regulação de genes envolvidos na migração e homeostase de células T por Foxo1
Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33
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(Naive) (Ativadas)
Papel de proteínas FoxO na ativação e diferenciação de células T
Ouyang, W., et al. Immunity (2009) 30, 358-371
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Outra funções de proteínas FoxO em células T
Peng, S. L. Oncogene (2008) 27, 2337-2344
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Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33
Modelo provável de diferenciação de nTregs no timo
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Ouyang, W., et al. Trends in Immunology (2011) 32, 26-33
Controle molecular da diferenciação de células T reguladoras induzida por TGF-β
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OBJETIVO
Avaliar as funções de Foxo1 e Foxo3 em linfócitos T, principalmente no que se refere ao desenvolvimento de funcionalidade de Tregs.
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Qual o efeito da deleção de Foxo1 e/ou Foxo3 em linfócitos T?WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3+/-
Foxo1+/-Foxo3-/-
Foxo1-/-Foxo3-/-
Expressão Foxo Score
clínico
Histologia
8 semanas
A deleção de Foxo1 e Foxo3 em linfócitos T de camundongos resultou em caquexia, esplenomegalia, linfadenopatia, grande infiltrado de células mononucleares em órgãos vitais, aumento do título de
autoanticorpos e falecimento precoce dos animais, demonstrando um papel cooperativo de Foxo1 e Foxo3 na proteção contra uma desordem inflamatória fatal.
ELISA
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Quais são as causas da imunopatologia observada em camundongos Foxo1-/-Foxo3-/-?
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3+/-
Foxo1+/-Foxo3-/-
Foxo1-/-Foxo3-/-
FACS
6 a 8 semanas
A desordem inflamatória observada em camundongos de 6 a 8 semanas está associada com a expansão específica da população de células CD4.
CD4
CD8
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Qual é o fenótipo e função das células CD4 em camundongos Foxo1-/-Foxo3-/-? WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3+/-
Foxo1+/-Foxo3-/-
Foxo1-/-Foxo3-/-
6 a 8 semans
Isolamento CD4 (FACS)
Foxo1 e Foxo3 desempenham função crítica na inibição da ativação e diferenciação de linfócitos T, mais especificamente a diferenciação em células CD4 efetoras
do tipo Th1 e Th17.
FACS
PMA+iono (4h)
FACS
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Como é a diferenciação de Tregs em camundongos Foxo1-/-Foxo3-/-?
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3+/-
Foxo1+/-Foxo3-/-
Foxo1-/-Foxo3-/-
FACS (timo e baço)
3 semanas
timo
baço
timo baço
Em camundongos deficientes de Foxo1 e Foxo3 é possível observar menor frequência e número total de células T reguladoras no timo e no baço.
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Como é a sobrevivência e proliferação das Tregs na ausência de Foxo1 e Foxo3?
FACS
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3+/-
Foxo1+/-Foxo3-/-
Foxo1-/-Foxo3-/-
Tregs
Cultura com FITC-VAD-FMK
FACS
3 semanas
Camundongos com 6 semanas
As Tregs deficientes de Foxo1 e Foxo3 apresentam sobrevivência semelhante às Tregs WT e maior proliferação.
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WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3+/-
Foxo1+/-Foxo3-/-
Foxo1-/-Foxo3-/-
Tregs
CD4 naive – CFSEAnti – CD3Esplenócitos irradiados (72h)
FACS
3 semanas
Como é a funcionalidade das Tregs in vitro e in vivo na ausência de Foxo1 e Foxo3?
FACS
CD4 T naive (4x105 )
Tregs WTTregs Foxo1-/-Foxo3-/-
(1x105)
Rag1 -/-
Mudança de pesoDesenvolvimento de colite
Foxo1 e Foxo3 são necessários para a função supressiva de células Treg.
6 semanas
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Quais são os genes regulados por Foxo1 e Foxo3? WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3-/-
Tregs baço (FACS)
Extração e amplificação
RNA
Hibridização Affymetrix
603 sondas analisadas (genes assinatura Treg)
189 sondas com diferença de expressão
(1.5)
• 33 genes positivamente correlacionados com a expressão de Foxp3 downregulados no DKO
• 3 genes negativamente correlacionados com a expressão de Foxp3 upregulados no DKO
• Sem mudanças na expressão de Foxp3, CTLA4 e CD25
• Maior expressão de genes correlacionados à proliferação celular• Maior expressão de genes codificantes para receptores de citocinas do padrão
Th1 e Th17 (IL-12, IL-18, IL-1 e IL-17)• Maior expressão de genes de fatores de transcrição (STAT1, Rorc, Rora e Ahr)
Devido à expressão semelhante de Foxp3 em Tregs WT e DKO, Foxo1 e Foxo3 podem controlar a expressão de uma série de genes assinatura de Treg
independentemente da expressão de Foxp3.
3 semanas
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Os defeitos de Tregs deficientes para Foxo1 e Foxo3 são responsáveis pela imunopatologia observada em camundongos?
Foxo1-/-Foxo3-/- (CD45.2)
WT Tregs (CD45.1)(3x105)
FACS (Treg e CD4)
V
CD4
Os defeitos funcionais de Treg contribuem para o fenótipo inflamatório em camundongos deficientes de Foxo1 e Foxo3, sendo que estes também têm função na
supressão da expressão de citocinas inflamatórias nas Tregs.
3-4 dias
8 semanas
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Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 no controle de doenças autoimunes sistêmicas causadas por deficiência de Tregs?
BM scurfy (2x106 )
BM WTBM Foxo1-/-Foxo3-/-
(2x106)
Rag1 -/-
SobrevivênciaFACS
Foxo1 e Foxo3 são essenciais para a geração de um compartimento efetivo de Tregs para evitar a ativação de linfócitos T scurfy.
6ª 8 semanas
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Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 na diferenciação de Tregs no timo?
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3-/-
Isolamento CD4 timo
Cultura IL-2, anti-CD3 e anti-CD28 por 18 ou 54h
(TGF-β)
Expressão Foxp3 (FACS)Expressão mRNA Foxp3 (RT-PCR)
3 semanas
BM WT (2x106 ) CD45.1
BM Foxo1-/-Foxo3-/-
(2x106) CD45.2
Rag1 -/-
FACS Tregs timo
Foxo1 e Foxo3 podem controlar a transcrição e expressão de Foxp3 em Tregs do timo.
6ª 8 semanas
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Qual a importância de Foxo1 e Foxo3 na diferenciação de Tregs na periferia?
WT (Foxo1+/+Foxo3+/+)Foxo1-/-Foxo3-/-
Isolamento CD4 periferia(naive)
Cultura IL-2, anti-CD3 e anti-CD28 por 54h com ou sem TGF-β
Expressão Foxp3 (FACS)Expressão mRNA Foxp3 (RT-PCR)
3 semanas
Foxo1 e Foxo3 podem controlar a transcrição e expressão de Foxp3 em Tregs induzidas por TGF-β.
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Foxo1 e Foxo3 se ligam no gene de Foxp3 para controlar a transcrição?
WT
Isolamento CD4 e Tregs (Foxp3+)
Preparação cromatina
Incubação com Ab anti-foxo1 e anti-foxo3
3 semanas
Precipitação com beads de proteína A agarose
PCR do precipitado
Anti-Foxo1 Anti-Foxo3
rVISTA tool
Foxo1 e Foxo3 interagem com o gene de Foxp3 e, possivelmente, podem controlar a sua transcrição.
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Objetivo: Avaliar o papel dos fatores de transcrição Foxo na diferenciação de linfócitos.
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Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos T na ausência de foxo1?
Animais com 3, 8 ou15 semanas
foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO
Citometria de fluxo CD44, CD69Linfocitos CD4+ TCRb+
LN, baço
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Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos T na ausência de foxo1?
Animais com 8 semanas
foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO
Linfocitos CD4+ TCRb+Incorporação de BrdU
LN, baço
Linfocitos CD4+ TCRb+PMA+IonomicinaElisa
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Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos T na ausência de foxo1?
Foxo1 é essencial na prevenção a ativação sistêmica e patológica de linfócitos T.
Animais com 8 semanas
foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO
HE- infiltrado celularParalisia de membros posteriores
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Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1?
Animais com 3,8 ou 15 semanas
foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO
LN, baço
Linfócitos B B220+Citometria de fluxo GL-7 e FAS
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Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1?
Animais com 8 semanas
foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO
Quantificação de Igs e anticorpo anti DNA dupla fita.
Soro
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Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1?
Animais com 8 semanas
foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO
Linfócitos T CD4+ CD44hiCitometria de fluxo CXCR5, PD-1, CD62L
Cxcr5-Tfh
LNBaço
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Caracterização do modelo experimental: como estão os linfócitos B na ausência de foxo1?
A ausência de Foxo1 é capaz de induzir uma autoimunidade dependente de Linfócitos B (aumento de células no centro
germinativo, anticorpos circulantes, Tfh, expressão de il21 e Bcl6)
Animais com 8 semanas
foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO
Linfócitos T CD4+ CD44hi do LNRT-qPCR Prdm1, Bcl6 e Il21.
LN
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A ativação de linfócito T na ausência de Foxo1 é conseqüência da alteração homeostática devido a manutenção das células T?
Animais com 8 semanas
foxo1f/ f- Cd4Cre foxo1f/f – foxo1f/ f- Il7ra tgCd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg
Linfócitos T CD4+Citometria de fluxo CD44, CD69.
Fatores Foxo regulam 7Ilra
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A ativação de linfócito T na ausência de Foxo1 é conseqüência da alteração homeostática devido a manutenção das células T?
Animais com 8 semanas
foxo1f/ fCd4Cre foxo1f/f foxo1f/ f- Il7ra tgCd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg
Linfócitos T CD4+Citometria de fluxo CD44, CD69.
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A ativação de linfócito T na ausência de Foxo1 é conseqüência da alteração homeostática devido a manutenção das células T?
A expressão de IL-7Ra não é capaz de prevenir a ativação de linfócitos T na ausência de de foxo1 (não é conseqüência de
alteração homeostática).
Animais com 8 semanas
foxo1f/ f- Cd4Cre foxo1f/f – foxo1f/ f- Il7ra tgCd4Cre foxo1f/f – Il7ra tg
LN, baço
Linfócitos B B220+Citometria de fluxo GL-7 e FAS
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A ausencia de Foxo1 interfere com as tolerâncias : central periférica ou dominante?
Transferência Medula óssea foxo1f/ f CD45.1Cd4Cre foxo1f/f CD45.1/2 E na proporção 1:4 WT:KO
Tcra-/-CD45.2
após 8 semanas
Linfócitos T CD4+Citometria de fluxo CD44, CD69., Foxp3
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A ausência de Foxo1 interfere com as tolerâncias : central periférica ou dominante?
Foxo1 controla a tolerância dominante de células T (Tregs).
Transferência Medula óssea foxp3- foxo1f/ f+ foxp3-Cd4Cre foxo1f/f+ foxp3+
Tcra-/-CD45.2
após 6 semanas
Linfócitos T CD4+Citometria de fluxo CD44, CD69, Foxp3
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Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das nTreg?
Animais com 8 semanas
foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO
Citometria de fluxo Foxp3, CTLA-4 CD25 e CD62L.
Timo
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Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das nTreg?
periferia
Animais com 8 semanas
foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO
Citometria de fluxo Foxp3, CD44, CD103 CD62L CD127
Linfócitos CD4+ TCRb+
LN, baço
Foxp3+
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Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das nTreg?
Foxo1 controla a homeostase e o desenvolvimento de célula nTreg (diminuição de CTLA-4, CD-25 e CD62L).
Animais com 8 semanas
foxo1f/ f- WtCd4Cre foxo1f/f - KO
Linfócitos CD4+ TCRb+Citometria de fluxo CTLA-4
LN
Naive
Estimuladas3 dias aCd3 aCD28 e TGFb
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Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das iTreg?
foxo1f/ f- WtER4Cre foxo1f/f – KO Tamoxifeno
Linfócitos naives CD4+ Cd69- Cd25- foram isoladas
Citometria :Proliferação CFSEExpressão de Foxp3 após 3 dias de tratamento com TGFb ou não
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Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das iTreg?
foxo1f/ f- WtER4Cre foxo1f/f – KO Tamoxifeno
Linfócitos naivesCD4+ Cd69- Cd25- foram isoladas
Citometria :Expressão de Foxp3, CTLA-4, CD25 , IFN-g após 3 dias de tratamento com TGFb ou não
![Page 50: Fatores de transcrição Foxo e indução de células T reguladoras Djalma Jonilson Jaqueline](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062700/552fc11d497959413d8ca8dc/html5/thumbnails/50.jpg)
Foxo1 interfere controla o desenvolvimento e homeostase das iTreg?
Foxo1 controla a responsividade de célula iTreg na TGF-b (diminuição de CTLA-4 CD-25 e CD62L).
foxo1f/ f- WtER4Cre foxo1f/f – KO Tamoxifeno
Linfócitos naives CD4+ CD69- CD25- foram isoladas dos animais LN
Co- cultura células CD45.1 WT Naives também de LN
Citometria :Expressão de Foxp3,GITR g após 3 dias de estímulo com TGF ,b aCD3 e aCD28
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Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T?
Animais com 8 semanas
CD4Cre-Cd4Cre foxo1f/f foxo3kca/kca
HE- infiltrado celularImunofluorescencia a dsDNA
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Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T?
Animais com 8 semanas
foxo1f/f foxo3f/fCd4Cre foxo1f/f foxo3f/f
Citometria de fluxo CD44, CD69Linfócitos CD4+ TCRb+
![Page 53: Fatores de transcrição Foxo e indução de células T reguladoras Djalma Jonilson Jaqueline](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062700/552fc11d497959413d8ca8dc/html5/thumbnails/53.jpg)
Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T?
Animais com 8 semanas
foxo1f/f foxo3f/fCd4Cre foxo1f/f foxo3f/f
LN, baço
Linfócitos B B220+Citometria de fluxo GL-7 e FAS
![Page 54: Fatores de transcrição Foxo e indução de células T reguladoras Djalma Jonilson Jaqueline](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022062700/552fc11d497959413d8ca8dc/html5/thumbnails/54.jpg)
Foxo3 colabora com Foxo1 no desenvolvimento de linfócitos T?
Foxo3 e Foxo1 possuem papeis sobrepostos no desenvolvimento e função de linfócitos t reguladores derivados do timo apesar de não serem necessários para
expressão e manutenção de Foxp3.
Animais com 8 semanas
foxo1f/f foxo3f/fCd4Cre foxo1f/f foxo3f/f
Linfócitos T CD4+citometria de fluxo CD25, FOxp3 eTCRb
Treg periférica
Timo
LN
foxo1f/f foxo3f/fCd4Cre foxo1f/f foxo3f/f
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