fisicoquimica levine volumen 1 5ta edicion
TRANSCRIPT
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La espectroscopa de fluorescencia en el anlisis estructural
de protenas y de agregados amiloides
Introduccin
La luz puede ser absorbida y emitida por ciertos compuestos y a este proceso se lo
denomina luminiscencia. Existen dos tipos de luminiscencia: la fluorescencia y la
fosforescencia. En la fluorescencia el tiempo entre la absorcin y emisin de la luz es del orden
de 10-8 segundos, mientras que el proceso de fosforescencia es mucho ms lento y toma
alrededor de 10-3 a 1 segundo en ocurrir. As, la fluorescencia dura nicamente mientras dura el
estmulo, es un fenmeno virtualmente instantneo, mientras que la fosforescencia puede durar
hasta minutos luego de desaparecido el estmulo.
La espectroscopa de fluorescencia es un mtodo muy utilizado en mediciones analticas
y en la investigacin cientfica, especialmente en bioqumica y biomedicina. Las dos razones
principales por las que se masific el uso de esta tcnica espectroscpica son: 1) su gran
sensibilidad y 2) el alto nivel de evolucin alcanzado tanto por los instrumentos requeridos,
como por los fluorforos diseados para aplicaciones especficas. An cuando una de las
aplicaciones ms utilizadas de la fluorescencia es el marcaje de macromolculas (como una
alternativa al marcaje con istopos radiactivos), puede ser usada por ejemplo para realizar
estudios de dinmica molecular, anlisis estructural de protenas, cuantificacin de iones en
compartimentos celulares, microscopa, anlisis de potencial de membrana, interacciones entre
macromolculas, etc.
Comparada con los mtodos de absorcin, la sensibilidad de los mtodos basados en
fluorescencia es 10 a 10.000 veces mayor, esto significa que se pueden analizar nanogramos a
picogramos de diversos analitos con muy buenos resultados. Otra ventaja de la fluorescencia es
su especificidad, que permite identificar molculas especficas en matrices complejas. Como
desventaja se puede distinguir que tiene menos aplicaciones que la espectroscopa de absorcin,
ya que es relativamente limitada la cantidad de sistemas qumicos que exhiben fluorescencia. Sin
embargo, an cuando el analito no exhiba fluorescencia natural, se pueden usar sondas
fluorescentes que se unen a grupos funcionales especficos en la molcula en estudio.
Fluorforos
La fluorescencia es el resultado de una serie de procesos que ocurren en ciertas
molculas llamadas fluorforos. Dichas molculas son generalmente orgnicas poliaromticas o
heterociclos. Los tomos son generalmente no fluorescentes, pero una notable excepcin son los
La Fluorescencia es un fenmeno fsico mediante el cual ciertas sustancias absorben
energa en forma de radiacin electromagntica emitindola en una longitud de onda
mayor en un perodo de tiempo muy corto.
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lantnidos, por ejemplo europio o terbio, cuya fluorescencia resulta de la transnicin electrnica
entre orbitales .
Los fluorforos se pueden dividir en dos clases generales: extrnsecos e intrnsecos. Se
denomina fluorforo intrnseco a aquel que por si mismo presenta fluorescencia. Por ejemplo el
grupo indol del triptofano en las protenas. Fluorforo extrnseco es aquel que se agrega a una
muestra que no presenta fluorescencia. Por ejemplo el 1,6-difenil- 1,3,5 hexatrieno (DPH) que se
utiliza para medir fluidez de membranas, las cuales no presentan fluorescencia.
Fundamento
Cuando el fluorforo absorbe luz uno de sus electrones pasa a un estado excitado (de
mayor energa) que es inestable y al retornar a su estado basal, el exceso de energa se libera en
forma de luz pero de una longitud de onda mayor (menor energa) a la de excitacin. Este
proceso es representado por el diagrama de Perrin-Jablonski (Figura 1).
Figura 1. Diagrama de Perrin-Jablonski
Un fluorforo absorbe energa electromagntica pasando de un estado electrnico basal
(S0) a un estado electrnico excitado (S1) luego de absorber un fotn (es decir, luz) de energa:
E = h .ex
donde E es la energa, h es la constante de Planck y ex es la frecuencia de excitacin. Esta
energa es suministrada por una fuente de luz externa. La absorcin de luz produce una transicin
electrnica en el fluorforo: un electrn es promovido desde el orbital molecular ocupado ms
externo al orbital molecular desocupado ms cercano al mismo (Figura 1). Este proceso est
dirigido por distintas reglas de seleccin y la probabilidad de que la transicin se produzca est
reflejada por el coeficiente de absortibidad molar, (M-1. cm-1) que est determinado por la ley
de Lambert y Beer para cada longitud de onda:
Decaimiento
vibracional
Decaimiento
vibracionalActivacin
trmica
Fosforescencia
Fluorescencia
Excitacin
Cruce
intersistema
Decaimiento
vibracional
Decaimiento
vibracionalActivacin
trmica
Fosforescencia
Fluorescencia
Excitacin
Cruce
intersistema
S0 + hexc S1 Excitacin
S1 S0 + hem Fluorescencia
S1 T1 Cruce intersistema
T1 S0 + hem Fosforescencia
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A = . l. c
donde A es la absorbancia, l es el paso ptico y c la concentracin del fluorforo.
En fosforescencia el electrn excitado sufre una transicin a un estado ms estable (T1), y
la emisin con energa hem resulta mantenida por un tiempo prolongado. En fluorescencia el
estado excitado dura un tiempo finito, normalmente entre 10-9 a 10-8 segundos. En este tiempo el
fluorforo sufre cambios conformacionales y esta sujeto a mltiples interacciones con el medio
ambiente molecular. Estos procesos tienen dos consecuencias importantes (Figura 1): 1) debido a
la energa que se disipa durante el tiempo de vida del estado excitado, el fotn de energa emitido
hem, es de menor energa que el fotn que el fluorforo absorbi previamente, por lo tanto la
longitud de onda de emisin es mayor que la de excitacin; 2) no todas las molculas que se
excitaron inicialmente por absorcin retornan al estado basal de energa por emisin de
fluorescencia. Otros procesos como por ejemplo: quenching colisional, transferencia de
energa de fluorescencia por resonancia (RET), conversin interna o desactivacin no radiativa y
formacin de un fotoproducto pueden disminuir la cantidad de molculas en el estado excitado y
por lo tanto disminuyen el rendimiento cuntico de fluorescencia (Figura 2).
El rendimiento cuntico de fluorescencia, F es la razn entre la cantidad de fotones
emitidos y la cantidad de fotones absorbidos por una molcula:
F = cantidad de fotones emitidos / cantidad total de fotones absorbidos
Figura 2: Esquema del paso al estado excitado y de los posibles procesos de disipacin de energa
Espectro de fluorescencia
En espectroscopa de fluorescencia se registran espectros de excitacin y de emisin. El
espectro de excitacin se corresponde con el espectro de absorbancia. Ambos espectros son una
representacin de la intensidad de fluorescencia en unidades arbitrarias en funcin de la longitud
de onda en nm. Para registrar el espectro de emisin se fija una longitud de onda de excitacin y
para el de excitacin se fija una longitud de onda de emisin. Una caracterstica llamativa de los
10-8 segundos
Quenching o transferencia de energa de fluorescencia por resonancia
Estado
basal
Estado
excitado*
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espectros de excitacin y emisin de fluorescencia es que para algunas molculas estos son
imgenes especulares uno del otro, a esto se llama regla del espejo (Figura 3). Alteraciones de
esta regla se pueden deber a impurezas fluorescentes de la muestra o, en muestras muy diluidas,
a una banda Raman que es la banda de vibracin del agua. Adems existen muchas sustancias
que no siguen esta regla (Figura 4) y esto se debe a una diferencia de arreglos geomtricos del
ncleo en el estado excitado si se compara con el estado basal.
Figura 3. Imgenes especulares de los espectros de excitacin y emisin de fluorescencia del
isotiosianato de fluorescena (FITC)
Figura 4. Espectros de excitacin y emisin de fluorescencia del p-terfenilo
Otra caracterstica de los espectros de fluorescencia es que el espectro de emisin es
independiente de la longitud de onda de excitacin (exc), debido a la disipacin parcial de
energa de excitacin que ocurre durante la duracin del estado excitado (Figura 5).
Intensidad de flu
orescencia
Intensidad de fluorescencia
Intensidad de flu
orescencia
Intensidad de fluorescencia
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El espectro de emisin de fluorescencia vara marcadamente con la estructura qumica
del fluorforo y del solvente en el que esta disuelto.
Intensidad de fluorescencia
Intensidad de fluorescencia
Figura 5. Independencia del pico de mxima emisin y la longitud de onda de excitacin.
Espectro de excitacin de un compuesto y sus diversos espectros de emisin excitando a las longitudes
de onda EX1, EX2 y EX3.
Procesos de disipacin de energa
Quenching
El quenching o atenuacin de fluorescencia puede ser definido como cualquier proceso
que disminuye la intensidad de fluorescencia de un determinado fluorforo sin cambiar el
espectro de emisin. Puede ser el resultado de interacciones del estado excitado con otras
molculas, por ejemplo el solvente (quenching colisional) o por la formacin de complejos del
estado basal no fluorescentes. El auto quenching (self-quenching) es la disminucin de la
fluorescencia debida a la alta concentracin del fluorforo, el cual al disminuir su concentracin
aumenta la fluorescencia, por ejemplo: calceina o carboxifluoresceina, los cuales se los emplea
para medir perdida de contenido de liposomas o de organelas. Cuando el fluorforo se ha
incorporado en el interior de vesculas en altas concentraciones, no fluoresce, pero si por alguna
razn, se altera la permeabilidad de la membrana, sale al medio, se diluye y fluoresce.
Transferencia de energa de fluorescencia por resonancia (RET)
La transferencia de energa de fluorescencia por resonancia (RET) se basa en la
transferencia de energa entre un grupo donante y un aceptor. Deriva de la capacidad del donante
fluorescente de excitar al aceptor, si ambos se encuentran a una distancia apropiada (entre 1 y 10
nm). La excitacin de molculas de aceptor puede ocurrir por transferencia directa de energa de
las molculas donor excitadas y sta se manifiesta como una reduccin en la intensidad de
emisin de la fluorescencia del donor y un correspondiente incremento en la intensidad de
emisin del aceptor de fluorescencia (Figura 6). El fluorforo donante excitado presenta
fluorescencia a una determinada longitud de onda. La aproximacin estrecha de un segundo fluorforo
con una banda de absorcin que se superpone con la banda de emisin del donante, conduce a la
excitacin del aceptor por el donante y la fluorescencia resultante es de mayor longitud de onda.
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Fuente luminosa
Longitud de onda
de exitacion del
donante
Fluorescencia del donante
Fluorescencia del aceptorRET
Donante
excitado
Donante
excitado
Aceptor
excitado
Fuente luminosa
Longitud de onda
de exitacion del
donante
Fluorescencia del donante
Fluorescencia del aceptorRET
Donante
excitado
Donante
excitado
Aceptor
excitado
Longitud de onda
de exitacion del
donante
Fluorescencia del donante
Fluorescencia del aceptorRET
Donante
excitado
Donante
excitado
Aceptor
excitado
Figura 6. Transferencia de energa de fluorescencia por resonancia
Anlisis estructural de las protenas
Hay slo tres aminocidos aromticos que absorben luz en la regin del ultravioleta
cercano ( > 240 nm) y son: fenilalanina (Phe), tirosina (Tyr) y triptfano (Trp). El espectro de
emisin de fluorescencia de las protenas est determinado por la presencia en la cadena proteica
de dichos aminocidos. Adems existen cofactores como FMN, FAD, NAD y porfirinas que
tambin presentan fluorescencia cuando estn presentes en las protenas. Los cambios de la
fluorescencia intrnseca pueden ser usados para monitorear cambios estructurales en la protena.
Los tres aminocidos aromticos tienen distinta absorcin y emisin de fluorescencia,
como se resume en la tabla 1.
ex (nm) em (nm) F Trp 295 353 0,20
Tyr 275 304 0,14
Phe 260 282 0,02
Tabla 1. Caractersticas de fluorescencia de los aminocidos aromticos
La fluorescencia de una protena es una sumatoria de las fluorescencias de los distintos
residuos aromticos que posee, pero generalmente se estudia entre 280-295 nm siguiendo la
fluorescencia del triptfano. Generalmente, se mide la emisin de fluorescencia del triptfano
por su mayor rendimiento cuntico y su vida media ms prolongada. Adems, la proximidad de
estos tres aminocidos en la estructura de una protena permite que ocurra transferencia de
energa por resonancia (RET) entre Phe y Tyr y entre Tyr y Trp, siendo la fluorescencia del Trp
la nica que no se transfiere. Las protenas usualmente tienen un nmero limitado de Trp y ste
est generalmente en el sitio activo de las protenas.
La tirosina, como el triptfano, tiene una fuerte banda de absorcin a 280 nm. Es un
emisor ms dbil que el triptfano, pero puede contribuir significativamente a la fluorescencia de
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la proteena, ya que normalmente est en un nmero mayor. La fluorescencia de la tirosina puede
ser fcilmente transferida si se encuentra cerca del triptfano.
La fenilalanina, con slo un anillo bencnico y un grupo de metileno es dbilmente
fluorescente. La sensibilidad experimental (el producto de rendimiento cuntico y absortividad
molar) es especialmente baja para este residuo. La fluorescencia de la fenilalanina se observa
slo en ausencia de tirosina y triptfano.
Los espectros de fluorescencia y el rendimiento cuntico son generalmente ms
dependientes del medio ambiente que los espectros de absorcin y los coeficientes de extincin
molar. En las protenas los residuos de Trp se encuentran generalmente formando parte del
ncleo hidrofbico de las mismas y por lo tanto est en regiones donde las molculas de agua
tienen poco acceso, el espectro de emisin del mismo, se corre hacia el ultravioleta (corrimiento
hacia el azul) con el mximo de emisin generalmente en 330 nm. Esto se debe a que la energa
emitida es mayor que cuando la cadena lateral se encuentra en contacto con el solvente, donde
parte de la energa absorbida es transferida a las molculas de agua y por lo tanto la longitud de
onda del mximo de emisin es mayor (340-350). Esto tambin sucede cuando una protena se
desnaturaliza. Por ejemplo, cuando al pptido MccJ25-Trp se lo resuspende en concentraciones
crecientes de dioxano, se ve un corrimiento hacia menores longitudes de onda y un aumento de
la fluorescencia (Figura 7).
Figura 7. Efecto del solvente en la fluorescencia del triptofano de la MccJ25-Trp.
Los rendimientos qunticos de los tres aminocidos aromticos decaen cuando se
incorporan a una protena. En la Tabla 2 se comparan las caractersticas de la fluorescencia de
los aminocidos libres e insertos en una protena. Tambin contiene datos que muestran la
sensibilidad de la fluorescencia de estos residuos a la polaridad de su entorno.
100 %
80 %
20 %
40 %
0 %
351 nm 333 nm
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Aminocido) Protena
Solvente em (nm F em (nm) F
H2O 340 0,12 333 0,02 Trp
DMSO 340 0,81 333 0,67
H2O 303 0,21 --- --- Tyr
DMSO 306 0,27 309 0,06
Phe DMSO 282 0,02 284 0,006
Tabla 2. Caractersticas de la fluorescencia de los aminocidos libres e insertos en una protena.
DMSO = dimetil sulfxido, un solvente orgnico.
La fluorescencia de los residuos aromticos vara en forma un tanto impredecible entre
las diversas protenas. Si se compara el estado plegado con el desplegado, el rendimiento
quntico puede aumentar o disminuir. La intensidad de fluorescencia no tiene mucho valor en s
misma, pero la magnitud de la intensidad, sin embargo, puede servir como una sonda de
perturbacin del estado plegado. La longitud de onda de emisin es un mejor indicador del
medio ambiente del fluorforo.
Por otro lado la fluorescencia del triptfano es quencheada por iodo, acrilamida, grupos
disulfuros, aminos y carboxilos y residuos de histidina cercanos.
Proceso patolgico de formacin de Amiloides
Se conoce como amiloidosis a una serie de patologas que se caracterizan por la
formacin irreversible de agregados insolubles, denominados fibras amiloides. Como ejemplos
de estas patologas podemos mencionar: la amiloidosis sistmica, la enfermedad de Alzheimer, la
enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeld-Jakob, la Encefalopata Espongiforme,
Amiloidosis familiar, Tumor de clulas C de la Tiroides, las enfermedades prinicas y en algunas
Diabetes tipo II.
Los agregados se pueden forman a partir de pptidos no estructurados o de protenas
globulares y se caracterizan por ser irreversibles, presentar estructura tipo cross y estructura
fibrilar, cuando se los observa al microscopio electrnico.
El modelo vigente sostiene que cada fibra presenta un dimetro entre 75-80 y se
encuentra formada por protofibras de 25-35 (Figura 8). En esta estructura la cadena peptdica
forma hojas cruzadas (paralelas o antiparalelas) que se disponen de forma perpendicular al eje
fibrilar.
Figura 8. Modelo de una fibra amiloide.
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La formacin de fibras amiloides pueden tambin ser inducidas in vitro bajo
condiciones fisicoqumicas adecuadas, permitiendo el estudio de los mecanismos que gobiernan
el proceso. Se sabe que ciertas protenas solubles a pH cido y en un entorno hidrofbico pueden
formar rpidamente estos agregados. Tambin pueden ser formados en presencia de fosfolpidos
cidos como fosfatidil serina (PS), cardiolipina (CL) o fosfatidil glicerol (PG). Estudios
realizados in vitro demostraron que protenas como albmina, lisozima, insulina,
gliceraldehido- 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), mioglobina, transtiretina, citocromo c,
histona H1, y R-lactoalbumina forman fibras amiloides.
La inhibicin o reversin de la formacin de fibrillas amiloides se insina como un
posible mecanismo preventivo de las enfermedades amiloides y a la fecha, distintos compuestos
orgnicos pequeos han demostrado capacidad de inhibicin del proceso in vitro.
Figura 9. Cintica de formacin de la fibra amiloide.
Los mecanismos moleculares relacionados con la formacin de los agregados amiloides
no han sido an dilucidados, pero se acepta la existencia de un mecanismo general de formacin.
La fibrilogenesis es dependiente de un proceso de nucleacin, ya que por diversos estudios se
puso de manifiesto que generalmente presenta una cintica de tipo sigmoidal (Figura 9). La
protena en estado monomrico establece un equilibrio lento con estructuras oligomricas
(tiempo de induccin), las cules, una vez formadas, dan lugar rpidamente a fibras amiloides, ya
sea mediante asociacin de unidades de monmeros o bien por fusin de oligmeros. Adems, el
agregado de fibras preformadas provoca una disminucin del tiempo de induccin.
La capacidad de la albmina de suero bovino (BSA) de formar fibrillas amiloides bajo
ciertas condiciones experimentales, ha sido recientemente demostrada. Este proceso de
fibrilacin ocurre minutos luego de la incubacin de la protena a pH fisiolgico y a temperaturas
mayores de 60C. La cintica de formacin de agregados por la BSA sigue un patrn de tipo
hiperblico en lugar de sigmoidal.
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Instrumentos utilizados para detectar fluorescencia
Los elementos esenciales en los sistemas de deteccin de fluorescencia son cuatro: 1) una
fuente de excitacin (luz blanca), 2) un lugar apropiado para poner la muestra, 3)
monocromadores o filtros para discriminar entre los fotones de emisin de los fotones de
excitacin y 4) un detector para registrar la emisin de los fotones, el cual produce una seal
generalmente elctrica. Para mejorar la visualizacin de los resultados generalmente est
acoplado al equipo un amplificador de la seal.
Existen distintos tipos de equipos que utilizan los aspectos bsicos de la fluorescencia,
entre ellos:
Espectrofluormetro y detectores de microplacas: miden el promedio de la
fluorescencia de la muestra (el volumen de muestra que mide ronda entre los L a mL).
Microscopio de Fluorescencia: determina la fluorescencia como una funcin de las
coordenadas espaciales en dos o tres dimensiones para objetos microscpicos (por debajo
de ~ 0,1 mm de dimetro).
Scanner de Fluorescencia: determina la fluorescencia en funcin de coordenadas en dos
dimensiones de objetos macroscpicos como ser geles de electroforesis, blotting y
cromatografas.
Citometra de Flujo: incorpora un detector de fluorescencia para determinar la
fluorescencia de clulas, en un flujo a travs de un capilar. Permite identificar y
cuantificar subpoblaciones de clulas en una muestra compleja.
Otros tipos de instrumentos que usan la deteccin por fluorescencia son los sistemas de
electroforesis capilar, de HPLC y los equipos de secuenciacin de DNA.
Espectrofluormetro
Un espectrofluormetro (Figura 10) consta de una lmpara de arco de Xenn la cual emite
luz blanca en un amplio rango de longitudes de onda que abarcan desde el UV, ~ 240 nm, hasta
el infrarrojo, ~ 900 nm. Este rayo de luz es colectado por el monocromador primario o de
excitacin (M1) el cual selecciona la longitud de onda (ex) que va a incidir sobre la muestra y es
determinada por el espectro de absorcin de cada fluorforo. El rayo de luz con la longitud de
onda ex incide sobre la cubeta que contiene a la muestra, la cual puede estar termostatizada. Las
cubetas pueden ser de diferentes tipos (cuarzo, vidrio, etc.) dependiendo de la longitud de onda
en la cual leamos. La emisin de fluorescencia generalmente es detectada a 90 del rayo de luz
de excitacin. Es colectada por un sistema de lentes y pasa a travs de un Monocromador
secundario o de emisin (M2) el cual separa la fluorescencia emitida por la muestra de la luz de
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excitacin, con una longitud de onda determinada (em). La luz incide en un fotodetector que
convierte los fotones de fluorescencia en una seal elctrica.
Otro componente muy importante es el canal de referencia que es un sistema que crea una
seal electrnica proporcional a la intensidad de luz incidente en la muestra. En el
espectrofluormetro se pueden colocar filtros en los trayectos pticos que impiden el paso de la
luz de ciertas longitudes onda que interfieran con la medicin.
Figura 10. Representacin esquemtica de un espectrofluormetro.
Lmpara de arco
de Xenn
Monocromador
primario de excitacin
Monocromador secundario
de excitacin
Cubeta de
muestra
ex
em
Detector /
amplificadorFotomultiplicador
Lmpara de arco
de Xenn
Monocromador
primario de excitacin
Monocromador secundario
de excitacin
Cubeta de
muestra
ex
em
Detector /
amplificadorFotomultiplicador
de emisin
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Parte experimental
Objetivo del Trabajo Prctico:
*Determinar la fluorescencia intrnseca de distintas protenas y como dicha fluorescencia
vara segn el medio en que se encuentran.
*Estudiar in vitro la capacidad de formacin de fibras amiloides de la albmina.
Determinacin de la fluorescencia intrnseca de protenas
1) Determinacin del espectro de excitacin y de emisin de albmina,
gammaglobulina, tripsina, lisozima, insulina y mioglobina: a) en buffer Tris-HCl 20 mM
pH 7,4, b) en dioxano al 50% y c) en urea 8M y d) en cloruro de guanidina 6M. A partir
de soluciones madres de la protena (2mg/ml) se realizaran diluciones 1/10 en los
distintos medios con un volumen final de 1,5 ml. Se incuban durante 30 min a
temperatura ambiente.
2) Determinacin de RET entre tirosina y triptfano. A partir de una solucin madre
de 2mg/ml de TYR se realiza una dilucin 1/10, se mide la intensidad de fluorescencia
cuando se la excita a 280 nm y fijando la longitud de onda de emisin en: a) 300 nm y b)
350 nm. Luego se le agregan 50 l de TRP (2mg/ml) y se repiten las lecturas de
intensidad de fluorescencia.
3) Quenching de la fluorescencia intrnseca del triptfano de la albmina con el
agregado de KI y hormonas tirodeas (T4). La albmina es la protena ms abundante del
plasma sanguneo, y es un transportador inespecfico de una gran cantidad de sustancias,
por ejemplo: hormonas. La albmina tiene un solo triptfano, el cual se encuentra en su
sitio de unin a la hormona. Cuando sta se une a la BSA se quenchea la fluorescencia
del triptfano. A partir de una solucin madre de 2mg/ml de albumina se realiza una
dilucin 1/10, se mide la intensidad de fluorescencia cuando se excita a 300 nm y emite a
350 nm. Luego se le agregan 50 l de T4 (4mg/ml) y se repite la lectura de intensidad de
fluorescencia.
Estudio in vitro de la capacidad de formacin de fibras amiloides de la albmina.
La albmina forma fibrillas amiloides cuando se la incuba a temperaturas mayores de
60C y a pH fisiolgico. La formacin de estos agregados se pondr en evidencia con la sonda
fluorescente Thioflavina T.
La Thioflavina T (ThT) (Figura 11), es un fluorforo que cuando se encuentra libre se
caracteriza por presentar una exc 415 nm y de em 482 nm. Sin embargo, al unirse a las fibras
amiloides, su espectro de excitacin se modifica apareciendo un pico a exc 450 nm, sin
modificar la longitud de onda de emisin.
Figura 11. Thioflavina T
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Determinacin: Se inducir la formacin de fibras amiloides de la albmina por calentamiento a 65C. Se estudiar la cintica de formacin de agregados de la albmina (2mg/ml) en buffer Tris-HCl 20 mM pH 7,4. Se tomarn alcuotas a distintos tiempos: 0, 10, 30, 60 y 90 min. Para detener la agregacin se pondrn los tubos en bao de hielo. Para la lectura se diluye las protenas a una concentracin final de 0.1 mg/ml y se les agrega ThT a una concentracin final de 25 M.
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1) Protena: exc em Dioxano 100% Urea 8M Guanidina 6M
200
220
240
260
270
280
290
300
310
320
330
340
350
360
370
380
390
400
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
260 280 300 320 340 360 380 400
2) RET: Tyr Trp y 3) Quenching
exc 275
em 300 em 350 KI
Tyr -----
Tyr-Trp
4)
Fluorescencia (UA)
0
10
30
60
90
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 20 40 60 80 100