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イルミナNGSでロングリードを可能にする

TruSeq Synthetic Long-Readライブラリー調製キット：

ワークフローのご紹介および注意点

November 28, 2014

崎川真里

イルミナ株式会社

テクニカルアプリケーションサイエンティスト

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本日のOutline

はじめに

プロトコール

Best Practiceとトラブルシューティング

HiSeqのランのセットアップとBaseSpaceでの解析

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はじめに

TruSeq Synthetic Long Read のご紹介

Long

Reads

• 複数のアプリケーションをサポート

（ゲノムフィニッシング、メタゲノミクス、de novo アセンブリ、ロングリードやショートリードでのメタアセンブリ）.

• HiSeqシステムによる、クオリティの高い10Kbのリード

• ショートリードをロングリードへと高精度にアセンブルする

Phasing

• 多型を見る異なる手法；相同染色体の固有のハプロタイプコンテンツを調べる

• ヘテロザイガスSNP とインデルの94%以上を1回のアッセイでフェージング

1つのキットで複数のアプリケーションに対応

http://www.illumina.com/products/trusight_cardiomyopathy.ilmn

http://www.illumina.com/products/trusight_inherited_disease.ilmn

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試薬キットの内容

Library Prep kit + Barcoding kit

TruSeq SYNTH Long-Reads

DNA Library Prep Kit (4 samples)

FC-126-1001

TruSeq SYNTH Long-Reads Barcode Kit

(1 samples) - FC-126-1002

(4 samples) - FC-126-1003

出荷は室温

保管は 2-8℃

出荷/保管

-25℃ ~ -15℃

or

出荷は室温

保管は 2-8℃

出荷/保管

-25℃ ~ -15℃

出荷/保管

室温

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アッセイのワークフロー

3日間のワークフロー

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プロトコール

Best Practicesとトラブルシューティング

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TruSeq Synthetic Long-Read DNA Prep ワークフロー

HiSeqでシーケンスを行う

Part 3 –短いDNAライブラリーの作製 Long range PCR産物を利用する。各ウェル固有のインデックス配列をもち、かつシーケンスに必要なアダプター配列をもつライブラリーを作成する。最終的に384ウェル分をプールし、精製・サイズ選択を行う。

Part 2 - Long range PCR 約8-10kbのDNA分子を希釈して384ウェルに分注し、各ウェルで少数分子由来のDNA分子を増幅する。

Part 1- 8-10kbの断片を得るゲノムDNAを断片化した後、末端修復、アダプター付加を経て

約8-10kbのサイズのDNA分子を回収する。

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TruSeq Synthetic Long-Read DNA Prep

ワークフロー



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100~500ngのゲノムDNAを1kbのラダーと共に

0.8%アガロースゲルで泳動する。

Best Practices

Input DNAは濃度10ng/ulの状態で50ul用意（total 500ng）

フェノールのコンタミがなく、40kb以上のサイズが残ったDNAを使用

Part 1- 8-10kbの断片を得る

input DNAの品質チェック

8-10kbに断片化 Long range PCR ライブラリ作成

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DNAの断片化

8-10 kbのgDNA

Best Practices

弊社ユーザーガイドに記載の設定で遠心を行う

gDNA

（引用 http://covarisinc.com/products/g-tube/）

g-TUBE™


http://covarisinc.com/products/g-tube/





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末端修復

－断片化によって生じた突出末端をEnd Repair Mixで平滑化する

3’末端へのA付加

－平滑化したDNAの3’末端にアデニンを付加する

アダプター付加

－Long Range PCRの工程で鋳型増幅に必要なアダプター

（11bpのエンドマーカーを含む）を、DNAの両末端に付加する。

Best Practices

使用するバッファーはよく溶かし混合する

特に指定の無い限り、反応は氷上で行う

プロトコールに記載の反応時間と温度を守る

サンプル精製はkitに付属のSample Purification Beadsを使用する


平滑末端化、3’末端へのA付加、アダプター付加

8-10kbのgDNA エンドマーカーを含むアダプター


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ゲル電気泳動でサイズ選択

E-Gel CloneWell 0.8% SYBR Safe gelを用いてサイズ選択を行う。

泳動が終了したゲルは、E-Gel OpenerまたはGel Knifeで開封する

泳動像をトランスイルミネーターで可視化し、X-tracta Gel Extraction Toolで目的のサイズのDNAを切り抜く

切り抜いたゲルから、QIAquick Gel Extraction KitでDNAを抽出する

Qubit dsDNA HS Assay kitで定量および、Bioanalyzer High Sensitivity chipでサイズ分布を確認する。


8-10kbの断片を選択的に回収する

ゲルでのサイズ選択

・E-Gel SYBR Safe gels 0.8% agarose “for NGS”

& QIAQuick Gel Extraction Kit

・Blue Pippen

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Option1: E-Gelを使用したサイズ選択

Best Practices

E-Gelカセットは室温で保存する（4℃保存はしない）

消費期限切れのE-Gelは使用しない、泳動時間はプロトコール通りに行う

DNAの損傷を避けるため、その他の泳動装置や染色剤は利用を避ける

サンプルレーン（レーン2）

(A) レーン左端に縦線を引く

(B) レーン右端に縦線を引く

ラダーレーン（レーン4）

(C) 10kbのバンドと水平に横線を引く

(D) 8kbのバンドと水平に横線を引く


開封前のプラスチックケース表面・裏面に線を描く

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サンプルの定量とサイズ分布の確認

Qubit dsDNA HS Assay

期待値: > 0.05 ng/ul

Bioanalyzer High Sensitivity DNA Chip (Optional)

10kbのUpper markerと重複する位置にサイズのピークが現れる

8 kb

6 kb 小さいサイズに肩がある

→ 適正にサイズ選択を

できていないことが原因

Troubleshooting


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qPCRでの定量

Best Practices

SYBR Green 100X の濃度は正確に計算する


Long Range PCRで適切なDNA量を使用する為に正確な濃度を知る

SYBR Green stock を用意する

・10,000X ストックをDMSOで100Xに希釈する

・Nanodropを使用する（Ideal Abs494±3 nm is 0.5 – 0.6）

Long qPCR用にはキットに付属のスタンダードDNA (QST)を使用

オーバーナイトで実施（反応時間は7.5時間以上）

94°Cで1分間、続けて以下の反応を 40サイクル:

・94°Cで30秒間

・65°Cで30秒間

・68°Cで 10分間

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qPCRでの定量

各qPCR装置を使用する（384ウェル対応である必要はない）

検量線を使用して定量する場合

手動で検量線を作成し、近似式にCq値を代入して濃度を計算する


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Part 2 - Long range PCR

Long range PCRとクオリティチェック

Best Practices

• Long Read と Phasing でLong range PCRの条件が異なる

• ウェルへのDNAのアプライ量が上記と異なると、PCRでの増幅が適正に行われないので注意

→タグメンテーションによる断片化が適正に行われない可能性がある

• ユーザーガイドに記載の384 wellプレートを使用すること

Workflow

DNA Seeding

Concentration

Number

of Cycles

Long

Reads

3 fg per well 21 cycles

Phasing 75 fg per well 15 cycles

384 rxn

5 ul MM per well One QC rxn

50 ul MM


ライブラリー調製用のプレートとQC用のプレートを用意

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E-Gel Ex 1%を使用し、Long range PCRのQCを行う

QC用に、ランダムに4ウェルを選び、各ウェルから5uL回収して混合する(Pooled sample)

Best practice • 角や端のサンプルは避ける

• 回収したウェルを記録しておく

E-Gel EX 1%

Lane 6: Pooled sample

Lane 7: QC sample

スタンダード（GTS）

1 2 3 4

384-well plate

QC sample in 96 well plate

20 ul




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プールしたサンプル、 QC用のサンプル、スタンダード（GST 1～4 ）の各バンドは同じ大きさにバンドが出る

– 10kbのマーカー位置にシングルバンドが見える

サンプルのバンドの濃さは、スタンダード（ GST1 ～4）の範囲に入る

範囲外の場合は

– 8-10kbに断片化したgDNAのインプット量が正しくない可能性がある

– qPCRでの定量とLong range PCRを再度実施する

Lane 6: Pooled sample

Lane 7: QC Sample 希釈した GST

1 2 3 4




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Part 3 – 短いDNAライブラリーの作製

酵素反応を利用した断片化

Tagmentation:

FPM+TDE Delivery

FRP

Sample Plate

(LAP)

FRPプレートをPCRプレート(LAPプレート)の上に重ねて操作を行う。

TDEマスターミックスを作製し、FPRプレート各ウェルに3ul分注する

－電動マルチチャンネルピペットを推奨

－3ulの分注ができるマルチチャンネルピペットでも対応可だが、操作中に溶液が蒸発する恐れがある。

酵素プレートを重ねたまま遠心する（プレート遠心機が必要）

トランスポゾン 8 - 10 kb のDNA

断片化


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酵素反応による断片化

Best Practices

型番指定の384ウェルプレートを使用する

プロトコールの酵素反応条件に従う（DNAの断片サイズに影響）

サーマルサイクラ―の温度を正しく設定し、断片化の効率を一定にする

FPRプレートには穴が開いているので、

遠心すると各ウェルに分注した酵素ミックスが

穴から下（LAPプレート）に落ちる。

→遠心することで全ウェルを同時に分注


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Indexing PCR:

384ウェル固有のインデックスをつける

Alignment Ring (Optional)

IDP

Sample Plate

(LAP)


各ウェル固有のインデックスプライマーでPCR

p7 Index 1 Rd2 SP Rd1 SP p5 Index 2

シーケンス可能なライブラリー

p7

Index 1 Read 2 Sequencing Primer

p5

Index 2

Read 1 Sequencing Primer

インデックス配列を含むプライマーを使用しPCRを実施

IDPプレートには予めインデックスプライマーが充填されている

タグメント化後のDNAをPCRで増幅し、クラスター形成に必要な配列（P5, P7配列）および、各ウェル固有のインデックス配列を付加する


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各ウェル固有のインデックスプライマーでPCR

Best Practices

インデックスを正確な位置に移すため、indexing plate (IDP) をしっかりセットする

インデックスを移した後は、IDPのウェルが空であることを確認する

型番指定の384ウェルプレートを使用すること

- 指定品以外はうまく重ならず適切に処理できない

Alignment Ring（Accessory kit）はプレートの位置ずれを防止する目的で利用する。オプション品なので必須ではない。


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サンプルプーリングと濃縮

Zymoカラムにサンプル溶液を通し、インデックスが付加したライブラリーを濃縮する

バキュームマニフォールドの使用を強く推奨する

サンプル溶液をCollection Plateに回収する

型番指定の384ウェルプレートを使用すること

－指定品以外はうまく重ならず適切に処理できない原因となる

底に回収される


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Best Practices

使用前に新しいエタノールを調製する

SPB は室温に戻し、ビーズをボルテックスでよく撹拌してから使用する

プロトコール通りに操作を行う

－ビーズの乾燥時間は37℃または、5分以上行わない

－ビーズの量は変更しない

ピペットチップの側面にビーズが付いていないことを確認する

最終的に回収するサンプル中にビーズが残らないよう行う


磁気ビーズを用いたサイズ選択

磁気ビーズを用いたサイズ選択

－マグネットスタンドを使用

－精製時はチューブまたは、プレートどちらを用いても可能


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ライブラリーの定量と定性チェック

1. 定量はqPCRを利用する

• KAPA Library Quantification Kit（日本ジェネティクス社）を使用

（http://www.n-genetics.com/product_detail.html?item_id=4332）

アダプター配列をもち、クラスター形成可能なライブラリーのみを定量する

2. Bioanalyzerでライブラリーのサイズを確認する

• High Sensitivity DNA Chipを使用

最終的なライブラリー

KAPAキット付属のサイズスタンダードと、実際のライブラリーサイズは大きく異なる

→ライブラリーのサイズ分布をBioanalyzerで確認し、定量値の補正に利用する


http://www.n-genetics.com/product_detail.html?item_id=4332





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Troubleshooting

サイズ分布が期待値の範囲外の場合（タグメント不良）酵素量とサンプルの比率がタグメント化反応で重要なポイント

→ 384ウェルプレートへのサンプル投入量が原因

（Long range PCR前に各ウェルに規定量を投入しているか確認）


ライブラリーの定量と定性チェック

サイズ選択前

サイズ選択後

赤: Long Reads

青: Phasing


期待される範囲: 200 – 2000bp

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HiSeqでシーケンスを行う





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HiSeqのランのセットアップと

BaseSpaceでの解析

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サンプルシートの作成

シーケンス結果をBase Space上で解析するために、ラン前にはIEMでサンプルシートの作成が必須

IEM 1.8を使用する

ワークフローと各設定

HiSeq - FASTQ Only

TruSeq Synthetic Long-Read DNA

I7_index_ID = TSSLRv1

→ 各ウェル固有のindexは選択しない

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HiSeq Control Software(HCS) でランのセットアップ

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各ライブラリーは、下記の通りレーンを使用する

v3/v4 Flow cell の場合、フローセルの1レーン

Rapid flow cellの場合は、フローセル1枚（2レーン分使用）

シーケンスの設定と用意するプライマー

Cluster/SBS

試薬キット

Dual Indexing

primer box Sequencing Recipe

推奨の

ライブラリーの最終濃度

(based on qPCR)

TruSeq Cluster and

SBS Kit v3 必要

HP11 + HP12 100 + 8 (Index 1) + 100 12pM

TruSeq Cluster and

SBS Kit v4 不要

101 + 8 (Index 1) + 101

or

126+ 8 (Index 1) + 126

16-18pM

TruSeq Rapid Cluster

and SBS kit 不要 101 + 8 (Index 1) + 101 8pM

参考資料: TruSeq Synth Long-Read DNA Library Prep Sequencing Insert.pdf

http://support.illumina.com/content/dam/illumina-

support/documents/documentation/chemistry_documentation/samplepreps_truseq/truseqsynthlongreaddna/truseq-synth-

long-read-dna-library-prep-sequencing-insert-15047266-a.pdf

解析のため、ラン開始と同時にBase Space上へのデータの転送が必須

http://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/samplepreps_truseq/truseqsynthlongreaddna/truseq-synth-long-read-dna-library-prep-sequencing-insert-15047266-a.pdf
























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BaseSpaceでの解析

独自に開発した解析手法

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TruSeq Long Reads Assembly App

解析サマリーページ

リードのヒストグラム

出力ファイル

– Long Read FASTQ (>1.5kb)

– FASTQ (0.5-1.5kb)

– Library Characteristics (.csv)

ウェルごとのメトリクスの詳細

– LongRead Summary report (.pdf)

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TruSeq Phasing Analysis App

解析サマリーページ

ヒストグラム

出力ファイル (~500 Mb)

– Phased.vcf.gz

– Unphased.vcf.gz

– Stats.xml

– Library Characteristics (.csv)

– PhasingSummary report (.pdf)

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TruSeq Synthetic Long ReadのPublic Data

Base Spaceで公開

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資料/サポートツールのご紹介

Datasheets:

http://products.illumina.com/content/dam/illumina-

marketing/documents/products/datasheets/datasheet-truseq-synthetic-kit-

phasing.pdf

http://products.illumina.com/content/dam/illumina-

marketing/documents/products/datasheets/datasheet-truseq-synthetic-kit-

assembly.pdf

http://www.illuminakk.co.jp/documents/pdf/datasheet_long_read_dna_assembly.

pdf （日本語版データシート）

User guide

http://support.illumina.com/downloads/truseq-synth-long-read-dna-library-prep-

guide-15047264.html

Online Trainings:

http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq-synth-long-read-

dna-library-prep-kit/training.html

http://www.illuminakk.co.jp/landing/truseq_synthetic_long_read.ilmn

http://products.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/datasheets/datasheet-truseq-synthetic-kit-phasing.pdf












http://products.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/datasheets/datasheet-truseq-synthetic-kit-assembly.pdf












http://www.illuminakk.co.jp/documents/pdf/datasheet_long_read_dna_assembly.pdf



http://support.illumina.com/downloads/truseq-synth-long-read-dna-library-prep-guide-15047264.html


















http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq-synth-long-read-dna-library-prep-kit/training.html


















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Questions?

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