februar 2019 paxgene blood rna kit-håndbog · 2019. 11. 21. · ‡ kunitz-enheden er den...

Februar 2019

PAXgene® Blood RNA Kit-håndbog

Version 2 50 (katalog nr. 762174)

R3 1115879DK 762174

PreAnalytiX GmbH

Feldbachstrasse, CH-8634 Hombrechtikon Fremstillet af QIAGEN GmbH for PreAnalytiX

2 PAXgene Blood RNA Kit-håndbog 02/2019

Varemærker: PAXgene®, PreAnalytiX™ (PreAnalytiX GmbH); QIAGEN®, QIAcube® (QIAGEN Group); BD Vacutainer®, BD Hemogard™, Safety-Lok™ (Becton, Dickinson and Company); Eppendorf® (Eppendorf AG).

PAXgene Blood RNA Kit kan ikke fås i alle lande; indhent venligst oplysninger.

Aftale om begrænset licens

Brug af dette produkt betyder, at enhver køber eller bruger af PAXgene Blood RNA Kit accepterer følgende vilkår:

1. PAXgene Blood RNA Kit må kun bruges i overensstemmelse med PAXgene Blood RNA Kit-håndbogen, og kun med de komponenter, der er i kittet. PreAnalytiX giver ingen licens, under nogen intellektuel ejendomsret, til at bruge eller inkludere komponenterne i kittet med komponenter, der ikke er inkluderet i dette kit, undtagen som beskrevet i PAXgene Blood RNA Kit-håndbogen og yderligere protokoller, som fås på www.preanalytix.com .

2. Ud over de udtrykkeligt givne licenser giver PreAnalytiX ingen garanti om at dette kit, og/eller brugen af det, ikke overtræder tredjeparts rettigheder.

3. Dette kit og dets komponenter er under licens til engangsbrug og må ikke genbruges, gendannes eller videresælges.

4. PreAnalytiX afviser specifikt alle andre licenser, udtrykte eller underforståede, end dem, der udtrykkeligt er angivet.

5. Køberen og brugeren af kittet indvilliger i ikke at tage eller lade andre tage skridt, der kunne føre til eller fremme handlinger, der forbydes ovenfor.

6. PreAnalytiX kan håndhæve forbuddene i denne begrænsede licensaftale i enhver ret, og vil inddrive alle undersøgelses- og retsomkostninger, herunder advokatsalærer, i ethvert søgsmål for at håndhæve denne begrænsede licensaftale samt alle deres intellektuelle ejendomsrettigheder i forbindelse med kittet og/eller komponenterne deri.

Opdaterede licensvilkår findes på www.preanalytix.com.

Betinget salg

Nærværende produkt leveres med en licens i henhold til visse krav i US-7,270,953 og US-7,682,790 samt EP-1820793 B1 og udenlandske tilsvarende patentkrav på brugen af produktet til behandling de nukleinsyrekomplekser, der dannes under prøveopsamling i en PAXgene Blood RNA Tube.

HB-0101-005 BD-8945 1115879 © 2005-2019 PreAnalytiX GmbH, alle rettigheder forbeholdes.

PreAnalytiX Company

PreAnalytiX GmbH

Feldbachstrasse

CH – 8634 Hombrechtikon

Schweiz

www.preanalytix.com

PreAnalytiX distributører

PreAnalytiX produkterne fremstilles for PreAnalytiX af QIAGEN eller BD og distributeres for

PreAnalytiX af QIAGEN eller BD. Produkterne kan ikke bestilles hos PreAnalytiX GmbH.

Adressen på den lokale PreAnalytiX distributør findes på sidste side.

PAXgene Blood RNA Kit-håndbog 02/2019 3

Indhold

Kit-indhold ................................................................................................................. 5

Symboler ................................................................................................................... 7

Opbevaringsforhold .................................................................................................... 8

Tilsigtet anvendelse ..................................................................................................... 9

Begrænsninger ved produktanvendelsen ........................................................................ 9

Kvalitetskontrol ......................................................................................................... 10

Teknisk service ......................................................................................................... 10

Sikkerhedsinformation ............................................................................................... 10

Indledning ............................................................................................................... 13

Princip og procedure ...................................................................................... 13

Prøvetagning og stabilisering ........................................................................... 14

RNA-koncentration og oprensning .................................................................... 19

Manuel RNA-oprensning ................................................................................. 19

Automatisk RNA-oprensning............................................................................. 29

Udstyr og reagenser, der skal leveres af brugeren ........................................................ 35

Vigtige bemærkninger ............................................................................................... 37

Brug af QIAcube ............................................................................................ 37

Start af QIAcube ............................................................................................ 37

Installation af protokoller på QIAcube ............................................................... 37

Opfyldning af QIAcube ................................................................................... 39

Protokol: Manuel oprensning af total RNA fra humant fuldblod indsamlet i PAXgene Blood

RNA Tubes (PBT) ....................................................................................................... 48


Protokol: Automatisk oprensning af total RNA fra humant fuldblod indsamlet i PAXgene

Blood RNA Tube (BRT) ............................................................................................... 55

Fejlfindingsvejledning ................................................................................................ 62

Bilag A: Generelle bemærkninger om håndtering af RNA.............................................. 64

Bilag B: Kvantificering og kvalitetsbestemmelse for total RNA ......................................... 65

Appendiks C: Håndtering af PAXgene Blood RNA Tube ................................................ 66

Bestillingsinformation ................................................................................................. 68

Revisionshistorik for håndbogen ................................................................................. 69


Kit-indhold

PAXgene Blood RNA Kit

Katalognr.

Antal præparater

(50)

762174

50

BR1 Resuspension Buffer (resuspensionsbuffer) 20 ml

BR2 Binding Buffer (bindingsbuffer)* 18 ml

BR3 Wash Buffer (vaskebuffer) 1* 45 ml

BR4 Wash Buffer 2 (vaskebuffer) (concentrat)† 11 ml

BR5 Elution Buffer (elueringsbuffer) 6 ml

RNFW RNase-free Water (bottle) (RNase-frit vand) (flaske)

2 × 125 ml

PK Proteinase K (green lid) (Proteinase K) (grønt låg)

2 × 1,4 ml

PRC PAXgene RNA Spin Columns (red) (PAXgene RNA-spinsøjler) (røde)

5 × 10

PT Processing Tubes (forarbejdningsrør) (2 ml) 6 × 50

Hemogard Secondary BDHemogard™ Closures (Sekundære BD Hemogard™-lukninger)

50

MCT Microcentrifuge Tubes (mikrocentrifugerør) (1,5 ml)

3 × 50, 1 × 10

RNFD DNase I, RNase-frit (DNase I, RNase-frit) (lyofiliseret)

1500 Kunitz-enheder‡

RDD DNA Digestion Buffer (white lid) (DNA-digestionsbuffer) (hvidt låg)

2 × 2 ml

DRB DNase Resuspension Buffer (tube, lilac lid) (DNase-resuspensionsbuffer) (rør, lilla låg)

2 ml

*Må ikke bringes i kontakt med desinfektionsmidler, som indeholder blegemiddel. Indeholder et guanidinsalt. Se

sikkerhedsinformation på side 10. † Wash Buffer (vaskebuffer) 2 (BR4) leveres som koncentrat. For at fremstille en brugsklar opløsning skal der inden

første brug tilsættes fire dele ethanol (96–100 %, renhedsgrad p.a.), som angivet på flaskeetiketten. ‡ Kunitz-enheden er den almindeligt anvendte enhed til opmåling af DNase I, defineret som den mængde DNase I som

forårsager en stigning i A260 på 0,001 pr. minut pr. milliliter ved 25 °C, pH 5,0, hvor der anvendes høj-polymeriseret DNA som substrat (Kunitz, M. (1950) J. Gen. Physiol. 33, 349 og 363).


PAXgene Blood RNA Kit

Katalognr.

Antal præparater

(50)

762174

50

PSC PAXgene Shredder Spin Columns (lilac) (PAXgene Shredder-spinsøjler) (lilla)

5 × 10

Håndbog PAXgene Blood RNA Kit-håndbog (version 2)

1


Symboler

<N> Indeholder tilstrækkelige reagenser til <N> test

Læs brugsanvisningen

Holdbarhedsdato

Medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik

Katalognummer

Lotnummer

Materialenummer

Komponenter

Antal

Sterilisering gennem UV-stråling

Kunitz-enheder

Tilsætter

Indeholder

Rekonstitueret

Doxyribonuclease I

Ethanol


Guanidin-isothiocyanat

RNase-Free DNase Set

Globalt handelsvarenummer

Må ikke genbruges

Temperaturbegrænsning

Øvre temperaturgrænse

Producent

Vigtig bemærkning

Skriv den aktuelle dato ned efter tilsætning af ethanol til flasken

Ved levering

Fører til

Opbevaringsforhold

PAXgene RNA-spinsøjler (PRC), PAXgene Shredder-spinsøjler (PSC), proteinase K (PK) og alle

bufferne (BR1, BR2, BR3, BR4 og BR5) kan opbevares et tørt sted ved den temperatur, der er

angivet på kit-etiketten.

RNase-Free DNase Set, som indeholder DNase I (RNFD), DNA digestionsbuffer (RDD) og

DNase resuspensionsbuffer (DRB), forsendes ved omgivelsestemperatur. Alle komponenter i

det RNase-Free DNase Set skal umiddelbart efter levering opbevares ved den temperatur,


som er angivet på etiketten. Ved korrekt opbevaring er kittet stabilt indtil den udløbsdato, der

er angivet på kit-æsken.

Tilsigtet anvendelse

PAXgene Blood RNA Kit bruges til oprensning af intracellulært RNA fra fuldblod, som blev

opsamlet i PAXgene Blood RNA Tube (BRT). Når kittet anvendes sammen med PAXgene

Blood RNA Tube (BRT), leverer systemet oprenset intracellulært RNA fra fuldblod til RT-PCR

anvendt i molekylærdiagnostisk testning. Anvisninger vedrørende anvendelsen af PAXgene

Blood RNA Tubes (BRT) findes i PAXgene Blood RNA Tube Handbook (PAXgene Blood RNA

Tube-håndbogen).

Præstationskarakteristika for PAXgene Blood RNA System er kun etableret med FOS- og

IL1B-gentranskriptioner. Brugeren er ansvarlig for at etablere egnede

præstationskarakteristika for PAXgene Blood RNA-systemet for andre mål-transkriptioner.

Begrænsninger ved produktanvendelsen

PAXgene Blood RNA Kit er beregnet til oprensning af intracellulært RNA fra humant fuldblod

(4,8 x 106 – 1,1 x 107 leukocytter/ml) til in vitro-diagnostisk anvendelse. Det er ikke

beregnet til oprensning af genomisk DNA eller virale nukleinsyrer fra humant fuldblod.

Grundet det begrænsede antal transkriptioner, der er valideret til stabiliseringsspecifikationer

(FOS- og IL1Bgentranskriptioner), kan der ikke angives præstationskarakteristika for alle

transkriptioner. Laboratoriepersonalet skal gennemgå både deres egne og producentens

data for at afgøre, om det er nødvendigt at validere andre transkriptioner.

Produktet er beregnet til brug af professionelle brugere, f. eks. laboratorieteknikere og læger,

der er uddannet i in vitro-diagnostiske procedurer.


Kvalitetskontrol

I overensstemmelse med QIAGENs ISO-certificerede kvalitetsstyringssystem testes hvert lot af

PAXgene Blood RNA- Kit efter fastlagte specifikationer for at sikre en ensartet produktkvalitet.

Teknisk service

QIAGENs tekniske service leverer høj kvalitet og er altid til rådighed. De tekniske

serviceafdelinger er bemandet med erfarne videnskabelige medarbejdere med vidtrækkende

praktisk og teoretisk erfaring i molekylærbiologi og brugen af PreAnalytiX-produkterne.

Kontakt os, hvis der er spørgsmål vedrørende PAXgene Blood RNA Kit.

Ring til QIAGENs tekniske service for at få teknisk assistance og yderligere oplysninger.

Sikkerhedsinformation

Der skal altid anvendes laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller, når der

arbejdes med kemiske stoffer.

Ved arbejde med biologiske og kemiske midler skal der altid anvendes en egnet laboratoriekittel,

engangshandsker og beskyttelsesbriller for at reducere risikoen for infektion (f.eks. med HIV eller

hepatitis B-virus) og skader. Der findes flere oplysninger i de tilhørende sikkerhedsdatablade

(Safety Data Sheets, SDS'er). De findes online i bekvemt og kompakt PDF-format på

www.preanalytix.com, hvor sikkerhedsdatabladene for dette kit kan læses eller udskrives.

FORSIGTIG

Der må IKKE tilsættes blegemiddel eller syreholdige opløsninger

direkte i affaldet fra prøveklargøringen.


Bindingsbuffer (BR2) og vaskebuffer 1 (BR3) indeholder guanidin-thiocyanat, som kan

reagere stærkt ved kontakt med klorblegemiddel. Hvis der spildes bindingsbuffer (BR2) eller

vaskebuffer 1 (BR3), skal der gøres rent med et egnet laboratoriedesinfektionsmiddel og

vand. Hvis den spildte væske indeholder potentielt smittefarlige reagenser, renses fladen

først med desinfektionsmiddel og vand og derefter med 1 % (v/v) natriumhypoklorit.

RNA-stabiliseringsopløsningen og blodvæsken fra PAXgene Blood RNA Tube (BRT) kan

desinficeres med 1 del klorblegemiddelopløsning (5 % natriumhypoklorit) til 9 dele RNA-

stabiliseringsopløsning og blodvæske.

Affaldet fra prøveklargøring, såsom supernatanter fra centrifugeringstrinnene i RNA-

oprensningsproceduren, skal altid betragtes som potentielt smittefarligt. Affald skal derfor

autoklaveres eller forbrændes før bortskaffelse for at ødelægge eventuelt smittefarligt

materiale. De officielle regler for bortskaffelse skal overholdes.

Følgende fare- og sikkerhedssætninger gælder komponenter i PAXgene Blood RNA Kit. Se

sikkerhedsoplysningerne om PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) i PAXgene Blood RNA Tube-

håndbog.

Buffer BR2

Indeholder: guanidin-thiocyanat. Fare! Farlig ved indtagelse. Kan være

farlig ved hudkontakt eller ved indånding. Forårsager alvorlig

øjenskade. Skadelig for vandlevende organismer, med langvarige

virkninger. Udvikler meget giftig gas ved kontakt med syre. Bær

beskyttelseshandsker/beskyttelsestøj/øjenbeskyttelse/ansigtsbeskyttelse.

VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere

minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis det kan gøres let. Fortsæt

med at skylle. Ring omgående til en GIFTINFORMATION eller en læge.


Buffer BR3

Indeholder: ethanol; guanidin-thiocyanat. Fare! Brandfarlig væske og

damp. Forårsager alvorlig øjenskade. Udvikler meget giftig gas ved

kontakt med syre. Holdes væk fra varme/gnister/åben ild/varme

overflader. Rygning forbudt. Bær beskyttelseshandsker/

beskyttelsestøj/øjenbeskyttelse/ansigtsbeskyttelse. VED KONTAKT

MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i flere minutter. Fjern

eventuelle kontaktlinser, hvis det kan gøres let. Fortsæt med at skylle.

Ring omgående til en GIFTINFORMATION eller en læge.

DNase I

Indeholder: DNase. Fare! Kan forårsage allergisk hudreaktion. Kan

forårsage allergi- eller astmasymptomer eller åndedrætsbesvær ved

indånding. Undgå indånding af pulver/røg/gas/tåge/damp/spray.

Bær beskyttelseshandsker/beskyttelsestøj/øjenbeskyttelse/

ansigtsbeskyttelse. Anvend åndedrætsværn. Ved eksponering eller

mistanke om eksponering: Ring til en GIFTINFORMATION eller en

læge. Flyt personen til et sted med frisk luft og sørg for, at

vedkommende hviler i en stilling, som letter vejrtrækningen.

Proteinase K

Indeholder: proteinase K. Fare! Forårsager let hudirritation. Kan

forårsage allergi- eller astmasymptomer eller åndedrætsbesvær ved

indånding. Undgå indånding af pulver/røg/gas/tåge/damp/spray.

Bær beskyttelseshandsker/beskyttelsestøj/øjenbeskyttelse/

ansigtsbeskyttelse. Anvend åndedrætsværn. Ved eksponering eller

mistanke om eksponering: Ring til en GIFTINFORMATION eller en

læge. Flyt personen til et sted med frisk luft og sørg for, at

vedkommende hviler i en stilling, som letter vejrtrækningen.


Indledning

Det første skridt ved mange molekylærbiologiske undersøgelser af cellulært RNA er

indsamling af fuldblod. Ustabiliteten af den cellulære RNAprofil in vitro udgør imidlertid et

væsentligt problem. Undersøgelser hos PreAnalytiX har vist, at antallet af kopier for enkelte

mRNA-species i fuldblod kan forandre sig mere end tusind gange under transport eller

opbevaring ved stuetemperatur.* Årsagerne til dette er den hurtige nedbrydning af RNA og

den inducerede ekspression af bestemte gener efter blodtapningen. Sådanne forandringer af

RNA-ekspressionens profil forhindrer pålidelige resultater i genekspressionsundersøgelser.

Det er derfor afgørende at finde en metode, som bevarer RNA-ekspressionsprofilen under og

efter flebotomi, for at opnå en nøjagtig analyse af genekspression i humant fuldblod.

Princip og procedure

PreAnalytiX har udviklet et nyt system, som gør det muligt at tappe, stabilisere, opbevare og

transportere humane fuldblodprøver og som leverer en hurtig og effektiv protokol for

oprensning af intracellulært RNA. Systemet kræver, at der bruges PAXgene Blood RNA Tube

(BRT; US patenter 6,602,718 og 6,617,170) til blodindsamling og RNA-stabilisering,

efterfulgt af manuel eller automatisk RNA-oprensning med PAXgene Blood RNA Kit. Den

manuelle og automatisk protokol giver i alt væsentligt den samme præstation med hensyn til

RNA-kvalitet og -udbytte. Der er inkluderet præstationsdata for den manuelle protokol

(side 22 – 29) og den automatiske protokol (side 32 – 34) i denne håndbog.

* Rainen, L. et al. (2002) Stabilization of mRNA expression in whole blood samples. Clin. Chem. 48, 1883.


Prøvetagning og stabilisering

PAXgene Blood RNA-rør (BRT) indeholder et reagens, som er baseret på en patenteret RNA-

stabiliseringsmetode. Dette reagens beskytter RNA-molekyler mod nedbrydning gennem

RNaser og minimerer ex vivoforandringer af genekspressionen. PAXgene Blood RNA-rør

(BRT) er beregnet til indsamling af humant fuldblod og stabilisering af cellulært RNA i op til

3 dage ved 18-25 °C (se fig. 1 og 2, side 15 og 16) eller i op til 5 dage ved 2-8 °C (fig. 3

og 4, side 17 og 18). Aktuelt disponible data viser, at den cellulære RNA er stabil i

mindst 11 måneder ved –20 °C eller –70 °C*. Kontakt QIAGENs tekniske service for at få

flere oplysninger om igangværende undersøgelser af endnu længere stabiliseringstider.

Den faktiske varighed af RNA-stabiliseringen kan variere alt efter RNA-specien og den

anvendte downstream-applikation. Grundet det begrænsede antal transkriptioner, der er

valideret til stabiliseringsspecifikationer (FOS- og IL1Bgentranskriptioner), kan der ikke

angives præstationskarakteristika for alle transkriptioner. Laboratoriepersonalet skal

gennemgå både deres egne og producentens data for at afgøre, om det er nødvendigt at

validere andre transkriptioner.

* En langtidsundersøgelse af opbevaring af blod i PAXgene Blood RNA Tubes er under udførelse.


Figur 1. RNA-stabilitet i blodprøver ved 18-25°C: FOS. Der blev taget blodprøver i duplikat fra 10 donorer, og prøverne blev opbevaret ved 18-25°C i det angivne antal dage, efterfulgt af total RNA-oprensning. [A] Blodet blev indsamlet og opbevaret i PAXgene Blood RNA Tubes (BRT), og total RNA blev oprenset med PAXgene Blood RNA Kit. [B] Blodet blev indsamlet og opbevaret i standard-blodprøvetagningsrør med EDTA som antikoagulans, og total RNA blev oprenset med en standard ekstraktionsmetode med organiske opløsningsmidler og silicamembran-baseret RNA-rensning. De relative FOS-transkriptionskoncentrationer blev bestemt med realtids Duplex-RT-PCR under anvendelse af 18S-rRNA som intern standard. Værdierne for alle prøver er opført med middelværdi og standardafvigelser for alle viste prøver. De stiplede linjer gengiver den samlede nøjagtighed ±3 x analysen (2,34 CT).

Opbevaring (dage)

ΔΔ

C T

Opbevaring (dage)

ΔΔ

C T


Figur 2. RNA-stabilitet i blodprøver ved 18-25°C: IL1B. Der blev udtaget blod, og samlet RNA blev oprenset efter opbevaring ved 18-25 °C som beskrevet i figur 1. De relative IL1B-transkriptionskoncentrationer blev bestemt med realtids duplex-RT-PCR under anvendelse af 18S-rRNA som intern standard. Værdierne for alle prøver er opført med middelværdi og standardafvigelser for alle viste prøver. De stiplede linjer gengiver den samlede nøjagtighed ±3 x analysen (1,93 CT).

Opbevaring (dage)

ΔΔ

C T

Opbevaring (dage)

ΔΔ

C T


Figur 3. RNA-stabilitet i blodprøver ved 2-8 °C: FOS. Der blev taget blodprøver i duplikat fra 10 donorer, og prøverne blev opbevaret ved 2-8°C i det angivne antal dage, efterfulgt af total RNA-oprensning. [A] Blodet blev indsamlet og opbevaret i PAXgene Blood RNA Tubes (BRT), og total RNA blev oprenset med PAXgene Blood RNA Kit. [B] Blodet blev indsamlet og opbevaret i standard-blodprøvetagningsrør med EDTA som antikoagulans, og total RNA blev oprenset med en standard ekstraktionsmetode med organiske opløsningsmidler og silicamembran-baseret RNA-rensning. De relative FOS-transkriptionskoncentrationer blev bestemt med realtids Duplex-RT-PCR under anvendelse af 18S-rRNA som intern standard. Værdierne for alle prøver er opført med middelværdi og standardafvigelser for alle viste prøver. De stiplede linjer gengiver den samlede nøjagtighed ±3 x analysen (2,34 CT).

Opbevaring (dage)

ΔΔ

C T

Opbevaring (dage)

ΔΔ

C T


Figur 4. RNA-stabilitet i blodprøver ved 2-8 °C: IL1B. Der blev udtaget blod, og samlet RNA blev oprenset efter opbevaring ved 2-8°C som beskrevet i figur 3. De relative IL1B-transkriptionskoncentrationer blev bestemt med duplex-RT-PCR i realtid under anvendelse af 18S-rRNA som intern standard. Værdierne for alle prøver er opført med middelværdi og standardafvigelser for alle viste prøver. De stiplede linjer gengiver den samlede nøjagtighed ±3 x analysen (1,93 CT).

Opbevaring (dage)

ΔΔ

C T

Opbevaring (dage)

ΔΔ

C T


RNA-koncentration og oprensning

PAXgene Blood RNA-kittet bruges til oprensning af total RNA fra 2,5 ml humant fuldblod,

som blev indsamlet i et PAXgene Blood RNA Tube (BRT). Proceduren er enkel og kan udføres

manuelt eller automatisk (se figur 5 og 10, side 20 og 30). I begge protokoller begynder

oprensningen med et centrifugeringstrin for at samle nukleinsyrer i pellets i PAXgene Blood

RNA Tube (BRT). Pelletet vaskes og resuspenderes, efterfulgt af manuel eller automatisk RNA-

oprensning. Begge protokoller følger i princippet de samme protokoltrin, med de samme kit-

komponenter.

Manuel RNA-oprensning

Det resuspenderede pellet inkuberes i optimeringsbuffer og proteinase K (PK) for at digestere

proteiner. En yderligere centrifugering med en PAXgene Shredder-spinsøjle (PSC) udføres for

at homogenisere cellelysatet og fjerne tiloversblevne cellerester. Supernatanten af

gennemstrømningen overføres til et frisk mikrocentrifugerør. Derefter tilsættes ethanol for at

justere bindingsbetingelserne, og lysatet overføres på PAXgene RNA-spinsøjlen (PRC). Ved

den efterfølgende korte centrifugering binder RNA selektivt til PAXgene silicagelmembranen,

mens kontaminanter passerer igennem den. Tiloversblevne kontaminanter fjernes ved hjælp

af flere effektive vasketrin. Mellem det første og det andet vasketrin bliver membranen

behandlet med DNase I (RNFD) for at fjerne eventuelle bundne rester af DNA. Efter

vasketrinnene bliver RNA elueret i elueringsbuffer (BR5) og varmedenatureret.

Totalt RNA oprenset ved hjælp af PAXgene Blood RNA-systemet er rent. Anvendes den

manuelle protokol, er værdierne A260/A280 mellem 1,8 og 2,2 og ≤1 % (w/w) genomisk

DNA til stede i ≥95 % af alle prøver, som målt af kvantitativ realtids-PCR af en sekvens af

beta-actin genet. Mindst 95 % af prøverne viser ingen hindring i RT-PCR, ved brug af op til

30 % af eluatet.


Figur 5. Den manuelle PAXgene Blood RNA-procedure.

Eluér

Vask

Digester DNA

Vask

Bind total RNA

Placer på PAXgene RNA-spinsøjle

Overfør supernatanten af gennemstrømningen til mikrocentrifugerør Tilføj ethanol

Overfør til PAXgene Shredder-spinsøjle

Inkubér

Tilsæt proteinase K og bindingsbuffer

Blod

Bland

Vask pelletet

Resuspender

Overfør til mikrocentrifugerør

Opvarm til 65 ºC

Brugsklar RNA


Når den manuelle protokol følges, er gennemsnitstiden for prøveklargøring (baseret på data

fra 12 prøveklargøringer) ca. 90 minutter*, hvoraf den rene håndteringstid udgør ca.

40 minutter. RNA-udbyttet fra 2,5 ml sundt humant fuldblod er ≥3 µg for ≥95 % af de

forarbejdede prøver. Da udbyttet afhænger stærkt af donorerne, kan de enkelte udbytter

variere. For individuelle donorer leverer PAXgene Blood RNA-systemet yderst reproducerbare

og gentagelige udbytter (se figur 6 og 7 på side 22 og 23), såvel som reproducerbare og

gentagelige RT-PCR-resultater (se figur 8 og 9 på side 27 og 28), hvilket gør det velegnet til

klinisk-diagnostiske undersøgelser.

Figur 6 (side 22) viser den generelle reproducerbarhed og gentagelighed for PAXgene

Blood RNA-systemet. Der blev foretaget yderligere undersøgelser for at påvise, hvilken

indflydelse forskellige lots af PAXgene Blood RNA Kit og forskellige laboranter havde på

reproducerbarheden af RNA-udbyttet og realtids-RT-PCR-resultaterne. Eftersom der blev

anvendt poolede blodprøver i stedet for individuelle PAXgene Blood RNA-rør (BRT), gengiver

forsøgsresultaterne ikke systemets gentagelsespræcision, herunder fluktuationer mellem de

enkelte blodindsamlinger, men kun gentagelsespræcisionen for prøvepræparationen

(se figur 7, side 23).

* Den samlede kørselstid for protokollen, inklusive den første håndtering af PAXgene Blood RNA Tubes

(centrifugeringer, vask og resuspension af pelletet).


Figur 6. Reproducerbar og gentagelig RNA-oprensning. Firedobbelte blodprøver fra 14 donorer blev alle manuelt behandlet af tre forskellige laboranter (A, B og C). Der blev benyttet tre forskellige sæt udstyr, og alle prøver, der var blevet klargjort af en enkelt laborant, blev behandlet med det samme udstyr. [A] Middelværdi og standardafvigelser for RNA-udbyttet pr. gentaget prøve fra samme donor og forskellige laboranter vises. [B] Tolv gentagne blodprøver fra hver af de 14 donorer blev forarbejdet af de 3 forskellige laboranter. Middelværdier og standardafvigelser for RNA-udbyttet pr. prøve fra samme donor og alle laboranter vises. Ved alle RNA-prøver var A260/A 280-forholdet i området fra 1,8 til 2,2.

Donor

RNA

-udb

ytte

(µg/

2,5

ml b

lod)

Donor

Gen

nem

snitl

igt R

NA

-udb

ytte

(µg/

2,5

ml b

lod)


Figur 7. Gentagelighed og reproducerbarhed af RNA-udbyttet for forskelllige laboranter og forskellige lots af PAXgene Blood RNA Kits ved anvendelse af poolede blodprøver. Der blev indsamlet blodprøver fra 30 donorer i PAXgene Blood RNA Tube (BRT; 12 rør pr. donor, dvs. i alt 360 rør). Indholdet af rørene fra 3 donorer blev poolet og derefter delt i alikvoter på 36 prøver. Disse 36 prøver pr. 3-donor-pool blev behandlet manuelt af tre forskellige laboranter. Hver laborant anvendte 3 forskellige lots af PAXgene Blood RNA Kit til ekstraktionen og forarbejdede firdobbelte prøver fra hver af de ti donor-pools. [A] RNA-udbytte og standardafvigelse for hver kombination af laborant og lot. Firdobbelte blodprøver fra 10 donor-pools blev forarbejdet af 3 forskellige laboranter (A, B og C) med hver af tre kit-lots (1, 2 og 3). Der vises middelværdier af udbyttet (søjler) og standardafvigelser (fejlbjælker) pr. firdobbelt prøve fra den samme donor-pool for forskellige laboranter og kit-lots. [B] Variationskoefficienten (CV) af RNA-udbytte pr. donor-pool for alle kombinationer af laborant og lot (A, B, C; 1, 2, 3), udregnet fra middelværdi og standardafvigelse for udbyttet, som er vist i figur 7A.

Donor-pool

CV a

f RN

A-u

dbyt

te (%

)

Donor-pool

RNA

-udb

ytte

(µg/

2,5

ml b

lod)


Tabel 1A. Reproducerbarhed inden for hvert lot og hver bruger til valgte donor-pools (1, 6, 9, 10).

Kombination af data

Donor-pool 1 5,1 x 106 celler/ml


Gennemsnitligt udbytte (µg)

SD (µg) CV (%) Gennemsnitligt udbytte (µg)

SD (µg) CV (%)

Lot 1, bruger A 8,03 0,42 5 9,55 0,99 10

Lot 1, bruger B 7,98 1,17 15 9,38 1,94 21

Lot 1, bruger C 7,87 0,45 6 10,71 0,65 6

Lot 2, bruger A 7,32 0,98 13 9,78 1,89 19

Lot 2, bruger B 6,09 1,04 17 9,82 2,83 29

Lot 2, bruger C 6,87 0,31 4 10,37 0,74 7

Lot 3, bruger A 7,04 0,90 13 8,96 0,68 8

Lot 3, bruger B 6,98 1,22 17 7,73 0,97 13

Lot 3, bruger C 8,78 0,89 10 10,59 1,94 18



Kombination af data Gennemsnitligt

udbytte (µg) SD (µg) CV (%)


SD (µg) CV (%)

Lot 1, bruger A 7,52 0,41 6 7,96 0,49 6

Lot 1, bruger B 8,82 1,72 19 8,90 0,76 9

Lot 1, bruger C 10,14 1,46 14 10,22 1,29 13

Lot 2, bruger A 6,92 0,27 4 7,63 1,23 16

Lot 2, bruger B 7,20 0,71 10 7,00 0,56 8

Lot 2, bruger C 9,14 1,52 17 11,56 1,21 10

Lot 3, bruger A 8,18 0,76 9 7,85 0,82 10

Lot 3, bruger B 6,41 0,88 14 8,88 2,17 24

Lot 3, bruger C 10,78 0,56 5 10,88 0,37 3


Tabel 1B. Reproducerbarhed inden for hver bruger og mellem alle lots til valgte donor-pools (1, 6, 9, 10)

Kombination af data





SD (µg) CV (%)

Bruger A, alle lots 7,46 0,85 11 9,43 1,22 13

Bruger B, alle lots 7,02 1,31 19 8,98 2,09 23

Bruger C, alle lots 7,84 0,98 13 10,56 1,15 11






SD (µg) CV (%)

Bruger A, alle lots 7,54 0,72 10 7,81 0,82 11

Bruger B, alle lots 7,48 1,50 20 8,26 1,54 19

Bruger C, alle lots 10,02 1,34 13 10,89 1,10 10

Tabel 1C. Reproducerbarhed inden for hver bruger og mellem alle brugere til valgte donor-pools (1, 6, 9, 10)

Kombination af data





SD (µg) CV (%)

Lot 1, alle brugere 7,96 0,69 9 9,88 1,34 14

Lot 2, alle brugere 6,76 0,93 14 9,99 1,84 18

Lot 3, alle brugere 7,60 1,27 17 9,09 1,71 19






SD (µg) CV (%)

Lot 1, alle brugere 8,83 1,63 19 9,02 1,27 14

Lot 2, alle brugere 7,75 1,36 18 8,73 2,31 26

Lot 3, alle brugere 8,46 1,99 24 9,20 1,80 20


Tabel 1D. Reproducerbarhed mellem alle lots og alle brugere til valgte donor-pools (1, 6, 9, 10)

Kombination af data





SD (µg) CV (%)

Lot 1, alle brugere 7,44 1,09 15 9,66 1,65 17






SD (µg) CV (%)

Lot 1, alle brugere 8,35 1,70 20 8,99 1,80 20

Detaljeret analyse af 4 repræsentative donor-pools. Pools blev valgt i henhold til antallet af

hvide blodlegemer og viser høje, mellem og lave værdier i det normale område for antallet

af hvide blodlegemer (4,8 x 106 – 1,1 x 107 leukocytter/ml). Antallet af hvide blodlegemer

repræsenterer gennemsnitsværdien af de 3 tællinger af hvide blodlegemer fra de 3 donorer

pr. donor-pool.


Figur 8. Reproducerbarhed for RT-PCR – mellem brugere. RNA, som blev oprenset i det eksperiment, der er beskrevet i figur 7, blev benyttet til realtids RT-PCR. De relative [A] FOS og [B] IL1B transkriptionskoncentrationer blev bestemt med duplex-RT-PCR i realtid under anvendelse af 18S-rRNA som intern standard. Værdier for alle prøver vises relativt til værdierne af bruger 1 (10 donor-pools x 3 kit-lots x 4 gentagelser = 120 data-sæt for hvert gen) med middelværdi (rød linje) og standardafvigelse (sort, lodret bjælke) for alle viste prøver. De stiplede linjer gengiver den samlede nøjagtighed ±3 x analysen (FOS: 2,34 CT; IL1B: 1,93 CT).

Bruger

ΔΔC T

Bruger

ΔΔC T


Figur 9. Reproducerbarhed af RT-PCR – mellem kit-lots. RNA, som blev oprenset i det eksperiment, der er beskrevet i figur 7, blev benyttet til realtids RT-PCR. De relative [A] FOS og [B] IL1B transkriptionskoncentrationer blev bestemt med duplex-RT-PCR i realtid under anvendelse af 18S-rRNA som intern standard. Værdier for alle prøver vises relativt til værdierne for kit-lot 1 (10 donor-pools x 3 brugere x 4 gentagelser = 120 datasæt for hvert gen) med middelværdi (rød linje) og standardafvigelse (sort, lodret bjælke) for alle viste prøver. De stiplede linjer gengiver den samlede nøjagtighed ±3 x analysen (FOS: 2,34 CT; IL1B: 1,93 CT).

Lot

ΔΔC T

Lot

ΔΔC T


Tabel 2. Sammenfatning af RT-PCR-data fra figur 8 og 9

Testsystem FOS/18S rRNA-analyse IL1B/18S rRNA-analyse

Sammenligning af data Middel (∆∆CT)

± SD (∆∆CT)

Middel (∆∆CT)

± SD (∆∆CT)

Reproducerbarhed inden for hver bruger og mellem alle lots

Alle brugere, lot 1 – lot 1 0,00 0,00 0,00 0,00

Alle brugere, lot 1 – lot 2 -0,03 0,48 -0,07 0,66

Alle brugere, lot 1 – lot 3 -0,21 0,52 0,11 0,71

Reproducerbarhed inden for hver bruger og mellem alle lots

Alle lots, bruger A – bruger A 0,00 0,00 0,00 0,00

Alle lots, bruger A – bruger B -0,46 0,44 -0,06 0,69

Alle lots, bruger A – bruger C -0,31 0,60 -0,15 0,71

Bruger: Laborant, udførte undersøgelsen. Lot: Lotnummer for det anvendte kit. SD: Standardafvigelse. Gennemsnitsværdi ∆∆CT (N = 120) og standardafvigelse er vist for de data, som præsenteres i figur 8 og 9.

Automatisk RNA-oprensning

Prøveklargøring er automatiseret med standard-QIAcube®-instrumentet (kat. nr. 9001882

[110 V], kat.-nr. 9001293 [230 V]; uden QIAcube Connect) og følger de samme trin som

den manuelle procedure, hvilket gør det muligt fortsat at bruge PAXgene Blood RNA Kit til

oprensning af RNA af høj kvalitet. Se QIAcube User Manual (QIAcube-brugervejledningen)

og www.giagen.com/MyQIAcube for at få mere information om QIAcube.

Den automatiske RNA-oprensningsprotokol består af 2 dele (eller protokoller), “PAXgene

Blood RNA Part A” og “PAXgene Blood RNA Part B”, med en kort manuel indgriben mellem

de 2 dele (se figur 10, side 30).


Figur 10. Den automatiske PAXgene Blood RNA-procedure.

Den centrifugerede, vaskede og resuspenderede nukleinsyrepellet (se “RNA-koncentration og

-oprensning” på side 19) overføres fra PAXgene Blood RNA Tube (BRT) til

forarbejdningsrørene (PT), som placeres i termoshakerenheden på QIAcube-arbejdsbordet.

Operatøren vælger og starter protokollen “PAXgene Blood RNA Part A” fra menuen.

QIAcube udfører trinene i protokollen frem til eluering af RNA i elueringsbuffer (BR5).

Blod

Bland

Vask pelletet

Resuspender

Overfør til forarbejdningsrør (PT), og sæt det i QIAcube-rysteren

Tilsæt proteinase K (PK) og bindingsbuffer (BR2) Inkubér

Overfør til PAXgene Shredder-spinsøjle (PSC)

Overfør gennemstrømning til forarbejdningsrør (PT) på QIAcube-rysteren

Tilsæt ethanol til gennemstrømningen

Sæt det i PAXgene RNA-spinsøjle (PRC) Bind total RNA

Vask

Digester DNA

Vask

Overfør til PAXgene RNA-spinsøjle (PRC)

Eluér

Luk låg på mikrocentrifugerør (MCT), og overfør til QIAcube-rysteren

Opvarm til 65 ºC

Brugsklar RNA


Operatøren overfører mikrocentrifugerørene (MCT), som indeholder den oprensede RNA, til

termoshakerenheden på QIAcube. Operatøren vælger og starter protokollen “PAXgene

Blood RNA Part B” fra menuen, og varmedenaturering udføres af QIAcube.

Gennemsnitstiden for prøveklargøring (baseret på data fra 12 kørsler af prøveklargøring) er

151 minutter* med betydeligt mindre ren håndteringstid sammenlignet med den manuelle

protokol.

RNA-udbyttet fra 2,5 ml sundt humant fuldblod er ≥3 µg for ≥95 % af de forarbejdede

prøver. Figur 11 (side 32) viser RNA-udbyttet fra 216 prøver der blev forberedt med den

automatiske protokol, med 3 kit-lots af 3 operatører. Eftersom der blev brugt poolede

blodprøver i stedet for individuelle PAXgene Blood RNA Tube (BRT) til disse undersøgelser,

viser resultaterne ikke det forventede RNA-udbyttet fra enkelte prøver i individuelle

blodindsamlinger. Da udbyttet afhænger stærkt af donorerne, kan de enkelte udbytter

variere (figur 11, side 32).

Mindst 95 % af prøverne viser ingen hindring i RT-PCR, ved brug af op til 30 % af eluatet.

Hvis den automatiske protokol bruges, kan krydskontaminering mellem prøver ikke

detekteres, som målt i kvantitativ, realtids RT-PCR af sekvenser af ABL1- og FOS-

transkriptioner i RNA-negative prøver (vand) mod RNA-positive prøver (humant fuldblod) i

samme kørsel.

RNA, der er oprenset med PAXgene Blood RNA-systemet og den automatiske protokol, er

ren, som det fremgår af manglen på RT-PCR-hindring (se figur 11, side 32) og A260/A280-

værdier mellem 1,8 og 2,2. Genomisk DNA er til stede ved ≤1 % (w/w) i ≥95 % af alle

prøver, som målt i kvantitativ, realtids-PCR af en sekvens af beta-actin-genet. Figur 12 og 13

(side 32 og 33) viser A260/A280-værdierne og relativt genomisk DNA af de i alt 216 prøver,

der er klargjort med den automatiske protokol med 3 kit-lots af 3 laboranter.

* Den samlede kørselstid for protokollen, inklusive den første håndtering af PAXgene Blood RNA Tubes

(centrifugeringer, vask og resuspension af pelletet).


Figur 11. RNA-udbytte – automatisk forarbejdning. Der blev indsamlet blodprøver fra 36 donorer i PAXgene Blood RNA Tube (BRT; 6 rør pr. donor, dvs. i alt 216 rør). Indholdet af rørene fra 6 donorer blev poolet og derefter delt i alikvoter på 36 prøver. Disse 36 prøver pr. 6-donor-pool blev behandlet manuelt af 3 forskellige laboranter (A, B, C). Hver laborant anvendte PAXgene Blood RNA Kit fra tre forskellige lots (1, 2, 3) til automatisk udtrækning, og forarbejdede firdobbelte prøver fra hver af de 6 donor-pools. RNA-udbytte for alle individuelle prøver er vist for hver operatør-/lot-kombination.

Figur 12. RNA-renhed (A260/A280-værdier) – automatisk forarbejdning. RNA blev oprenset af 3 forskellige laboranter (A, B, C) med 3 forskellige lots (1, 2, 3) fra PAXgene Blood RNA Kit i det eksperiment, der er beskrevet i figur 11. A260/A280-værdier for alle individuelle prøver er vist for hver operatør/lot-kombination.

RNA-udbytte (µg/2,5 ml blod)

RNA-renhed (A260/A280) 2,3

2,2

2,1

2,0

1,9

1,8

1,7


Figur 13. RNA-renhed (% genomisk DNA-forurening) – automatisk forarbejdning. RNA blev oprenset af 3 forskellige laboranter (A, B, C) med 3 forskellige lots (1, 2, 3) fra PAXgene Blood RNA Kit i det eksperiment, der er beskrevet i figur 11. Genomiske DNA-mængder (w/w) for alle individuelle prøver er vist for hver operatør/lot-kombination.

Den automatiske protokol for RNA-oprensning med PAXgene Blood RNA-systemet giver RT-

PCR-resultater med høj reproducerbarhed og gentagelighed, som vist i figur 14 (side 34),

hvilket gør den meget robust til klinisk-diagnostiske tests.

Genomisk DNA (w/w) (%)


Figur 14. Reproducerbarhed for RT-PCR – mellem automatiserede og manuelle protokoller. RNA blev oprenset af 3 forskellige laboranter (A, B, C) med 3 forskellige lots (1, 2, 3) fra PAXgene Blood RNA Kit med den automatiserede protokol i det eksperiment, der er beskrevet i figur 11. Parallelt hermed blev RNA oprenset fra de tilsvarende replikatrør med den manuelle protokol. De relative [A] FOS og [B] IL1B transkriptionskoncentrationer blev bestemt med realtids Duplex-RT-PCR under anvendelse af 18S-rRNA som intern standard. Mulige forskelle i transkriptionsniveauer mellem RNA forberedt fra parrede blodprøver med begge udtrækningsprotokoller (automatisk og manuel protokol) blev udregnet med metoden ∆∆CT. Individuelle ∆∆CT værdier for alle prøvepar (4 replikater x 6 donor-pools x 3 kit-lots x 3 operatører = 216 par for hvert gen) vises som enkelte prikker med gennemsnit (større prikker) og standardafvigelser (sorte bjælker) for alle de viste prøver. De stiplede linjer gengiver den samlede nøjagtighed ±3 x analysen (FOS: 1,16 CT; IL1B: 1,98 CT; forskellig analysepræcision sammenlignet med figur 1–4, 8 og 9 pga. forskellige analyseversioner).

Middel

Middel

ΔΔCT

ΔΔCT


Udstyr og reagenser, der skal leveres af brugeren

Der skal altid anvendes laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller, når der

arbejdes med kemikalier. Der findes flere oplysninger i de tilhørende sikkerhedsdatablade

(safety data sheets, SDS’er), som kan fås hos produktets leverandør.

For alle protokoller

PAXgene Blood RNA Tube (BRT, kat.-nr. 762165)

Ethanol (96–100 %, renhedsgrad p. a.)

Pipettér* (10 µl – 4 ml)

Sterile RNase-fri pipettespidser†, med aerosol-barriere.

Målecylinder‡

Centrifuge* med variable hastigheder fra 3.000–5.000 x g, udstyret med udsvingsrotor

og centrifugebægre til PAXgene Blood RNA Tubes (BRT)

Vortex-mixer*

Knust is

Vandfast tusch til etiketter

Til manuel protokol

Mikrocentrifuge* med variabel hastighed mellem 1.000–8.000 x g, lavere eller højere

g-kraft kan dog anvendes (se yderligere oplysninger i protokoltrinnene). Centrifugen skal

være udstyret med en rotor til 2 ml mikrocentrifugerør

* Sørg for, at instrumenterne regelmæssigt kontrolleres, vedligeholdes og kalibreres efter producentens anvisninger. † Brugeren skal gøre sig bekendt med retningslinjerne for håndtering af RNA (bilag A, side 64). ‡ Til tilsætning af ethanol til buffer BR4-koncentrat.


Shaker–inkubator* der kan inkubere ved 55 °C og 65 °C og ryste ved ≥400 omdr./min.,

ikke over 1.400 omdr./min. (f.eks. Eppendorf® Thermomixer Compact eller tilsvarende)

Til den automatiserede protokol

QIAcube* (QIAGEN, kat. nr. 9001882 [110 V], kat. nr. 9001293 [230 V])

Saks

QIAcube forbrugsvarer

Filter-Tips, 1.000 µl (1024) (QIAGEN, kat. nr. 990352)†

Reagent Bottles, 30 ml (6) (QIAGEN, kat. nr. 990393)†

Rotor Adapters, (10 x 24) (QIAGEN, kat. nr. 990394)†

QIAcube-tilbehør

Reagent Bottle Rack (QIAGEN, kat. nr. 990390) †

Rotor Adapter Holder (QIAGEN, kat. nr. 990392) †

* Sørg for, at instrumenterne regelmæssigt kontrolleres, vedligeholdes og kalibreres efter producentens anvisninger. † Også inkluderet i Starter Pack, QIAcube (QIAGEN kat. nr. 990395)


Vigtige bemærkninger

Brug af QIAcube

Brugeren skal være bekendt med betjeningen af QIAcube. Læs venligst QIAcube-

brugervejledningen og al yderligere information, der følger med QIAcube, og vær ekstra

opmærksom på sikkerhedsinformationen, før de automatiske PAXgene Blood RNA-protokoller

påbegyndes.

Start af QIAcube

Luk døren på QIAcube, og tænd for QIAcube med strømkontakten (se figur 15, side 38).

Der lyder et bip, og opstartsskærmen vises. Instrumentet udfører automatisk opstartstest.

Installation af protokoller på QIAcube

En indledende protokolinstallation er påkrævet, før den første RNA-klargøringskørsel kan

udføres på QIAcube. Installer begge protokollerne “PAXgene Blood RNA Part A” og

“PAXgene Blood RNA Part B”.

Protokoller findes på www.giagen.com/MyQIAcube og skal downloades til den USB-nøgle,

der følger med QIAcube, og overføres til QIAcube via USB-porten.

USB-porten, der er placeret bag beskyttelsespanelet (se figur 15, side 38), gør det muligt at

koble QIAcube til en USB-nøgle (følger med QIAcube). Datafiler, såsom log- eller

rapportfiler, kan også overføres via USB-porten fra QIAcube til USB-nøglen.


USB-porten må kun bruges til den USB-nøgle, der leveres af QIAGEN. Slut

ikke andre enheder til denne port.

Fjern ikke USB-nøglen, mens protokoller downloades eller datafiler overføres,

eller under en protokolkørsel.

Figur 15. QIAcube set forfra.

Berøringsskærm

USB-port bag beskyttelsespanel

Dør

Strømafbryder

RS232-serieport bag beskyttelsespanel (må kun benyttes af QIAGEN instrumentservicespecialister)

Affaldsskuffe

1 4

2 5

3 6

1

2

3 4

5

6


Opfyldning af QIAcube

For at spare tid kan opfyldningen udføres under en eller begge de 10 minutters centrifugetrin

(trin 3 og 5) i “Protokol: Automatisk oprensning af total RNA fra humant fuldblod indsamlet i

PAXgene Blood RNA-rør (BRT)”, side 55.

Reagensflasker

Før hver kørsel på QIAcube fyldes de 4 reagensflasker forsigtigt med reagenserne fra

tabel 3 op til det maksimale niveau eller, hvis dette ikke er muligt, til det niveau, som er

muligt med de buffermængder, der leveres i PAXgene Blood RNA Kit. Mærk tydeligt flasker

og låg med buffernavn, og placer de fyldte reagensflasker korrekt i reagensflaskeholderen.

Sæt holderen ind på QIAcube-arbejdsbordet som vist (figur 16 og 17, side 40 og 41).

Den leverede mængde af buffer BR2 vil ikke fylde en reagensflaske op til det

viste niveau. Buffer BR3 og BR4 vil muligvis ikke fylde flasken op til det viste

niveau efter forarbejdning af flere prøver i tidligere kørsler.

Sørg for at fjerne lågene fra flaskerne, før de placeres på arbejdsbordet.

Der er tilstrækkelig buffer i PAXgene RNA Blood-kittet (50) til maksimalt 7 RNA

klargøringskørsler på QIAcube, når antallet af prøver er 2 til 12 pr. kørsel.

Generelt bør kørsler med et lavere antal prøver undgås, når der behandles i

alt 50 prøver pr. kit med maksimalt 7 kørsler af RNA-klargøring. Mere end 7

kørsler af RNA-klargøring kan medføre, at der ikke er en tilstrækkelig

buffervolumen til behandling af de sidste prøver.


Tabel 3. Placeringer i reagensflaskeholderen

Position Reagens

1 Bindingsbuffer (BR2)

2 96–100 % ethanol

3 Vaskebuffer 1 (BR3)

4 Vaskebuffer 2 (BR4)*

5 – (skal være tom)

6 – (skal være tom)

* Vaskebuffer 2 (BR4) leveres som koncentrat. For at fremstille en brugsklar opløsning skal der inden første brug tilsættes fire dele ethanol (96–100 %, renhedsgrad p.a.), som angivet på flaskeetiketten.

Figur 16. Opfyldning af reagensflaskeholderen. [A] Tegning over positioner og indhold af flaskerne i reagensflaskeholderen. [B] Placering af holder i QIAcube.

A B

Position 3 Vaskebuffer

1 (BR3)

Position 4 Vaskebuffer

2 (BR4)

Position 5

Tom

Position 6

Tom

Position 2 96–100 %

ethanol

Position 1 Bindingsbuffer

(BR2)


Figur 17. QIAcube indeni.

Centrifugelåg

Mikrocentrifugens røråbninger

Centrifuge

Spidsstativ

Ryster

Bortskaffelsesåbninger til spidser og søjler

Reagensflaskeholder

Robotarm

Spidssensor

1 6

2 7

3 8

4 9

5

1

2

3 4

5

9

7

6

8


Spinsøjler (PRC, PSC), mikrocentrifugerør (MCT) og QIAcube-plastiktilbehør

Placer 2 spidsholdere med filterspidser på 1.000 µl på QIAcube (se figur 17, side 41).

Genopfyld holderen med spidser, når det er nødvendigt.

Brug kun 1.000 µl-filterspidser, der er designet til brug med QIAcube.

Mærk rotoradaptere og mikrocentrifugerør (MCT) for hver prøve med en vandfast tusch.

Åben de PAXgene Shredder-spinsøjler (PSC), der skal bruges, og klip lågene helt af med en

saks (se figur 18, side 43).

For at QIAcube robotgribearmen kan fungere korrekt, skal lågene og alle

plastikdele, der forbinder låget til PAXgene Shredder-spinsøjlerne (PSC),

fjernes helt (klippes af; se figur 16). Ellers kan robotgribearmen ikke få

ordentligt fat i spinsøjlerne (PSC, PRC).

Placer PAXgene RNA-spinsøjlen (PRC), PAXgene Shredder-spinsøjlen (PSC, uden låg), og det

markerede mikrocentrifugerør (MCT) i de korrekte positioner i hver mærket rotoradapter, som

vist i tabel 4 og figur 19 (side 43).

Sørg for, at spinsøjlens (PRC) og mikrocentrifugerørets (MCT) låg er trykket helt

ned til bunden af åbningerne ved kanten af rotoradapteren, ellers vil lågene

gå af under centrifugering.


Figur 18. Opfyldning af PAXgene Shredder-spinsøjle (PSC). PAXgene Shredder-spinsøjlen (PSC) er placeret i midterpositionen af rotoradapteren. Klip låget af, før søjlen (PSC) placeres.

Tabel 4. Laboratorieartikler i rotoradapteren

Position Reagens Placering af låg

1 PAXgene RNA-spinsøjle (rød, PRC) L1

2 PAXgene Shredder-spinsøjle (lilla, PSC) (klip låget af, før søjlen placeres i rotoradapteren)

–

3 Mikrocentrifugerør (MCT)* L3

* Brug de mikrocentrifugerør (1,5 ml, MCT), der følger med i PAXgene Blood RNA-kittet.

Figur 19. Positioner i rotoradapteren. Rotoradapteren har tre rørpositioner (1–3) og tre lågpositioner (L1–L3).

Søjlelåg fjernet korrekt

Søjlelåg fjernet ukorrekt; en del af låget er stadig påsat


Opfyldning af centrifugen

Sæt de samlede rotoradaptere i centrifugespandene som vist i figur 20 nedenfor.

Ved forarbejdning af mindre end 12 prøver skal centrifugerotoren fyldes, så den

er i radial balance (se figur 21, side 45). Alle centrifugespande skal være

monteret, før en protokolkørsel påbegyndes, selv hvis der skal forarbejdes mindre

end 12 prøver. Det er ikke muligt at forarbejde en enkelt (én) eller 11 prøver.

Figur 20. Opfyldning af centrifugen. Placer de samlede rotoradaptere i centrifugespandene.


Figur 21. Opfyldning af centrifuge og ryster. Centrifuge- og rysterpositioner er vist for forarbejdning af to (2 prøver) til ti (10 prøver) prøver. Det er ikke muligt at forarbejde én eller 11 prøver.

2 prøver 3 prøver

4 prøver 5 prøver

6 prøver 7 prøver

9 prøver 8 prøver

10 prøver


Forarbejdningsrør (PT)

Fjern alle forarbejdningsrør (PT), der stadig sidder i mikrocentrifugens røråbninger fra

tidligere kørsler (se figur 17, side 41). Fyld 3 forarbejdningsrør (PT) med den mængde

reagens, der er angivet i tabel 5, i overensstemmelse med antallet af prøver i kørslen.

Til DNase I inkuberingsblanding pipetteres den angivne mængde DNA-digestionsbuffer

(RDD) i et forarbejdningsrør (PT), og den angivne mængde DNase I (RNFD)-stamopløsning

tilsættes. Bland forsigtigt ved at pipettere hele blandingen op og ned 3 gange med en

1.000 µl pipettespids.

Brug de forarbejdningsrør på 2 ml (PT), der leveres med PAXgene Blood RNA Kit. Mærk

rørene (PT) tydeligt med reagensnavne, og placer dem i de korrekte positioner i

mikrocentrifugens røråbninger, som vist i tabel 6 (side 47).

DNase I (RNFD) er meget modtageligt for fysisk denaturering. Bland kun ved

pipettering, hvor wide-bore-pipettespidser anvendes for at reducere

forskydning. Undlad at vortexe.

Sørg for kun at pipettere den påkrævede mængde, som angivet i Tabel 5.


Tabel 5. Den påkrævede mængde reagens i forarbejdningsrør til mikrocentrifugens røråbninger

Antal prøver

Reagensmængde til det angivne antal prøver (µl)

Proteinase K (PK) DNase I inkuberingsblanding Elueringsbuffer (BR5)

2 126 187 (23 DNase I + 164 Buffer RDD) 313










Tabel 6. Mikrocentrifugens røråbninger

Position

A B C

Indhold Proteinase K (PK) DNase I inkuberingsblanding Elueringsbuffer (BR5)

Ka r Forarbejdningsrør (PT)* Forarbejdningsrør (PT)* Forarbejdningsrør (PT)*

* Brug de forarbejdningsrør på 2 ml (PT), der leveres med PAXgene Blood RNA Kit.


Protokol: Manuel oprensning af total RNA fra humant fuldblod indsamlet i PAXgene Blood RNA Tubes (PBT)

Vigtige anvisninger før start

Det skal kontrolleres, at kittets æske er ubeskadiget, og at ingen af bufferbeholderne er

utætte. Beskadigede kits må ikke anvendes.

Ved brug af pipette skal det kontrolleres, at volumenet er indstillet korrekt, og at væsken

opsuges og dispenseres fuldstændigt.

For at undgå at overføre prøver til det forkerte rør eller spinsøjle, skal det sikres, at alle

rør eller spinsøjler er korrekt mærket med en vandfast tusch. Mærk låget og kroppen på

hvert rør (PR, MCT). For spinsøjler mærkes kroppen af forarbejdningsrøret (PT). Luk hvert

rør eller spinsøjle, når væske er blevet overført til den.

Spild af prøve- og buffervæsker under klargøringen kan nedsætte RNAs udbytte og

renhed.

Alle protokoltrin (inklusive centrifugeringerne) skal gennemføres ved stuetemperatur

(15-25 °C), medmindre andet er angivet.

På grund af nukleinsyre-amplifikationsmetodernes høje sensitivitet skal følgende

forholdsregler overholdes for at undgå krydskontaminering:

Prøver skal altid pipetteres i spinsøjlerne (PRC, PSC) uden at fugte søjlens rand.

Udskift altid pipettespidser mellem væskeoverførsler. Brug pipettespidser med aerosol-

barriere.

Undgå at røre ved membranen i spinsøjlen (PRC, PSC) med pipettespidsen.


Når et mikrocentrifugerør (MCT) er blandet eller opvarmet, skal det centrifugeres

kortvarigt for at fjerne dråber fra lågets inderside.

Brug handsker under hele proceduren. Skift handsker med det samme, hvis de kommer i

berøring med prøven.

Spinsøjlerne (PRC, PSC) skal lukkes, før de sættes ind i mikrocentrifugen.

Centrifugeringen skal foretages som angivet i protokollen.

Åbn kun én spinsøjle (PRC, PSC) ad gangen, og vær omhyggelig med at undgå aerosol-

dannelse.

For at opnå en effektiv parallel-forarbejdning af mange prøver anbefales det at fylde en

holder med forarbejdningsrør (PT), hvortil spinsøjlerne (PRC, PSC) kan overføres efter

centrifugering. Bortskaf de brugte forarbejdningsrør (PT) med gennemstrømningen og

placer de nye forarbejdningsrør (PT) med spinsøjlerne (PRC, PSC) direkte i

mikrocentrifugen.

Ting, der skal gøres før start

Blod skal indsamles i PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) efter anvisningerne i PAXgene

Blood RNA Tube-håndbogen. I bilag C (på side 66) findes anbefalinger vedr. håndtering

af PAXgene Blood RNA Tubes (BRT).

Efter blodprøvetagningen skal PAXgene Blood RNA Tube (BRT) inkuberes i mindst 2 timer

ved stuetemperatur for at sikre, at blodcellerne lyseres fuldstændigt. Inkubation af

PAXgene Blood RNA Tube (BRT) natten over kan føre til et øget udbytte. Hvis PAXgene

Blood RNA Tube (BRT) efter blodprøvetagningen blev opbevaret ved 2-8 °C, –20 °C eller

–70 °C, skal røret først bringes op på stuetemperatur og derefter opbevares ved

stuetemperatur i to timer, før protokollen startes.

Læs sikkerhedsinformationerne på side 10.

Læs retningslinierne for håndtering af RNA (bilag A, side 64).

Sørg for, at instrumenter, såsom pipetter og rysteinkubator, regelmæssigt kontrolleres og

kalibreres efter producentens anvisninger.


En ryster-inkubator er påkrævet i trin 5 og 20. Sæt temperaturen i rysterinkubatoren til

55 °C.

Bindingsbufferen (BR2) kan efter længere opbevaring danne bundfald. Det kan om

nødvendigt opløses ved at opvarme bufferen til 37 °C.

Vaskebuffer 2 (BR4) leveres som koncentrat. For at fremstille en brugsklar opløsning skal

der inden første brug tilsættes fire dele ethanol (96–100 %, renhedsgrad p.a.), som

angivet på flaskeetiketten.

Før den første brug af RNase-Free DNase Set skal der tilberedes en DNase I-

stamopløsning. Opløs DNase I (RNFD; 1500 Kunitz-enheder)* i 550 µl

DNaseresuspensionsbuffer (DRB), som leveres med kittet. Sørg for, at der ikke spildes

DNase I (RNFD), når hætteglasset åbnes. Den rekonstituerede DNase I (RNFD) må ikke

blandes på en vortex-mixer. DNase I er meget modtageligt for fysisk denaturering.

Blandingen bør kun foregå ved at vende røret forsigtigt.

Aktuelle data viser, at rekonstitueret DNase I (RNFD) kan opbevares ved 2-8°C i op til

6 uger. Ved længere tids opbevaring af DNase I (RNFD) skal stamopløsningen fjernes fra

glasflasken, og den skal deles op i portioner til enkelt-brug (brug mikrocentrifugerørene

[MC] på 1,5 ml, der blev leveret med kittet, der er nok til 5 portioner), og opbevares ved

–20 °C i op til 9 måneder. Optøede portioner kan opbevares ved 2-8°C i op til 6 uger.

De optøede portioner kan ikke nedfryses igen.

Ved rekonstituering og opdeling af DNase I (RNFD) skal retningslinjerne for håndtering

af RNA (bilag A, side 64) følges.

* Kunitz-enheden er den almindeligt anvendte enhed til opmåling af DNase I, defineret som den mængde DNase I som



Procedure

1. Centrifugér PAXgene Blood RNA Tube (BRT) i 10 minutter ved 3.000–5.000 x g i en

udsvingsrotor.

Sørg for, at blodprøverne i PAXgene Blood RNA Tube (BRT) blev inkuberet i

mindst 2 timer ved stuetemperatur (15–25 °C) for at opnå fuldstændig lysering

af blodcellerne.

Rotoren skal være udstyret med adaptere til rundbundede rør. Hvis der

anvendes andre typer adaptere, kan rørene blive beskadigede under

centrifugeringen.

2. Fjern supernatanten ved at dekantere eller pipettere. Tilsæt 4 ml RNase-frit vand (RNFW) til

pelletet, og luk røret med en ny sekundær BD Hemogard-sikkerhedslukning (følger med kittet).

Hvis supernatanten dekanteres, skal det sikres, at pelletet ikke forstyrres, og rørets kant

skal tørres med en ren papirserviet.

3. Opløs pelletet med en vortex-mixer, og centrifugér i 10 minutter ved 3.000–5.000 x g

med en udsvingsrotor. Fjern og bortskaf supernatanten fuldstændigt.

Små cellerester, som befinder sig i supernatanten efter vortex, men før centrifugeringen,

berører ikke proceduren.

Hvis supernatanten ikke fjernes fuldstændigt, bliver lyseringen hæmmet og

lysatet fortyndet, hvilket har en negativ indvirkning på betingelserne for

bindingen af RNA til PAXgene-membranen.

4. Tilsæt 350 µl resuspensionsbuffer (BR1), og bland på en vortex-mixer, indtil pelletet er

fuldstændigt opløst.

5. Overfør prøven med en pipette til et 1,5 ml mikrocentrifugerør (MCT). Tilsæt 300 µl

bindingsbuffer (BR2) og 40 µl proteinase K (PK). Bland i ca. 5 sekunder (vortex), og

inkuber i 10 minutter ved 55 °C i en rysteinkubator ved en hastighed fra 400–1400 rpm.

Efter inkubationen øges rysteinkubatorens temperatur til 65 °C (for trin 20).

Bland ikke bindingsbuffer (BR2) og proteinase K (PK), før de tilsættes prøven.


6. Pipettér lysatet direkte ind i PAXgene Shredder-spinsøjlen (PSC, lilla), som er anbragt i et

2 ml forarbejdningsrør (PT), og centrifugér i 3 minutter ved maksimalt omdrejningstal

(maks. 20.000 x g).

Overfør forsigtigt lysatet til spinsøjlen (PRC) med en pipette, og kontroller

visuelt, at lysatet er fuldstændigt overført til spinsøjlen (PSC).

For at undgå en eventuel beskadigelse af spinsøjlerne (PSC) og rørene (PT), må der ikke

centrifugeres ved mere end 20.000 x g.

Visse prøver kan løbe gennem PAXgene Shredder-spinsøjlen (PSC) uden

centrifugering. Dette skyldes den lave viskositet i nogle prøver, og bør ikke

opfattes som tegn på produktfejl.

7. Overfør forsigtigt hele supernatanten fra gennemstrømningsfraktionen til et nyt 1,5 ml

mikrocentrifugerør (MCT) uden at forstyrre pelletet i forarbejdningsrøret.

8. Tilsæt 350 µl ethanol (96-100 %, renhedsgrad p. a.). Bland og centrifugér kort

(1–2 sekunder ved 500–1.000 x g) for at fjerne dråber fra indersiden af rørenes låg.

Der må ikke centrifugeres længere end 1–2 sekunder, da dette eventuelt fører

til pelletering af nukleinsyrer og dermed til et reduceret udbytte af total RNA.

9. Pipettér 700 µl af prøven ind i en PAXgene RNA spinsøjle (PRC, rød), som før blev puttet

ind i en 2 ml Processing Tube (PT), og centrifugér i 1 minut ved 8000–20.000 x g.

Overfør spinsøjlerne (PRC) i en ny 2 ml Processing Tube (PT) og forkast den benyttede

Processing Tube (PT) samt gennemstrømningen.

10. Overfør resten af prøven til PAXgene RNA-spinsøjlen (PRC), og centrifugér i 1 minut ved

8.000–20.000 x g. Placer spinsøjlen (PRC) i et nyt 2 ml forarbejdningsrør (PT), og

bortskaf det gamle forarbejdningsrør (PT) med gennemstrømning.

Overfør forsigtigt prøven til spinsøjlen (PRC), og kontroller visuelt at prøven er

fuldstændigt overført til spinsøjlen (PRC).

11. Tilsæt 350 µl vaskebuffer 1 (BR3) til PAXgene RNA-spinsøjlen (PRC). Centrifugér i 1 minut

ved 8.000–20.000 x g. Placer spinsøjlen (PRC) i et nyt 2 ml forarbejdningsrør (PT), og

bortskaf det gamle forarbejdningsrør (PT) med gennemstrømning.


12. Tilsæt 10 µl DNase I (RNFD) stamopløsning til 70 µl DNA digestionsbuffer (RDD) i et

1,5 ml mikrocentrifugerør (MCT). Bland ved forsigtigt at slå med fingrene på røret og

centrifugér kort for at samle væskerester fra rørets væg.

For at forarbejde f.eks. 10 prøver tilsættes 100 µl DNase I (RNFD) stamopløsning til

700 µl DNA digestionsbuffer (RDD). Anvend de 1,5 ml mikrocentrifugerør (MCT), der

følger med kittet.

DNase I er meget modtageligt for fysisk denaturering. Opløsningen må kun

blandes ved at slå med fingrene på røret. Undlad at vortexe.

13. Pipettér DNase I (RNDF) inkubationsblandingen (80 µl) direkte på membranen i PAXgene

RNA-spinsøjlen (PRC), og lad den stå på bordet (20–30 °C) i 15 minutter.

Sørg for, at DNase I (RNFD) inkubationsblandingen kommer direkte på

membranen. Hvis en del af blandingen hænger fast på væggen eller på O-

ringen i spinsøjlen (PRC), vil DNase-digestionen muligvis være ufuldstændig.

14. Pipettér 350 µl vaskebuffer 1 (BR3) ind i PAXgene RNA-spinsøjlen (PRC) og centrifugér i

1 minut ved 8000–20.000 x g. Overfør spinsøjlen (PRC) i et nyt 2 ml forarbejdningsrør

(PT), og bortskaf det benyttede forarbejdningsrør (PT) samt gennemstrømningen.

15. Pipettér 500 µl vaskebuffer 2 (BR4) ind i PAXgene RNA-spinsøjlen (PRC) og centrifugér i

1 minut ved 8000–20.000 x g. Overfør spinsøjlen (PRC) i et nyt 2 ml forarbejdningsrør

(PT), og bortskaf det benyttede forarbejdningsrør (PT) samt gennemstrømningen.

Vaskebuffer 2 (BR4) leveres som koncentrat. Sørg for, at der tilsættes ethanol til

vaskebuffer 2 (BR4) før den første brug (se "Ting der skal gøres før start" på

side 49).

16. Tilsæt igen 500 µl vaskebuffer 2 (BR4) til PAXgene RNA-spinsøjlen (PRC). Centrifugér i

3 minutter ved 8.000–20.000 x g.

17. Bortskaf det forarbejdningsrør (PT), der indeholder gennemstrømningen, og anbring

PAXgene RNA-spinsøjlen (PRC) i et nyt 2 ml forarbejdningsrør (PT). Centrifugér i 1 minut

ved 8.000–20.000 x g.


18. Bortskaf det forarbejdningsrør (PT), der indeholder gennemstrømningen. Placer PAXgene

RNA-spinsøjlen (PRC) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør (MCT), og pipettér 40 µl

elueringsbuffer (BR5) direkte på membranen i PAXgene RNA-spinsøjlen (PRC).

Centrifugér i 1 minut ved 8.000–20.000 x g, for at eluere RNAen.

For at opnå en maksimal elueringseffektivitet er det vigtigt, at hele membranen fugtes

med elueringsbuffer (BR5).

19. Gentag elueringstrinnet (trin 18) som beskrevet, med 40 µl elueringsbuffer (BR5) og det

samme mikrocentrifugerør (MCT).

20. Inkuber eluatet i 5 minutter ved 65 °C i en rysteinkubator (se trin 5), dog uden at ryste.

Derefter køles prøverne straks med is.

Denne inkubation ved 65 °C denaturerer RNAen til downstream-applikationer.

Inkubationstiden eller –temperaturen må ikke overskrides.

21. Hvis RNA-prøverne ikke straks skal bruges, skal de opbevares ved –20 °C eller –70 °C.

Da RNAen forbliver denatureret, også efter flere ganges nedfrysning og optøning, er det

ikke nødvendigt at gentage inkubationen ved 65 °C. Hvis RNA-prøverne skal bruges til

en diagnostisk analyse, skal producentens angivelser overholdes.

For at få en nøjagtig RNA-kvantificering ved absorbering ved 260 nm, anbefaler vi, at

prøven fortyndes med 10 mM Tris·Cl, pH 7,5.* En fortynding af prøven med RNase-frit

vand kan føre til lave værdier og ringe præcision.

Nulstil spektrofotometeret med en blindprøve, der indeholder det samme forhold

elueringsbuffer (BR5) og Tris-HCl-buffer som i de prøver, der skal måles. Elueringsbufferen

(BR5) absorberer stærkt ved 220 nm, hvilket kan føre til for høje

baggrundsabsorptionsværdier, hvis spektrofotometeret ikke er korrekt nulstillet.

Bemærk: Ved kvantificering i Tris-HCl-buffer bruges forholdet

A260 = 1 ⇒ 44 µg/ml. Se bilag B, side 65.

* Der skal altid anvendes laboratoriekittel, engangshandsker og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med kemiske

stoffer. Der findes flere oplysninger i de tilhørende sikkerhedsdatablade (safety data sheets, SDS’er), som kan fås hos produktets leverandør.


Protokol: Automatisk oprensning af total RNA fra humant fuldblod indsamlet i PAXgene Blood RNA Tube (BRT)

Vigtige anvisninger før start

Det skal kontrolleres, at kittets æske er ubeskadiget, og at ingen af bufferbeholderne er

utætte. Beskadigede kits må ikke anvendes.

Ved brug af pipette skal det kontrolleres, at volumenet er indstillet korrekt og at væsken

opsuges og dispenseres fuldstændigt.

For at undgå at overføre prøver til de forkerte rør og plastikforbrugsvarer skal det sikres,

at alle forarbejdningsrør (PT), mikrocentrifugerør (MCT) og rotoradaptere er korrekt

mærket med en vandfast tusch. Mærk låget og kroppen på hvert mikrocentrifugerør

(MCT), kroppen på hvert forarbejdningsrør (PT) og den ydre væg på hver rotoradapter.

Spild af prøve- og buffervæsker under klargøringen kan nedsætte RNAs udbytte og

renhed.

Alle protokoltrin (inklusive centrifugeringerne) skal gennemføres ved stuetemperatur

(15-25 °C), medmindre andet er angivet.

På grund af nukleinsyre-amplifikationsmetodernes høje sensitivitet skal følgende

forholdsregler overholdes for at undgå krydskontaminering:

Pipettér forsigtigt prøven til forarbejdningsrøret (PT), på bunden af hvert rør uden at fugte

kanten af røret.

Udskift altid pipettespidser mellem væskeoverførsler. Brug pipettespidser med aerosol-

barriere.

Undgå at røre ved membranen i spinsøjlen (PRC, PSC) med pipettespidsen.


Når et mikrocentrifugerør (MCT) er blandet eller opvarmet, skal det centrifugeres

kortvarigt for at fjerne dråber fra lågets inderside.

Brug handsker under hele proceduren. Skift handsker med det samme, hvis de kommer i

berøring med prøven.

Ting, der skal gøres før start

Blod skal indsamles i PAXgene Blood RNA Tubes (BRT) efter anvisningerne i PAXgene

Blood RNA Tube-håndbogen. I bilag C (på side 66) findes anbefalinger vedr. håndtering

af PAXgene Blood RNA Tubes (BRT).

Efter blodprøvetagningen skal PAXgene Blood RNA Tube (BRT) inkuberes i mindst 2 timer

ved stuetemperatur for at sikre, at blodcellerne lyseres fuldstændigt. Inkubation af

PAXgene Blood RNA Tube (BRT) natten over kan føre til et øget udbytte. Hvis PAXgene

Blood RNA Tube (BRT) efter blodprøvetagningen blev opbevaret ved 2-8 °C, –20 °C eller

–70 °C, skal røret først bringes op på stuetemperatur og derefter opbevares ved

stuetemperatur i to timer, før protokollen startes.

Læs sikkerhedsinformationerne på side 10.

Læs “Vigtige bemærkninger”, side 37.

Læs retningslinierne for håndtering af RNA (bilag A, side 64).

Læs QIAcube -brugervejledningen og al yderligere information, der følger med QIAcube,

og vær ekstra opmærksom på sikkerhedsinformationen.

Sørg for, at instrumenter, såsom pipetter og QIAcube, regelmæssigt kontrolleres og

kalibreres efter producentens anvisninger.

Bindingsbufferen (BR2) kan efter længere opbevaring danne bundfald. Det kan om

nødvendigt opløses ved at opvarme bufferen til 37 °C.

Vaskebuffer 2 (BR4) leveres som koncentrat. For at fremstille en brugsklar opløsning skal

der inden første brug tilsættes fire dele ethanol (96–100 %, renhedsgrad p.a.), som

angivet på flaskeetiketten.


Før den første brug af RNase-Free DNase Set skal der tilberedes en DNase I-

stamopløsning. Opløs DNase I (RNFD; 1500 Kunitz-enheder)* i 550 µl

DNaseresuspensionsbuffer (DRB), som leveres med kittet. Sørg for, at der ikke spildes

DNase I (RNFD), når hætteglasset åbnes. Den rekonstituerede DNase I (RNFD) må ikke

blandes på en vortex-mixer. DNase I er meget modtageligt for fysisk denaturering.

Blandingen bør kun foregå ved at vende røret forsigtigt.

Aktuelle data viser, at rekonstitueret DNase I (RNFD) kan opbevares ved 2-8°C i op til

6 uger. Ved længere tids opbevaring af DNase I (RNFD) skal stamopløsningen fjernes fra

glasflasken, og den skal deles op i portioner til enkelt-brug (brug mikrocentrifugerørene

[MC] på 1,5 ml, der blev leveret med kittet, der er nok til 5 portioner), og opbevares ved

–20 °C i op til 9 måneder. Optøede portioner kan opbevares ved 2-8°C i op til 6 uger.

De optøede portioner kan ikke nedfryses igen.

Ved rekonstituering og opdeling af DNase I (RNFD) skal retningslinjerne for håndtering

af RNA (bilag A, side 64) følges.

Monter den korrekte rysteadapter (følger med QIAcube; brug adapteren til 2 ml

sikkerhedsrør, markeret med “2”), og placer rysteholderen ovenpå adapteren.

Kontroller affaldsskuffen, og tøm den hvis det er nødvendigt.

Installer protokollerne, hvis de ikke allerede er installeret ved tidligere kørsler. Installer

begge protokollerne “PAXgene Blood RNA Part A” og “PAXgene Blood RNA Part B”.

Se “Installation af protokoller på QIAcube”, side 37.

* Kunitz-enheden er den almindeligt anvendte enhed til opmåling af DNase I, defineret som den mængde DNase I som



Procedure

1. Luk døren på QIAcube, og tænd for QIAcube med strømkontakten (se figur 15, side 38).

Der lyder et bip, og opstartsskærmen vises. Instrumentet udfører automatisk opstartstest.

2. Åbn døren til QIAcube, og placer de nødvendige reagenser og plastiktilbehør i

QIAcube. Se “Opfyldning af QIAcube”, side 39.

For at spare tid kan opfyldningen udføres under en eller begge de 10 minutters

centrifugetrin (trin 3 og 5).

3. Centrifugér PAXgene Blood RNA Tube (BRT) i 10 minutter ved 3.000–5.000 x g i en

udsvingsrotor.

Sørg for, at blodprøverne i PAXgene Blood RNA Tube (BRT) blev inkuberet i

mindst 2 timer ved stuetemperatur (15–25 °C) for at opnå fuldstændig lysering

af blodcellerne.

Rotoren skal være udstyret med adaptere til rundbundede rør. Hvis der

anvendes andre typer adaptere, kan rørene blive beskadigede under

centrifugeringen.

4. Fjern supernatanten ved at dekantere eller pipettere. Tilsæt 4 ml RNase-frit vand (RNFW) til

pelletet, og luk røret med en ny sekundær BD Hemogard-sikkerhedslukning (følger med kittet).

Hvis supernatanten dekanteres, skal det sikres, at pelletet ikke forstyrres, og rørets kant

skal tørres med en ren papirserviet.

5. Opløs pelletet med en vortex-mixer, og centrifugér i 10 minutter ved 3.000–5.000 x g

med en udsvingsrotor. Fjern og bortskaf supernatanten fuldstændigt.

Små cellerester, som befinder sig i supernatanten efter vortex, men før centrifugeringen,

berører ikke proceduren.

Hvis supernatanten ikke fjernes fuldstændigt, bliver lyseringen hæmmet og

lysatet fortyndet, hvilket har en negativ indvirkning på betingelserne for

bindingen af RNA til PAXgene-membranen.

6. Tilsæt 350 µl resuspensionsbuffer (BR1), og bland på en vortex-mixer, indtil pelletet er

fuldstændigt opløst.


7. Overfør prøven med en pipette til et 2 ml forarbejdningsrør (PT).

Brug de forarbejdningsrør på 2 ml (PT), der leveres med PAXgene Blood RNA Kit.

8. Placer de åbne forarbejdningsrør (PT) med prøverne i QIAcube-rysteren (se figur 17, side 41).

Prøvepositionerne har numre, så den er nemmere at fylde. Sæt rysterholderpropper (følger

med QIAcube) i pladserne ved kanten af rysterholderen, ved siden af hvert forarbejdningsrør.

Dette tillader detektion af prøver under opfyldningskontrol.

Sørg for, at den korrekte rysteradapter (rysteradapter, 2 ml, sikkerhedsrør,

markeret med “2”, følger med QIAcube) er installeret.

Ved forarbejdning af mindre end 12 prøver skal rysterholderen fyldes som vist

i figur 21, side 45. Det er ikke muligt at forarbejde én eller 11 prøver.

9. Luk QIAcube-instrumentets dør (se figur 15, side 38).

10. Vælg protokollen “PAXgene Blood RNA Part A”, og start den.

Følg instruktionerne på QIAcube-berøringsskærmen.

Sørg for, at begge programdele (del A og del B) er installeret på QIAcube-

instrumentet (se “Installation af protokoller på QIAcube”, side 37).

QIAcube vil udføre opfyldningskontrol for prøver, spidser, rotoradaptere og

reagensflasker.

11. Når protokollen “PAXgene Blood RNA Part A” er færdig, åbnes QIAcube-instrumentets

dør (se figur 15, side 38). Fjern og bortskaf PAXgene RNA-spinsøjlerne (PRC) fra

rotoradapterne, og de tomme forarbejdningsrør (PT) fra rysteren.

Under kørslen overføres spinsøjlerne fra rotoradapterposition 1 (lågposition L1)

til rotoradapterposition 3 (lågposition L2) af instrumentet (se figur 19, side 43).

12. Luk lågene på alle 1,5 ml mikrocentrifugerør (MCT), der indeholder den oprensede RNA

i rotoradapterne (position 3, lågposition L3, se figur 19, side 43). Overfør 1,5 ml

mikrocentrifugerørene (MCT) til QIAcube rysteradapteren (se figur 17, side 41).

13. Luk QIAcube-instrumentets dør (se figur 15, side 38).

14. Vælg protokollen “PAXgene Blood RNA Part B”, og start den.


Følg instruktionerne på QIAcube-berøringsskærmen.

Dette program inkuberer prøverne ved 65 °C og denaturerer RNAen til

downstream-applikationer. Dette trin må ikke udelades, selv hvis downstream-

applikationen inkluderer et varmedenatureringstrin. Tilstrækkelig RNA-

denaturering er yderst vigtig for maksimal effektivitet ved downstream-

applikationer.

15. Når protokollen “PAXgene Blood RNA Part B” er færdig, åbnes QIAcube-instrumentets

dør (se figur 15, side 38). Placer straks mikrocentrifugerørene (MCT) med den oprensede

RNA på is.

ADVARSEL: Varm overflade. Varmesystemets temperatur kan nå op på

70 °C. Undgå berøring, når den er varm.

Efterlad ikke den oprensede RNA i QIAcube. Da prøverne ikke er afkølede,

kan den oprensede RNA nedbrydes. Ubemandede kørsler natten over kan

derfor ikke anbefales.

16. Hvis RNA-prøverne ikke straks skal bruges, skal de opbevares ved –20 °C eller –70 °C.

Da RNAen forbliver denatureret efter gentagen frysning og optøning, er det ikke

nødvendigt at gentage varmeinkuberingsprotokollen (“PAXgene Blood RNA Part B”). Hvis

RNA-prøverne skal bruges til en diagnostisk analyse, skal producentens angivelser

overholdes.

For at få en nøjagtig RNA-kvantificering ved absorbering ved 260 nm, anbefaler vi, at

prøven fortyndes i 10 mM Tris·Cl, pH 7,5.* En fortynding af prøven med RNase-frit vand

kan føre til lave værdier og ringe præcision.

Nulstil spektrofotometeret med en blindprøve, der indeholder det samme forhold

elueringsbuffer (BR5) og Tris-HCl-buffer som i de prøver, der skal måles.




Elueringsbufferen (BR5) absorberer stærkt ved 220 nm, hvilket kan føre til for høje

baggrundsabsorptionsværdier, hvis spektrofotometeret ikke er korrekt nulstillet.

Ved kvantificering i Tris-HCl-buffer bruges forholdet

A260 = 1 => 44 µg/ml. Se bilag B, side 65.

17. Fjern reagensflaskeholderen fra QIAcube arbejdsbordet (se figur 17, side 41), og luk

alle flasker med de korrekt mærkede låg. Buffer i flasker kan opbevares ved

stuetemperatur (15–25 °C) i op til 3 måneder. Fjern, og bortskaf resterende reagenser i

forarbejdningsrørene (PT) i QIAcube mikrocentrifugens røråbninger (se figur 17, side

41). Fjern, og bortskaf rotoradaptere fra centrifugen (se figur 17, side 41). Tøm QIAcube

affaldsskuffen (se figur 15, side 38). Luk QIAcube-instrumentets dør, og sluk for

instrumentet med strømkontakten (se figur 15, side 38).


Fejlfindingsvejledning

Denne fejlfindingsvejledning kan være nyttig til at afhjælpe eventuelle problemer. For yderligere information henvises også til siden "Frequently Asked Questions" (Hyppigt stillede spørgsmål) hos vores Technical Support Center: www.qiagen.com/FAQ/FAQList.aspx. Derudover svarer personalet fra QIAGENs tekniske service gerne på spørgsmål vedrørende informationen og protokollerne i denne håndbog eller prøve- og analyseteknologier (kontaktinformation: se sidste side, eller besøg www.qiagen.com).

Kommentarer og forslag

RNA er nedbrudt

RNase-kontaminering

Vær forsigtig med ikke at tilføre RNaser til reagenserne under proceduren eller ved senere håndtering (se bilag A, side 64).

Lavt RNA-udbytte

a) Mindre end 2,5 ml blod, der er indsamlet i PAXgene Blood RNA Tube (BRT)

Sørg for, at der indsamles 2,5 ml i PAXgene Blood RNA Tube (BRT; se PAXgene Blood RNA Tube-håndbog).

b) RNA-koncentrationen målt i vand

RNA skal fortyndes i 10 mM Tris-HCl, pH 7,5* for at få en nøjagtig kvantifikation (se bilag B, side 65).

c) Der blev overført cellerester til PAXgene RNA-spinsøjlen (PRC) i trin 9 og 10 af den manuelle protokol

Undgå at overføre større partikler, når supernatanten pipetteres efter trin 7 i den manuelle protokol (små cellerester indskrænker dog ikke præparationen).



http://www.qiagen.com/


Kommentarer og forslag

d) Supernatanten blev ikke fuldstændigt fjernet i trin 3

Sørg for, at supernatanten fjernes fuldstændigt. Hvis supernatanten dekanteres, skal dråber på randen af PAXgene Blood RNA Tube (BRT) fjernes ved hjælp af en papirserviet. Overhold rimelige forholdsregler for at undgå krydskontaminering.

e) Efter indsamlingen i PAXgene Blood RNA Tube (BRT) inkuberes blodet i mindre end 2 timer

Efter indsamling skal blodet inkuberes i PAXgene Blood RNA Tube (BRT) i mindst 2 timer.

Lav A260/A280-værdi

a) Vand, der bruges til at fortynde RNA til måling af A260/A280

Brug 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 til at fortynde RNA, før renheden måles* (se bilag B, side 65).

b) Spektrofotometeret er ikke korrekt nulstillet

Nulstil spektrofotometeret med en blindprøve, der indeholder det samme forhold elueringsbuffer (BR5) og 10 mMTris-HCl, pH 7,5, som i de prøver, der skal måles. Elueringsbufferen (BR5) absorberer stærkt ved 220 nm, hvilket kan føre til for høje baggrundsabsorptionsværdier, hvis spektrofotometeret ikke er korrekt nulstillet.

Fejlfunktion i instrumentet

QIAcube fungerer ikke korrekt Læs QIAcube-brugervejledningen, og vær især opmærksom på afsnittet om fejlfinding. Sørg for, at QIAcube vedligeholdes korrekt, som beskrevet i QIAcube-brugervejledningen.

* Wilfinger, W.W., Mackey, M., and Chomczynski, P. (1997) Effect of pH and ionic strength on the

spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques 22, 474.


Bilag A: Generelle bemærkninger om håndtering af RNA

Håndtering af RNA

Ribonukleaser (RNase) er meget stabile og aktive enzymer, som normalt ikke

kræver kofaktorer, for at være aktive. RNaser er svære at deaktivere og selv

små mængder er nok til at nedbryde RNA. Derfor må der ikke anvendes

laboratoriematerialer af glas eller plastik uden først at eliminere en eventuel

RNase-kontaminering. Vær meget forsigtig med ikke utilsigtet at introducere

RNaser til RNA-prøven under eller efter oprensningsproceduren. For at skabe

og bevare et RNase-fri miljø, når der arbejdes med RNA, skal visse

forholdsregler overholdes under forbehandling og brug af engangs- og

flergangsbeholdere og opløsninger.

Generel håndtering

Arbejdet med RNA skal altid følge principperne for korrekt mikrobiologisk og

aseptisk arbejdsteknik. Hænder og støvpartikler kan bære bakterier og

skimmelsvampe og leverer dermed den hyppigste årsag til RNase-

kontaminering. Derfor skal der altid bæres latex- eller vinylhandsker, når der

arbejdes med reagenser eller RNA-prøver, for at undgå RNase-kontaminering

via huden eller fra støvet laboratorieudstyr. Skift laboratoriehandskerne

hyppigt, og hold rørene lukket, når det er muligt. Lad den oprensede RNA

forblive på is, når den opdeles til downstream-applikationer.

Protokoller til fjernelse af RNase-kontaminering fra glasmaterialer og opløsninger findes i

almene molekylærbiologiske metodebøger såsom Sambrook, J. og Russell, D. W. (2001)

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring

Harbor Laboratory Press.


Bilag B: Kvantificering og kvalitetsbestemmelse for total RNA

Kvantificering af RNA

Koncentrationen af RNA kan bestemmes ved at måle absorptionen ved 260 nm (A260) i et

spektrofotometer. For at sikre signifikans bør aflæsninger være i det lineære område på

spektrofotometeret. Absorption af 1 enhed ved 260 nm svarer til 44 µg DNA pr. ml (A260 =

1 ⇒ 44 µg/ml). Denne relation er kun gyldig for målinger i 10 mM Tris-HCl, * pH 7,5. Det

er derfor nødvendigt at fortynde RNA-prøven, hvilket skal gøres i 10 mM Tris·Cl. Som oplyst

længere nede (se afsnit „renhed af RNA“ på side 66) er forholdet af absorbtionsværdierne

ved 260 nm og 280 nm en måleenhed for renheden af RNA. Sørg for, at kyvetterne, som

bruges til måling af RNA-prøverne, er RNase-frie. Nulstil spektrofotometeret med en

blindprøve, der indeholder det samme forhold elueringsbuffer (BR5) og Tris-HCl-buffer som i

de prøver, der skal måles. Elueringsbufferen (BR5) absorberer stærkt ved 220 nm, hvilket

kan føre til for høje baggrundsabsorptionsværdier, hvis spektrofotometeret ikke er korrekt

nulstillet. Nedenfor vises et eksempel på beregning af RNA-kvantificering.

Volumen af RNA-prøven = 80 µl

Fortynding (1/15) = 10 µl RNA-prøve + 140 µl 10 mM Tris-HCl, pH 7,5

Absorptionsmåling af den fortyndede prøve i en kyvette (RNase-fri).

A260 = 0,3

Koncentration af-prøve = 44 x A260 x fortyndingsfaktoren

= 44 x 0,3 x 15

= 198 µg/ml

Samlet udbytte = koncentration x prøvevolumen i milliliter

= 198 µg/ml x 0,08 ml

= 15,8 µg RNA




Renhed af RNA

Forholdet mellem læsninger ved 260 nm og 280 nm (A260/A280) anslår renheden af RNA i

forhold til urenheder, der absorberes i UV, såsom proteiner. A260/A280-forholdet påvirkes

dog meget af pH. Ved relativt lave pH-værdier er A260/A280-forholdet og sensitiviteten

reduceret over for proteinkontamination.* Det anbefales at måle absorbtionsforholdet i

10 mM Trix-HCl, pH 7,5, når der er behov for nøjagtige værdier. Ren RNA har et

A260/A280-forhold på 1,8–2,2 i 10 mM Tris-HCl, pH 7,5. Nulstil spektrofotometeret med en

blindprøve, der indeholder det samme forhold elueringsbuffer (BR5) og Tris-HCl-buffer som i

de prøver, der skal måles. Elueringsbufferen (BR5) absorberer stærkt ved 220 nm, hvilket

kan føre til for høje baggrundsabsorptionsværdier, hvis spektrofotometeret ikke er korrekt

nulstillet.

Appendiks C: Håndtering af PAXgene Blood RNA Tube

De følgende anbefalinger fra BD kan hjælpe ved håndtering af PAXgene

Blood RNA Tube (BRT). Se PAXgene Blood RNA Tube-håndbog for at læse

yderligere oplysninger om PAXgene Blood RNA Tubes (BRT).

Instruktioner til fjernelse af BD Hemogard-lukningen

1. Tag PAXgene Blood RNA Tube (BRT) med den ene hånd, og anbring tommelfingeren

direkte under BD Hemogard-lukningen. (Der kan opnås mere stabilitet, hvis underarmen

placeres på en fast overflade). Med den anden hånd drejes BD Hemogard-lukningen,

* Wilfinger, W.W., Mackey, M., and Chomczynski, P. (1997) Effect of pH and ionic strength on the

spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques 22, 474.


mens der samtidigt trykkes opad med tommelfingeren, men KUN INDTIL PROPPEN I

RØRET LØSNER SIG.

2. Fjern tommelfingeren, før lukningen fjernes. Tryk IKKE lukningen af PAXgene Blood RNA

Tube (BRT) med tommelfingeren. Advarsel: Hvis PAXgene Blood RNA Tube (BRT) indeholder

blod, kan der være en potentiel infektionsfare. For at undgå skader under fjernelse af

lukningen er det vigtigt at fjerne tommelfingeren, som lukningen trykkes op med, fra

PAXgene Blood RNA Tube (BRT), så snart BD Hemogard-lukningen har løsnet sig.

3. Løft lukningen af PAXgene Blood RNA Tube (BRT). Det er usandsynligt, at plastikkappen

kan løsne sig fra gummiproppen, men PRØV IKKE AT SAMLE LUKNINGEN IGEN, hvis

det skulle ske. Fjern gummiproppen forsigtigt fra PAXgene Blood RNA Tube (BRT).

Anvisninger for indføring af den sekundære BD Hemogard-sikkerhedslukning

1. Udskift lukningen af PAXgene Blood RNA Tube (BRT).

2. Drej og tryk nedad, indtil proppen er på plads igen. Proppen skal trykkes helt ind, for at

PAXgene Blood RNA Tube (BRT) kan håndteres sikkert.


Bestillingsinformation

Produkt Indhold Kat.-nr.

PAXgene Blood RNA Kit (50) 50 PAXgene-spinsøjler, 50 PAXgene Shredder-spinsøjler, forarbejdningsrør, RNase-fri DNase I, RNase-fri reagenser og buffere. Til anvendelse sammen med PAXgene Blood RNA Tube

762174

PAXgene Blood RNA Tubes (100) 100 rør til blodindsamling 762165

Relaterede produkter, der kan bestilles fra QIAGEN

Starter Pack, QIAcube Pakningen indeholder: reagensflaskeholdere (3); mærkningsstrips til holder (8); 200 µl filterspidser (1024); 1.000 µl filterspidser (1024); 1.000 µl filterspidser, wide-bore (1024); 30 ml reagensflasker (18); rotoradaptere (240); rotoradapterholder

990395

Filter-Tips, 1000 µl (1024) Sterile engangsfilterspidser i holder 990352

Reagent Bottles, 30 ml (6) Reagensflasker (30 ml) med låg; pakke med 6; til brug med QIAcube reagensflaskeholderen

990393

Rotor Adapters (10 x 24) Til 240 præparater: 240 engangsrotoradaptere; til brug med QIAcube

990394

Reagent Bottle Rack Holder med plads til 6 x 30 ml reagensflasker på QIAcube arbejdsbordet

990390


Rotor Adapter Holder Holder til 12 engangsrotoradaptere; til brug med QIAcube

990392

Relaterede produkter, der kan bestilles fra BD*

Blood Collection Set BD Vacutainer® Safety-Lok™ 6 Blood Collection Set: 21G, 0,75" (0,8 x 19 mm nål), 12" (305 mm) slange med luer-adapter; 50 pr. æske, 200 pr. kasse

367286

BD Vacutainer One-Use Holder Kasse, kun til 13 mm og 16 mm diameter; 1.000/kasse

364815

BD Vacutainer Plus Serum Tubes 13 x 75 mm 4,0 ml træk med rød BD Hemogard-lukning og papiretiket; 100/æske, 1.000/kasse

368975

* Disse produkter er typiske tilbehørsartikler for blodtapning, som kan anvendes sammen med PAXgene Blood RNA Tube

(BRT). Der findes mere information om dette tilbehør, inklusiv om hvordan man bestiller, på www.preanalytix.com.

For opdateret licensinformation og produktspecifikke ansvarsfraskrivelser henvises til den

aktuelle PreAnalytiX eller QIAGEN kit-håndbog eller -brugervejledning. PreAnalytiX- og

QIAGEN kit-håndbøger og -brugermanualer kan fås via www.preanalytix.com og

www.qiagen.com eller kan rekvireres fra PreAnalytiX's tekniske service.

Revisionshistorik for håndbogen

Dokument og revision Ændringer Dato

HB-0101-004, R2 Ændringer, som følger ændringer i GHS-regler, udført i hele dokumentet.

Juni 2015

HB-0101-005, R3 Ny skabelon, opdateringer af data i automatisk protokol og i præstationsdata; opdatering af sikkerhedsoplysninger, som følger ændringer i GHS-regler, ændringer i instrumentoplysninger og i erklæring om begrænsninger i produktets anvendelse.

Februar 2019


Denne side er tom med vilje.


PreAnalytiX Worldwide

PreAnalytiX-produkter forhandles af QIAGEN- og BD-virksomheder

Australia • Orders 03-9840-9800 • Fax 03-9840-9888 • Technical 1-800-243-066 Austria • Orders 0800/28-10-10 • Fax 0800/28-10-19 • Technical 0800/28-10-11 Belgium • Orders 0800-79612 • Fax 0800-79611 • Technical 0800-79556 Brazil • Orders 0800-557779 • Fax 55-11-5079-4001 • Technical 0800-557779 Canada • Orders 800-572-9613 • Fax 800-713-5951 • Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737) China • Orders 0086 21 3865 3865 • Fax 0086 21 3865 3965 • Technical 800 988 0325, 800 988 0327 Denmark • Orders 80-885945 • Fax 80-885944 • Technical 80-885942 Finland • Orders 0800-914416 • Fax 0800-914415 • Technical 0800-914413 France • Orders 01-60-920-926 • Fax 01-60-920-925 • Technical 01-60-920-930 • Offers 01-60-920-928 Germany • Orders 02103-29-12000 • Fax 02103-29-22000 • Technical 02103-29-12400 Hong Kong • Orders 800 933 965 • Fax 800 930 439 • Technical 800 930 425 Ireland • Orders 1800-555-049 • Fax 1800-555-048 • Technical 1800-555-061 Italy • Orders 02-33430411 • Fax 02-33430426 • Technical 800-787980 Japan • Telephone 03-5547-0811 • Fax 03-5547-0818 • Technical 03-5547-0811 Korea (South) • Orders 1544 7145 • Fax 1544 7146 • Technical 1544 7145 Luxembourg • Orders 8002-2076 • Fax 8002-2073 • Technical 8002-2067 Mexico • Orders 01-800-7742-639 • Fax 01-800-1122-330 • Technical 01-800-7742-639 The Netherlands • Orders 0800-0229592 • Fax 0800-0229593 • Technical 0800-0229602 Norway • Orders 800-18859 • Fax 800-18817 • Technical 800-18712 Singapore • Orders 65-67775366 • Fax 65-67785177 • Technical 65-67775366 Spain • Orders 91-630-7050 • Fax 91-630-5145 • Technical 91-630-7050 Sweden • Orders 020-790282 • Fax 020-790582 • Technical 020-798328 Switzerland • Orders 055-254-22-11 • Fax 055-254-22-13 • Technical 055-254-22-12 UK • Orders 01293-422-911 • Fax 01293-422-922 • Technical 01293-422-999 USA • Orders 800-426-8157 • Fax 800-718-2056 • Technical 800-DNA-PREP (800-362-7737)

www.qiagen.com www.PreAnalytiX.com

Argentina, Uruguay and Paraguay • Orders 011 4551 7100 Australia • Orders 1 800 656 100 • Fax 1 800 656 110 Austria • Orders 43 1 7063660 • Fax 43 1 7063660-11 Belgium • Orders 32-53720408 • Fax 32-53720558 Brazil • Orders 0800 055 5654 Canada • Orders 800-268-5430 • Fax 800-565-0897 Denmark • Orders 45 43 43-45-66 • Fax 45 43-43-41-66 East Europe, Middle East & Africa (EMA) • Orders 971 4 3379525 • Fax: 971 4 03379551 Finland • Orders 358-9-88-70-780 • Fax 358-9-88-70-7817 France • Orders 33 476 683636 • Fax 33 476 683693 Germany • Orders 49 6221305553 • Fax 49 6221305377 Italy • Orders 390248204775 • Fax 390248204817 • Technical 390248240264 The Netherlands • Orders 31 20 6545 716 • Fax 31 20 5829 421 New Zealand • Orders 0800 572 468 • Fax 0800 572 469 Spain • Orders 34-91-848-8115 • Fax 34-91-848-8104 Sweden • Orders 46 8 775 51 00 • Fax 46 8 775 51 95 Switzerland • Orders 41 61 4852222 • Fax 41 61 4852200 UK • Orders 44 1-865-781-666 • Fax 44 1-865-781-528 USA • Orders 888-237-2762 • Fax 800-847-2220 • Technical 800-631-0174

www.bd.com www.PreAnalytiX.com


1115879DK HB-0101-005 BD-8945 02/2019

februar 2019 paxgene blood rna kit-håndbog · 2019. 11. 21. · ‡ kunitz-enheden er den...

Documents