8/22/2019 Feromoni 4 +

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 8 6 , p p . 1 8 0 6 - 1 8 1 0 , M a r c h 1 9 8 9B i o c h e m i s t r y

R e g u l a t i o n o f p h e r o m o n e b i o s y n t h e s i s b y a b r a i n hormone i n t w om o t h s p e c i e s( n e u r o e n d o c r i n e r e g u l a t i o n / p h e r o m o n e b i o s y n t h e s i s / f a t t y a c i d s y n t h e s i s / A r g y r o t a e n i a v e l u t i n a n a / T r i c h o p l u s i a m i )

J U L I E T D . T A N G * , RALPH E . C H A R L T O N * , R U S S E L L A . J U R E N K A * , WALTER A . WOLF*, P . L A R R Y P H E L A N t ,LEAM S R E N G * t , A ND WENDELL L . R O E L O F S * * D e p a r t m e n t o f E n t o m o l o g y , Ne w Y o r k S t a t e A g r i c u l t u r a l E x p e r i m e n t S t a t i o n , C o r n e l l U n i v e r s i t y , G e n e v a , NY 1 4 4 5 6 ; a n d t D e p a r t m e n t o f E n t o m o l o g y ,O h i o A g r i c u l t u r a l R e s e a r c h a n d D e v e l o p m e n t C e n t e r , O h i o S t a t e U n i v e r s i t y , W o o s t e r , OH 4 4 6 9 1C o n t r i b u t e d b y W e n d e l l L . R o e l o f s , D e c e m b e r 8 , 1 9 8 8ABSTRACT E x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d t o c h a r a c t e r i z et h e a c t i o n o f a b r a i n h o r m o n e o n p h e r o m o n e b i o s y n t h e s i s i nf e m a l e r e d b a n d e d l e a f r o l l e r a n d c a b b a g e l o o p e r m o t h s . R e s u l t ss h o w e d t h a t t h e t w o s p e c i e s d i f f e r e d i n t h e i r r e s p e c t i v e c o n t r o lm e c h a n i s m s . I n t h e c a b b a g e l o o p e r , p h e r o m o n e t i t e r f r o md e c a p i t a t e d f e m a l e s t h a t r e c e i v e d e i t h e r s a l i n e o r b r a i n e x t r a c ti n j e c t i o n s w a s n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l f e m a l e s ,s u g g e s t i n g t h a t p h e r o m o n e b i o s y n t h e s i s w a s n o t d e p e n d e n t o nt h e p r e s e n c e o f t h e b r a i n h o r m o n e . I n c o n t r a s t , w i t h r e d b a n d e dl e a f r o l l e r f e m a l e s , s t u d i e s u s i n g r a d i o l a b e l e d a c e t a t e i n c o r p o -r a t i o n a s w e l l a s i n c o r p o r a t i o n o f - d e u t e r i u m - l a b e l e d h e x a d e c -a n o i c a c i d s h o w e d t h a t . ( i ) t h e b r a i n h o r m o n e w a s r e q u i r e d f o rp h e r o m o n e b i o s y n t h e s i s , ( i i ) t h e b r a i n h o r m o n e r e g u l a t e d p h e r -o m o n e b i o s y n t h e s i s b y a c t i v a t i n g s y n t h e s i s o f o c t a d e c a n o y l a n dh e x a d e c a n o y l i n t e r m e d i a t e s , a n d ( i i ) t h e b r a i n h o r m o n e d i d n o tc o n t r o l o t h e r e n z y m e s i n t h e p a t h w a y . R e g u l a t i o n o f f a t t y a c i ds y n t h e t a s e w a s u n l i k e l y s i n c e a s s a y s o f t h e e n z y m e f r o m d e c a p -i t a t e d a n d n o r m a l f e m a l e s s h o w e d n o d i f f e r e n c e s i n t h e a m o u n to r d i s t r i b u t i o n o f t h e 1 8 - a n d 1 6 - c a r b o n a c y l e n d p r o d u c t s . T h e s er e s u l t s i n c o n j u n c t i o n w i t h t h o s e f r o m o r g a n c u l t u r e s o f t h ep h e r o m o n e g l a n d s u g g e s t t h a t t h e b r a i n h o r m o n e ' a c t s b yi n c r e a s i n g t h e s u b s t r a t e s u p p l y f o r f a t t y a c i d s y n t h e s i s .R e c e n t r e s e a r c h i n m o t h s h a s g r e a t l y a d v a n c e d o u r u n d e r -s t a n d i n g o f t h e e n d o g e n o u s c o n t r o l m e c h a n i s m s r e s p o n s i b l ef o r s e x p h e r o m o n e p r o d u c t i o n a n d r e l e a s e . F e m a l e m o t h se m i t p h e r o m o n e o n l y w h e n t h e y c a l l , a b e h a v i o r t h a t r e q u i r e si n p u t f r o m t h e b r a i n o r o t h e r h i g h e r n e r v o u s c e n t e r s ( 1 - 4 ) .P r o d u c t i o n o f p h e r o m o n e , o n t h e o t h e r h a n d , i s u n d e rn e u r o e n d o c r i n e c o n t r o l b y a p e p t i d e l o c a l i z e d i n t h e s u b -e s o p h a g e a l g a n g l i o n p o r t i o n o f t h e b r a i n c o m p l e x ( 5 - 7 ) .S e v e r a l l i n e s o f e v i d e n c e s u p p o r t t h e e x i s t e n c e o f a b r a i nh o r m o n e t h a t c o n t r o l s p h e r o m o n e p r o d u c t i o n . A f t e r n e c k -l i g a t i o n o r d e c a p i t a t i o n , f e m a l e s e x h i b i t e d a d e c r e a s e i np h e r o m o n e t i t e r ( 5 , 6 ) . A s u b s e q u e n t i n c r e a s e i n t i t e r w a si n d u c e d b y i n j e c t i o n o f b r a i n e x t r a c t . S i n c e h e m o l y m p hs h o w e d p h e r o m o n o t r o p i c a c t i v i t y o n l y d u r i n g p e r i o d s w h e n af e m a l e w a s p r o d u c i n g p h e r o m o n e , i t w a s c o n c l u d e d t h a tc o n t r o l o f p h e r o m o n e p r o d u c t i o n w a s m e d i a t e d b y r e l e a s e o ft h e b r a i n h o r m o n e i n t o t h e h e m o l y m p h a t s p e c i f i c t i m e s o f t h ed a y ( 5 ) . T h e p r e s e n c e o f f u n c t i o n a l l y s i m i l a r p h e r o m o n o t r o p i cf a c t o r s i n s e v e r a l f a m i l i e s o f m o t h s h a s b e e n d e m o n s t r a t e d ( 5 ,7 ) a s w e l l a s f r o m b r a i n s o f i n s e c t s f r o m o t h e r o r d e r s - e . g . , ac o c k r o a c h , P e r i p l a n e t a a m e r i c a n a , a n d a c r i c k e t , G r y l l u sb i m a c u l a t u s ( L . S . a n d W . L . R . , u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) .T h e b i o s y n t h e t i c p a t h w a y s o f p h e r o m o n e p r o d u c t i o n f o r t h et w o s p e c i e s e x a m i n e d i n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e r e d b a n d e dl e a f r o l l e r m o t h ( R B L R ) , A r g y r o t a e n i a v e l u t i n a n a , a n d t h ec a b b a g e l o o p e r m o t h ( C L ) , T r i c h o p l u s i a n i , a r e d e p i c t e d i n

1 8 : A c y l

Z 7 - 1 2 : O A cR e d . / A c e l . IZ 7 - 1 2:AcylI -2C

Z 9 - 1 4 : A c y l. $ r ~ I -2C I - 2 CA6 1 1l6AII - , , - l :Acy I

l

Z 1 1-6A& - 2 CA I I1 4 : A c y l I - b Z . / E 1 1 - 1 4 : A c y l IR e d . / A c e t .

Z / E 1 1 - 1 4 : O A cF I G . 1 . K e y s t e p s i n t h e b i o s y n t h e s i s o f t h e RBLR a n d CLp h e r o m o n e s ( 8 - 1 0 ) . S o l i d a r r o w s d e s c r i b e t h e p a t h w a y f o u n d f o r t h eCL a n d o p e n a r r o w s f o r t h e R B L R . - 2 C , c h a i n s h o r t e n i n g ; A l l , A l ld e s a t u r a t i o n ; R e d . / A c e t . , r e d u c t i o n / a c e t y l a t i o n ; 1 8 - , 1 6 - , a n d1 4 : A c y l , o c t a d e c a n o a t e , h e x a d e c a n o a t e , a n d t e t r a d e c a n o a t e e s t e r -i f i e d t o a c o m p l e x l i p i d , r e s p e c t i v e l y ; Z 7 - 1 2 : Q A c , ( Z ) - 7 - d o d e c e n y la c e t a t e ; Z 7 - 1 2 : A c y l , Z 9 - 1 4 : A c y l , Z 1 1 - 1 6 : A c y l , a n d Z / E 1 1 -1 4 : A c y l , ( Z ) - 7 - d o d e c e n o a t e , ( Z ) - 9 - t e t r a d e c e n o a t e , ( Z ) - 1 1 - h e x -

a d e c e n o a t e , ( Z ) - a n d ( E ) - 1 1 - t e t r a d e c e n o a t e , r e s p e c t i v e l y , e s t e r i f i e dt o a n a t u r a l l y o c c u r r i n g l i p i d ; Z / E 1 1 - 1 4 : O A c , ( Z ) - a n d ( E ) - 1 1 -t e t r a d e c e n y l a c e t a t e .F i g . 1 ( 8 - 1 0 ) . T h e e n z y m a t i c s t e p s i n v o l v e d ( f a t t y a c i ds y n t h e s i s , c h a i n s h o r t e n i n g , A l l d e s a t u r a t i o n , r e d u c t i o n , a n da c e t y l a t i o n ) a r e c o m m o n t o a v a r i e t y o f m o t h s p e c i e s ( 1 1 , 1 2 ) .T h e i n f l u e n c e o f t h e b r a i n h o r m o n e o n t h e s e p a t h w a y s t e p s ,h o w e v e r , i s y e t t o b e r e p o r t e d . I n t h i s p a p e r , d e c a p i t a t i o n a n db r a i n e x t r a c t i n j e c t i o n w e r e u s e d t o e v a l u a t e t h e e f f e c t o f t h ep r e s e n c e a n d a b s e n c e o f b r a i n h o r m o n e . W h e r e a p p r o p r i a t e ,t h e i n d i c e s u s e d t o m o n i t o r e f f e c t s w e r e p h e r o m o n e t i t e r , t i t e ro f b i o s y n t h e t i c i n t e r m e d i a t e s i n t h e p a t h w a y , i n c o r p o r a t i o n o f[ 1 - 1 4 C ] a c e t a t e , a n d i n c o r p o r a t i o n o f [ 1 6 , 1 6 , 1 6 - 2 H ] h e x a -d e c a n o i c a c i d . I n a d d i t i o n , g l a n d s f r o m d e c a p i t a t e d a n dn o r m a l RB L R f e m a l e s w e r e c o m p a r e d f o r i n v i t r o f a t t y a c i ds y n t h e t a s e a c t i v i t y a n d f o r [ 1 - 1 4 C ] a c e t a t e i n c o r p o r a t i o n i n t op h e r o m o n e a n d b i o s y n t h e t i c i n t e r m e d i a t e s i n o r g a n c u l t u r e .

MATERIALS A ND METHODSI n s e c t s . A p i n t o b e a n d i e t w a s u s e d t o r e a r b o t h s p e c i e s( 1 3 ) . CL w e r e h o u s e d a t 2 8 2 0 C w i t h a l i g h t / d a r k c y c l e o f

A b b r e v i a t i o n s : RBLR, r e d b a n d e d l e a f r o l l e r m o t h ; C L , c a b b a g el o o p e r m o t h ; M A I , m o s t a b u n d a n t i s o t o p o m e r ; E x a m p l e s o f com-p o u n d a b b r e v i a t i o n s a r e : Z 1 1 - 1 4 : A c y l , ( Z ) - 1 1 - t e t r a d e c e n o a t e e s t e r -i f i e d t o a c o m p l e x l i p i d ; Z 1 1 - 1 4 : G A c , ( Z ) - 1 1 - t e t r a d e c e n y l a c e t a t e ;a n d Z l l - 1 4 : M E , m e t h y l ( Z ) - 1 1 - t e t r a d e c e n o a t e .t P r e s e n t a d d r e s s : E q u i p e d e R e c h e r c h e A s s o c i d e a u C e n t r e N a t i o n a ld e l a R e c h e r c h e S c i e n t i f i q u e U n i t e A s s o c i d e 6 7 4 , F a c u l t d d e sS c i e n c e s , 6 B d G a b r i e l , F - 2 1 1 0 0 D i j o n , F r a n c e . T o wh o m r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .1 8 0 6

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 6 ( 1 9 8 9 ) 1 8 01 6 h r / 8 h r ; R B L R we r e h o u s e d a t 2 6 2 0 C w i t h a l i g h t / d a r kc y c l e o f 1 6 h r / 8 h r . S e x e s w e r e s e p a r a t e d a s p u p a e a n d a d u l tf e m a l e s w e r e s e g r e g a t e d d a i l y .B r a i n E x t r a c t P r e p a r a t i o n . H e a d s f r o m 4 - t o 5 - d a y - o l dR B L R a n d 2 - t o 3 - d a y - o l d CL f e m a l e s we r e c o l l e c t e d 2 h rb e f o r e l i g h t s - o f f a n d h o m o g e n i z e d i n c o l d m e t h a n o l / w a t e r ,1 : 1 ( v o l / v o l ) . A f t e r r e p e a t e d c e n t r i f u g a t i o n ( 1 0 , 0 0 0 x g f o r 3m i n a t 4 0 C ) a n d p e l l e t r e s u s p e n s i o n , t h e s u p e r n a t a n t wa sl y o p h i l i z e d a n d s t o r e d a t - 1 5 T C . B e f o r e use t h e e x t r a c t wasr e s u s p e n d e d i n s a l i n e ( 1 4 ) t o g i v e t h e d o s a g e s i n d i c a t e d .B r a i n e x t r a c t s were u s e d s t r i c t l y w i t h i n s p e c i e s .D e c a p i t a t i o n s . A t m i d - p h o t o p h a s e , 1 - d a y - o l d f e m a l e s w e r es e g r e g a t e d i n t o two g r o u p s . O n e g r o u p wa s a n e s t h e t i z e d( C O 2 g a s a n d c h i l l i n g ) a n d d e c a p i t a t e d , w h e r e a s t h e c o n t r o lg r o u p wa s o n l y a n e s t h e t i z e d .T o p i c a l A p p l i c a t i o n o f P h e r o m o n e P r e c u r s o r s a n d B r a i n E x -t r a c t I n j e c t i o n . T h e p r e c u r s o r s u s e d were s o d i u m [ 1 - 1 4 C ] a c e t a t e( 5 6 m C i / m m o l ; 1 C i = 3 7 G B q ) i n a s o l u t i o n o f w a t e r / d i m e t h y ls u l f o x i d e , 1 : 1 ( v o l / v o l ) , a n d [ 1 6 , 1 6 , 1 6 - 2 H ] h e x a d e c a n o i c a c i d i nd i m e t h y l s u l f o x i d e ( 8 - 1 0 ) . F o r t h e R B L R , t h e c o m p o u n d d o s e sw e r e , r e s p e c t i v e l y , 0 . 2 1 C i a n d 0 . 4 , u g ( e a c h u s e d i n s e p a r a t ee x p e r i m e n t s a n d a p p l i e d i n a 0 . 2 - t l d r o p ) . CL f e m a l e s r e c e i v e do n l y s o d i u m [ 1 - ' 4 C ] a c e t a t e ( a 0 . 3 - M C i d o s e a p p l i e d i n a 1 - 1 . ld r o p ) . S i n c e f e m a l e s o f b o t h s p e c i e s r e s t r i c t c a l l i n g p e r i o d s t os c o t o p h a s e a t t h e r e a r i n g t e m p e r a t u r e s u s e d ( 1 5 , 1 6 ) , e x p e r i -m e n t s w e r e t i m e d s u c h t h a t f e m a l e s c o u l d b e r e t u r n e d t o t h ei n c u b a t o r s b y s c o t o p h a s e o n s e t . Two h o u r s b e f o r e l i g h t s - o f f ,g l a n d s o f d e c a p i t a t e d a n d c o n t r o l 4 - d a y - o l d f e m a l e s w e r ef o r c i b l y e x t r u d e d a n d t h e p r e c u r s o r wa s a p p l i e d . A f t e r t h ec o m p o u n d wa s a b s o r b e d ( = 4 5 m i n a t 3 2 T C ) , f e m a l e s w e r ei n j e c t e d i n t h e a b d o m e n w i t h 1 , u l o f s a l i n e o r 1 , u l o f b r a i n e x t r a c t( 2 h e a d e q u i v a l e n t s ) . F e m a l e s were i n c u b a t e d f o r 4 h r i n t h ed a r k a t t h e i r r e s p e c t i v e r e a r i n g t e m p e r a t u r e s , t h e n t h e p h e r o -mone g l a n d s w e r e e x t r a c t e d f o r l i p i d i n c h l o r o f o r m / m e t h a n o l ,2 : 1 ( v o l / v o l ) .F a t t y A c i d S y n t h e t a s e A c t i v i t y . P h e r o m o n e g l a n d s f r o m4 - d a y - o l d RB L R f e m a l e s w e r e h o m o g e n i z e d i n 0 . 1 5 m l o fc o l d 0 . 1 M p o t a s s i u m p h o s p h a t e ( p H 7 . 4 ) , c o n t a i n i n g 0 . 3 5 Ms u c r o s e , 3 mM E D T A , a n d 5 mM d i t h i o t h r e i t o l . T h e s u s p e n -s i o n w a s c e n t r i f u g e d a t 1 0 , 0 0 0 x g , t h e s u p e r n a t a n t wa sr e c e n t r i f u g e d a t 1 0 0 , 0 0 0 x g , a n d t h e r e s u l t i n g s u p e r n a t a n twa s u s e d a s t h e c r u d e e n z y m e s o l u t i o n . A s s a y s c o n t a i n e de n z y m e , 5 mM N A D P H , 3 mM m a l o n y l - C o A , a n d 0 . 2 . t C i o f[ 1 - 1 4 C ] a c e t y l - C o A ( 5 6 m C i / m m o l ) . A f t e r i n c u b a t i o n a t 3 7 0 Cf o r 3 0 m i n , a s s a y s w e r e e x t r a c t e d w i t h c h l o r o f o r m / m e t h a n o l ,2 : 1 ( v o l / v o l ) , a n d m e t h y l e s t e r s f o r m e d b y a c i d m e t h a n o l y s i s( 1 7 ) . R e v e r s e - p h a s e TL C [ A n i s i l RP p l a t e s , a c e t o n i t r i l e , 9 : 1( v o l / v o l ) ] wa s u s e d t o s e p a r a t e p r o d u c t s a n d r a d i o a c t i v i t ywa s m e a s u r e d o n a B e r t h o l d TL C s c a n n e r .R B L R L i p i d S y n t h e s i s : B o d y v s . P h e r o m o n e G l a n d . I m m e -d i a t e l y b e f o r e s c o t o p h a s e o n s e t , 4 - d a y - o l d f e m a l e s w e r ei n j e c t e d i n t h e a b d o m e n w i t h 0 . 2 , t C i o f s o d i u m [ 1 - ' 4 C ] a c e t a t ei n 1 , u o f w a t e r . A f t e r a 4 - h r i n c u b a t i o n i n t h e d a r k a t 2 6 C ,t h e p h e r o m o n e g l a n d a n d b o d y were s e p a r a t e l y e x t r a c t e d .T i s s u e s w e r e h o m o g e n i z e d i n c h l o r o f o r m / m e t h a n o l , 2 : 1( v o l / v o l ) , w a t e r wa s a d d e d , a n d t h e c h l o r o f o r m l a y e r w a sr e m o v e d . T h e c h l o r o f o r m wa s e v a p o r a t e d u n d e r N 2 , a n dr a d i o a c t i v i t y wa s d e t e r m i n e d b y l i q u i d s c i n t i l l a t i o n c o u n t i n g .O r g a n C u l t u r e . P h e r o m o n e g l a n d s were d i s s e c t e d f r o m4 - d a y - o l d RB L R f e m a l e s 2 h r b e f o r e l i g h t s - o f f a n d w a s h e dt w i c e i n G r a c e ' s m e d i u m ( 1 8 ) . G l a n d s w e r e i n c u b a t e d i n a3 0 - p l I d r o p o f t h e b a s i c m e d i u m [ G r a c e ' s m e d i u m / b o v i n es e r u m a l b u m i n ( 1 , u g / p , ) / s o d i u m [ 1 - 1 4 C ] a c e t a t e ( 0 . 6 , u C i ) ] , o rt h e b a s i c m e d i u m w i t h b r a i n e x t r a c t ( 1 h e a d e q u i v a l e n t p e r, p A ) . A f t e r a 4 - h r i n c u b a t i o n i n t h e d a r k a t 2 6 0 C , g l a n d s w e r ee x t r a c t e d i n c h l o r o f o r m / m e t h a n o l , 2 : 1 ( v o l / v o l ) .T i t e r D e t e r m i n a t i o n . To q u a n t i f y a m ounts o f p h e r o m o n ea n d i n t e r m e d i a t e s , g l a n d s w e r e e x t r a c t e d i n c h l o r o f o r m /m e t h a n o l , 2 : 1 ( v o l / v o l ) , f o r 2 4 h r , w i t h 5 0 0 n g o f m e t h y lp e n t a d e c a n o a t e a d d e d a s a n i n t e r n a l s t a n d a r d . M e t h y l e s t e r s

-0-

-a--.2 60

%-a )

04] 4 ( 4 8 7 )02-0

1 8 : M E ( 1 0 6 )1 6 : M E ( 1 4 2 )1 4 : M E ( 3 4 )Z / E 1 - 1 4 : M E ( 1 9 6 )Z / E 1 - 1 4 : O A c ( 2 2 9 )

0 6 3 0H o u r s a f t e r D e c a p i t a t i o n

/ / / A ( 3 2 7 )

7 2

F I G . 2 . T i m e - r e l a t e d c h a n g e s i n a m o u n t s o f p h e r o m o n e a nb i o s y n t h e t i c i n t e r m e d i a t e s i n c o n t r o l ( C o n ) v e r s u s d e c a p i t a t e d ( D e cRBLR f e m a l e s ( t h r e e r e p l i c a t e s o f f i v e i n s e c t s ) . A m o u n t s ( n g p ef e m a l e ) o b t a i n e d a t t i m e 0 h r f o r c o n t r o l s a r e e n c l o s e d i n p a r e n t h e s en e x t t o t h e c o m p o u n d k e y . F o r e a c h i n t e r v a l a f t e r t h e t i m e od e c a p i t a t i o n , t h e t i t e r s o f d e c a p i t a t e d a n d c o n t r o l f e m a l e s w e rc o m p a r e d ( t w o - t a i l e d , u n p a i r e d t t e s t , P = 0 . 0 5 ) . W h e r e s i g n i f i c a nd i f f e r e n c e s w e r e f o u n d , t h e m e a n f r o m d e c a p i t a t e d f e m a l e s f o l l o w eb y t h e p o o l e d S E i s i n d i c a t e d i n p a r e n t h e s e s b e s i d e t h e d a t a p o i n tT he m e a n t i t e r o f c o n t r o l f e m a l e s c a n b e c a l c u l a t e d b y m u l t i p l y i n g t hm e a n o f d e c a p i t a t e d f e m a l e s b y t h e c o n t r o l / d e c a p i t a t e d t i t e r r a t i oA f t e r e x t r a c t i o n , e s t e r i f i e d f a t t y a c i d s w e r e d e r i v a t i z e d t o f o r m t hc o r r e s p o n d i n g m e t h y l e s t e r s ( M E ) . 1 8 : M E , m e t h y l o c t a d e c a n o a t e* , L o g a r i t h m i c t r a n s f o r m a t i o n w a s n e c e s s a r y t o s a t i s f y e q u a l v a r ia n c e s .w e r e f o r m e d b y b a s e m e t h a n o l y s i s , a n d a c e t y l c h l o r i d e wau s e d t o r e g e n e r a t e t h e a c e t a t e s ( 1 0 ) . S a m p l e s w e r e a n a l y z eb y f l a m e i o n i z a t i o n GC o n a c a p i l l a r y c o l u m n ( S u p e l c o w a1 0 , 0 . 2 5 mm x 3 0 m ) . T h e c o l u m n wa s p r o g r a m m e d f r o m 6 0 '( 1 m i n ) t o 1 0 0 ' C a t 1 0 ' C / m i n ( 0 m i n ) a n d t h e n a t 5 0 C / m i n t2 2 0 ' C ( 1 5 m i n ) .I n c o r p o r a t i o n o f L a b e l e d P r e c u r s o r s . S e p a r a t i o n a n d q u a nt i f i c a t i o n o f p h e r o m o n e a n d i n t e r m e d i a t e s i n [ 1 - 1 4 C ] a c e t a te x p e r i m e n t s w e r e a c c o m p l i s h e d b y t h e r m a l c o n d u c t i v i t y GCo n a m a c r o b o r e c a p i l l a r y c o l u m n ( S P - 2 3 8 0 , 0 . 5 3 mm x 3 0 m )T h e c o l u m n w a s p r o g r a m m e d f r o m 8 0 T C ( 2 m i n ) t o 2 0 0 ' C a3 0 C / m i n a n d h e l d a t 2 0 0 T C f o r 1 5 m i n . C o m p o u n d s e l u t i nf r o m t h e d e t e c t o r w e r e c o l l e c t e d i n c o l d g l a s s m i c r o p i p e t sw h i c h t h e n w e r e w a s h e d w i t h s c i n t i l l a t i o n f l u i d , a n d r a d i oa c t i v i t y w a s m e a s u r e d .I n c o r p o r a t i o n l e v e l s o f [ 1 6 , 1 6 , 1 6 - 2 H ] h e x a d e c a n o i c a c ii n t o RB L R p h e r o m o n e a n d i n t e r m e d i a t e s w e r e q u a n t i f i e d bG C / m a s s s p e c t r o m e t r y u s i n g e l e c t r o n - i m p a c t ( 7 0 e v ) a ns e l e c t e d - i o n m o n i t o r i n g ( 1 0 ) . C o m p o u n d s w e r e s e p a r a t eu s i n g a c a p i l l a r y c o l u m n ( 0 . 2 5 mm x 3 0 m ) c o a t e d w i tc r o s s b o n d e d C a r b o w a x PEG 20M ( S t a b i l w a x , R e s t e k , B e ll a f o n t e , P A ) . T h e t e m p e r a t u r e p r o g r a m w a s t h e s a m e a s t h au s e d i n t h e f l a m e - i o n i z a t i o n a n a l y s i s . T h e f o l l o w i n g m o sa b u n d a n t i s o t o p o m e r s ( M A I ) w e r e s e l e c t i v e l y m o n i t o r e dm e t h y l t e t r a d e c a n o a t e ( 1 4 : M E ) , m / z 2 4 2 ; m e t h y l h e x a d e ca n o a t e ( 1 6 : M E ) , m / z 2 7 0 ; ( Z ) - 1 1 - t e t r a d e c e n y l a c e t a t e ( Z 1 11 4 : O A c ) , m / z 1 9 4 ( M - 6 0 ) ; m e t h y l ( Z ) - a n d ( E ) - 1 1 - t e t r ad e c e n o a t e ( Z / E 1 1 - 1 4 : M E ) , m / z 2 0 8 (M - 3 2 ) . I n a d d i t i o nt h e ( M A I + 1 ) , t h e ( M A I + 2 ) , a n d t h e d e u t e r i u m - e n r i c h e( M A I + 3 ) i o n s w e r e s c a n n e d .T o q u a n t i f y a m o u n t s o f l a b e l e d c o m p o u n d s p r e s e n t , aa l i q u o t o f e a c h s a m p l e w a s a n a l y z e d b y f l a m e - i o n i z a t i o n GCa n d t h e t o t a l a m o u n t o f e a c h c o m p o u n d w a s d e t e r m i n e d . T ht o t a l i o n c u r r e n t f o r e a c h c o m p o u n d [ ( M A I ) + ( M A I + 1 ) +( M A I + 2 ) + ( M A I + 3 ) ] w a s o b t a i n e d f r o m t h e G C / m a ss p e c t r o m e t r i c a n a l y s i s . T h e a m o u n t o f l a b e l e d c o m p o u n dp r e s e n t ( a d j u s t e d f o r t h e l o w , n a t u r a l l y o c c u r r i n g a m o u n t s ot h e MAI + 3 i o n ) w a s c a l c u l a t e d a s [ ( M A I + 3 ) / t o t a l i o

B i o c h e m i s t r y : T a n g e t a l .

8/22/2019 Feromoni 4 +

3/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 6 ( 1 9 8 9 )c u r r e n t ] m u l t i p l i e d b y t h e t o t a l a m o u n t o f c o m p o u n d ( f r o mt h e f l a m e - i o n i z a t i o n GC a n a l y s i s ) .

RESULTSE f f e c t s o f D e c a p i t a t i o n o n T i t e r . A f t e r 1 - d a y - o l d RB L Rf e m a l e s w e r e d e c a p i t a t e d , c o m p o u n d s i n t h e g l a n d t h a tn o r m a l l y i n c r e a s e d w i t h a g e [ i . e . , t h e p h e r o m o n e ( Z / E 1 1 -

1 4 : O A c ) , 1 8 : A c y l , 1 4 : A c y l , a n d Z / E 1 1 - 1 4 : A c y l ( 1 7 ) ] d i d n o t( F i g . 2 ) . F o r t h e p h e r o m o n e , s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e nt i t e r s f r o m d e c a p i t a t e d a n d c o n t r o l f e m a l e s w e r e f o u n d a t a l li n t e r v a l s e x a m i n e d . T i t e r s f r o m c o n t r o l f e m a l e s r a n g e d f r o m4 t o 6 1 t i m e s g r e a t e r t h a n t i t e r s f r o m d e c a p i t a t e d f e m a l e s . T h es i g n i f i c a n t e f f e c t s o f d e c a p i t a t i o n o n p h e r o m o n e t i t e r a l s ow e r e v i s i b l e i n t h e s p l i t - p l o t d e s i g n e x p e r i m e n t w i t h r a d i o -l a b e l e d a c e t a t e ( F i g . 3 A ) . D e c a p i t a t e d f e m a l e s i n j e c t e d w i t he i t h e r b r a i n e x t r a c t o r s a l i n e h a d a s i g n i f i c a n t l y l o w e rp h e r o m o n e t i t e r t h a n c o n t r o l f e m a l e s i n j e c t e d w i t h e i t h e rb r a i n e x t r a c t o r s a l i n e .F o r a l l b i o s y n t h e t i c i n t e r m e d i a t e s e x c e p t 1 6 : A c y l , s i g n i f -i c a n t d i f f e r e n c e s w e r e f o u n d 3 0 a n d 7 2 h r a f t e r t h e t i m e o fd e c a p i t a t i o n ( F i g . 2 ) . By 7 2 h r , t i t e r s f r o m c o n t r o l f e m a l e s f o rt h e s e i n t e r m e d i a t e s r a n g e d f r o m 4 t o 8 t i m e s g r e a t e r t h a nA

2 0 0 -0 )I--E0 )c )cC0E

0

C2 0 0 0 -0 )E0 )._

C I L

0c o. 07 O0 O

R B L R0 S a l ( 6 0 )U BE ( 9 9 )( 2 4 )

M S a l ( 2 2 7 )* BE ( 1 2 7 1 ) *( 2 3 7 )

D e c C o n( 7 8 3 ) ( 7 1 4 )( 3 8 )

B C L3 0 0 E 3 S a l ( 1 8 6 )0 * B E ( 1 0 5 )( 3 3 )

D6 0 0 ]

0 *

r e s p e c t i v e t i t e r s f r o m d e c a p i t a t e d f e m a l e s . M e a n c o m p a r i -s o n s s h o w e d t h a t c h a n g e s i n t h e c o n t r o l / d e c a p i t a t e d t i t e rr a t i o w e r e d u e t o a n i n c r e a s e i n t i t e r f r o m c o n t r o l f e m a l e s a n dt o a d e c r e a s e i n t i t e r f r o m d e c a p i t a t e d f e m a l e s . F o r a l l t i m e se x a m i n e d , d e c a p i t a t e d a n d c o n t r o l f e m a l e s s h o w e d n o d i f -f e r e n c e s i n t i t e r s o f 1 6 : A c y l .U n l i k e t h e RBLR, d e c a p i t a t i o n i n t h e CL d i d n o t r e s u l t i na n y s i g n i f i c a n t c h a n g e i n t i t e r o f t h e p h e r o m o n e Z 7 - 1 2 : OAc( F i g . 3 B ) . D e c a p i t a t e d CL f e m a l e s i n j e c t e d w i t h e i t h e r b r a i ne x t r a c t o r s a l i n e h a d a p h e r o m o n e t i t e r s i m i l a r t o c o n t r o lf e m a l e s i n j e c t e d w i t h e i t h e r b r a i n e x t r a c t o r s a l i n e .I n c o r p o r a t i o n o f A p p l i e d P r e c u r s o r s . T h e e f f e c t o f b r a i ne x t r a c t i n j e c t i o n o n r a d i o l a b e l e d a c e t a t e i n c o r p o r a t i o n i n t op h e r o m o n e d i f f e r e d f o r t h e t w o s p e c i e s . I n t h e R BL R ( F i g .3 C ) , d e c a p i t a t e d o r c o n t r o l f e m a l e s i n j e c t e d w i t h b r a i ne x t r a c t e x h i b i t e d s i g n i f i c a n t l y h i g h e r l e v e l s o f l a b e l i n c o r p o -r a t i o n i n t o p h e r o m o n e t h a n d e c a p i t a t e d o r c o n t r o l f e m a l e si n j e c t e d w i t h s a l i n e . I n t h e CL ( F i g . 3 D ) , d e c a p i t a t e d o rc o n t r o l f e m a l e s i n j e c t e d w i t h b r a i n e x t r a c t h a d s i g n i f i c a n t l yl o w e r l e v e l s o f l a b e l i n c o r p o r a t i o n i n t o p h e r o m o n e t h a nd e c a p i t a t e d o r c o n t r o l f e m a l e s i n j e c t e d w i t h s a l i n e .I n t h e s a m e e x p e r i m e n t u s i n g RBLR, i n j e c t i o n o f b r a i ne x t r a c t a l s o r e s u l t e d i n s i g n i f i c a n t l y h i g h e r l e v e l s o f l a b e l e da c e t a t e i n c o r p o r a t i o n i n t o a l l b i o s y n t h e t i c i n t e r m e d i a t e se x c e p t 1 4 : A c y l ( F i g . 4 ) . L a c k o f s i g n i f i c a n c e i s p r o b a b l y d u et o t h e l o w a m o u n t s o f 1 4 : A c y l f o u n d i n t h e g l a n d ( F i g . 2 ) .A l t h o u g h t h e s p l i t - p l o t d e s i g n d o e s n o t a l l o w s t a t i s t i c a lc o m p a r i s o n s a m o n g t h e f o u r i n d i v i d u a l s u b g r o u p s ( F i g s . 3 Ca n d 4 ) , i t i s n o t e w o r t h y t h a t f o r a l l i n t e r m e d i a t e s l a b e l e da c e t a t e i n c o r p o r a t i o n f r o m f e m a l e s t h a t w e r e d e c a p i t a t e d a n ds a l i n e - i n j e c t e d w a s a l w a y s l o w e s t ( < 3 0 dpm a b o v e b a c k -g r o u n d ) .E f f e c t s o f d e c a p i t a t i o n a n d b r a i n e x t r a c t i n j e c t i o n i n t h eRB L R o n p h e r o m o n e b i o s y n t h e s i s f r o m d e u t e r i u m - l a b e l e dh e x a d e c a n o i c a c i d a r e s h o w n i n T a b l e 1 . S p l i t - p l o t a n a l y s i s o fv a r i a n c e r e v e a l e d n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n t h e a m o u n t s o fd e u t e r i u m - l a b e l e d c o m p o u n d p r e s e n t w h e n f e m a l e s w e r eg r o u p e d a c c o r d i n g t o t h e d a y - 1 ( d e c a p i t a t e d o r c o n t r o l ) o r t h ed a y - 4 ( i n j e c t i o n w i t h b r a i n e x t r a c t o r s a l i n e ) t r e a t m e n t s .RBLR F a t t y A c i d S y n t h e t a s e A c t i v i t y . F a t t y a c i d s y n t h e t a s ea c t i v i t y o f p h e r o m o n e g l a n d s f r o m d e c a p i t a t e d f e m a l e s d i d

6 0 0 -M S a l ( 4 0 0 )* B E ( 1 7 8 ) *( 6 5 )- . 0 - )0 a )c o ,0 -COc c 0 -

- a - - D e c - S a l- i D e c - B E-- o-- C o n - S a l- - . - - C o n - B E

O - - - _ _ . -- " , . 1O-w s w w wm* m *e x ( 0 4 'D e c C o n( 2 4 5 ) ( 3 3 3 )( 6 6 ) C o m p o u n d

wR iF I G . 3 . E f f e c t s o f d e c a p i t a t i o n a n d b r a i n e x t r a c t i n j e c t i o n onp h e r o m o n e t i t e r a n d l e v e l s o f [ 1 - 1 4 C ] a c e t a t e i n c o r p o r a t i o n i n t h eRBLR, Z / E 1 1 - 1 4 : O A c p h e r o m o n e ( A a n d C ) , a n d t h e C L , Z 7 -1 2 : OAc p h e r o m o n e ( B a n d D ) . T h e s p l i t - p l o t d e s i g n wa s s u c h t h a t ond a y 1 , f e m a l e s w e r e d i v i d e d i n t o d e c a p i t a t e d ( D e c ) a n d c o n t r o l ( C o n )g r o u p s , a n d t h e n , o n d a y 4 , e a c h g r o u p wa s f u r t h e r d i v i d e d i n t o t wos u b g r o u p s : o n e r e c e i v e d i n j e c t i o n s o f b r a i n e x t r a c t ( B E ) a n d t h eo t h e r i n j e c t i o n s o f s a l i n e ( S a l ) . RBLR d a t a a r e b a s e d o n f o u rr e p l i c a t e s o f f i v e i n s e c t s , a n d CL d a t a o n t h r e e r e p l i c a t e s o f f i v ei n s e c t s . I n t h e s p l i t - p l o t a n a l y s i s o f v a r i a n c e , s i g n i f i c a n c e ( d e n o t e db y a n a s t e r i s k ; P = 0 . 0 5 ) wa s d e t e r m i n e d f o r t h e d a y - 1 ( D e c v s . C o n )a n d f o r t h e d a y - 4 ( i n j e c t e d w i t h S a l o r B E ) t r e a t m e n t s . T h e m e a n s

( S E ) c o m p a r e d a r e e n c l o s e d i n p a r e n t h e s e s .

F I G . 4 . E f f e c t s o f d e c a p i t a t i o n ( D e c ) a n d b r a i n e x t r a c t ( B E )i n j e c t i o n i n t h e RBLR o n [ 1 - 1 " C ] a c e t a t e i n c o r p o r a t i o n i n t o b i o s y n -t h e t i c i n t e r m e d i a t e s ( f o u r r e p l i c a t e s o f f i v e i n s e c t s ) . T h e s p l i t - p l o td e s i g n a n d a b b r e v i a t i o n s a r e t h e same a s i n F i g . 3 . S t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e ( P = 0 . 0 5 ) , i n d i c a t e d b y a n a s t e r i s k b e l o w t h e c o m p o u n dn a m e , w a s o n l y f o u n d w h e n s u b g r o u p s w e r e s o r t e d a c c o r d i n g t o t h ed a y - 4 t r e a t m e n t [ i n j e c t e d w i t h BE o r s a l i n e ( S a l ) ] . F o r t h e s ec o m p o u n d s , m e a n v a l u e s a r e a s f o l l o w s : i n j e c t e d w i t h B E , i n j e c t e dw i t h S a l , a n d S E . F o r 1 8 : M E v a l u e s a r e 4 3 8 , 7 2 , a n d 1 0 0 ; f o r1 6 : M E v a l u e s a r e 2 0 1 , 6 3 , a n d 3 6 ; f o r Z / E 1 1 - 1 4 : M E v a l u e s a r e 2 8 3 ,7 9 , a n d 4 9 . L i n e s c o n n e c t p o i n t s o f e a c h s u b g r o u p a n d d o n o t i m p l yc o n t i n u i t y . C o n , c o n t r o l .

1 8 0 8 B i o c h e m i s t r y : T a n g e t a l .

8/22/2019 Feromoni 4 +

4/5

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 6 ( 1 9 8 9 ) 1 8T a b l e 1 . E f f e c t s o f d e c a p i t a t i o n a n d b r a i n e x t r a c t i n j e c t i o n o n i n c o r p o r a t i o n o f [ 1 6 , 1 6 , 1 6 - 2 H ] h e x a d e c a n o i c a c i d i n t oi n t e r m e d i a t e s a n d p h e r o m o n e

T r e a t m e n t L a b e l e d c o m p o u n d , n g p e r f e m a l eD a y 1 D a y 4 1 6 : M E 1 4 : M E Z / E 1 1 - 1 4 : ME Z / E 1 1 - 1 4 : O A c

D e c a p i t a t i o n S a l i n e 5 . 0 1 . 2 0 . 3 0 . 1 1 . 3 0 . 2 1 . 4 0 . 4B r a i n e x t r a c t 4 . 5 1 . 1 0 . 4 0 . 1 1 . 3 0 . 2 2 . 2 0 . 7C o n t r o l S a l i n e 4 . 8 1 . 0 0 . 4 0 . 0 4 1 . 9 0 . 4 4 . 2 0 . 6

B r a i n e x t r a c t 4 . 8 2 . 1 0 . 4 0 . 1 1 . 7 0 . 5 3 . 7 1 . 0D a t a a r e p r e s e n t e d o n l y f o r i n t e r m e d i a t e s t h a t o c c u r i n t h e p a t h w a y b e t w e e n h e x a d e c a n o i c a c i d a n d p h e r o m o n e . V a l u e sa r e m e a n s SEM b a s e d o n f o u r r e p l i c a t e s o f f i v e f e m a l e s . S p l i t - p l o t a n a l y s i s o f v a r i a n c e s h o w e d n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e si n t h e a m o u n t o f d e u t e r i u m - l a b e l e d c o m p o u n d f o u n d w h e n m e a n s w e r e g r o u p e d a c c o r d i n g t o t h e d a y - i o r t h e d a y - 4t r e a t m e n t s .n o t d i f f e r f r o m t h a t o f c o n t r o l f e m a l e g l a n d s ( 3 r e p l i c a t e s o f1 0 f e m a l e s ; t w o - t a i l e d u n p a i r e d t t e s t ; P = 0 . 0 5 ) . T h eq u a n t i t i e s ( m e a n SEM) o f 1 8 - a n d 1 6 - c a r b o n f a t t y a c y l sp r o d u c e d f r o m g l a n d s o f d e c a p i t a t e d f e m a l e s w e r e , r e s p e c -t i v e l y , 1 . 4 0 . 1 a n d 0 . 3 0 . 0 2 p m o l p e r f e m a l e a n d , f o rc o n t r o l f e m a l e s , 1 . 1 0 . 1 a n d 0 . 2 0 . 1 p m o l p e r f e m a l e .I n t e r e s t i n g l y , we a l s o f o u n d t h a t t h e 5 : 1 p r o d u c t r a t i o o f t h e 1 8 -t o 1 6 - c a r b o n f a t t y a c y l s f o r t h e p h e r o m o n e g l a n d d i f f e r e d f r o mt h e 1 0 : 1 r a t i o f o u n d f o r t h e r e s t o f t h e b o d y .RBL R L i p i d S y n t h e s i s : B o d y v s . P h e r o m o n e G l a n d . Whenr a d i o l a b e l e d a c e t a t e w a s i n j e c t e d i n t o t h e f e m a l e a b d o m e n( t h r e e r e p l i c a t e s o f f i v e f e m a l e s , t w o - t a i l e d u n p a i r e d t t e s t , P =0 . 0 5 ) , s i g n i f i c a n t l y m o r e l a b e l ( m e a n S E M ) w a s f o u n di n c o r p o r a t e d i n t o l i p i d o f c o n t r o l f e m a l e p h e r o m o n e g l a n d s ( 7 9+ 2 8 dpm p e r f e m a l e ) t h a n d e c a p i t a t e d f e m a l e p h e r o m o n eg l a n d s ( 1 7 4 dpm p e r f e m a l e ) . T h e a m o u n t o f l a b e l i n c o r p o -r a t e d i n t o l i p i d o f t h e r e s t o f t h e b o d y , h o w e v e r , s h o w e d n od i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e t w o t r e a t m e n t s ( 8 6 8 7 1 1 0 1 d p m p e rf e m a l e f o r c o n t r o l f e m a l e s a n d 8 5 6 6 3 7 8 d p m p e r f e m a l e f o rd e c a p i t a t e d f e m a l e s ) . F o r l a b e l i n c o r p o r a t i o n i n t o l i p i d o f t h ep h e r o m o n e g l a n d , l o g a r i t h m i c t r a n s f o r m a t i o n o f t h e d a t a w a sn e c e s s a r y t o s a t i s f y r e q u i r e m e n t s o f e q u a l v a r i a n c e s .R B L R P h e r o m o n e G l a n d O r g a n C u l t u r e . S p l i t - p l o t a n a l y s i so f v a r i a n c e o n l e v e l s o f r a d i o l a b e l e d a c e t a t e i n c o r p o r a t i o n

i n t o p h e r o m o n e a n d a l l b i o s y n t h e t i c i n t e r m e d i a t e s s h o w e d n os i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s w h e n f e m a l e s w e r e g r o u p e d a c c o r d i n gt o t h e d a y - 1 ( d e c a p i t a t i o n o r c o n t r o l ) o r t h e d a y - 4 ( i n c u b a t i o ni n t h e b a s i c m e d i u m o r t h e b a s i c m e d i u m w i t h b r a i n e x t r a c t )t r e a t m e n t s ( t h r e e r e p l i c a t e s o f f i v e f e m a l e s ) . A l t h o u g h a l lc o m p o u n d s w e r e a n a l y z e d , d a t a a r e p r e s e n t e d f o r t h e p h e r -o m o n e a n d 1 8 : A c y l o n l y . F o r l a b e l i n c o r p o r a t i o n i n t o p h e r -o m o n e , m e a n s ( SE f o r t h e c o m p a r i s o n ) f o r d e c a p i t a t e d a n dc o n t r o l f e m a l e s w e r e , r e s p e c t i v e l y , 4 4 5 a n d 5 0 0 dpm p e rg l a n d ( 1 1 0 ) ; m e a n s f o r g l a n d s i n c u b a t e d i n m e d i u m a l o n ea n d m e d i u m w i t h b r a i n e x t r a c t w e r e , r e s p e c t i v e l y , 4 0 3 a n d5 4 1 dpm p e r g l a n d ( 9 8 ) . F o r l a b e l i n c o r p o r a t i o n i n t o1 8 : A c y l , m e a n s f r o m d e c a p i t a t e d a n d c o n t r o l f e m a l e s w e r e1 4 5 a n d 1 3 1 dpm p e r g l a n d ( 1 0 ) ; a n d m e a n s f o r g l a n d si n c u b a t e d i n t h e m e d i u m a l o n e a n d m e d i u m w i t h b r a i n e x t r a c tw e r e 1 6 3 a n d 1 1 3 dpm p e r g l a n d ( 3 3 ) .DISCUSSIONT h e R B L R a n d t h e CL m o t h s b o t h e m p l o y m o n o u n s a t u r a t e da c e t a t e e s t e r s a s t h e m a j o r c o m p o n e n t o f t h e i r s e x p h e r o -mone b l e n d . I n a d d i t i o n , t h e r e a c t i o n s i n v o l v e d i n b i o s y n -t h e s i s a r e c o m m o n t o b o t h s p e c i e s . Y e t , d e s p i t e t h e s es i m i l a r i t i e s , we h a v e f o u n d t h a t t h e i r r e s p e c t i v e c o n t r o lm e c h a n i s m s f o r p h e r o m o n e p r o d u c t i o n a p p e a r d i f f e r e n t .P h e r o m o n o t r o p i c a c t i v i t y h a s b e e n d o c u m e n t e d f o r CLb r a i n e x t r a c t s w h e n i n j e c t e d i n t o RB L R o r E u r o p e a n c o r nb o r e r r e c i p i e n t f e m a l e s ( L . S . a n d W . L . R . , u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) .H o w e v e r , o u r d a t a d e m o n s t r a t e t h a t b i o s y n t h e s i s o f t h e m a i np h e r o m o n e c o m p o n e n t , Z 7 - 1 2 : O A c , i n t h e C L , w a s n o t d e -p e n d e n t o n t h e p r e s e n c e o f t h e h e a d , a n d , b y i n f e r e n c e , o n t h eb r a i n h o r m o n e p r e v i o u s l y c h a r a c t e r i z e d b y o t h e r s ( 5 - 7 ) . D e -

c a p i t a t e d CL f e m a l e s s h o w e d n o d i f f e r e n c e s i n p h e r o m o n e t i t e r

c o m p a r e d t o c o n t r o l s a n d e x h i b i t e d n o d i f f e r e n c e s i n l e v e l sl a b e l e d a c e t a t e i n c o r p o r a t i o n i n t o p h e r o m o n e . B o t h r e s us t r o n g l y i n d i c a t e t h a t d e n o v o r a t e s o f p h e r o m o n e b i o s y n t h ei n d e c a p i t a t e d a n d c o n t r o l f e m a l e s w e r e s i m i l a r . When b re x t r a c t w a s i n j e c t e d i n t o d e c a p i t a t e d o r c o n t r o l f e m a l e s ,f o u n d a s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n l a b e l e d a c e t a t e i n c o r p o r a ti n t o p h e r o m o n e a s c o m p a r e d t o f e m a l e s i n j e c t e d w i t h s a l i n e .i s p o s s i b l e t h a t b y i n j e c t i n g b r a i n e x t r a c t , f e m a l e s w e r e e x p o st o a f a c t o r n o r m a l l y n o t r e l e a s e d i n v i r g i n s . A f a c t o r w i tn e g a t i v e i n f l u e n c e o n p h e r o m o n e b i o s y n t h e s i s , h o w e v e r , mc o m e i n t o p l a y a f t e r m a t i n g o c c u r s .U n l i k e t h e C L , t h e R BL R r e p r e s e n t s a c a s e i n w h i c hf a c t o r , p r e s u m a b l y s i m i l a r t o t h e b r a i n h o r m o n e ( 5 - 7 ) , wr e q u i r e d f o r p h e r o m o n e b i o s y n t h e s i s . D e c a p i t a t i o n r e s u li n a s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n p h e r o m o n e t i t e r , w h i c h c a na t t r i b u t e d b y c o m p a r i s o n w i t h c o n t r o l t i t e r s t o l a c kp r o d u c t i o n a n d t o a d e c r e a s e i n i n i t i a l a m o u n t s . Whd e c a p i t a t e d o r c o n t r o l f e m a l e s w e r e i n j e c t e d w i t h b re x t r a c t , s i g n i f i c a n t l y h i g h e r l e v e l s o f l a b e l e d a c e t a t e w ei n c o r p o r a t e d i n t o p h e r o m o n e a n d a l l a b u n d a n t b i o s y n t h e ti n t e r m e d i a t e s . S i m i l a r e f f e c t s w e r e a l s o o b s e r v e d w he x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d a t m i d - p h o t o p h a s e ( J . D .u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) . T h e s e r e s u l t s i m p l y t h a t t h e b rh o r m o n e a c t e d b y s t i m u l a t i n g t h e s y n t h e s i s o f t h e f ii n t e r m e d i a t e s i n t h e p a t h w a y ( i . e . , t h e 1 8 - a n d 1 6 : A cp r o d u c t s o f f a t t y a c i d s y n t h e t a s e ) . T h u s , i n d e c a p i t as a l i n e - i n j e c t e d f e m a l e s , o n e w o u l d e x p e c t n o d e n o v o st h e s i s o f p a t h w a y i n t e r m e d i a t e s b e c a u s e n o b r a i n h o r m ow a s p r e s e n t . I n d e e d , a m o u n t s o f l a b e l e d a c e t a t e i n c o rr a t i o n f o r i n t e r m e d i a t e s w e r e h a r d l y a b o v e b a c k g r o u n dt h i s t r e a t m e n t s u b g r o u p .A d d i t i o n a l e v i d e n c e i n s u p p o r t o f b r a i n h o r m o n e a c t i o nt h e RB L R o n s y n t h e s i s o f t h e f i r s t f a t t y a c i d i n t e r m e d i a t e st h e p a t h w a y , a s o p p o s e d t o o t h e r s t e p s , w a s p r o v i d e de x p e r i m e n t s w i t h d e u t e r i u m - l a b e l e d h e x a d e c a n o i c a c i d . Tr e s u l t s s h o w e d t h a t d e c a p i t a t e d f e m a l e s p r o c e s s e d s i m ia m o u n t s o f d e u t e r i u m - l a b e l e d p r e c u r s o r i n t o p h e r o m o n e ai n t e r m e d i a t e s a s c o n t r o l s . F u r t h e r m o r e , i n j e c t i o n o f b re x t r a c t h a d n o i n f l u e n c e o n t h e a m o u n t o f l a b e l i n c o r p o r ai n t o p h e r o m o n e . A p p a r e n t l y , e n z y m e a b u n d a n c e s a n d a c ti t y s t a t e s f o r t h e s e r i e s o f r e a c t i o n s t h a t c o n v e r t 1 6 : A c y l ip h e r o m o n e w e r e u n a f f e c t e d b y d e c a p i t a t i o n o r b r a i n e x t ri n j e c t i o n . H e n c e , t h e b r a i n h o r m o n e d i d n o t i n f l u e n c e t hs t e p s .P r e v i o u s r e p o r t s h a v e e m p h a s i z e d 1 6 : A c y l a s t h e f i r s t f aa c i d i n t e r m e d i a t e f o r m e d i n t h e p a t h w a y o f p h e r o m ob i o s y n t h e s i s ( 8 - 1 1 ) ; h o w e v e r , o u r r e s u l t s i n t h e R BL R f a1 8 : A c y l . F i r s t , 1 8 : A c y l w a s t h e m o r e a b u n d a n t p r o df o r m e d b y f a t t y a c i d s y n t h e t a s e , a n d s e c o n d , g l a n d u l a r to f 1 8 : A c y l d e c r e a s e d a f t e r d e c a p i t a t i o n , w h e r e a s t h e t i t e1 6 : A c y l r e m a i n e d u n c h a n g e d . A l t h o u g h we d o n o t k n o ws p e c i f i c f o r m i n w h i c h t h e s e i n t e r m e d i a t e s a r e u s e dp h e r o m o n e b i o s y n t h e s i s , we c a n i n f e r t h a t i n t e r m e d i a t e s ts h o w e d d i f f e r e n c e s r e p r e s e n t e d s t o r e d p o o l s t h a t c o u l da d d e d t o a n d t a k e n f r o m . F o r 1 6 : A c y l , s t a t u s q u o wm a i n t a i n e d s u g g e s t i n g t h a t t h e s t o r e d p o o l e x i s t e d i n a f o

B i o c h e m i s t r y : T a n g e t a l .

8/22/2019 Feromoni 4 +

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U SA 8 6 ( 1 9 8 9 )u n a v a i l a b l e f o r p h e r o m o n e b i o s y n t h e s i s . I n a d d i t i o n , t h ef o r m o f 1 6 : A c y l p r o d u c e d d u r i n g p h e r o m o n e b i o s y n t h e s i s ( a sa r e s u l t o f c h a i n s h o r t e n i n g o f 1 8 : A c y l ) i s p r o b a b l y s h o r t -l i v e d , b e f o r e i t i m m e d i a t e l y u n d e r g o e s a n o t h e r r o u n d o f c h a i ns h o r t e n i n g t o 1 4 : A c y l .S i n c e t h e k e y t o b r a i n h o r m o n e a c t i o n i n t h e RB L Ra p p e a r e d t o l i e i n t h e p r o d u c t i o n o f 1 8 - a n d 1 6 : A c y l f r o ma c e t y l - C o A , we c o m p a r e d d e c a p i t a t e d a n d c o n t r o l f e m a l ep h e r o m o n e g l a n d s f o r f a t t y a c i d s y n t h e t a s e a c t i v i t y . Nod i f f e r e n c e s w e r e d e t e c t e d w i t h r e g a r d t o q u a n t i t y o r q u a l i t yo f e n d p r o d u c t f o r m e d , s u g g e s t i n g t h a t f a t t y a c i d s y n t h e t a s ew a s n o t t h e t a r g e t o f t h e b r a i n h o r m o n e . L i k e w i s e , t h e r e w e r en o d i f f e r e n c e s i n l a b e l e d a c e t a t e i n c o r p o r a t i o n i n t o i n t e r m e -d i a t e s a n d p h e r o m o n e when g l a n d s f r o m d e c a p i t a t e d a n dc o n t r o l f e m a l e s w e r e i n c u b a t e d i n g l a n d c u l t u r e w i t h o rw i t h o u t b r a i n e x t r a c t . T h e r e f o r e , w h e n p h e r o m o n e g l a n d sw e r e i n c u l t u r e , a c e t a t e f r e e l y e n t e r e d t h e c e l l s a n d a l le n z y m e s n e c e s s a r y f o r f a t t y a c i d s y n t h e s i s w e r e a c t i v e .I n l i g h t o f t h e s e r e s u l t s , i t a p p e a r s t h a t i n i n v i v o e x p e r i -m e n t s , t h e t o p i c a l l y a p p l i e d a c e t a t e w a s n o t d i r e c t l y a b s o r b e db y t h e p h e r o m o n e g l a n d c e l l s b u t i n s t e a d w a s p r e f e r e n t i a l l yi n c o r p o r a t e d b y o t h e r t i s s u e s . T h i s i s s u p p o r t e d b y t h e f a c tt h a t a n a l y s i s o f f e m a l e b o d i e s a f t e r p h e r o m o n e g l a n d s w e r er e m o v e d s h o w e d t h a t t h e t o p i c a l l y a p p l i e d a c e t a t e w a si n c o r p o r a t e d a t h i g h l e v e l s i n t o l i p i d s o f t h e r e s t o f t h e b o d y .M o r e o v e r , i n c o r p o r a t i o n l e v e l s w e r e t h e s a m e r e g a r d l e s s o ft r e a t m e n t ( d e c a p i t a t e d o r n o t , i n j e c t e d w i t h b r a i n e x t r a c t o rn o t - a l l f e m a l e s s h o w e d = 5 0 0 0 dpm p e r b o d y ) . I n j e c t i o n o fl a b e l e d a c e t a t e i n t o t h e b o d y a l s o d e m o n s t r a t e d t h a t a l t h o u g hd e c a p i t a t i o n h i n d e r e d l i p i d s y n t h e s i s i n t h e p h e r o m o n e g l a n d ,i t d i d n o t i n t e r f e r e w i t h l i p i d s y n t h e s i s i n t h e r e s t o f t h e b o d y .O v e r a l l , o u r r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e b ra i n h o r m o n e a c t s o ns o m e o t h e r t i s s u e t h a t i n t u r n s u p p l i e s s u b s t r a t e t o t h ep h e r o m o n e g l a n d f o r f a t t y a c i d , a n d h e n c e , p h e r o m o n eb i o s y n t h e s i s .

We t h a n k K . P o o l e a n d M . C a m p b e l l f o r r e a r i n g i n s e c t s , a n d D r .J . B o u r k e a n d H . L e i ch t we i s f o r p r o v i d i n g a c c e s s t o a n d a s s i s t a n c ei n u s i n g t h e G C / m a s s s p e c t r o m e t e r . T h i s r e s e a r c h w a s s u p p o r t e d b ya g r a n t f r o m t h e N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n ( D C B - 8 7 1 1 9 5 5 ) .1 . T a n g , J . D . , C h a r l t o n , R . E . , C a r d d , R . T . & Y i n , C . - M . ( 1 9 8 7 )J . I n s e c t P h y s i o l . 3 3 , 4 6 9 - 4 7 6 .2 . S a s a k i , M . , R i d d i f o r d , L . M . , T r u m a n , J . W . & M o o r e , J . K .( 1 9 8 3 ) J . I n s e c t P h y s i o l . 2 9 , 6 9 5 - 7 0 5 .3 . I t a g a k i , H . & C o n n e r , W. E . ( 1 9 8 6 ) J . I n s e c t P h y s i o l . 3 2 , 6 5 7 -6 6 4 .4 . I t a g a k i , H . & C o n n e r , W . E . ( 1 9 8 7 ) J . I n s e c t P h y s i o l . 3 3 , 1 7 7 -1 8 1 .5 . R a i n a , A . K . & K l u n , J . A . ( 1 9 8 4 ) S c i e n c e 2 2 5 , 5 3 1 - 5 3 2 .6 . A n d o , T . , A r i m a , R . , U c h i y a m a , M . , N a g a s a w a , H . , I n o u e , T .& S u z u k i , A . ( 1 9 8 8 ) A g r i c . B i o l . C h e m . 5 2 , 8 8 1 - 8 8 3 .7 . R a i n a , A . K . , J a f f e , H . , K l u n , J . A . , R i d g w a y , R . L . & H a y e s ,D . K . ( 1 9 8 7 ) J . I n s e c t P h y s i o l . 3 3 , 8 0 9 - 8 1 4 .8 . B j o s t a d , L . B . & R o e l o f s , W. L . ( 1 9 8 3 ) S c i e n c e 2 2 0 , 1 3 8 7 - 1 3 8 9 .9 . B j o s t a d , L . B . & R o e l o f s , W. L . ( 1 9 8 1 ) J . B i o l . C h e m . 2 5 6 ,7 9 3 6 - 7 9 4 0 .1 0 . B j o s t a d , L . B . & R o e l o f s , W . L . ( 1 9 8 6 ) J . C h e m . E c o l . 1 2 , 4 3 1 -4 5 0 .1 1 . B j o s t a d , L . B . , W o l f , W . A . & R o e l o f s , W . L . ( 1 9 8 7 ) i nP h e r o m o n e B i o c h e m i s t r y , e d s . P r e s t w i c h , G . D . & B l o m q u i s t ,G . J . ( A c a d e m i c , O r l a n d o , F L ) , p p . 7 7 - 1 2 0 .1 2 . M o r s e , D . & M e i g h e n , E . ( 1 9 8 7 ) i n P h e r o m o n e B i o c h e m i s t r y ,

e d s . P r e s t w i c h , G . D . & B l o m q u i s t , G . J . ( A c a d e m i c , O r l a n d o ,F L ) , p p . 1 2 1 - 1 5 8 .1 3 . G l a s s , E . H . & R o e l o f s , W. L . ( 1 9 8 5 ) i n H a n d b o o k o f I n s e c tR e a r i n g , e d s . S i n g h , P . & M o o r e , R . F . ( E l s e v i e r , A m s t e r d a m ) ,p p . 1 9 7 - 2 0 5 .1 4 . C a r r o w , G . M . , C a l a b r e s e , R . L . & W i l l i a m s , C . M . ( 1 9 8 1 )P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 8 , 5 8 6 6 - 5 8 7 0 .1 5 . C a r d d , R . T . , C o m e a u , A . , B a k e r , T . C . & R o e l o f s , W. L .( 1 9 7 5 ) E x p e r i e n t i a 3 1 , 4 6 - 4 8 .1 6 . S o w e r , L . L . , S h o r e y , H . H . & G a s t o n , L . K . ( 1 9 7 1 ) A n n .E n t o m o l . S o c . Am. 6 4 , 4 8 8 - 4 9 2 .1 7 . B j o s t a d , L . B . , W o l f , W. A . & R o e l o f s , W. L . ( 1 9 8 1 ) I n s e c tB i o c h e m . 1 1 , 7 3 - 7 9 .1 8 . G r a c e , T . D . C . ( 1 9 6 2 ) N a t u r e ( L o n d o n ) 1 9 5 , 7 8 8 - 7 8 9 .

1 8 1 0 B i o c h e m i s t r y : T a n g e t a l .