エンドグルカナーゼ触媒反応に2位水酸基はいかに関わるのか

誌名誌名 応用糖質科学

ISSNISSN 21856427

著者著者

正田, 晋一郎野口, 真人李, 格非芹澤, 一成

巻/号巻/号 9巻2号

掲載ページ掲載ページ p. 83-89

発行年月発行年月 2019年5月

農林水産省 農林水産技術会議事務局筑波産学連携支援センターTsukuba Business-Academia Cooperation Support Center, Agriculture, Forestry and Fisheries Research CouncilSecretariat

応用糖質科学第 9巻第2号 83-89(2019) G-

A-si

.J

.-1.

＿-How is the Hydroxy Group at 2-Position Involved in the Endoglucanase-catalyzed Hydro-

lyzation or Transglycosylation?*

エンドグルカナーゼ触媒反応に 2位水酸基はいか

に関わるのか＊

(2019年 1月18日受付； 2019年 2月26日受理）

正田晋一郎1,*口 野口真人［李格非＼芹澤一成1

（し ょうだしんいちろう，の ぐちまさと， りげふ ぇい，せり ざわ か ずなり）

Shin-ichiro Shoda, 1・* * Masato NoguchいGefeiLi,1 and Kazunari Serizawa1

1東北大学大学院工学研究科バイオ工学専攻

980-8579宮城県仙台市青葉区荒巻字青葉 6-6-11-514

1 Department of Biomolecular Engineering, Graduate School of Engineering, Tohoku University 6-6-11-514 Aramaki Aza Aoba, Aoba-ku, Sendai, Miyagi 980-8579, Japan

要旨： 最近我々は，独自に開発した「水系における脱水反応」を用いて，無保護 1 ,2— アン ヒ ドロ糖の合成を初めて達成した.1,2-アンヒドロセロビオースをドナー基質とし，糖転移活性を示す加

水分解酵素を探索した結果， GHl2に属する Aspergillusaculeatus F-50 由来 endo-~-1 ,4-glucanase I (FI-CMCase)に活性があることを見出したまた， GHSとGHl2に属する複数のエンドグルカ

ナーゼも， 1,2-アンヒドロセロビオースを認識し，転移生成物を与えることが分かった．これら

の実験結果と，既往の基質複合体結晶構造に関するデー タを考慮し，アノマー保持型エンド ~­グルカナーゼについて，グリコシ ド結合開裂時に 2位ヒ ドロ キシ基の近接性補助により生じるエ

ポキシ ド中間体を経由する機構を提唱する

キーワード： 1,2-アンヒドロ糖，糖転移反応，糖加水分解反応，近接性補助，アノマー保持型エンド P—グルカナーゼ＊＊＊

1. はじめに

近接する置換基が，反応の立体選択性に影響を及ぽした

り，反応速度 を増加 させたりする効果を， 近接性補助

(Anchimeric Assistance)と呼ぶ近接性補助は，有機化学

の教科書に記述されるほど普遍的な現象であるが， 自然界

に目を向けると生体内反応においてもいくつかの例を見出

すことができるある種の Nグセチルグルコサミニダー

ゼにおいて，基質の一部である N—アセチルグルコサミン

部分の 2位アセ トアミド基のカルボニル酸素がアノマー位

を攻撃し，オキサゾリニウムイオン中間体を生成する機構

が提唱されだ.2)_ これとほぼ時を同じくして，二環性化合

物である糖オキサゾリンが加水分解酵素により認識され，

グリコシル化反応の優れた糖供与体となることが見出され

た（図 1(B))". この発見を契機に，さまざまなオキサゾリ

ン基質がデザインされ，オ リゴ糖や複合糖質の合成に利用

されるようになっているりさて，合成化学的な有用性に

加え，糖オキサゾリンにはもう一つの顔があるそれはオ

キサゾリン基質が，ある酵素に認識されるか否かを調べる

ことでその酵素の反応機構がオキサゾリニウム中間体を

経由するかどうかの予測ができることであるりこのよう

に，構造生物学の観点からも糖オキサゾリン体が担う役割

は非常に大きいり

我々は， a.-マ ンノシドや P—グルコシ ド な どの 1 ,2-trans

グリコシド類のグリコシド結合を切断する酵素の活性中心

において，近接性補助，すなわち 2位ヒドロキシ基が関与

し，二環性化合物である 1 ,2—アンヒドロ糖 （糖エポキシド）

が生成すると考えた近接性補助の可能性については，糖

質加水分解酵素 (GlycosideHydrolase ; GH)ファミ リー99

に分類される endo-a.-mannosidaseのX線結晶構造解析か

ら，エポキシド中間体を経由する機構が提案されている

（図2)7>.しかし，実際に 1,2-アンヒドロ糖に酵素を作用さ

せた報告は皆無であった今回我々は， 1,2-アンヒドロ糖

を供与体とする新規グリコシル化反応の開発という合成化

学的なモチベーションと，触媒機構に関してこれまでとは

違った新しい知見が得られるのではないかという酵素化学

的な典味から，研究に着手した．本稿では， 1,2-アンヒド

ロ糖を基質とする酵素的グリコシル化反応の概要と，その

実験結果および結晶構造解析に基づく新たな加水分解機構

について，箪者らの論考と提案を述べる．

＊本原稿は， 日本応用糖質科学会平成 30年度大会応用糖質科学シンポジウムで一部発表された．

＊＊連絡先 (Tel.022-795-7230, Fax. 022-795-7293, E-mail: shoda@poly.che.tohoku.ac.jp)

••* Key words: 1,2-anhydro sugars, transglycosylation, glycosidic hydrolysis, anchimeric assistance, retaining endo-~-glu­canase

◆ 84◆ 応用糖質科学第 9巻第2号 (2019)

(A) rT 0 " 0 H../VVV'-, O 人0 ~ 0 ), 0

ROHO 立OHHNV"cQ0 H', H ） ー→

予OH H ＇ RO

呼芯雰H,CO;;S,.H Jo-R' マ H OH

R'OH

vVVV'v 0 予0― v'VVV'v 0 予0― 、ノ0vv予、or、-9

glycoside oxazolinium ion free sugar

`>sugar oxazoline

(donor)

図1. オキサゾリニウム塩を経由する加水分解機構 (A)および糖オキサゾリンを供与体とする糖転移反応 (B)

.. 、

＋ ~o HOー~

glycosidase )J こぃこ:)=o

acceptor oligosaccharide

0 0 0 E333~_

') E333~E333~_

O HO 勺")゜ H

HO-r---'-t~(OR~ 晶~~,〗 ~HO-r---'-t O OH

図2. エンド-u-マンノシダーゼ (GH99)の推定反応触媒機構

~ OH OH

free sugars

Cl Cl 人

比CーN'-N;:..CH3 or ¥_J

DMC

C_

3

C

3

H

H

ー

A

C

B

M

'z、zー

C

+

0CD

~ ゚Et3N, D20/CH3CN (1:1) 1,2-anhydro sugars

-10°C, 10 min 12 examples, 27-73% yield

図3. 1,2ーアンヒドロ糖の合成

2. 1,2-アンヒドロ糖の合成

1,2-アンヒドロ糖は， ピラノース環にエポキシ環酸素が

直接結合した不安定な化合物であり，約 1世紀前から多く

の化学者によってその合成が試みられたが，温和な条件で

の合成法がなかったために，実際にその存在を確認するこ

とはできなかった最近我々は， Direct Anomeric Activa-

tion'>という考え方を創出し，その一環として，水中にお

いて糖のヘミアセタールを直接活性化することにより，無

保護糖を 1,2-アンヒドロ糖ヘ一段階で変換する反応を開発

した（図 3)•>. 重水ーアセトニトリル混合溶媒中，種々の無

保護糖に対し，塩化 2クロロ-1,3—ジメチルイミダゾリニウ

ム (DMC) または塩化 2クロロ—1,3—ジメチルベンゾイミダ

ゾリウム (CDMBI)10>とトリエチルアミン (Et,N)を作用さ

せ，—10 ℃ にて反応溶液の NMRを測定したその結果

生成物の 1位と 2位の炭素シグナルに，エポキシ環特有の

顕著な高磁場シフトが認められた自発加水分解は少なか

らず進行するが， 0℃以下の低温であれば 1,2ーアンヒドロ

糖は数時間の半減期を持つことから，後述するワンポット

での酵素反応への適用は十分に可能であると考えた．

3. 酵素的グリコシル化反応への応用

1,2—アンヒドロセロビオースをドナー基質として，市販

のセルラーゼ製剤から糖転移活性を示す蛋白質をスクリー

ニングした．精製・同定した結果， GH12に分類される

Aspergillus aculeatus 由来の endo-~-1,4-glucanase (Endl)で

あることが判明した．これと 92%の相同性を持つ Asper-

正田他：エンドグルカナーゼ触媒反応に 2位水酸基はいかに関わるのか ◆ 85◆

gillus aculeatus F-50 株由来の endo-~-1,4-glucanase I (FI-

CMCase)''lを用いて糖転移活性を評価したところ，系内に

共存する遊離のセロビオースに糖転移したセロテトラオー

スが得られた反応条件を検討した結果，酵素反応時にセ

ロビオースを新たに添加することで糖転移収率が向上する

だけでなく，各種セロビオース誘導体を糖受容体として共

存させると，対応するセロテトラオース誘導体が得られる

ことも分かった（表 1, entry 1-4). さらに，セロビオース

と類似の構造を持つラクトースの 1,2-アンヒドロ体も，糖

転移反応の供与体としての利用が可能であった（表 1, en-

try 5). 本手法は収率において課題を残すものの，原料の

無保護糖からワンポット 2段階（約 1時間）という圧倒的

な短時間・短工程でオリゴ糖合成を達成することができ

る．また， 2位にヒドロキシ基を有する糖ならば原理的に

1,2-アンヒドロ糖へ変換できるため， 1,2-アンヒドロ糖と

酵素の組み合わせを幅広く検討することで，将来的に多様

なオリゴ糖の合成が可能になるものと期待される．

表 1. 1,2グンヒドロ糖を供与体とする糖転移反応R2 OH

眉三9三。H

cellobiose, lactose

CDMBI (0.8 eq)

nBuMe2N (3.5 eq)

比O/CH3CN= 1 :1 0°C, Smin

R2 OH OH

図芯~~゜1,2-anhydro sugar

Fl-CM Case

acceptor

R2 OH

眉三三三合~~ROH

MES (4 eq)

比O/CH3CN= 1: 1 0°C, 1 h

entry 1,2-anhydro sugar (donor)

product

acceptor yield[%] a)

OH

咄三~4。HCellobiose

2

3

OH OH

憎辛斎~~゜1,2-anhydro cellobiose

49% conv. from cellobiose

4

咆4~~s

Cel-a-SPh 3.0 eq ℃〕

24 b)

(42) c)

OH

H2芯匂こ。Me 15 d)

OH

Cel-~-OMe 4.0 eq

咆4~4心 11"1Cel-13-SPh 1.5 eq

12 b)

5

H:。~~~ミ1,2-anhydro lactose

39% conv. from lactose D

OH>S

OH>oH

OH

H

7 b)

Cel-a-SPh 1.5 eq

a) Yields were calculated based on the initial amount of 1,2-anhydro sugars.

b) Determined by HPLC c) The yield in the presence of the additional cellobiose (4 eq) was shown in

parenthesis. d) Isolated yield

◆ 86◆

4. 加水分解酵素の触媒反応機構に関する考察

4.1. 1,2ーアンヒドロ糖を認識する加水分解酵素の探索

前節において， 1,2-アンヒドロ糖を供与体として用いる

グリコシル化反応を紹介した我々の次なる関心は， 1,2-

アンヒドロ糖を認識する加水分解酵素の普遍性ならびに，

その触媒反応機構である．まず， FI-CMCaseと同じ A.

aculeatus F-50 株由来の GH5 に属する endo-~-1,4-glucanase

II (FII-CMCase)を用いて糖転移反応を検討したところ，

1,2ーアンヒドロセロビオースを遊離のセロビオースヘ付加

させる糖転移活性を示したまた， GH5およびGH12に

それぞれ分類される Trichodermareesei 由来の endo-~-1,4-

glucanase II (EGII) と endo-~-1,4-glucanase III (EGIII)にも

同様の活性が認められたさらに，キシログルカン分子中

の ~(1→4)グリコシド結合の加水分解と糖転移反応を触

媒する GH16のArabidopsisthaliana由来キシログルカンエ

ンドトランスグリコシラーゼ／ヒドロラーゼAtXTH22'2)は，

キシログルカンオリゴ糖XXXG(7 糖）の 1,2—アンヒドロ

体を認識し， 14糖生成物である (X幻 CG)2を与えた精製

酵素の入手の都合上，今回検証した加水分解酵素の種類は

限定的であるが，同一ファミリー内では活性中心のアミノ

酸残基が高度に保存されている点を考慮すると，糖転移活

性を示す酵素が確認された GH5および GH12に属する他

の酵素も， 1,2-アンヒドロ糖に対する認識能を有するもの

と推測される．

4.2. アノマー保持型酵素の触媒機構とその歴史

糖質加水分解酵素は，出発物質と生成物のアノマーの立

体配置が同じであるアノマー保持型酵素と，立体配置が逆

になるアノマー反転型酵素に大別される．本稿ではアノ

マー保持型酵素について詳細に触れてみたい．これまで，

さまざまな反応機構モデルが提案されてきたが，最も多く

議論の対象となっている代表的なモデルは， Phillips'3lと

Koshland叫こよるものであろう. Phillips機構では，ピラ

(A) C,T ? H a

~0( -R 、 こ

応用糖質科学第 9巻第2号 (2019)

ノースの椅子型立体配座が変化し，引き続くグリコシド結

合の開裂によって生成するオキソカ）レベニウムイオン中間

体が，そのまま触媒アミノ酸残基のカルボキシラートに

よって，静電的に安定化される（図 4(A)). 一方，

Koshland機構では，グリコシド結合の開裂と同時に触媒

残基のカルボキシラートが，アノマー炭素に背面から求核

攻撃し，基質と酵素が共有結合を介してつながったグリコ

シルエステル中間体を形成する（図 4(B)).

この二つの反応機構に関する論理の主張・提案がこれまが

で繰り広げられてきたが，最近は Koshland機構を受け入

れる研究者が多いようである．その理由の一つとして，グ

リコシルエステル中間体の分解速度を著しく低下させた基

質アナログを用いる研究の影響がある. Withersらは，基

質の 2位炭素に電子吸引性のフルオロ基を導入した基質を

設計し，保持型酵素との共有結合中間体を形成させた後，

質量分析および結晶構造解析を行った. 1990年代以降

GH5や GH12に属する endo-j3-l ,4-glucanaseを含む多くの

アノマー保持型酵素について共有結合性中間体の結晶構造

解析15-18)が行われたことで，現在ではグリコシルエステル

中間体を拠り所とする Koshland機構が受け入れられてい

るのである．

しかしながら，グリコシルエステル中間体の存在を見事

に示した実験結果をもって，直ちに Koshland機構に結び

付けることには少なからず議論の余地がある．すなわち，

これらの特殊な基質アナログを以てしても，野生型酵素を

使用した結晶構造解析を可能にするほどの半減期を持つ共

有結合中間体を得ることは決して容易ではなく，酸塩基触

媒にあたる酸l生アミノ酸を他のアミノ酸で置換した酵素の

解析もあり叫必ずしも実際の反応機構を反映していると

は限らない．自殺基質と呼ばれる不可逆的酵素阻害剤を利

用した化学修飾は，確かに活性中心のアミノ酸残基を特定

するうえで有力な手法ではあるが，反応機構を推定する決

定打となりうるかは疑問である20). 以降では， 1,2-アンヒ

voヽ／_~ rヽヽo～ HO X I

2 H

~~OH

✓ 〇ヽ―r"'へノo‘

ROH

、orヽ―r／、心o ,/VVV¥., o―r o

オキソカルペニウムイオン中間体

,/VVV', o_ ~ o 比0 ？0 H I ぐ0

ROH v。へ/'v—rへ／。グリコシルエステル中間体

図4. アノマー保持型酵素の Phillips機構 (A)とKoshland機構 (B)

正田他 ：エンドグルカナーゼ触媒反応に 2位水酸基はいかに関わるのか ◆ 87◆

ドロ糖を基質として用いた我々の実験結果を議論の中心に

据え，これまでに報告されている GHSおよび GH12の

endo-~-1 ,4-glucanase の結晶構造から得られる知見を加味し

ながら，Koshland機構に代わる新たな加水分解機構の可

能性について筆者らの見解を述べる．

4.3. GHSおよび GH12加水分解酵素の構造的特徴に関

する考察

GHS および GH12 の endo-~-1 ,4-glucanase とセロオ リ ゴ

糖との複合体結晶構造について有機反応論的に極めて妥

当な結果が得られている 21-23)_ これらの報告によると ，リ

ガンドのセロオリゴ糖が活性中心をま たいで—および＋サブ

サイトに結合するとき， — l サブサイトにおける糖骨格の

配座は＇ふと呼ばれるねじれ舟形コンホメーションをとる

ことが明らかにされている（図 5).最安定構造である℃

椅子形ではなく，なぜ＇ふのコンホメーションをとるのか

と言えば， ピラノ ース環内の酸素原子上にある非共有性電

子対の一つが，開裂するグ リコ シド結合に対してアンチペ

リプラナーに位置する必要があるからである．

このような軌道に関する条件の他に，以下に述べる立体

化学的な条件を満たすためにもコ ンホメーショ ン変化は必

須であるすなわち， ①グ リコシド結合に含まれる酸素原

子のプロトン化の促進， ②立体電子効果に よる遷移状態の

安定化，③アノマー炭素原子まわりの立体障害の緩和であ

る24.25). これ らの うち，筆者らは③の影響に着目したグ

リコ シルエステ ル中間体を経由する Koshland機構に従 う

ならば， — l サブサイト のコンホメ ー ションが ℃，の場合，

求核触媒のカルボキシラートと糖分子のアノマーおよび

3, 5位の水素原子との間で立体障害が生じ求核攻撃の妨

げとなる．一方＇ふコンホメーションではアノマー炭素

まわりの立体障害が緩和されるため，グリコシド結合に対

し背面からの求核攻撃が容易になる．

ここ で我々は，求核触媒カルボキシラー トの酸素原子と

アノマー炭素原子との距離に注目したその距離は，GHS

の Caldicellulosiruptorsp. 由来の lichenase(F32EG5, 求核

触媒残基 ：E326)"lにおいては 3.2Aであった（図 S(A)).ま

た， GH12のHumicolagrisea由来 endoglucanase(Ce! 12 A,

求核触媒残基： El20)'')では 3.sAを示した（固 S(B)). グリ

E326

コシルエステル中間体の共有結合の距離が約 uAである

点を考慮する と， 3A以上離れたこれらの原子間距離は相

当に長い． — 1 サブサイト におけるふコンホメーション

は，確かにアノマー炭素近傍の立体障害を緩和させるが，

アノマー炭素 とカルボキ シラ ートの酸素原子との距離はむ

しろ増加するため， Koshland機構で提唱されている求核

置換反応は， より困難になると考えられる

一方，求核触媒のカルボキシラートの酸素原子と， ー1

サプサイトの 2位ヒドロキシ基 (2-0H) との関係に目を転

じると，これらの間には強固な水素結合が存在することに

気づく （図 5).Withersらは，この水素結合について，基

質認識能の向上あるいは遷移状態の安定化に寄与すると推

定しているものの，触媒機構に及ぼす影響に関しては明確

に説明していないあらためてセロオリゴ糖との複合体結

晶構造を眺めてみると， 1ふコンホメーションにおいて ーl

サブサイトの 2-0Hがアキシアルに向いていることが分か

る．このとき，開裂するグ リコ シド結合の酸素原子に対し

て2-0Hは背面に近い位置関係にあり，求核触媒のカルボ

キシラートによって活性化された 2-0Hによるアノマー炭

素への求核攻撃，つまりはエポキシド環の形成が十分可能

なのである結晶構造解析の結果から浮かび上がったこれ

ら二つの事実，すなわち， ① -1サブサイ トにおけ るアノ

マー炭素と求核触媒のカルボキ シラー ト酸素原子が決して

近いとはいえないこと ，および② ふコンホメーションに

おいてグリコシド結合の背面に位置する 2-0Hが求核触媒

のカ ルボキシ ラートと 強固な水素結合を形成していること

は， GHSおよびGH12の加水分解酵素の触媒機構に近接

性補助が内在することを強く示唆している．

上述の考察と我々の実験結果を拠り所と して， a-マンノ

シドや B—グルコシドなどの 1 ,2-trans グ リコシドに作用す

る加水分解酵素について， グリコシド結合の開裂時に隣接

基が関与する ことで 1 ,2 —アンヒドロ糖骨格を持つ中間体が

生成する機構を論ずる余地が残されていることを主張した

いただし筆者らの考察は，あくまでもカルボキシラ ート

酸素とアノマー炭素間距離の静的な解析を根拠とするもの

である． したがって， Koshland機構が示す共有結合性中

間体を形成する経路や， Phillips機構のオキソカルベニウ

図5. GHSおよびGHl2のアノマー保持型酵素とセロオリゴ糖との複合体構造

(A) F32EG5 (Caldicellulosiruptor sp., PDB code: 5H4R). (B) Cell2 A (H. grisea, PDB code: I UU6).

◆ 88◆

ムイオンを中間体とする経路を完全に否定するものではな

いことを付記しておく．

5. おわりに

本稿では， 1,2-アンヒドロ糖を基質とする新規な酵素的

グリコシル化反応を紹介するとともにその実験結果と加

水分解酵素の結晶構造に基づき， 2位ヒドロキシ基の関与

を伴う新たな加水分解機構の可能性について考察してき

た．その結果，今回 1,2-アンヒドロ糖を認識することが実

験的に明らかとなった GHSおよびGH12の加水分解酵素

については，結晶構造解析の結果からもエポキシド中間体

の存在を示唆する構造的特徴が浮き彫りとなった．現在，

例外的な活性中心を持つ酵素を除き，多くのアノマー保持

型酵素がKoshland機構をとると考えられているが， GH

ファミリーの数然り膨大な種類の加水分解酵素が存在する

以上，触媒反応機構に関しても，複数のメカニズムが存在

するように思えてならない．アノマー保持型エンド P—グ

ルカナーゼについて， 2位ヒドロキシ基が関与する機構の

妥当性が評価され，反応のロジックに裏付けられた加水分

解機構が明らかになるまでには，さらなる検証実験が必要

であると筆者らは考えており，現在も関連研究を鋭意進め

ている．本稿が糖質加水分解酵素の触媒機構について再考

するきっかけとなれば，筆者にとって望外の喜びである．

謝辞

日本応用糖質科学会平成 30年度大会応用糖質科学シン

ポジウムにおいて，本研究の発表の機会を与えて頂きまし

た日本応用糖質科学会会長ならびに関係の諸先生方に深謝

いたしますまた，貴重な酵素を供与頂きました川口剛司

先生ならびに炭谷順一先生（大阪府立大学），西谷和彦先

生（東北大学）に感謝いたしますさらに，酵素機構に関

して有益なアドバイスを頂戴しました伏信進矢先生および

五十嵐圭日子先生（東京大学），北岡本光先生（農研機構食

品研）に感謝いたします．

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正田他：エンドグルカナーゼ触媒反応に 2位水酸基はいかに関わるのか ◆ 89◆

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質疑応答

［質問］ 分子科学研究所 中村彰彦

すべてのアノマー保持型酵素で 1,2-アンヒドロ基質を用

いて糖転移反応しますかまた，すべてのアノマー保持型

酵素の反応が 1,2-アンビドロ機構で進むと考えていいので

しょうか．

［回答］

現時点では， 1,2-アンヒドロ糖と酵素の組合せを網羅的

に調べていないので， どのくらいの数の酵素が認識するか

は不明です．ただし，エンドグルカナーゼに関して言え

ば，少なくとも同一のファミリーに属する酵素は，糖転移

反応の触媒となる可能性が高いと考えています．また， 2

位ヒドロキシの欠損によって kcat値がほぼゼロになること

が報告されている酵素は，近接性補助型の機構である可能

性が高いと思われます．

［質問］ 東北大院農藤井智幸

大変難しい実験になると思いますが，反応速度を実測し

て前指数因子と活性化エネルギーを求めることはできませ

んか類似の反応系をお持ちですので，速度パラメータの

傾向から有益な知見（エンタルピー効果とエントロピー効

果）が得られるように思います．

［回答］

標識をもたない糖エポキシドを短時間で定量するのが現

時点では困難であるため，反応速度の測定は行っておりま

せん．ただし，初期における反応速度が極めて大きいこと

から，活性化エネルギーはかなり小さいと推定できます．

［質問］ 農研機構食品研北岡本光

工ポキシドが酵素内で水分子の攻撃を受けた場合，反応

を検出する手段はあるのでしょうか

［回答］

1,2—アンヒドロセロビオースの場合，＋サブサイトに遊離

セロビオースが取り込まれて糖転移反応を併発するため，

加水分解のみを検出するのは困難です. 1,2-アンヒドロラ

クトースの場合は，加水分解のみを検出できます．なお，

1,2-7ンヒドロ糖の量を直接検出するのは困難であるた

め，反応しなかった残存エポキシドを，検出容易なチオグ

リコシドに変換する方法を開発し，定量を行っております．

［質問］ 北大院農木村淳夫

1,2グンヒドロ糖を経由する触媒反応を行う酵素につい

て他の例があれば紹介願いたい．

［回答］

GH99の endo-a-mannosideaseは，結晶構造解析の結果

から，隣接基関与型の機構が提唱されていますが， 1,2-ア

ンヒドロ糖を用いて実際に検証した報告はありません．

［質問］ （樹林原光川侑輝

~-N—グリコシド結合を持つ天然ヌクレオシドに作用す

るヌクレオシダーゼに対しても，エポキシドを経由する反

応機構を適用できるかまたそのための基質は調製可能

か．

［回答］

ヌクレオシドの 2位ヒドロキシ基と，アノマー炭素上の

C-N結合が， トランスの関係にあるので，適応可能と考

えます．基質の調製については，本研究で用いているホル

ムアミジン型脱水縮合剤を用いることにより，温和な条件

下で合成できる可能性は十分にあると思います．