ミクロンサイズの 球形アパタイト粒子を ... ·...
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ミクロンサイズの球形アパタイト粒子を
簡単に合成
兵庫県立大学 工学研究科 機械系工学専攻
准教授 飯村 健次
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研究背景
生体材料として既に実用段階にあるヒドロキシアパタイトですが、もう一つタンパク質の分離精製にも大きなニーズがあります。
簡単に適度な大きさの粒子が得られれば、また優れた分離特性を持つものであれば、大儲けも夢ではありません
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ヒドロキシアパタイト
生体親和性に優れている
人工骨，人工歯根
イオン交換特性に優れている
Ca10(PO4)6(OH)2
ヒドロキシアパタイトとは？
タンパク質吸着クロマトグラフィー用カラム
直接的な応用
間接的な応用
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ある生体機能に関与するタンパク質を特定
種々のタンパク質が生体内に存在
多様な役割を果たしている
遺伝子治療
品種改良
タンパク質を分離精製する必要性
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新技術の基となる研究成果・技術一般的な合成法と形状
カラム充填材に最適な粒子径は５ µm ～２０µm
圧力損失
大
圧力損失
小
針状ヒドロキシアパタイト
湿式法
カラム充填の際目詰まりするため使い難い
欠点
µm以下
一般的に板状ヒドロキシアパタイトは合成不可能
塩基性タンパク質を吸着分離できない
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ヒドロキシアパタイトのタンパク質吸着特性
c
a
b
Ca2＋
PO43-OH-
acidicprotein
－ooc－ooc
＋H3N
Basic protein
＋H3N＋H3N＋H3N
a軸に沿って成長板状アパタイト
塩基性タンパク質がより吸着
c軸に沿って成長
針状アパタイト
酸性タンパク質がより吸着
形状を変えることで吸着するタンパク質を制御
－ooc－ooc
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60℃で保持し熟成→結晶化促進・細分化
比較的均一な球形粒子
W/O乳化液膜法
二リン酸カリウム
相分離
水-エタノール混合溶液
塩化カルシウム水溶液
W/O乳化液膜状態
熟成前(４０µm)
２時間熟成後(５µm)
１０µm
１００µm
イオン交換が十分でなく結晶化していない
（半液滴状態）
リンとカルシウムが反応→シェルを形成
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mμ100
Just after adding CaCl2 aqPrecursor CA. 20～30μm Spherical particles CA. 5μm
After 2hrs
mμ100
mμ100After 1hr
Disrupture of precursorGeneration of finer spherical partiles
at 60℃
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Optical microscope images of particles for several ethanol concentrations (a) 90wt%, (b) 60wt% and (c) 40wt%.
粒子径もある程度制御可能
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ヒドロキシアパタイトではない
XRD解析結果
熟成後
HAP
K2CaP2O7
ピロフォスフェイト(K2CaP2O7)
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結晶相を転移させる一般的な手法
水熱合成法
①
②
①ポータブルリアクター
②温度コントローラー
１５０℃で２４時間水熱処理
水熱合成
フライアッシュ ゼオライト
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水熱前(ピロフォスフェイト) 水熱後(HAp)
水熱合成後の物性評価
24h熟成後
HAP
K2CaP2O7
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pH値がカルシウム溶出量におよぼす影響
高pH
PO4K
OH
Ca
界面で反応 球形のままHAp転移？
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高ｐH下での水熱合成（NaOH添加）
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吸光度を分光光度計により測定
試料 蒸留水
タンパク質吸着実験
使用したタンパク質
酸性タンパク質：アルブミン （RCH(NH2)COOH ）のアミノ酸約600から成る
塩基性タンパク質：リゾチーム （C616H963N193O182S10・XHCl）
対照試料：市販アパタイト（湿式法）
酸性または塩基性タンパク質水溶液
(100ppm)
アパタイト粒子
２時間振とう
酸性タンパク質(アルブミン)吸着
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
200 250 300 350 400
波長[nm]
吸光
度[a
.u.]
24時間 150℃水熱
湿式法アパタイト
例
蒸留水
アルブミン
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リゾチー
ム吸
着量
(mg/
m2 )
塩基性タンパク質（リゾチーム）
得られたアパタイトは塩基性タンパク質のみ吸着
酸性タンパク質（アルブミン）
アルブミン吸
着量
(mg/
m2 )
リゾチー
ム吸
着量
(mg/
m2 )
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ゼータ電位測定結果
湿式法HAp(２０．６ｍＶ)
－ ＋
０
水熱合成後 ｐH１４(－１２．３ｍＶ)
０
－ ＋
表面は負に帯電
板状アパタイトの合成に成功？
吸着特性＋表面電位
表面は正に帯電
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XRDによる結晶面解析
c面ピークa面ピーク
板状であれば c面のピーク>a面のピーク
ではなぜ塩基性タンパク質を吸着したのか？
針状アパタイトの集合体
×
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しかし，負に帯電
カルシウム欠損型HAp？
Ca10－ X(PO4)6(OH)2－X
板状HApではない
Ca＋
Ca＋
Ca＋
Ca＋
＋H2N
塩基性タンパク質
＋H2N＋H2N
＋H2N
PO43－
PO43－
PO43－
PO43－
針状HApであった
K2CaP2O7
))((
))((
))((
))((
考察
詳細なメカニズムは不明であるが
塩基性タンパク質を選択的に吸着する
球形アパタイト粒子の合成に成功した
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想定される用途
• これまで無かったタンパク質分離カラムに
• また、達成された吸着挙動に着目すると、重金属イオンの分離といった分野・環境用途に展開することも可能と思われる。
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実用化に向けた課題
• 現在、強度等の物性の点が不明である。
• 今後、タンパク質分離について実験データを取得し、カラム充填剤に適用していく場合の条件設定を行っていく。
企業への期待
• 分離精製に知見を持つ、企業との共同研究を希望。
• また、生体分野への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。
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本技術に関する知的財産権
• 発明の名称 ：球状ヒドロキシアパタイ
ト及びその製造方法
• 出願番号 ：特願2009-232624
• 出願人 ：兵庫県
• 発明者 ：飯村健次
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お問い合わせ先
兵庫県立大学 知的財産本部
知的財産コーディネーター 林谷正雄
ＴＥＬ 078-367-8645
ＦＡＸ 078-362-0654
e-mail [email protected]