TUGAS KELOMPOK BIOKIMIA

“FERMENTASI ENZIM AMILASE DARI BACILUS

Sp.PADA SUBSTRAT TAPIOKA”

Anggota Kelompok :

Freddy Manullang 1407123875

Mahatir Nur Muhammad 1407119411

Sunitha Sari 1407112646

Dosen Pengampu :

Prof. Dr. H. Adrianto Achmad, MT.

Program Studi Sarjana Teknik Kimia

Fakultas Teknik Universitas Riau

Pekanbaru

2015

Abstrak

Dalam penelitian ini digunakan isolat bakteri termofilik yang diisolasi dari sumber air

panasMakula Tana Toraja. Isolasi enzim dilakukan setelah bakteri tersebut diaktifkan dan

dikulturdalam medium yang mengandung pati pada suhu 50oC, pH 7 selama 72 jam.Enzim

amilase ekstraseluler yang diperoleh memiliki keaktifan optimum pada suhu 35oC dan pH 6,4.

Enzim inimerupakan enzim amilase logam karena keajtifan katalitiknya dapat ditingkatkan oleh

ion logam,seperti Co2+, Mg2+, Ni2+, and Ca2+ sehingga bersifat aktivator untuk ion Zn2+.

Menurunkan aktivitas enzim dan bersifat inhibitor.Ekstrak kasar enzim amilase hasil isolasi

dapatmenghidrolisis masing-masing substrat yaitu pati sagu, pati singkong dan pati jagung

sebesar 92,36 %, 83,15 % dan 61,57 %. Aktivitas spesifik enzim amilase pada kondisi optimum

diperoleh 0.00142 U/mg protein.

Kata kunci:  Bacillus subtillis, enzim amilase, karakteristik,substrat, termofilik

Abstract

In this research, the thermophilic bacterium Bacillus subtilis isolates were isolated from a

hotspring Makula Tana Toraja. Enzyme isolation performed after the bacteria activated and

culturedin medium containing starch at a temperature of 50oC, pH 7,0 for 72 hours.

Extracellularamylase enzyme obtained has optimum activity at a temperature of 35oC and pH

6,4. Thisenzyme is an metal amylase because of the catalytic activity can be enhanced by ions

Co2+, Mg2+, Ni2+, and Ca2+so these metal ions are activators and inhibited by Zn2+and metal

ions areinhibitors. Crude extract of the isolated amilase enzyme could hydrolyze each

substrates thatsago starch, cassava starch and corn starch are respectively 92.36%, 83.15%

and 61.57%. Thespecific activity at the optimum condition obtained 0.00142 U/mg protein.

Keywords :Bacillus subtillis, amylase enzyme, characteristic, subsrate, thermophilic

BAB I

PENDAIIULUAN

1.1. LatarBelakang

Enzim merupakan molekul protein yang dihasilkan oleh sel hidup dandigunakan oleh

sel-sel tersebut untuk mengkatalis reaski biokimia secara spesifik. Sebagai katalisator biologis

enzim mampu melakukan perubahan-perubahansesuai dengan spesifikarsi dan kondisi substrat

yang akan dirombaknya. Dalamrelakukan aktivitas enzim akan bekerja secara maksimum

apabila kondisi prosesberlangsung secara optinum antara lain, konsentrasi substrat, pH reaksi,

suhu danlain-lain. Dewasa ini enzim sudah banyak dimanfaatkan untuk berbagai

keperluankomersial di dalam industri, karena efisinsi kerja yang tinggi dan dapat dihasilkandari

berbagai sumber dengan biaya yang lebih rendah karena dapat diproduksidalam wakfu cepat

dan jumlah yang dapat dikendalikan.

Enzim amilase merupakan enzim yang dapat menghidrolisis makromlekul karbohidrat

almilum menjadi produk yang lebih sederhana dan dapatdimanfaatkan untuk berbagai keperluan

misalnya dapat menghidrolisis sumber pati / amilum menjadi bentuk yang lebih sederhana

seperti glukosa. Sehinggaenzim ini banyak digunakan untuk menghasilkan high glukosa atau

fruktosa syrup ataudalam berbagai industri alkohol dan lain-lain.

Sejak tahun 70'an, Lembaga Ilmu Pengetahuan lndonesia (LIPI) telahmenyadari, bahwa

enzim akan memegang peranan penting dalam industri. Enzim adalah protein tidak beracun

namun mampu mempercepat laju reaksi kimia dalam suhu dan derajat keasaman yang rendah.

Produk yang dihasilkannya sangatspesifik sehingga dapat diperhitungkan dengan mudah. Enzim

menjadi primadonaindustri saat ini dan di masa yang akan datang karena melalui

penggunaannya,energi dapat dihemat dan akrab dengan lingkungan. Saat ini penggunaan enzim

dalam industri makanan dan minuman, industri tekstil, industri kulit dan kertas dilndonesia

semangkin rneningkat. Dilaporkan, enzim amilase yang digunakandalam industri tekstil di

Bandung, jumlahnya tidak kurang dari 4 ton per bulanatau sekitar 2 -3 juta dolar Amerika setiap

bulannya dan semuanya diimpor.

Untuk menghasilkan enzim-enzim dengan spesifikasi tertentu dapatdiproduksi dari

berbagai sumber. Salah satu sumber enzim yang banyakdieksplorasi adalah yang berasal dari

mikroba. Penggunaan mikroba ini banyakdiusahakan karena mempunyai keunggulan kompetitif

yaitu dapat diproduksidalam waktu yang cepat dan dapat dikendalikan produksinya sesuai

keperluan.Misalnya untuk menghasilkan enzim amilase dapat berasal dari golongan Bacillusdan

Aspergillus, seperti Bacillus substillis, B. amyloliquefaciens serta Aspergillusniger dan Asper

gillus orizae.

Bacillus amyloliquefaciens dapat menghasilkan berbagai macam enzimseperti alfa

amilase, selulase, hemiselulase, protease, urease, xylanase, dankhitinase (Wizna 2007).

B.amyloliquefaciens ini telah ditemukan oleh Wizna (2007) dari sarasaft, narmun proses

produksi serta kinerja optimum enzim yangdihasilkan belum dikenalidengan menggunakan

substrat pati.

1.2 Perumusan Masalah

1. Bagaimana kondisi optimum produksi amilase dengan fermentasi amilum olehBacillus

2. Bagaimanakah kondisi pH optimum, suhu, waktu inkubasi dan konsentrasisubstrat

optimum dari enzim amilase yang dihasilkan Bacilluspada substrat tapioka.

3. Apakah Bacillus menghasilkan enzim selulase dan xylanasedidalam substrat tapioka.

1.3 Tujuan Pembahasan

Mempelajari dan memahami proses fermentasi enzim amilase dari Bacillus

amyloliquefacienspada substrat tapioka.

BAB II

TEORI DASAR

Enzim adalah molekul biopolimer yang tersusun dari serangkaian asam amino dalam

komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Enzim memegang peranan penting dalam

berbagai reaksi di dalam sel. Sebagai protein, enzim diproduksi dan digunakan oleh sel hidup

untuk mengkatalisis reaksi, antara lain konversi energi dan metabolisme pertahanan sel.

Amilase mempunyai kemampuan untuk memecah molekul-molekul pati dan glikogen Molekul

pati yang merupakan polimer dari alfa-D-glikopiranosa akan dipecah oleh enzim pada ikatan

alfa-1,4- dan alfa-l,6-glikosida.

Amilase merupakan enzim yang paling penting dan keberadaanya paling besar, pada

bidang bioteknologi, enzim ini diperjual belikan sebanyak 25% dari total enzim yang lainya.

Amilase didapatkan dari berbagai macam sumber, seperti tanaman, hewan dan mikroorganisme.

Amilase yang berasal dari mikroorganisme banyak digunakan dalam industri, hal ini

dikarenakan mikroorganisme periode pertumbuhanya pendek. Amilase pertama kali yang

diproduksi adalah amilase yang berasal dari fungi pada tahun 1894.

Enzim alfa-amilase merupakan enzim yang banyak digunakan pada berbagai macam

makanan, minuman dan industri tekstil. Alfa amilase ekstra seluler dihasilkan dari beberapa

bakteri, diantaranya adalah Bacillus coagulans, B. stearothermophilus dan B. Licheniformis.

Amilase adalah enzim yang paling penting dan signifikan dalam bidang bioteknologi, industri

enzim amylase merupakan kelas industri yang memiliki kurang lebih 25% pasar enzim dunia.

Enzim tersebut dapat diperoleh dari bermacam-macam sumber, seperti tumbuhan, binatang, dan

mikroorganisme. Sekarang banyak mikrobia penghasil amylase yang tersedia secara komersial

dan mikrobia tersebut hampir seluruhnya menggantikan hidrolisis kimia pati pada industri

produksi pati.

Amilase yang dihasilkan mikroorganisme mempunyai spektrum yang luas pada aplikasi

industri karena lebih stabil daripada-amilase yang dihasilkan oleh tumbuhan dan binatang.

Keuntungan utama dalam penggunaan mikroorganisme pada produksi amilase adalah kapasitas

produksi yang besar dan fakta bahwa mikrobia mudah dimanipulasi untuk menghasilkan enzim

dengan karakteristik yang di inginkan.-amilase diperoleh dari bermacam-macam jamur, yeast

dan bakteri. Meskipun demikian, enzim dari sumber jamur dan bakteri mendominasi aplikasi

dalam sektor industri. amilase mempunyai kemampuan aplikasi yang luas dalam proses industry

seperti makanan, fermentasi, tekstil, kertas, deterjen, dan industri farmasi. Amilase dari jamur

dan bakteri dapat digunakan dalam industri farmasi dan kimia. Meskipun demikian, dengan

perkembangan bioteknologi, aplikasi amilase berkembang di banyak bidang, seperti kesehatan,

obat-obatan, dan analisis kimia, seperti aplikasi dalam sakarifikasi pati pada tekstil, makanan,

brewing, dan industri distilasi.

2.1 Biokimia Enzim Amilase

Amylase Pencernaan makanan secara kimiawi terjadi dengan bantuan zat kimia tertentu.

Enzim pencernaan merupakan zat kimia yang berfungsi memecahkan molekul bahan makanan

yang kompleks dan besar menjadi molekul yang lebih sederhana dan kecil. Molekul yang

sederhana ini memungkinkan darah dan cairan getah bening (limfe) mengangkut ke seluruh sel

yang membutuhkan.

2.2 Macam-macam Enzim Amilase

Secara umum, amilase dibedakan menjadi tiga berdasarkan hasil pemecahan dan letak

ikatan yang dipecah, yaitu alfa-amilase, beta-amilase, dan glukoamilase. Enzim alfa-amilase

merupakan endoenzim yang memotong ikatan alfa-1,4 amilosa dan amilopektin dengan cepat

pada larutan pati kental yang telah mengalami gelatinisasi. Proses ini juga dikenal dengan nama

proses likuifikasi pati. Produk akhir yang dihasilkan dari aktivitasnya adalah dekstrin beserta

sejumlah kecil glukosa dan maltosa. Alfa-amilase akan menghidrolisis ikatan alfa-1-4 glikosida

pada polisakarida dengan hasil degradasi secara acak di bagian tengah atau bagian dalam

molekul. Enzim beta-amilase atau disebut juga alfa-l,4-glukanmaltohidrolas E.C. 3.2.1.2.

bekerja pada ikatan alfa-1,4-glikosida dengan menginversi konfigurasi posisi atom C(l) atau C

nomor 1 molekul glukosa dari alfa menjadi beta. Enzim ini memutus ikatan amilosa maupun

amilopektin dari luar molekul dan menghasilkan unit-unit maltosa dari ujung nonpe-reduksi

pada rantai polisakarida. Bila tiba pada ikatan alfa-1,6 glikosida aktivitas enzim ini akan

berhenti. Glukoamilase dikenal dengan nama lain alfa-1,4- glukan glukohidro-lase atau EC

3.2.1.3. Enzim ini menghidrolisis ikatan glukosida alfa-1,4, tetapi hasilnya beta-glukosa yang

mempunyai konfigurasi berlawanan dengan hasil hidrolisis oleh enzim a-amilase. Selain itu,

enzim ini dapat pula menghidrolisis ikatan glikosida alfa-1,6 dan alfa-1,3 tetapi dengan laju

yang lebih lambat dibandingkan dengan hidrolisis ikatan glikosida a-1,4.

Sumber enzim a-amilase sangat beragam mulai dari tanaman, jaringan mamalia bahkan

mikroorganisme. Enzim a-amilase dari malt merupakan salah satu contoh jenis yang dihasilkan

dari tanaman, dari mamalia enzim ini dapat dihasilkan dari ludah dan pankreas. Sumber a-

amilase yang paling potensial adalah mikroorganisme yang telah banyak digunakan dalam

bidang industri. Enzim ini mempunyai 2 golongan, yaitu termostabil yang tahan pada suhu

tinggi dantermolabil pada suhu tinggi. Endoamilase tahan panas biasanya berasal dari bakteri,

sedangkan yang tidak tahan panas berasal dari kapang.

Enzim a-amilase yang berasal dari bakteri (bacterial a-amilase) merupakan endoenzim

yang memotong ikatan a-1,4 amilosa dan amilopektin dengan cepat pada larutan pati kental

yang telah mengalami gelatinasi. Proses ini juga dikenal dengan proses likuifikasi pati. Produk

akhir yang dihasilkan dari aktivitasnya adalah dekstrin beserta sejumlah kecil glukosa dan

maltosa. Enzim a-amilase dapat diperoleh dari Bacillus licheniformis dan Bacillus subtilis yang

telah luas digunakan dalam proses hidrolisis (likuifikasi) secara komersial oleh karena

ketahanannya terhadap panas hingga 90°C bahkan ada yang mencapai 100°.

Enzim a-amilase yang berasal dari kapang (fungal a-amilase) dapat diperoleh dari

Aspergillus niger dan Aspergillus oryzac. Enzim ini sangat berbeda dari Bacterial a-amilase

karena jenis ini memiliki suhu deaktivasi yang rendah, aksi sakarifikasi yang tinggi serta nilai

pH optimum yang rendah (pH 4 – 5). Enzim ini banyak digunakan dalam industri roti serta

industri sirup maltosa dimana pH rendah dibutuhkan untuk mendegradasi pati. Enzim a-amilase

yang termolabil dari kapang digunakan dalam proses sakarifikasi. Enzim ini mempunyai nama

laina-1,4 glukan-glukanohidrolase atau EC 3.2.1.1.

Enzim a-amilase stabil pada kisaran pH 5,5 – 8,0. Aktivitas a-amilase ditentukan

dengan mengukur hasil degradasi pati yang diamati dari penurunan kadar pati larut, kadar

maltosa atau mengukur viskositas dan jumlah terbentuknya gula pereduksi pada aktivitas

optimumnya secara normal yaitu pH 4,8 – 6,5.

Menurut Comission on Enzymes of The International Union Biochemistry, unit enzim

adalah jumlah enzim yang mengkatalis pembentukan satu mikromol produk per menit dibawah

kondisi tertentu. Enzim tidak murni dapat pula dinyatakan dalam unit per mililiter. Maka dapat

dikatakan bahwa satu unit enzim a amilase adalah satu mikromol a/b maltosa yang terbentuk per

menit pada suhu dan pH aktivitasnya.

a. Alfa amilase (α-amilase)

Enzim α-amilase (α-1,4 glukan-4-glukan hidrolase) terdapat pada tanaman,jaringan

mamalia, dan mikroba. α-amilase murni dapat diperoleh dari berbagaisumber, misalnya dari

malt (barley), ludah manusia, pankreas serta dapat jugadiisolasi dari Aspergillus oryzae dan

Bacillus subtilis. Isolasi dan pemurnianenzim dilakukan berdasar fraksinasi dengan garam, juga

dengan penggunaanpanas selektif (biasanya 70 °C, selama 15 menit). Aktivitas α-amilase

ditentukandengan mengukur hasil degradasi pati yang biasanya dari penurunan kadar pati

yang larut atau dari kadar dekstrinnya dengan menggunakan substrat jenuh α-amilase mampu

menghidrolisis pati dan glikogen melalui pemotongan internal ikatan α-1,4-glikosida secara

acak, menghasilkan oligosakarida seperti maltosa, glukosa, dan α-dekstrin. Enzim α-amilase

merupakan enzim yang penting dan dimanfaatkan secara luas dalam dunia industri seperti

industri pangan, fermentasi, tekstil, kertas, obat-obatan, dan gula.

Pemanfaatan enzim ini pada skala industri lebih dititikberatkan padapeningkatan

produksi dan efisiensi prosesnya. α-amilase termostabil dipandanglebih penting dalam

aplikasinya dibidang industri dibandingkan jenis α-amilaseyang tidak tahan suhu tinggi.

Termostabilitas α-amilase biasanya disesuaikandengan pemanfaatannya, sebagai contoh α-

amilase termolabil dapat digunakanpada proses sakarifikasi pati, sedangkan α-amilase

termostabil lebih sesuaidigunakan dalam likuifikasi pati. Berbagai mikrobayang mampu

menghasilkan α-amilase berhasil diisolasi dan dimurnikan, seperti B. stearothermophilus,

Streptococcus bovis JB1 dan Lactobacillus plantarum.

Gambar 2.1. Struktur Kimia α-amilase, β-amilase dan glukoamilase

b. Beta amilase (β-amilase)

β-amilase (β-1,4 glukan maltohidrolase) terdapat pada berbagai hasiltanaman, tetapi

tidak terdapat pada mamalia, dan mikroba. Secara murni telahdapat diisolasi dari kecambah

barley, ubi jalar, dan kacang kedelai. Enzim β-amilase memecah ikatan glukosida β-1,4 pada

pati dan glikogen dengan membalikkonfigurasi karbon anomeri glukosa dari α menjadi β.

Enzim β-amilase aktif pada pH 5,0-6,0.

Sejumlah mikroorganisme juga menghasilkan amilase untuk mendegradasipati

ekstraseluler. Pada jaringan hewan tidak memiliki β-amilase, kecuali apabilamikroorganisme

terdapat dalam saluran pencernaanya.

c. Gamma amilase (γ-amilase)

Gamma amilase mempunyai nama lain, yaitu glukan 1,4-α-glukosidase,1,4-α-D-glukan

glukohidrolase, exo-1,4-α-glukosidase, glukoamilase,amiloglukosidase, lisosomal α-

glukosidase. Pemutusan ikatan akhir α(1-4)glikosida pada ujung non reduksi dari amilosa dan

amilopektin, untukmenghasilkan unit glukosa, γ-amilase sangat efisien pada lingkungan

yangbersifat asam dan bekerja pada pH optimum 3.

Terdapat 3 macam subunit enzim amilase untuk memecah amilum, yaitu:

a. Endoamilase

Endoamilase adalah α-amilase yang memecahkan ikatan α-1,4-glikosidapada amilosa

dan amilopektin untuk menghasilkan oligosakarida dengan panjangrantai yang bermacam-

macam dan konfigurasi α pada unit pereduksi glukosa C1.α-Amilase yang termostabil

digunakan pada cairan yang bersuhu tinggi. Enzimdari Bacillus amyloliquefaciens mempunyai

suhu optimum 70 °C, dibandingkandengan 92 °C untuk enzim yang diisolasi dari Bacillus

licheniformis.

b. Eksoamilase

Eksoamilase memecah ikatan α-1,4-glikosida. Eksoamilase glukogenikjuga mampu

menghidrolisis ikatan α-1,6-glukosida pada oligosakarida yangbercabang, sedang eksoamilase

maltogenik (misalnya β-amilase padi-padian)tidak mampu melewati titik-titik percabangan.

Pengambilan produk molekulrendah, berturut-turut seperti misalnya glukosa dan maltose dari

ujung polimerpati yang tidak dapat direduksi menyebabkan secara perlahan-lahan turunnya

viskositas dan produk yang demikian itu memiliki konfigurasi-β pada C1 glukosa tereduksi.

c. Enzim penghilang cabang

Glukoamilase merupakan enzim yang memiliki kekhususan yang rendah,menghidrolisis

ikatan α-1,3 dan α-1,6 pada laju lebih rendah daripada α-1,4.Enzim ini mampu mengadakan

polimerisasi glukosa menjadi maltosa danisomaltosa, tetapi proses pembentukan gula tidak

pernah mencapai keseimbangan,dengan demikian reaksi ini tidak tampak nyata. Pengaruh enzim

glukoamilasemenyebabkan posisi α dapat diubah menjadi β, pH optimal 4-5, dan suhu optimal

50-60 °C. Enzim ini secara industri dipakai pada produksisirup jagung dan glukosa.

8. Enzim Amilase dari Mikroorganisme Termofilik

Amilase merupakan enzim yang paling penting dan keberadaanya palingbesar pada

bidang bioteknologi, enzim ini diperjualbelikan sebanyak 25% daritotal enzim yang lainya.

Amilase didapatkan dari berbagai macam sumber, sepertitanaman, hewan, dan mikroorganisme.

Amilase yang berasal dari mikroorganismebanyak digunakan dalam industri, hal ini

dikarenakan dapat menekan biayaproduksi, mengurangi risiko terjadinya kontaminasi,

meningkatkan difusi masa,meningkatkan produktivitas, dan mempengaruhi daya larut saat

pencampuransenyawa organik. Amilase pertama kali diproduksiadalah amilase yang berasal

dari fungi pada tahun 1894. Enzimamilase dari bakteri mempunyai keunggulan dibanding enzim

amilase daritumbuhan, yaitu kestabilannya pada suhu yang tinggi, dan mudah untuk

diproduksi dalam jumlah yang banyak.

Enzim amilase yang dihasilkan oleh mikroba tertentu dari bakterimerupakan jenis

enzim ekstraseluler. Bakteri menghasilkan enzim amilase didalam sel dan menggunakannya di

luar sel, yaitu untuk menghidrolisis nutrisiyang mengandung amilum di lingkungannya. Ukuran

molekul amilum yangsangat besar menyebabkan tidak dapat masuk ke dalam sel bakteri, karena

halitulah molekul amilum dihidrolisis terlebih dahulu oleh enzim amilaseekstraseluler menjadi

molekul karbohidrat sederhana dengan ukuran molekul kecilyang selanjutnya digunakan

sebagai sumber karbon bagi aktivitas pertumbuhandan kehidupannya. Enzim

amilaseekstraseluler dapat diperoleh dari mikroba yang memproduksinya dengansentrifugasi

untuk mendapatkan supernatan yang mengandung enzim amilaseekstraselluler.

Enzim yang bersal dari mikroorganisme termofilik mempunyai nilaikomersial yang

cukup tinggi dalam bidang industri karena daya termostabilitasnyayang tinggi, stabil terhadap

zat-zat yang bersifat mendenaturasi enzim sepertidetergen dan senyawa organik lainnya, stabil

dalam kondisi lingkungan yangasam maupun alkalis, sangat cocok untuk proses fermentasi

dibidang industri.Konsep mengenai termostabilitas yang dimiliki oleh enzim yang berasal dari

mikroorganisme termofil didasarkan pada struktur molekular pada selnya yang tersusun dari

molekul protein termostabil dan asosiasi senyawa protein enzim dengan molekul lainnya seperti

lipid, polisakarida, maupun protein lainnya yang menyebabkan terbentuknya suatu senyawa

yang mempunyai mekanisme yang memungkinkan tetap stabilnya ketika menghadapi kondisi

yang dapatmenginaktivasinya.

Amilase termostabil digunakan dalam skala yang cukup luas dalam prosesindustri.

Enzim amilase yang digunakan tersebut berkisar pada α-amilase, β-amilase, glukoamilase,

pululanase dan jenis lainnya. Kesemuajenis enzim amilase dari mikroorganisme termofilik

mempunyai nilai aplikasikomersial paling tinggi dalam bidang industri makanan, minuman,

pembuatansirup yang mengandung glukosa, maltosa maupun oligosakarida.Berbagai mikroba

yang mampu menghasilkan α-amilase berhasil diisolasidan dimurnikan, seperti B.

Stearothermophilus. Streptococcus bovis JB1 dan Lactobacillus plantarum. Pemurnian dan

karakterisasi α-amilase dari beberapa mikroba jenis Bacillus sp.ataupun B. subtilis juga telah

dilakukan. Penelitian terhadap mikroorganisme termofilik penghasil enzim amilasetermostabil

pada akhir-akhir ini telah diarahkan bukan hanya yang bersifat termofil tetapi juga hipertermofil

(mampu hidup di atas suhu 80 °C) sepertiamilase yang diketahui terdapat pada Pyrococcus

furiosus, Pyrococcus woeseiyang memiliki aktifitas sampai suhu 130 °C. Padaumumnya

mikroorganisme termofil ditemukan di sumber-sumber air panas,daerah aktif gunung berapi dan

di dasar laut yang mempunyai sumber mata airpanas.

2.3 Sifat dan Fungsi Enzim Amilase

Enzim amylase yang berfungsi untuk mengubah karbohidrat menjadi gula sederhana.

Enzim amylase juga berfungsi untuk mengubah tepung menjadi gula. Secara umum enzim

memiliki sifat :

Bekerja pada substrat tertentu.

Memerlukan suhu tertentu.

Keasaman (pH) tertentu pula.

Suatu enzim tidak dapat bekerja pada substrat lain. Molekul enzim juga akan rusak oleh

suhu yang terlalu rendah atau terlalu tinggi. Demikian pula enzim yang bekerja pada keadaan

asam tidak akan bekerja pada suasana basa dan sebaliknya. pada suhu tinggi aktivitasnya tinggi

tetapi kemantapan enzyme rendah. Suhu yang yang membuat aktivitas dan kemantaban suatu

enzyme tinggi maka disebut suhu optimum.Jumlah hasil reaksi juga akan mempengaruhi

aktivitas enzim.

Telah disebutkan beberapa factor yang mempengaruhi aktivitas enzim salah satunya

suhu dan pH. Sehubungan dengan pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim, maka semakin

meningkat suhu, aktivitas enzim akan semakin meningkat. Pada pemanasan tinggi enzim yang

merupakan suatu protein akan mengalami denaturasi protein sehingga aktivitas kerjanya

menjadi nol. Pada umumnya reaksi kima dengan naiknya suhu 10 derajat Celcius maka akan

meningkatkan kecepatan reaksi sebesar 2 kali. Hal ini akan berlaku pada enzyme dengan suhu

maksimum hingga 35 derajat Celcius. Jika lebih dari suhu tersebut enzim akan mengalami

denaturasi sehingga merusak fungsi katalisatonya. Umumnya enzim mulai kehilangan sifat

katalisatornya pada suhu 35 derajat Celcius dan berakhir pada suhu 60 derajat Celcius.

Oleh sebab itu perlu diketahui nilai suhu dan pH optimum dari enzim amylase yang ada

pada air liur. Agar diketahui seberapa besar efek hidrolisis maka diperlukan blanko sebagai

pembanding. Blanko ini berisi seperti tabung pengujian yang membedakan hanyalah

penambahan air liur. Amilum akan membentuk kompleks dengan Iodium hingga menghasilkan

larutan berwarna biru. Warna ini dapat di pakai dalam pengukuran absorbansi yang sebanding

dengan kosentrasi amilum. Semakin besar nilai absorbsinya maka semakin besar kosentrasi

amilum yang belum terhidrolisis.Untuk mengetahui besarnya hasil hidrolisis maka nilai A uji

dikurangi dengan nilai A blanko sehingga di peroleh A yang artinya semakin besar nilai A maka

semakin besar pula amilum yang telah terhidrolisis.

Sehingga jika di buatkan sebuah kurva hubungan antara suhu dan pH ,akan diperoleh

nilai pH dan suhu optimum yang dipakai oleh enzyme. Enzim amilase adalah salah satu enzim

yang mampu dihasilkan oleh jamur dan jamur yang menghasilkan enzim tersebut biasanya

disebut jamur amilolitik. Dari beberapa penelitian yang telah dilakukan, jamur yang mampu

menghasilkan enzim amilase berasal dari genus Penicillium, Cephalosporium, Mucor,

Neurospora, Aspergillus dan Rhizopus.

2.4 Substrat dan Kondisi Untuk Sintesis Enzim Amilase

Sejumlah sumber karbon yang diuji dan ditelitinya, maltosa merupakan substrat yang

terbaik untuk produksi protein dan amilase. Umumnya tepung gandum dan tepung jagung juga

merupakan sumber karbon yang bagus untuk amilase rizhobia.

Produksi amilase, penambahan kalsium (10 mM) atau pepton 1% pada ekstrak yeast

pada mediun mineral, akan memperpendek periode lag dan menambah pertumbuhan dan

sintesis amilase. Penambahan glukosa pada kultur mengurangi dari sintesis a-amilase, hal ini

bisa disebabkan karena glukosa mempengaruhi kegiatan bakteri ini. Suhu optimum pada sintesis

amilase adalah sekitar 500 C dan pH optimum untuk sintesis amilase sekitar 7,0. Ekstrak enzim

dipertahankan aktivitasnya 100% ketika diinkubasi selama 1 jam pada suhu 90o C dan 40% pada

suhu 60o C selama 24 jam.

Komposisi dan konsentrasi media sangat mempengaruhi produksi dari enzim amilase

ekstraseluler pada bakteri, yeast, dan Aspergillus sp. Komposisi medium sangat mempengaruhi

produksi amilase, seperti halnya sporulasi pada Bacillus cereus. Keberadaan pati akan

menginduksi produksi amilase. Keadaan lingkungan dan sumber nitrogen pada media kultur

juga akan mempengaruhi pertumbuhan produksi amilase. Disamping karbon dan nitrogen,

sodium dan garam potassium, ion metal, dan detergen juga akan mempengaruhi produksi

amilase dan pertumbuhan mikroorganisme.

Gambar 2.2 reaksi subtrat dengan enzim

Dari hasil uji aktivitas selulase dan xylanase pada substrat tapioka, ternyata Bacillus

amylcliquefaciens juga dapat menghasilkan enzim selulase dan xylanase dengan nilai aktivitas

0,016 Unit/ml dan aktivitas spesifik 0,0066 UniVmg protein untuk selulase sefiaA,0229 Unit/ml

dan 0,00141 Unit/mg protein untuk xylanase.

2.5 Manfaat Enzim Amylase

Enzim amylase banyak digunakan sebagai industri gula cair, makanan, industri tekstil,

dan industri farmasi .Enzim ini juga banyak digunakan pada industri minuman misalnya

pembuatan High Fructose Syrup (HFS) maupun pada industri tekstil, sebagai food additive

untuk memperbaiki tekstur bahan makanan.Penambahan enzim alfa-amilase dalam bentuk

tepung malt atau tepung enzim hasil kerja mikroorganisme dapat meningkatkan kemampuan

menghidrolisa pati yang dikandung dalam tepung terigu, dengan demikian khamir yang tumbuh

pada pembuatan adonan mendapat energi yang cukup sehingga pembentukan karbon dioksida

optimal dan pengembangan adonan menjadi optimal amilase untuk produksi energi alternatif

bioetanol, membantu metabolism karbohidrat.

2.6 Aktivator dan Inhibitor

Aktivator merupakan molekul yang mempermudah ikatan antara enzimdengan

substratnya, misalnya ion klorida yang bekerja pada enzimamilase. Inhibitor merupakan suatu

molekul yang menghambat ikatan enzimdengan substratnya. Inhibitor akan berikatan dengan

enzim membentuk kompleksenzim-inhibitor baik pada sisi aktif enzim maupun bagian lain dari

sisi aktifenzim. Keberadaan inhibitor akan menurunkan kecepatan reaksi enzimatis.

Terbentuknya komplek enzim inhibitor akan menurunkan aktivitas enzim terhadap

substratnya. Aktivitas enzim juga terdapat pada berbagai sumber mikroorganismeseperti bakteri

dan jamur. Mikroorganisme ini menghasilkan enzim intraselulerdan enzim ekstraseluler. Enzim

intraseluler merupakan enzim yang berfungsi didalam sel yaitu mensintesis bahan selular dan

juga menguraikan nutrien untukmenyediakan energi yang dibutuhkan sel. Enzim ekstraseluler

merupakan enzimyang dilepas dari sel ke lingkungan untuk menghidrolisis molekul polimer di

lingkungan, seperti selulosa, hemiselulosa, lignin, ataupun juga untukmemfasilitasi pengambilan

suatu zat dari lingkungan bagi kebutuhan metabolismenya. Enzim ekstraseluler

dapat dipisahkan dari lingkungan dengan filtrasi ataupun sentrifugasi, sedangkan enzim

intraseluler dapat diekstrak dari dalam sel lewat proses pemecahan sel

2.7 Cara Menghasilkan Enzim Amylase

Degradasi yang terjadi pada pati diketahui dengan hilangnya material yang terwarnai

oleh iodine. Uji deteksi α amylase yang menghidrolisis α-1,4-glikogen dan poliglucosan

lainnya. Pada saat awal perlakuan terjadi penurunan yang cepat berat molekul pati yang

dihasilkan dari pewarnaan iodine. Produk akhir utama dari degradasi ini adalah oligosakarida

dengan berat molekul yang rendah. Sebaliknya, β-amilase mampu mengkatalisis sebuah

serangan exolitik dan mendegradasi pati dengan cara memecah maltose dari ujung rantai pati.

Enzim amylase dari B. subtilis dapat dipisahkan satu sama lain dan secara subsekuen

mengeluarkannya bersama maltose. Enzim amylase dapat dipisahkan dari protease dengan

menambahkan insoluble starch ke dalam kultur untuk menyerap amilase.

Aktivitas amilase dilakukan oleh enzim bakteri dan terlihat berwarna biru di dalam

iodin. Apabila iodin menyebabkan media pati berwarna biru pada koloni bakteri maka tidak ada

amilase yang diproduksi. Molekul maltosa yang kecil dapat masuk ke dalam sel untuk

digunakan sebagai energi. Interaksi iodin dengan pati membuat media berwarna biru gelap.

Produksi enzim amilase oleh koloni bakteri pada media ditunjukkan adanya zona bening dengan

penambahan larutan iodin di sekitar koloni bakteri.

2.7.1 Media

Media agar yang digunakan adalah yeastekstrak 0,05%, NaCl 0,1%, bakto agar

1,5%,amonium sulfat 0,7%, CaCl2, 0,01% K2HPO4, 0,01% MgSO4.7H2O0,01% dan amilum

2%.Komposisi media produksi terdiri dariamonium sulfat 0,7%, yeast ekstrak 0,05%,bakto

tripton 0,01%, NaCl 0,1%, CaCl2 0,01%, K2HPO4 0,01% MgSO4.7H2O0,01%dan amilum 0,5%.

2.7.2 Fermentasi

Inokulum yang telah disiapkan dimasukkansecara aseptik ke dalam media

fermentasilalu diinkubasi selama 20 – 100 jam padasuhu 50OC menggunakanshaker

inkubator dengan kecepatan 180 rpm (untukmengetahui waktu produksi optimumamilase).

Cairan fermentasi yangmengandung enzim amilase dipisahkan dariselnya dengan sentrifuse

pada kecepatan3500 rpm selama 30 menit.Filtrat enzimyang didapat diuji aktivitasnya.

2.7.3 Uji Deteksi Amilase

Degradasi yang terjadi pada pati diketahui dengan hilangnya material yang terwarnai

oleh iodine. Uji deteksi α amylase yang menghidrolisis α-1,4-glikogen dan poliglucosan

lainnya. Pada saat awal perlakuan terjadi penurunan yang cepat berat molekul pati yang

dihasilkan dari pewarnaan iodine. Produk akhir utama dari degradasi ini adalah oligosakarida

dengan berat molekul yang rendah. Sebaliknya, β-amilase mampu mengkatalisis sebuah

serangan exolitik dan mendegradasi pati dengan cara memecah maltose dari ujung rantai pati.

Enzim amylase dari B. subtilis dapat dipisahkan satu sama lain dan secara subsekuen

mengeluarkannya bersama maltose. Enzim amylase dapat dipisahkan dari protease dengan

menambahkan insoluble starch ke dalam kultur untuk menyerap amilase.

Aktivitas amilase dilakukan oleh enzim bakteri dan terlihat berwarna biru di dalam

iodin. Apabila iodin menyebabkan media pati berwarna biru pada koloni bakteri maka tidak ada

amilase yang diproduksi. Molekul maltosa yang kecil dapat masuk ke dalam sel untuk

digunakan sebagai energi. Interaksi iodin dengan pati membuat media berwarna biru gelap

Menurut Ekunsaumi (2004), produksi enzim amilase oleh koloni bakteri pada media

ditunjukkan adanya zona bening dengan penambahan larutan iodin di sekitar koloni bakteri

BAB III

METODOLOGI 3.1 Pemilihan Mikroorganisme

Mikroorganisme yang digunakan dalampenelitian ini adalah isolatBacillussubstillisyang

diisolasi dari sumber airpanas Makula Tana Toraja Sulawesi Selatan. Biakan dipelihara serta

diperbanyak padamedia agar.Media-media agar yang digunakan adalah yeastekstrak 0,05%,

NaCl 0,1%, bakto agar 1,5%,amonium sulfat 0,7%, CaCl20,01% K2HPO40,01%

MgSO4.7H2O0,01% dan amilum 2%.Komposisi media produksi terdiri dariamonium sulfat

0,7%, yeast ekstrak 0,05%,bakto tripton 0,01%, NaCl 0,1%, CaCl20,01% K2HPO4 0,01%

MgSO4.7H2O0,01%dan amilum 0,5%.Fermentasi inokulum yang telah disiapkan

dimasukkansecara aseptik ke dalam media fermentasilalu diinkubasi selama 20 – 100 jam

padasuhu 500C menggunakanshaker inkubator dengan kecepatan 180 rpm (untukmengetahui

waktu produksi optimumamilase). Cairan fermentasi yangmengandung enzim amilase

dipisahkan dariselnya dengan sentrifuse pada kecepatan3500 rpm selama 30 menit.Filtrat

enzimyang didapat diuji aktivitasnya.

3.2 Uji Aktivitas Amilase (Sudarmadji, 1984)

Prinsip uji aktivitas enzim amilasedidasarkan pada perhitungan gula pereduksidari hasi

hidrolisis pati dengan metodeNelson-Somogy. Sebanyak 1 mL larutanpati 2% dan 1 mL buffer

fosfat pH 7,0 ,ditambahkan 1 mL larutan ekstrak enzimamilase, diinkubasi pada suhu 500C

selama60 menit, setelah itu dinonaktifkan padasuhu 1000C selama 5-10 menit.

Dinginkan,selanjutnya ditentukan kadar glukosanyadengan metode Nelson-Somogy yakni

kedalam tabung reaksi dimasukkan 1 mLcampuran enzim tersebut kemudianditambahkan 1 mL

reagen Nelson-somogy.Kemudian dipanaskan kembali dalampenangas air pada suhu 1000C

selama 20menit. Selanjutnya didinginkan dalam air eshingga suhu larutan sama dengan

suhukamar. Setelah dingin ditambahkan 1 mLreagen arsenomolibdat dan 5 mL air suling lalu

dikocok hingga bercampur rata.Diamkan pada suhu kamar selama 30 menit.Absorbansi larutan

diukur denganspektrofotometer UV-VIS padaλmax (660nm). Sebagai kontrol 1 mL ekstrak

enzimamilase dipanaskan sampai mendidih laluditambahkan 1 mL pati 2% dan

1mL larutanbuffer fosfat pH 7,0 dan selanjutnyapengerjaan sama dengan pengujian

aktivitasenzim.Untuk mengetahui kadar glukosa hasilhidrolisis pati oleh enzim dihitung

denganmenggunakan kurva kalibrasi larutan standarglukosa pada berbagai konsentrasi

0,02;0,04; 0,06; 0,08; 0,1µmol/ml. Perhitunganaktivitas enzim dilakukan

denganmensubstitusikan absorbansi larutan yangdiperoleh pada pengujian aktivitas enzim

kedalam persamaan regresi kurva kalibrasilarutan standar glukosa. Aktivitas enzimyang

diperoleh dinyatakan dalam unit/mL,dimana 1 unit adalah aktivitas enzim yangmenghasilkan

1µmol glukosa perjam padakondisi percobaan.

3.3 Pengukuran Kadar Protein dengan Metode Lowry (1951).

Komposisi reagen Lowry B adalahNa2CO32% dalam NaOH 0,1 N : CuSO4 1%:

Natrium-kalium-Tartrat (100:1:1) danreagen Lowry A adalah larutan asamphospho-tungstic-

phospho-molybdic (folin): aquades (1:1). Kadar protein diukurdengan menggunakan BSA

(Bovine SerumAlbumin) sebagai standar dan diukur denganmenggunakan spektrofotometer

padapanjang gelombang maksimum. Sebanyak1 mL enzim amilase ditambah 2,5 mLlarutan

Lowry B, diinkubasi pada suhu 250Cselama 10 menit.Selanjutnya ditambahkan0,25 mL Lowry

A dan diinkubasi kembali pada 250C selama 30 menit dengan sesekalidikocok, kemudian

absorbansi diukurpadaλ  maksimum BSA (630 nm) yang telah ditentukan dengan

spektrofotometerUV-Vis.

1. Karakterisasi enzim amilasea.

Penentuan suhu optimum enzim-enzim, substrat dan bufer fosfat 0.1 MpH 7,0

dicampur dan diinkubasi selama60 menit pada kisaran suhu 200C, 250C,300C, 350C, 400C,

dan 450C kemudiandilakukan pengujian aktivitas amilasepada setiap perubahan suhu

sehinggadiperoleh aktivitas amilaseoptimum padasuhu tertentu.

2. Penentuan pH optimum enzim

Enzim, substrat dan bufer sitrat 0.1 Mdan bufer posfat 0,1 M pada berbagaikisaran

pH 5,8; 5,8; 6,0; 6,2; 6,4; 6,6 dan7,0 dicampur dan diinkubasi selama 60menit pada suhu

optimum (yang telah dicapai pada perlakuan diatas)kemudian dilakukan pengujian

aktivitasamilase pada setiap perubahan pHsehingga diperoleh aktivitasamilaseoptimum

pada pH tertentu.

3. Pengaruh ion logam terhadapaktivitas enzim

Untuk mengetahui jenis logam yangberperan sebagai aktivator atau inhibitor,maka

campuran enzim, substrat, danbufernya ditambahkan berbagai jenislogam seperti: MgCl2;

CaCl2; CoCl2;NiCl2; dan ZnCl2pada konsentrasi 1.0mM dan 10 mM. Kemudian

diinkubasiselama 60 menit (seperti pada penentuansuhu dan pH optimum).

Selanjutnyadilakukan pengukuran aktivitas enzimamilase.Penggunaan ekstrak kasar

amilasehasil isolasi dalam menghidrolisismasing-masing substratnya.

Masing-masing substrat yaitu tepungtapioka, tepung sagu dan tepung

jagungditimbang 1 gram kemudian dilarutkandengan akuades sampai volume 100

mL,dipanaskan sampai mendidih. Selanjutnyadidinginkan, larutan ini digunakan

sebagaisubstrat.

a. Hidrolisis substrat oleh enzimamilase

Di dalam tabung reaksi dimasukkan1 mL larutan enzim amilase, ditambahkan0,25 mL

larutan CoCl2sehingga konsentrasiion logam Co2+di dalam campuran adalah10 mM,

kemudian dikocok. Ditambahkan0,75 mL buffer fosfat pH 6,4 dan 0,5 mLlarutan substrat

(masing-masing dikerjakanuntuk tepung tapioka 1%, tepung sagu 1%,tepung jagung 1%

dan sebagai kontroldigunakan pati standar 1%). Diinkubasidalam inkubator pada suhu

350C selama 60menit,kemudian dipanaskan pada suhu100C selama 10 menit untuk

inaktivasi.Setelah itu didinginkan dan diukur kadarglukosanya.

b. Pengukuran glukosa hasil hidrolisis

Pengukuran kadar glukosa hasil hidrolisis menggunakan metode Nelson-

Somogyi,sama dengan penentuan aktivitas enzimamilase.

BAB IV

PEMBAHASAN

Enzim amilase dapat dihasilkan oleh berbagai mikroba dimana salah satunya adalah

bakteri dari jenis Bacillus. Pada percobaan praktikum kali ini, untuk memproduksi enzim

amilase digunakan pati tapioka sebagai substrat. Penggunaan substrat bertujuan untuk dapat

menginduksi bakteri untuk menghasilkan enzim amilase. Karena substrat diperlukan dalam

proses produksi enzim, maka enzim amilase yang diproduksi dari bakteri jenis Bacillus dapat

dikatakan sebagai inducible enzyme.

Dalam praktikum kali ini, dua jenis bakteri yaitu Bacillus subtilis dan Bacillus sp.

digunakan dalam produksi enzim amilase dimana Bacillus subtilis dapat menghasilkan enzim

amilase apabila dilihat dari aktivitas enzimnya, sedangkan Bacillus sp. tidak. Tidak

dihasilkannya enzim amilase dari biakan Bacillus sp. dapat dipengaruhi beberapa hal,

diantaranya suhu dan lama inkubasi dan substrat yang digunakan. Pada umumnya enzim

amilase secara optimum dihasilkan di titik tertentu pada fase logaritmik dari kurva pertumbuhan

mikroba, akan tetapi ada mikroba tertentu dimana fase logaritmiknya lebih panjang sehingga

enzim amilase tidak diproduksi karena titik tersebut belum tercapai sehingga lama inkubasi

erpengaruh dalam hal ini. Adapun suhu dapat berpengaruh karena ada beberapa bakteri yang

bersifat thermophilic yaitu bakteri yang lebih optimum dalam produksi enzim amilase dalm

kondisi suhu yang lebih tinggi.

Untuk lebih mengetahui karakter Bacillus sp. maka diperlukan percobaan lanjutan

seperti pangaruh lamanya inkubasi, sampel ekstrak enzim kasar diambil pada selang waktu‐waktu tertentu sehingga dapat diketahui beapa lama bakteri tersebut mulai memproduksi enzim

amilase dan dapat diketahui juga waktu optimum produksi. Selain itu dapat dilakukan inkubasi

pada suhu‐suhu tertentu sehingga diperoleh pada suhu berapa enzim tersebut optimum

memperoduksi enzim amilase.

Aktivitas enzim spesifik yang diperoleh dari jenis Bacillus subtilis adalah sebesar 0.91

U/mg protein dari larutan EEK, nilai ini sangat kecil apabila dibandingkan dengan hasil yang

diperoleh Dheeran dkk yaitu 14.5 U/mg, Marlida dkk yaitu 86 U/mg dan Chakraborty dkk yaitu

11.5 U/mg. hal ini dapat dikarenakan belum ditentukannya waktu optimum, suhu, dan kondisi

yang dapat meningkatkan hasil enzim dalam pemanenan ekstrak enzim kasar seperti

penambahan vitamin dan suplemen untuk bakteri.

Apabila telah dilakukan optimasi dan produksi enzim yang dihasilkan meningkat

sampai pada level tertentu, protein terlarut yang dapat mempengaruhi aktivitas enzim spesifik

dapat dikurangi dengan cara pemurnian enzim yaitu bisa dengan dialysis, kromatografi penukar

ion atau dengan ultra filtrasi sehingga aktivitas enzim spesifik dari produk yang dihasilkan dapat

ditingkatkan.

BAB V

PENUTUP

3.1 Kesimpulan

Dari hasil pembahasan dan teori yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa Bacillus

amyloliquefaciens isolat sarasah Lembah Anai dapat menghasilkan enzim amilasepada substrat

tapioka. Pertumbuhan populasi maksimum Bacillusamyloliquefociens diperoleh pada hari ke-6

fermentasi dengan pH 6,0 dan suhupertumbuhan 37oC. Produksi enzim amilase optirnum

diperoleh pada hari ke-7pada pH awal 5,0 dan suhu 40'C (4.182).Kondisi optimum aktivitas

enzim amilase tsacillus amyloliquefaciens padasubstrat tapioka diketahui: pH 6,0; suhu 45"Ct

urdktu 20 menit dan konsentrasisubstrat 4,0 o (b/v). Dari hasil perhitungan didapatkan nilai K*

0,148 (mg/ml)dan nilai Vmuk, 0,0178 (mg/mllmenit).

Aktifitas optimum enzim amilase yang dihasilkan diperoleh A,0717Unit/ml dan

aktivitas spesifik 6,6367 Unitlmg protein.Dari hasil uji aktivitas selulase dan xylanase pada

substrat tapioka, ternyata Bacillus amylcliquefaciens juga dapat menghasilkan enzim selulase

danxylanase dengan nilai aktivitas 0,016 Unit/ml dan aktivitas spesifik 0,0066UniVmg protein

untuk selulase sefiaA,0229 Unit/ml dan 0,00141 Unit/mg proteinuntuk xylanase.

3.2 Saran

Dengan diketahuinya kemampuan Bacillus amyloliquefaciens dapatmenghasilkan

enzim amilase serta karalcteristik enzim yang dihasilkarr, makaperlu diteliti/dikembangkan

lebih lanjut untuk memproduksi, ekstraksi danpurifikasi enzim amilase dalam bentuk murni agar

dapat dimanfaatkan padakeperluan yang lebih luas.

DAFTAR PUSTAKA

Alberts- B, D.Bray. J.Lewis, M.Rafl K.Roberts,and J.D. watwon. 1994.Molecular Biology of the

cell. penerbit pr. Gramedia. Jakarta.

Anwaralikham. F.A.B, Awang. A.S, Awang. H. 2006. Biotechnology. Faculty ofResource and

technology university Malaysia sarawak. SarawakMalaysia.

Bahagiawati.Isolasi dan Purifikasi Inhibitor Alfamilase dari Biji KacangPhaseolusvulgari s.

Jurnal Agrobiogen. Volume 1 .

Belk.C, V. Borden. 1989. Biology Science for Live. Second Edition. University ofMinnesota.

Duluth.

Bohinsky. R.c. 1987.Modern concept in Biochemistry. Fifth Edition. London.

Boyer. R, J. Wiley and Son. 2002. Concept in Biochemistry. Second Edition .NewYork..

Boyer. R.F. 1993. Modern Experiment Biochemistry.2 nd,Edition. BenjaminCumming.

Redwood City.

Case. C.L. T.R. Johnson.2004- Laboratory Experiments In Microbiology. The Benjamin

Cumming Publi shing Company. Inc. London.

Christopher, K. Mathews, K.E.v. Holde, Kevin, G. Ahern. 1999. Biochemistri.Third Edition.

Oregon State University.

D.w. Martin. Jr. P.A. Mayes, v.w. Rodwell. 2000. Biokimia. penerbit BukuKedokteran EGC.

Jakarta.

Fardiaz. s. 1983. Keamanan Pangan. Jurusan Ilmu dan teknologi pangan,Fakultas Teknologi

Pertanian, Institut pertanian Bogor. Bogor.

Fardiaz. s. 1988. Fisiologi Fermentasi. pusat Antar universitas. InstitutPertanian Bogor. Bogor.

Fennema. O.R. 1985. Food Chemistry. New york and Basel.

Hein. M, L.R. Best, S. Pattisaon, S. Arena. 1995. Introduction to organic andBiochemistry.

Books Cole Publishing Company Pacipic Grove. California.

Hutagalung. H. 2004, Karbohidrat. Bagian Ilmu Gizi. Fakultas KedokteranUniversitas Sumatera

Utara. Medan

Wizna. 2007. Potensi Amyloliguefacilus Selulolitik Sarasah Hutan dalamPeningkatan Kuallitas

Pakan Campuran Empelur sagu dan Isi Rumen danImplikasinya terhadap Produktivitas

Temak Unggai. Disertasi. ProgramPascasarjana, Universitas Andalas. padang.