Fermentacyjne technologiewytwarzania enzymów i białek

terapeutycznych wysokiej wartości

Porównanie cech preparatów enzymatycznych o niskiej czystości, produkowanych w dużych ilościach i preparatów o wysokim stopniu oczyszczenia Enzymy do celów technologicznych, wytwarzane w dużych ilościach (bulk)

Enzymy wysokiej czystości

Niewielki koszt jednostkowy, cena kalkulowana na jednostki masy Surowe preparaty, często poniżej 10% białka Obecność innych enzymów Preparaty otrzymane w wyniku suszenia rozpyłowego lub stężone roztwory Brak stabilizatorów Niewiele etapów oczyszczania Próbki dostępne nieodpłatnie Minimalne zamówienie 1-2 kg

Wysoki koszt jednostkowy, cena kalkulowana na jednostki aktywności enzymu Wysoka czystość, często powyżej 90% Inne enzymy nieobecne, lub ich obecność określona ilościowo Liofilizaty lub zawiesiny w roztworze siarczanu amonu Obecne stabilizatory Wiele etapów oczyszczania, w tym techniki chromatograficzne Brak takich próbek Szeroki zakres dostępnych ilości (poczynając od bardzo niewielkich)

Produkcja enzymów

Warunki wytwarzania enzymu rekombinowanego

1. Producent bakteryjny– zwykle szczep E. coli zawierający plazmid kodujący enzym w wektorze z markerem oporności na antybiotyk i obszar induktorowy.

Fermentacja okresowa z zasilaniem. Wzrost początkowy w pożywce minimalnej (glukoza + ekstrakt drożdżowy + sole + antybiotyk). W fazie początkowej wzrostu dodawanie składników odżywczych w kontrolowany sposób. Źródło azotu – sole amonowe, mocznik. Po osiągnięciu fazy intensywnego wzrostu – dodanie induktora.

Proces trwający 24 – 48 h w temperaturze 24 – 28 C.Osiąga się do 50% ogólnej puli białek, z wydajnością 10 – 15 g/L

2. Alternatywni producenci – drożdże (S. cerevisiae, Pichia pastoris), grzyby – Aspergillus, Fusarium. Gen zintegrowany z chromosomalnym DNA + efektywny promotor. Pożywki z tanimi źródłami węgla i azotu. Fermentacja 4 – 8 dni. Enzymy często wydzielane poza komórkę, co obniża koszty izolacji.

Schemat technologiczny wytwarzania enzymu

Przykłady enzymów stosowanych w diagnostyce

Enzym Źródło (oryginalne) Stosowany do oznaczania----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Oksydaza cholesterolowa Nocardia erythropolis Cholesterol

lub Brevibacterium spp.Kreatynaza Pseudomonas spp. KreatynaKreatyninaza j.w. Kreatynina-galaktozydaza E. coli jony Na+, ELISAOksydaza glukozowa Aspergillus niger GlukozaDehydrogenaza Glc-6-P Leuconostoc mesenteroides Glukoza-glukozydaza S. cerevisiae aktywność -amylazyOksydaza glicerolo-3-P Aerococcus viridians TriacylogliceroleHeksokinaza S. cerevisiae GlukozaPeroksydaza Chrzan Enzym wskaźnikowy,

testy ELISAOksydaza pirogronianowa Pediococcus spp. Pirogronian, transami-

nazyOksydaza kwasu moczowego Arthrobacter protopharmiae Kwas moczowyUreaza Klebsiella aerogenes Mocznik

Białka rekombinowane terapeutyczne

Białko Leczona choroba Rok zaakceptowania------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Insulina Cukrzyca 1982Ludzki hormon wzrostu Karzełkowatość 1985Interferon alfa Wirusowe zapalenie wątroby

niektóre nowotwory 1986Szczepionka przeciwko wiru-sowemu zap. wątroby typu B Zapobieganie WZW typu B 1986Aktywator plazminogenu Zawał serca, zator naczyniowy 1987Erytropoetyna Anemia związana z niewydolnoś-

cią nerek 1989Interferon gamma Chroniczna granulomatoza 1990Czynnik stymulujący granulocyty Neutropenia, stany po przesz-

czepach szpiku 1991Czynnik krzepliwości VIII Hemofilia A 1992Interferon beta Stwardnienie rozsiane 1993DNaza Zwłóknienie torbielowate 1994Glukocerebrozydaza Choroba Gauchera 1994Czynnik krzepliwości IX Choroba Christmasa 1997Interleukina-10 Zapobieganie trombocytopenii 1997

Białka, które są glikoproteinami nie mogą być wytwarzanew komórkach bakteryjnych. Komórki grzybów wytwarzają glikoproteiny o innej budowie niż komórki ssacze.

Pierwsze białko terapeutyczne wytwarzane przez zwierzę transgeniczne

Atryn, pierwszy lek pochodzący od zmodyfikowanego genetycznie zwierzęcia został dopuszczony do użytku w Europie przez Europejską Agencję do spraw Leków (EMEA) w roku 2006. Atryn jest uzyskiwany z mleka genetycznie zmodyfikowanych kóz, które mają gen kodujący antyrombinę – białko hamujące patologiczne krzepnięcie krwi. Niedobór antytrombiny – choroba o podłożu genetycznym (1 raz na 5 tys. osób).

Jedna koza może zastąpić 90 000 ludzkich dawców krwi.

Naturacja białek z ciał inkluzyjnych

1. Liza komórek; 2. Wydzielenie ciał inkluzyjnych poprzez wirowanie; 3. Rozpuszczenie wroztworze 6-8 M mocznika (+ mieszania zredukowanego i utlenionego glutationu, w razie potrzeby); 4. Powolne usuwanie czynnika denaturującego – rozcieńczanie, dializa

Problem tworzeniaagregatów podczasfałdowania białek

Białka terapeutyczne rekombinowane I generacji

Insulina

Genentech, Eli Lilly1. Osobna ekspresja łańcuchów A i B w E. coli jako białek fuzyjnych

z syntazą tryptofanową i -galaktozydazą;2. Rozszczepienie bromocyjanem;3. Połączenie łańcuchów przez chemiczną reoksydację

NovonordiskEkspresja proinsuliny w E. coli, potem usunięcie enzymatyczne

Gensulin (BIOTON)

Konstrukcja genu: sekwencja kodująca Peptyd B-dipeptyd-Peptyd A-peptyd nośnikowy

Ekspresja w Escherichia coli Produkt: białko fuzyjne w ciałach inkluzyjnychEtapy izolacji wstępnej: rozbicie komórek, izolacja ciał inkluzyjnych, naturacjaPółprodukt: prekursor z mostkami disiarczkowymiObróbka: rozcięcie hydrolityczne – oddzielenie peptydu nośnikowego oraz przecięcie wiązania peptydowego pomiędzy dipeptydem a peptydem AOczyszczanie: chromatografia kolumnowaDalsza obróbka: usunięcie dipeptydu przy użyciu karboksypeptydazyProdukt: insulina identyczna z ludzką, o czystości około 95%Dalsze oczyszczanie: HPLC, ekstrakcja, krystalizacjaProdukt: insulina identyczna z ludzką, o czystości ponad 99,9%

Białka terapeutyczne rekombinowane I generacji