【プレゼン資料】ゲノム編集新ツール 実験時間の短 …...2 本日の内容...
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The world leader in serving science
2014年8月8日(金)
ライフテクノロジーズジャパン株式会社
サーモフィッシャーサイエンティフィックグループ
ゲノム編集オンラインセミナーゲノム編集オンラインセミナーゲノム編集オンラインセミナーゲノム編集オンラインセミナー
ゲノム編集にもっと自由を:実験時間の短縮、マルチプレックス、
より多種類の細胞、のための新製品登場
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本日の内容
• ゲノム編集で遺伝子改変ができる仕組み
• 現在のゲノム編集の手法とそれぞれの使用目的
• Cas9 mRNAとgRNA発現エレメントの共導入の利点
• 実験データ
• 様々な細胞タイプでのゲノム編集
• iPS細胞でのゲノム編集
• マルチプレックス(複数ターゲット) のゲノム編集
• mRNAトランスフェクション試薬の効果
• まとめ
• 質疑応答 15分
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ゲノム編集で遺伝子改変ができる仕組み
�CRISPR/Cas9�TALENs
標的部位における二本鎖標的部位における二本鎖標的部位における二本鎖標的部位における二本鎖DNA切断切断切断切断
非相同末端結合非相同末端結合非相同末端結合非相同末端結合
Non-homologous End-Joining (NHEJ)
相同組換え相同組換え相同組換え相同組換え
Homologous Recombination (HR)
疾患に強い遺伝子導入植物疾患に強い遺伝子導入植物疾患に強い遺伝子導入植物疾患に強い遺伝子導入植物 幹細胞エンジニアリングと幹細胞エンジニアリングと幹細胞エンジニアリングと幹細胞エンジニアリングと
遺伝子治療遺伝子治療遺伝子治療遺伝子治療
組織と動物の疾患モデル組織と動物の疾患モデル組織と動物の疾患モデル組織と動物の疾患モデル
応用分野応用分野応用分野応用分野
高頻度の塩基欠失高頻度の塩基欠失高頻度の塩基欠失高頻度の塩基欠失/挿入で挿入で挿入で挿入で
フレームシフトによりノックアウトフレームシフトによりノックアウトフレームシフトによりノックアウトフレームシフトによりノックアウト
切断付近の相同配列を含む切断付近の相同配列を含む切断付近の相同配列を含む切断付近の相同配列を含む
ドナードナードナードナーDNA存在下でノックイン存在下でノックイン存在下でノックイン存在下でノックイン
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主要な2つのゲノム編集ツールの比較
CRISPR/Cas TALs
特⻑�一本鎖RNAがCas9ヌクレアーゼを標的部位に誘導�迅速、簡易なクローニング�複数ターゲットのゲノム編集
�DNA結合タンパク質が、Fok1ヌクレアーゼを標的部位に誘導�⾼精度�様々なゲノム編集オプション
- 遺伝子発現の活性化/抑制- エピゲノム編集
発現ベクター準備 〜1週間 4週間(受託サービス利⽤)
標的配列選定時のフレキシビリティ ◎ ○
特異性 △(情報が不⼗分) ◎ゲノム編集オプション
�ノックアウト�ノックイン
�ノックアウト�ノックイン�遺伝子発現制御(活性化/抑制)�任意の機能ドメインを利⽤可
ライセンス - 治療分野を除き、開発・商業目的での使⽤は弊社がサブライセンス権を有する
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CRISPR/Cas9ツールの種類ツールの種類ツールの種類ツールの種類
GeneArt® CRISPR Nuclease
Vector(約約約約9 kb)
CRISPR/Cas9 システムの構成要素システムの構成要素システムの構成要素システムの構成要素
1. Cas9 nuclease: 二本鎖DNA切断酵素
2. gRNA: 1本鎖RNAとしてゲノム編集のターゲット配列に
相補的に結合, Cas9を誘導
オールインワンベクターオールインワンベクターオールインワンベクターオールインワンベクター1
2 Cas9 ととととgRNA を共を共を共を共導入導入導入導入
gRNA
Cas9: Cas9発現ベクター, mRNA あるいはタンパク質
gRNA: gRNA発現ベクター, 二本鎖DNAフラグメント, RNA
OFP ベクターベクターベクターベクター: セルソータ―を用いた細胞濃縮
CD4 ベクターベクターベクターベクター: 磁気ビーズを用いた細胞濃縮
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Cas9 ととととgRNA を共を共を共を共導入する方法とは導入する方法とは導入する方法とは導入する方法とは?
500 bp
~100 bp
Cap, polyA構造が付加した、構造が付加した、構造が付加した、構造が付加した、Wild type Cas9 nuclease をコードするをコードするをコードするをコードする mRNA
ターゲット遺伝子特異的にデザインされたターゲット遺伝子特異的にデザインされたターゲット遺伝子特異的にデザインされたターゲット遺伝子特異的にデザインされたgRNA発現カセット発現カセット発現カセット発現カセット
• Cas9 mRNA とターゲット特異的にデザイン
されたgRNAを一緒にトランスフェクション
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2つのつのつのつのCRISPR/Cas9ツールとそれぞれの価値ツールとそれぞれの価値ツールとそれぞれの価値ツールとそれぞれの価値
オールインワンベクターオールインワンベクターオールインワンベクターオールインワンベクター Cas9ととととgRNAを共を共を共を共導入導入導入導入
メリット �1種類のプラスミドで実施
�スクリーニング後に、成功したCRISPRを
保存するのに適する
�Cas9と共発現するレポーター遺伝子で細
胞濃縮可
�クローニング不要
�より小さなDNAサイズによる、細胞導
入効率の改善
�導入困難な細胞のための、T7プロモ
ーターオプション
�マルチプレックスのゲノム編集
デメリット �gRNAエンコード領域のクローニング必要
�ベクターが大きく(10kb以上)、トランスフェ
クション効率の改善が難しい場合もある
�Cas9, gRNAのプロモーター制約で使用
できる細胞が決まる(ex. U6, CMV)
�レポーター遺伝子による細胞濃縮を行
うことができない
最適な対象
サンプル/アプリケーシ
ョン
�哺乳類培養細胞 �オールインワンベクターではゲノム編
集効率の低い細胞
�幹細胞など遺伝子導入困難な細胞
�胚へのマイクロインジェクション
�マルチプレックスゲノム編集
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実験ワークフローの比較
• Cas9, gRNAはReady-to transfectのため、クローニングに要する時間を短
縮することができます
オールインワンベクターオールインワンベクターオールインワンベクターオールインワンベクター
Day1 Day2 Day3 Day4 Day6 Day7
Cas9ととととgRNAの共の共の共の共導入導入導入導入
Day1 Day2
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トランスフェクション効率について
Lipofectamine
® 3000以前以前以前以前
Lipofectamine
® 3000
HEK293
Hela
Cho-K1
Cos7
C2C12
HCT116
Hep3B
Hepa1-6
H 578T
HT1080
N2A
3T3
4T1
A549
ACHN
H460
H9C2
HuH7
K562
LNCap
Lipofectamine
® 3000以前以前以前以前
Lipofectamine
® 3000
MCF7
MDA-MB-435
NCI-H23
P19
PANC-1
PC12
SK-ME
SK-MEL-28
SW480
T986
Vero
U2OS
A431
bend3
BJ
BT-549
C6
CaCo
CHO-S
COLO 205
DU 145
HCC1937
Lipofectamine
® 3000以前以前以前以前
Lipofectamine
® 3000
HepG2
HT29
Jurkat
L6
L929
MCF 10A
MDA-MB-231
MDA-MB-468
MDCK
NCI-H460
Raw
RBL
RD
Saos-2
SH-SY5Y
SK-Br-3
SKN-SH
SK-OV-3
SW620
U937
トランスフェクション容易トランスフェクション容易トランスフェクション容易トランスフェクション容易
70%以上か発現倍率等価以上か発現倍率等価以上か発現倍率等価以上か発現倍率等価
トランスフェクション容易トランスフェクション容易トランスフェクション容易トランスフェクション容易
70%以上か発現倍率等価以上か発現倍率等価以上か発現倍率等価以上か発現倍率等価
トランスフェクション中間トランスフェクション中間トランスフェクション中間トランスフェクション中間
40-70%か発現倍率等価か発現倍率等価か発現倍率等価か発現倍率等価
トランスフェクション中間トランスフェクション中間トランスフェクション中間トランスフェクション中間
40-70%か発現倍率等価か発現倍率等価か発現倍率等価か発現倍率等価
トランスフェクション困難トランスフェクション困難トランスフェクション困難トランスフェクション困難
<40か発現倍率等価か発現倍率等価か発現倍率等価か発現倍率等価
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ゲノム編集の評価: ミスマッチ認識酵素による切断アッセイ
変異が入った箇所変異が入った箇所変異が入った箇所変異が入った箇所
ゲノムゲノムゲノムゲノム
PCRによる増幅による増幅による増幅による増幅
熱変性、アニール熱変性、アニール熱変性、アニール熱変性、アニール
ミスマッチ認識酵素にミスマッチ認識酵素にミスマッチ認識酵素にミスマッチ認識酵素による切断よる切断よる切断よる切断
ミスマッチミスマッチミスマッチミスマッチ
切断切断切断切断
PCR産物産物産物産物
電気泳動により確認電気泳動により確認電気泳動により確認電気泳動により確認
① ② ③
変異導入サンプル変異導入サンプル変異導入サンプル変異導入サンプル
電気泳動の結果電気泳動の結果電気泳動の結果電気泳動の結果
切断されたバンド
• ミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼを使用
• PCR産物中のミスマッチ部位を切断することで変異があるとバンドが切断される
• 元のバンドと切断されたバンドの量比から変異率が算出される(indel%)
原理原理原理原理
�汎用性高く、比較的定量性あり
�多サンプルの評価向き
�変異導入率が低いサンプルやDNA二次構造や
SNPを持つ部位に弱い
0 25 32 Indel(%)
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複数の細胞タイプにおける効率的なゲノム編集
IVT:in vitro転写したgRNA
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+ MEGAclear™Transcription Clean-Up Kit (AM1908)
プロモーターの制約を無くし、多様な細胞で使用可能
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iPS細胞におけるゲノム編集効率の改善
IVT:in vitro転写したgRNA
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マルチプレックスゲノム編集によるスクリーニング
• あるターゲット遺伝子について複数のgRNAを設計し、最適な切断サイトをスクリーニング
• 複数ターゲット遺伝子について、それぞれ設計したgRNAを同時に使用してスクリーニング
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実験結果1. – in vitro 転写gRNAを用いたマルチプレックス
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実験結果2. –U6-gRNAを用いたマルチプレックス
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mRNAトランスフェクション試薬
mRNA導入のためのトランスフェクション試薬
1. GeneArt® CRISPR Nuclease mRNA (A25640)の
細胞導入をサポートするために0.3 mLサイズのプ
ロトタイプとして先行販売
2. GeneArt® CRISPR Nuclease mRNAおよび、
in vitro転写gRNAの共導入にぜひお試しください。
Lipofectamine® MessengerMAXについて詳しくは
WEBページhttps://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/LMRNA003 をご覧ください
型番型番型番型番 製品名製品名製品名製品名 サイズサイズサイズサイズ 価格価格価格価格
LMRNA003 GeneArtR CRISPR Nuclease mRNA 0.3ml ¥26,000
記載の価格は2014年8月現在の価格です。消費税は含まれておりません。価格は予告なしに変更する場合がありますので、予めご了承ください。
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まとめ
• 時間と手間の短縮
• GeneArt® CRISPR Nuclease mRNA、CRISPR Strings™ U6 DNA はReady-to-transfect。ベクターへのクローニングを省略し時間を短縮。
• CRISPR Strings™ は標的サイトのデザインサービスも無償提供
• 複数ターゲットのゲノム編集
• 複数のCRISPR Strings™ をCas9 mRNA とともに細胞導入することでマルチプレッ
クスゲノム編集が可能。
• コスト面でもより手軽に多数のgRNA 発現エレメントを入手可能。
• より幅広い細胞や胚でのゲノム編集を実現
• Cas9 ヌクレアーゼやgRNA 発現のためのプロモーターの制約が無くなり、より幅広
い細胞や胚でのゲノム編集を実現。
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弊社が提供するCRISPR/Cas9 ツールのまとめ
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CRISPR/Cas9 システム選択ガイド
GeneArt® CRISPR Nuclease
Vector
GeneArt® CRISPR Nuclease mRNA+ Strings™
U6 DNA
GeneArt® CRISPR Nuclease mRNA+ Strings™
T7 DNA
単一プラスミド上に単一プラスミド上に単一プラスミド上に単一プラスミド上にCas9ととととgRNA発現発現発現発現
エレメントをもつオールインワンフォーエレメントをもつオールインワンフォーエレメントをもつオールインワンフォーエレメントをもつオールインワンフォー
マットマットマットマット
○○○○
レポーター遺伝子レポーター遺伝子レポーター遺伝子レポーター遺伝子
○○○○
OFPまたはまたはまたはまたはCD4
Ready-to-transfect ○○○○
幅広い細胞タイプ幅広い細胞タイプ幅広い細胞タイプ幅広い細胞タイプ への適用可否への適用可否への適用可否への適用可否 ○○○○
in vivo 実験への適用可否への適用可否への適用可否への適用可否 ○○○○
ゲノムへのランダム導入を回避するかゲノムへのランダム導入を回避するかゲノムへのランダム導入を回避するかゲノムへのランダム導入を回避するか ○○○○
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• GeneArt® CRISPR Nuclease mRNA
• Cap, polyA付加の野生型Cas9ヌクレアーゼmRNA
• 単独, またはCRISPR Strings™ DNA と共に購入
Appendix. 製品情報
• GeneArt® CRISPR Strings™ DNA
• カスタム合成の二本鎖DNA断片
• ターゲット特異的なガイドRNA(gRNA)をデザインし、合成
• 標的としたゲノム遺伝子座にCas9タンパク質を誘導
• 2つのフォーマットがあります
− U6 promoter付加型: 直ぐにトランスフェクトできます
− T7 promoter付加型: in vitro転写後使用します
型番型番型番型番 製品名製品名製品名製品名 納期納期納期納期 価格価格価格価格
815210DE GeneArt® Strings™ U6 DNA 9営業日~ ¥12,000
815220DE GeneArt® Strings™ T7 DNA 9営業日~ ¥12,000
※設計サービスは無償です。
※オーダーフォーム受領後、およそ2日以内で設計結果を連絡します。
型番型番型番型番 製品名製品名製品名製品名 サイズサイズサイズサイズ 価格価格価格価格
A25640 GeneArtR CRISPR Nuclease mRNA 15 µg ¥65,000
CRISPR Strings™ オーダーフォームはこちらからダウンロードいただけます
www.lifetechnologies.com/crispr-mrna-jp
記載の価格は2014年8月現在の価格です。消費税は含まれておりません。価格は予告なしに変更する場合がありますので、予めご了承ください。
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Appendix. CRISPR Strings™のオーダー方法
1. GeneArt® CRISPR 見積兼注文用紙(エクセル)を以下サイトからダウンロードしてください:
www.lifetechnologies.com/crispr-mrna-jp2. お客様は下記の必要情報をご記入いただき、[email protected] 宛にご送付ください
1. お客様情報 – ご注文にはライフテクノロジーズオンラインオーダーIDが必要です。未登録のお客様は
GeneArt® CRISPR 見積兼注文書内に必要事項をご記入いただければID登録ができます。
2. CRISPR Strings™ デザイン
1. デザインアシスタンス(設計をご希望される場合(無償です))
2. 既知のCRISPR配列(既に配列が決まっている場合)
3. CRISPR Strings名(任意)
4. デザインするCRISPR配列の数
5. プロモーターの希望:U6またはT7
6. 対象生物のゲノム:ヒト 拡張予定:マウス、ラット、ショウジョウバエ、CHO細胞、ゼブラフィッシュ
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Appendix. キャンペーン & 録画版セミナーのご案内
キャンペーンの詳細はこちらをご覧ください:www.lifetechnologies.com/promo
ゲノム編集ゲノム編集ゲノム編集ゲノム編集 録画版セミナー録画版セミナー録画版セミナー録画版セミナー :いつでもお好きな時にご覧くださいいつでもお好きな時にご覧くださいいつでもお好きな時にご覧くださいいつでもお好きな時にご覧ください
ゲノム編集ゲノム編集ゲノム編集ゲノム編集 パートパートパートパート1:ターゲットサイトの
デザイン方法
(CRISPR/Cas9と
TALENs)
ゲノム編集ゲノム編集ゲノム編集ゲノム編集 パートパートパートパート2:ゲノム編集による
変異導入の成功を
評価する方法
ゲノム編集ゲノム編集ゲノム編集ゲノム編集 パートパートパートパート3:相同性組換え用
ノックインベクター設計
と、新しい遺伝子導入
法で成功率を向上
ゲノム編集ゲノム編集ゲノム編集ゲノム編集 パートパートパートパート4:標的サイトの変異導入
パターンやオフターゲ
ットの可能性を次世代
シーケンサで評価する
オンラインセミナーの閲覧/申込はこちらから:www.lifetechnologies.com/seminarsjp
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