fÁjdalomban szerepet jÁtszÓ mechanizmusok...
TRANSCRIPT
FÁJDALOMBAN SZEREPET JÁTSZÓ MECHANIZMUSOK
KOMPLEX ÁLLATKÍSÉRLETES VIZSGÁLATA
EGYETEMI DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS
TÉKUS VALÉRIA
Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar
Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet
Gyógyszertudományok Doktori Iskola
Neurofarmakológiai Program
Doktori iskolavezető: Dr. Pintér Erika
Programvezető: Dr. Pintér Erika
Témavezetők: Dr. Helyes Zsuzsanna, Dr. Pethő Gábor
2014.
2
TARTALOMJEGYZÉK
oldalszám
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 4
ÁLTALÁNOS BEVEZETÉS 6
Fájdalom, nocicepció, hiperalgézia, allodínia 6
Kapszaicin-érzékeny érzőideg végződések 7
Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 (TRPV1) és Ankirin (TRPA1)
receptorok felépítése és funkciója 8
Új típusú analgetikumok fejlesztésének indokoltsága 11
In vivo állatmodellek alkalmazásának indokoltsága 12
ÁLTALÁNOS CÉLKITŰZÉSEK 13
AZ ALKALMAZOTT MÓDSZEREK ÁLTALÁNOS BEMUTATÁSA 13
Termonocicepció: fájdalmas hőküszöb mérésen alapuló módszerek 13
A mechanonocicepció vizsgálata a talp érintési érzékenységének mérésével 15
Egyéb in vivo vizsgálati módszerek 16
Lábtérfogati változások mérése 16
A spontán súlyeloszlás vizsgálata 16
A spontán lokomotoros aktivitás vizsgálata 17
A motoros koordináció vizsgálata 17
In vitro vizsgálati módszerek 17
Gyulladásos neuropeptidek és citokinek meghatározása szövet
homogenizátumokból
Etikai vonatkozások 18
1.FEJEZET: TRPV1 RECEPTOR AGONISTÁK DESZENZIBILIZÁLÓ ANTINOCICEPTÍV
HATÁSAINAK VIZSGÁLATA FÁJDALMAS HŐ- ÉS HIDEGKÜSZÖB MÉRÉSÉVEL
PATKÁNYBAN
IRODALMI HÁTTÉR, ELŐZMÉNYEK 19
A kapszaicin, RTX és deszenzibilizáció 19
N-oleoildopamin 20
CÉLKITŰZÉS 21
KÍSÉRLETI MODELLEK 21
Kísérleti állatok 21
A termonociceptív küszöbök meghatározása 21
Az érzőideg végződés deszenzibilizációjának vizsgálata 21
TRPV1 receptor deszenzibilizációjának vizsgálata 22
Felhasznált anyagok 23
Statisztikai analízis 23
EREDMÉNYEK 24
MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉS 28
2. FEJEZET: TRPV1 ANTAGONISTÁK HATÁSAINAK VIZSGÁLATA PATKÁNYMODELLBEN
IRODALMI HÁTTÉR, ELŐZMÉNYEK 32
CÉLKITŰZÉS 33
KÍSÉRLETI MODELLEK 33
Kísérleti állatok 33
RTX által kiváltott nociceptív hőküszöbcsökkenés 33
Enyhe hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenés 34
Plantáris incízióval kiváltott hőküszöbcsökkenés 34
RTX indukálta hiperalgézia mérése Plantar Test készülékkel (latenciaidő mérés) 35
Felhasznált anyagok 35
Statisztikai analízis 36
EREDMÉNYEK 36
TRPV1 antagonisták hatásai a termonocicepciós küszöbök vizsgálatakor 36
RTX által kiváltott hőküszöbcsökkenés gátlása 36
Az enyhe hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenés gátlása 37
A plantáris bőr-izom incízió okozta hőküszöbcsökkenés gátlása 39
TRPV1 receptor antagonisták hatása az alap hőküszöbre 40
3
TRPV1 antagonisták hatásai RTX által kiváltott latenciaidő-csökkenésre 40
MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉS 41
3. FEJEZET: A TRPV1 ÉS TRPA1 RECEPTOROK SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA AZ ALAP
HŐÉRZÉKELÉSBEN ÉS MUSTÁROLAJ ÁLTAL KIVÁLTOTT HIPERALGÉZIA MODELLBEN
RECEPTOR GÉNHIÁNYOS EGEREK FELHASZNÁLÁSÁVAL
BEVEZETÉS, IRODALMI HÁTTÉR 46
CÉLKITŰZÉS 47
KÍSÉRLETI MODELLEK 48
Kísérleti állatok 48
Felhasznált anyagok 48
Előkísérletek és módszertani fejlesztések 48
Az alap termonociceptív küszöbök meghatározása 49
Mustárolaj által kiváltott termális hiperalgézia vizsgálata 49
Mustárolaj hatására kialakuló mechanikai hiperalgézia vizsgálata 49
Mustárolaj hatására kialakuló akut nocifenzív reakció 49
Statisztikai analízis 50
EREDMÉNYEK 50
Előkísérletek 50
Alap (kontroll) hőküszöb értékek meghatározása 51
Mustárolaj által kiváltott termális hiperalgézia meghatározása 52
Mustárolaj által kiváltott mechanikai hiperalgézia meghatározása 53
Mustárolaj által kiváltott akut nocifenzív reakció meghatározása 54
MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉS 55
4. FEJEZET: A KOMPLEX REGIONÁLIS FÁJDALOM SZINDRÓMA (CRPS)
PASSZÍV TRANSZFER-TRAUMA EGÉRMODELLJE
IRODALMI HÁTTÉR, ELŐZMÉNYEK 59
Neuro-immun interakciók 59
A CRPS klinikai jellemzői 59
CÉLKITŰZÉS 62
KÍSÉRLETI MODELLEK ÉS VIZSGÁLATI MÓDSZEREK 62
Vizsgálati alanyok és mintagyűjtés 62
Kísérleti állatok 62
Kísérleti protokoll 63
Plantáris bőr-izom incízió 64
Vizsgálati módszerek 64
EREDMÉNYEK 66
Mechanikai hiperalgézia 67
Lábduzzadás 68
Hő- és hideghiperalgézia 69
Spontán súlyeloszlás 69
Spontán lokomotoros aktivitás és motoros kordináció 69
Talphőmérséklet és testsúlyváltozás 70
Lábhomogenizátumokban mért gyulladásos neuropeptidek és citokinek
koncentrációja 71
Potenciálisan befolyásoló tényezők 71
MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉS 73
ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA 76
IRODALOMJEGYZÉK 78
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 93
PUBLIKÁCIÓS LISTA 94
4
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
ATP: adenozin-trifoszfát
AITC: allyl-isothiocyanate / allil-izotiocianát
ANOVA: analysis of variance / variancia-analízis
BK: bradikinin
B2: bradikinin receptor 2
CGRP: Calcitonin- gene-related-peptide / calcitonin gén-rokon peptid
CKK: kolecisztokinin
COX-2: ciklooxigenáz
CRPS: Complex Regional Pain Syndrome / Komplex Regionális Fájdalom Szindróma
CZP: kapszazepin
DMSO: dimetil-szulfoxid
H2S: hidrogén-szulfid
IASP: International Association for the Study of Pain / Fájdalomkutatás Nemzetközi
Szervezete
IC: intracelluláris
IgG: immunglobulin G
i.p.: intraperitoneális
i.pl.: intraplantáris
LCS: latenciaidő-csökkenés
MO: mustárolaj
MED: minimális effektív dózis
NSAID: non-steroidal anti inflammatory drug / nem szteroid gyulladáscsökkentő szer
NKA: neurokinin A
NGF: nerve growth factor / idegi eredetű növekedési faktor
NMR: nucleus raphe magnus
OLDA: N-oleoildopamin
PACAP: pituitary adenylate-cyclase-activating polypeptide / hipofízis-adenilát-cikláz-
aktiváló polipeptid
PAG: periaquaeductal grey matter/ periaquaduktális szürkeállomány
PAR: proteáz aktiváló receptor
PG: prosztaglandin
5
PGE2: prosztaglandin-E2
PKA: protein-kináz-A
PKC: protein-kináz-C
PLC: foszfolipáz-C
PIP2: foszfatidilinozitol 4,5-biszfoszfát
RIA: radioimmunassay
RTX: reziniferatoxin
SEM: standard hiba
SP: substance P / P-anyag
TNF-α: tumor nekrózis faktor alfa
TRP: tranziens receptor potenciál
TRPV1: tranziens receptor potenciál vanilloid 1
TRPA1: tranziens receptor potenciál ankirin 1
VR1: vanilloid receptor 1
6
Általános bevezetés
Fájdalom, nocicepció, hiperalgézia, allodínia
A fájdalomkutatás nemzetközi szervezete (International Association for the Study of Pain,
IASP) az alábbiak szerint definiálja a fájdalom fogalmát: egy kellemetlen szubjektív
érzéskvalitás, mely tényleges vagy potenciális szövetkárosodást jelez. Neurobiológiai
komponensével, a nocicepcióval, (a fájdalmas stimulus percepciója) illetve affektív
komponensével (fájdalom emociója) jellemezhető, ez utóbbi azonban csak emberekben
vizsgálható. Állatkísérletek során a nociceptorok aktiválódását, illetve a fájdalmas
stimulusra adott elhárító (nocifenzív) magatartást tudjuk vizsgálni. A nociceptorok, melyek
szövetkárosító ingerekre specifikusan reagáló szenzoros idegvégződések, többféle
szempontból csoportosíthatók. Érzékenység alapján megkülönböztethetünk unimodális
(csak termális vagy mechanikai ingerekkel stimulálható) illetve polimodális (hő-,
mechanikai és kémiai ingerekkel egyaránt aktiválható) receptorokat. Axonjaik
mielinizáltsága alapján vékonyan mielinizált, gyorsan vezető (12–30 m/s) Aδ
nociceptorokra, és mielinhüvely nélküli, lassan vezető (0,5–2 m/s) rostokkal rendelkező C
nociceptorokra oszthatjuk őket. A perifériás nociceptorok olyan primer afferens neuronok
végződései, melyek sejttestjei a gerincvelő hátsógyöki illetve trigeminus ganglionokban
találhatók. Ezek perifériás nyúlványai alkotják a fájdalomérző idegrostokat, míg centrális
nyúlványaik a központ felé a gerincvelő hátsó szarvába vagy a nucleus tractus spinalis
nervi trigeminibe továbbítják az ingerületet.
A fájdalom időtartama alapján lehet akut, illetve krónikus. Az akut fájdalom a szervezet
legfontosabb védekező mechanizmusa, mely a szövetek valamilyen károsodására hívja fel
a figyelmet, csillapítása az egyik legfontosabb tüneti kezelés. Krónikus fájdalomról
beszélünk, ha az több mint három hónapig fennáll. Ez a fájdalomállapot lehet konstans (pl.
malignus tumor esetében), illetve intermittáló (pl. migrén).
Az enyhe fájdalmas ingerek által kiváltott fokozott fájdalomérzetet hiperalgéziának
nevezzük, míg a nem fájdalmas stimulusokkal kiváltott patológiás fájdalomérzet az
allodínia (Merskey és Bogduk 1994). Mind a mechanikai, mind pedig a termális allodínia
és hiperalgézia kialakulhat gyulladás illetve eltérő eredetű (traumás, toxikus) centrális vagy
perifériás idegsérülés hatására, melyek a szomato-szenzoros vagy a spino-talamo-kortikális
pályarendszer bármely szintjén létrejöhetnek (Tajti és Vécsei 2006).
7
Kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések
A perifériás nociceptorok egy nagy csoportját, kb. 50-70%-át alkotják a kapszaicin-
érzékeny érzőideg-végződések (Holtzer és mtsai. 1991). Nevüket a csípős paprika
alkaloidjáról, a kapszaicinről kapták, mivel ezen idegvégződések membránjában
lokalizálódik receptora, a Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 (TRPV1) ioncsatorna
(lásd később). Ezek az érzőideg-végződések egyedülálló módon ún. hármas funkcióval
rendelkeznek: egyrészt a klasszikus afferens funkcióval, mely során az ingerületbe került
szenzoros idegvégződés a központi idegrendszer felé közvetíti az idegaktivitást, ennek
következtében kialakul a fájdalomérzet, vagyis a nocicepció. Szolcsányi János és Gábor
Aranka korai kísérleteik során patkányok n. saphenusának és n. trigeminusának elektromos
izgatása következtében létrejövő arteriolás vazodilatációt, vaszkuláris permeabilitás-
növekedést és plazmaproteinek extravazációjátt figyelte meg a beidegzési területeken.
Ezen idegeken nagy dózisú kapszaicinnel történő előkezelés után sem ortodrómos kémiai,
sem antidrómos elektromos ingerlés hatására nem alakult ki a gyulladásos reakció. Ennek
alapján azt feltételezték, hogy a gyulladáskeltő mediátorok a kapszaicin-érzékeny
fájdalomérző-idegvégződésekből, a nociceptorokból szabadulnak fel (Jancsó és mtsai.
1967). Későbbi kísérleteik során igazolták, hogy az aktivált érzőideg-végződésekből
gyulladáskeltő szenzoros neuropeptidek (kalcitonin gén-rokon peptid (CGRP),
tachikininek (substance P (SP) és neurokinin A (NKA)) szabadulnak fel, melyek
értágulatot, plazmafehérje kiáramlást okoznak, továbbá a gyulladásos sejtek aktivációjával
hozzák létre a neurogén gyulladást (Szolcsányi 1984 a, b, 1988). Ezt a folyamatot
nevezzük lokális efferens funkciónak. A neurogén gyulladás számos betegség
patomechanizmusában meghatározó szerepet játszik, jelenleg azonban egyetlen
gyógyszercsoport sem képes hatékonyan gátolni a betegség neurogén komponensét
(Helyes és mtsai. 2003).
A gyulladáskeltő neuropeptidek mellett, gyulladásgátló és fájdalomcsillapító mediátorok
(pl. szomatosztatin, hipofízis-adenilát-cikláz-aktiváló polipeptid (PACAP)) is
felszabadulnak, melyek a keringésbe jutva a test távolabbi pontjaira eljutva akadályozzák a
neurogén és nem neurogén gyulladás kialakulását, illetve analgetikus hatást váltanak ki. Ez
az érzőideg-végződések harmadik, ún. szisztémás efferens funkciója (Szolcsányi és mtsai.
1998 a, b).
8
1. ábra: A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések hármas funkciója (Rövidítéseket lásd a szövegben)
A Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1 (TRPV1) és Ankyrin 1 (TRPA1)
receptorok felépítése és funkciója
A hátsó gyöki és trigeminus ganglionokban a polimodális nociceptív primer szenzoros
neuronokon expresszálódnak, Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid családba tartozó
Vanilloid 1 és Ankirin 1 receptorok. Jelenlétüket újabban nem neuronális struktúrákon is
kimutatták (Inoue és mtsai. 2002, Fernandes és mtsai 2012). Mindkét receptor jelentős
szerepet játszik az érzőidegek aktivációján keresztül a fájdalom (Fernandes és mtsai. 2011)
és a neurogén gyulladás (Geppetti és mtsai. 2008) mechanizmusaiban. A TRPA1-et
expresszáló szenzoros neuronok 97%-ának membránjában megtalálható a TRPV1 receptor
is, míg a TRPV1-et expresszáló neuronok 30%-ában koexpresszálódik a TRPA1 is (Story
és mtsai. 2003). Mindkét receptor ioncsatornához kötött receptor, melyek Ca2+
és Na+
ionok számára permeabilisek, számos kémiai irritáns, endogén mediátor és fizikai inger
9
képes őket stimulálni. Szerkezetüket tekintve hasonlók: mindkét receptort 6 β-redő
szerkezetű transzmembrán domén építi fel. Az 5. és 6. alegység között intracelluláris,
hidrofób hurok található, ez alkotja csatornarégiót. Ezen struktúrák négy egységből álló
tetramerré alakulva alkotják a nem szelektív kationcsatornát (2. ábra). Legszembetűnőbb
különbség köztük a TRPA1 receptor N-terminális régiójában található 14 ankirin
ismétlődés, mely hosszúságával egyedülálló az élővilágban. A receptor elnevezését is erről
kapta, ezen ismétlődésnek feltetételezhetően a mechanikai érzékelésben jut fontos szerep
(Kwan és mtsai. 2006).
2. ábra: TRPV1 és TRPA1 receptor felépítése (Forrás: Bessac és Jordt 2008a.)
A TRPV1 egy olyan receptor, mely fizikai és kémiai ingerek számára molekuláris
integrátor funkciót lát el (Tominaga és mtsai. 1998). A receptor létezését, Szolcsányi már
1975-ben valószínűsítette (Szolcsányi 1975). Számos exogén növényi eredetű irritáló
vanilloid vegyület (reziniferatoxin (RTX), piperin, gingerol) (Pingle és mtsai. 2007,
Szállási 2007) képes aktiválni, ezért a receptor eredeti elnevezése vanilloid receptor 1
(VR1) lett, melyet azonban az egyéb tranziens receptorpotenciált közvetítő ioncsatornákkal
mutatott szerkezeti hasonlóságai miatt később TRPV1-re változtattak (Gunthorpe és mtsai.
2002). Kapszaicin melletti másik fontos stimulátora a fájdalmas intenzitású hő (43°C
felett), míg a pH változása (acidózis), „endovanilloidok” (pl. anandamid), arachidonsav-
metabolitok, oxidált linolsav metabolitok, és esszenciális olajok is képesek még a receptort
aktiválni (Pingle és mtsai. 2007, Szállási 2007). Gyulladáskeltő mediátorok, mint
bradikinin, prosztaglandinok, adenozin-trifoszfát (ATP), proteáz aktiváló receptorok (PAR
10
1, 2 ,4), tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-alfa), idegnövekedési faktor (nerve growth factor,
NGF) is érzékenyítik a receptort foszforiláció révén. Ezen mediátorok hatására a
csatornaproteinek allosztérikusan modifikálódnak, ezáltal növelik a hő, a protonok és/vagy
a kapszaicin által kiváltott receptor aktiváció mértékét (Moriyama és mtsai. 2005, Szállási
és mtsai. 2007). A receptor szenzibilizációjának mértékét számos mechanizmus
befolyásolja, köztük a TRPV1 foszforilációjának mértéke, melyben a protein kináz A
(PKA), protein kináz C (PKC) és egyéb kinázok játszanak kulcsfontosságú szerepet
(Premkumar és Ahern 2000, Jung és mtsai. 2003).
A TRPA1 receptor hidegérzékelésben betöltött szerepéről rendelkezésre álló adatok
egymásnak ellentmondóak. Számos különböző eredmény született e téren, vannak, akik
mellette (Story és mtsai. 2003, Obata és mtsai. 2005, Kwan és mtsai. 2006, Sawada és
mtsai. 2008), vannak, akik ellene érvelnek (Jordt és mtsai. 2004, Nagata és mtsai. 2005,
Bautista és mtsai. 2006). Feltételezhetően más mechanizmusok mellett a TRPA1 is
hozzájárul a 17°C alatti hőmérséklet érzékeléséhez.
A TRPA1 receptor exogén agonistái közül jelentősek a növényi eredetű vegyületek, a
mustárolajban található allil-izotiocianát (AITC) (Jorgt és mtsai. 2004, Bandell és mtsai
2004, Bautista és mtsai. 2006), a fokhagymában levő allicin (Macpherson és mtsai. 2005),
fahéjaldehid (Macpherson és mtsai. 2006), továbbá toxikus kipufogó gázokban és
dohányfüstben található vegyületek (pl. acrolein) (Bautista és mtsai. 2006). Endogén
agonistái között tartják számon az oxidatív stressz során felszabaduló reaktív gyököket
(Bessac és mtsai. 2008b), köztük a 4-hidroxinonenalt (Trevisani és mtsai. 2007), lipid
peroxidáz termékeket (Taylor-Clark és mtsai. 2008), továbbá cink, réz és kadmium ionokat
(Hu és mtsai. 2009, Gu és Lin 2010). Endogén modulátorai között szerepelnek a
gyulladásos folyamatok során felszabaduló ágensek, pl. bradikinin (Bandell és mtsai.
2004), PAR-2 agonisták (Dai és mtsai. 2007), továbbá a hidrogén-szulfid (H2S) (Miyamoto
és mtsai. 2011).
A receptor aktiválása többféleképpen történhet, fahéjaldehid, acrolein, AITC és a legtöbb
növényi eredetű terpén a csatorna intracelluláris N-terminális részén található specifikus
cisztein oldallánchoz kötődik reverzibilis kovalens kötéssel, így idézve elő a konformáció
változást és a csatorna nyitását (Hinman és mtsai. 2006). A TRPA1 receptor sajátossága,
hogy a Ca2+
ionokra nézve nem szelektív, az intracelluláris Ca2+
-szint-növekedés direkt
módon képes aktiválni a receptort. A bradikinin indirekt módon stimulálja a TRPA1
receptort, mégpedig úgy, hogy a primer szenzoros neuronon megtalálható G proteinhez
11
kötött receptorához kötődik, aktiválja a foszfolipáz C-t (PLC), amely a sejtmembránban
lévő foszfatidilinozitol biszfoszfát (PIP2) hidrolíziséhez vezet. E folyamat eredményeként a
keletkező inozitol-triszfoszfát (IP3) az intracelluláris Ca2+
raktárakból szabadít fel Ca2+
-
ionokat, míg a diacilglicerol (DAG) aktiválja a protein-kináz C-t (PKC), ami a TRPV1
szenzitizációjához vezet, így még több Ca2+
-ion áramlik be az extracelluláris térből a sejt
belsejébe. A kétféle úton zajló események az intracelluláris Ca2+
koncentráció emelkedése
révén a TRPA1 ioncsatorna nyitását okozzák (Bautista és mtsai. 2006).
3. ábra: A TRPV1 és TRPA1 receptor közötti interakcó (Forrás: Bautista és mtsai. 2006).
Új típusú analgetikumok fejlesztésének indokoltsága
A fájdalomcsillapítás területén új támadáspontú szerek fejlesztésében az elmúlt 100 évben
nem történt lényegi áttörés. Évtizedek óta ugyanazon hatásmechanizmusú gyógyszereket
használják, melyek két nagy csoportra oszthatók, a nem-szteroid gyulladáscsökkentőkre
(NSAID) illetve az opioidokra.
Az NSAID-ok akut, elsősorban gyulladással és szövetkárosodással járó fájdalomra hatnak
(pl. traumás vagy posztoperatív fájdalom). Hatásmechanizmusuk alapja, hogy képesek
gátolni a gyulladás vagy szöveti trauma következtében indukálódó ciklooxigenáz 2 (COX-
2) enzimet, melynek hatására csökken a szintetizálódott prosztaglandinok (PG)
mennyisége a perifériás szövetekben, így csökken a nociceptor szenzibilizáló
(hiperalgéziát okozó) hatásuk. A COX-2 enzim gátlásával, akadályozzák a gerincvelő
hátsó szarvában a PGE2 nociceptív, spinális neuronokon kifejtett szenzibilizáló hatását.
12
Gyulladásgátló hatásuk mellett láz és fájdalomcsillapító hatással is rendelkeznek.
Mellékhatásaik többsége az élettanilag fontos COX-1 enzim gátlása révén alakul ki.
Ismerünk COX izoenzimekre nem-szelektív, COX-2-preferenciális és COX-2-specifikus
szereket. Az áttörést jelentő COX-2-specifikus szerek sem váltották be a hozzájuk fűződő
reményeket. Ugyan a szelektivitás miatt a kialakuló gasztrointesztinális mellékhatásaik
minimálisak, azonban a kardiovaszkuláris rizikót jelentősen megnövelik.
Az opioidok hatékonysága nagy, ezért nagy intenzitású fájdalommal járó megbetegedések
(pl. malignus tumor) kezelésében alkalmazzák őket. Az opioidok mind a fájdalom
percepciójára, mind pedig a fájdalom affektív komponensére hatással vannak, csökkentik a
szorongást, emelik a fájdalomküszöböt. Hatásmechanizmusuk főként centrális
támadáspontú, melynek magyarázata a gerincvelő opioid receptor (μ, δ, κ) gazdagsága,
azonban perifériás támadásponttal is jellemezhetők, mivel µ-receptorok az érzőideg
végződéseken is megtalálhatók (Stein és mtsai. 1990, Mousa és mtsai. 2001, Atkinson
2013).
Bár a korábban felsorolt két csoportba tartozó vegyületek a legtöbb esetben hatékony
fájdalomcsillapítók, mégis egyes fájdalom állapotokban (pl. neuropátiás fájdalomban)
hatástalannak bizonyulnak. Ezen esetekben adjuváns analgetikumok alkalmazására van
szükség. Ebbe a típusba tartoznak triciklikus antidepresszánsok (pl. amitriptilin,
nortriptilin), egyes antiepileptikumok (gabapentin, pregabalin), illetve a helyi
érzéstelenítők (pl. lidocain). Azonban gyakran e szerek alkalmazása mellett sem kielégítő a
hatás, melynek eredményességét tovább csökkentik az esetenként súlyos mértékben
jelentkező mellékhatások, pl. a COX izoenzimre nem szelektív NSAID-ok alkalmazásakor
fellépő gasztrointesztinális és renális mellékhatások, vagy a hosszantartó opioid-kezelés
következtében jelentkező fizikai és pszichés dependencia, tolerancia, eufória,
légzésdepresszió, obstipáció vagy vizeletretenció.
Mindezek alapján sürgető olyan új típusú célmolekulák azonosítása, melyek a perifériás
nociceptorokon szeletíven ható fájdalomcsillapítók támadáspontjai lehetnek.
In vivo állatmodellek alkalmazásának indokoltsága
A rendelkezésre álló in vitro elektrofiziológiai (pl. 1 idegrost akciós potenciálját elvezető
technika, „patch-clamp”, Ca2+
-imaging technika) és különböző molekuláris biológiai
technikák alkalmazásával lehetőség nyílik a különböző receptorok aktivációs
mechanizmusainak, jelátviteli útvonalainak felderítésére, illetve a receptorokon ható
13
agonisták-antagonisták azonosítására. Azonban az egyes szerek szervezetben kiváltott
hatásainak komplex vizsgálatához nélkülözhetetlenek az élő állatokon (egereken,
patkányokon) elvégzett tesztek.
Az in vivo élő szervezetekben elvégzett kísérletek kifejezetten jelentős szerepet játszottak
olyan akut és krónikus fájdalomállapotok eseteiben is, ahol a perifériás input válaszok
tanulmányozása humán alanyokon nem vagy alig kivitelezhető (Staud 2013). Krónikus
fájdalom modellekben vizsgált fájdalmas stimulusok jelátviteli útvonalainak azonosítása,
feldolgozása és percepciójának feltérképezése is állatkísérletek bevonásával valósult meg
(Kuner 2007). Mivel a legtöbb humán betegség nem pontosan modellezhető
állatkísérletesen, a megfelelő preklinikai módszerek kidolgozása ezek miatt nagy
fontossággal bír.
ÁLTALÁNOS CÉLKITŰZÉSEK
1. In vivo fájdalomtesztek során alkalmazott készülékek módszertani fejlesztése,
komplex betegség modellek validálása és kidolgozása
2. A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések komplex vizsgálata, az ezeken
található receptorok aktivációjának serkentése illetve gátlása különböző
farmakológiai vegyületekkel, továbbá szerepük meghatározása különböző fájdalom
és gyulladás-modellekben
AZ ALKALMAZOTT MÓDSZEREK ÁLTALÁNOS BEMUTATÁSA
Termonocicepció: fájdalmas hőküszöb mérésen alapuló módszerek
A nocicepció vizsgálatára számos módszer áll a rendelkezésre, az értekezés alapjául
szolgáló kísérletek során főként a termonocicepció vizsgálata került fókuszpontba. Az
általam alkalmazott módszerek alapelveit és fontosabb jellemzőit az alábbiakban foglalom
össze, míg a részletes kísérleti protokollokat az egyes fejezetekben ismertetem.
A klasszikus, latenciaidő-mérésen alapuló termonocicepciós tesztekben küszöb feletti
állandó intenzitású ingereket alkalmaznak, és az elhárító reakció megjelenéséig eltelt időt
mérik. Ilyen módszer például az állandó hőmérsékletű (50-55°C) forró lap, mely esetben a
vizsgált állat ráhelyezésekor az összes végtag érintkezik az ingerforrással (Eddy &
Leimbach 1953).
14
5. ábra: Egyenletesen emelkedő
hőmérsékletű forró lap
4. ábra: Plantar teszt
6. ábra: Egyenletesen emelkedő
hőmérsékletű vízfürdő
Másik módszer a plantar teszt (Hargraeves és mtsai. 1988) (4. ábra), ahol állatokat egy
alulról üveg felületű műanyag dobozba
helyezik, majd egyik talpukat állandó
intenzitású fókuszált fénysugár
segítségével ingerlik. Abban a pillanatban,
amikor az állat elhúzta a lábát, a fókuszált
fény kialszik, és a kijelzőről az eltelt idő -
mely az elhárító reakció latenciaideje-
leolvasható.
Ezzel szemben az általunk bevezetett új
mérési módszerekben a kezdeti, viszonylag alacsony kiindulási hőmérséklet fokozatos
emelésével – melyet az elhárító reakció megjelenésekor azonnal leállítunk – pontosan
meghatározható a termonocicepciós küszöb. E módszerek igazi előnye megbízhatóságában
és jó reprodukálhatóságában rejlik, így kiváló alternatívájává vált a tradicionális
latenciaidő- meghatározáson alapuló teszteknek. Az a hőmérsékleti érték, melynél az állat
elhárító reakciót mutat, – megnyalja, megrázza vagy megemeli valamelyik hátsó végtagját
– a fájdalmas hőküszöb. Az egerek és patkányok lábon mért termális küszöbének
meghatározásához az IITC Life Science által gyártott emelkedő/csökkenő hőmérsékletű
forró/hideg lapot használtuk (Almási és mtsai. 2003) (5. ábra). Az állatok szabadon
mozogtak egy alulról fűthető/hűthető fém aljú plexidobozban. A fémlap fűtése
szobahőmérsékletről indult, sebessége kétféle lehet, egyrészt 6 °C / perc illetve 12 °C /
perc. A nocifenzív reakciót kiváltó hőmérsékleti érték elérésekor a lap fűtését/hűtést
azonnal leállítottuk, és az állatot eltávolítottuk.
15
7. ábra: Dinamikus plantáris eszteziométer
Elhárító reakció hiányában a melegítés minden esetben az 50 °C elérése után leállt,
tekintve, hogy e hőmérséklet felett jelentős szövetkárosodás jöhet létre. A készülék a lábon
mért fájdalmas hidegküszöbök vizsgálatára is alkalmasnak bizonyult hasonló elvek
alapján. A fájdalmas hideg küszöbök meghatározásakor a legkisebb beállítható érték a 0 °C
volt. A termonocicepció mérésére egy másik módszert is alkalmaztunk, az Experimetria
Kft.-vel közösen kifejlesztett és intézetünkben korábban validált emelkedő hőmérsékletű
vízfürdőt (6. ábra) (Bölcskei és mtsai. 2007, Füredi és mtsai. 2009).
Patkányok lábán mért fájdalmas hőküszöbök vizsgálatához az állatokat gyengéden tartva,
egyik hátsó végtagjukat egy vízzel teli tartályba merítettük, majd a tartály vizét 30°C-ról
indulva egyenletesen melegíteni kezdtük. A mérést egy pedál segítségével a nocifenzív
reakció megjelenésekor azonnal leállítottuk, és a kijelzőről leolvasott hőmérsékleti értéket
tekintettük a láb termális fájdalomküszöbének.
A mechanonocicepció vizsgálata a talp érintési érzékenységének mérésével
A talp érintési érzékenységét dinamikus
plantáris eszteziométerrel (Ugo Basile, Comerio,
Olaszország) vizsgáltuk (7. ábra). A készülék
lényegében egy módosított von Frey berendezés.
Az állatok szabadon mozogtak egy alul rácsos
ketrecben. Egy tükrös stimulátor segítségével
egy tompa végű tűt irányítottunk pontosan az
állat talpának közepére, mely emelkedésével
fokozatosan növekvő erőhatást fejt ki az adott
területre. A maximális erőhatást 10g-ban
határoztuk meg, míg a tűemelés sebességét 2,5 g/s-ra állítottuk. A mechanonociceptív
küszöb elérésekor,- vagyis annál az értéknél, amelynél az állat elhárító reakciót mutat,
tehát elhúzza a lábát-, a digitális számláló megáll, és az érték a kijelzőről grammban
leolvasható.
16
9. ábra: Incapacitance teszter
8. ábra: Pletizmométer
Egyéb in vivo vizsgálati módszerek:
Lábtérfogati változások mérése
A láb térfogatának változásait pletizmométerrel (Ugo
Basile, 7140, Comerio, Olaszország) (8. ábra) vizsgáltuk.
A készülék a közlekedőedények elve alapján működik. Két
folyadékkal jelig töltött edény csatlakozik egy
transzducerhez, mely detektálja az állat lábának
bemerítésekor kiszorított folyadék térfogatát. A digitális
kijelzőről leolvasható a láb térfogata cm3-ben. A kapott
adatokat a kezdeti kontroll értékekhez viszonyítva
százalékosan ábrázoltuk.
A spontán súlyeloszlás vizsgálata
A hátsó végtagok spontán
súlyeloszlását Incapacitance Tester
(Linton Instrumentation, Norfolk,
Egyesült Királyság) készülékkel
vizsgáltuk (9. ábra), mellyel a hátsó
végtagok nehézkedését lehet
detektálni. Alkalmazásával a
hiperalgézia mértéke meghatározható
a spontán súlyterhelés változásával. A
mérés egy plexiketrecben történik,
melynek aljába két digitális mérleget építettek. Az állatok hátsó végtagjaikkal ezekre a
mérlegekre állnak, míg mellső lábaikat egy ezzel 45°-os szöget bezáró plexilapra
támasztják. A mért értékeket a digitális kijelzőről grammban olvastuk le. Kontroll
körülmények között az állatok a két hátsó végtagjukat szinte azonos mértékben terhelik,
tehát a spontán súlyeloszlás 50-50%, mely fájdalom hatására eltolódik. A spontán
súlyeloszlás változását a végtagok értékeinek összehasonlításával százalékban fejeztük ki.
17
10. ábra: Open field teszt
11. ábra: Rotarod kerék
A spontán lokomotoros aktivitás vizsgálata
A spontán lokomotoros aktivitás mérésére
open field tesztet alkalmaztunk (10. ábra).
Az állatokat egy 16 egyenlő részre osztott,
felülről nyitott dobozba helyeztük, majd a
kísérlet 5 perce alatt videokamerával
detektáltuk a következő paramétereket:
mozgással vagy mosakodással eltöltött időt,
érintett mezők és ágaskodások számát,
illetve a doboz közepén töltött időt. Krónikus
fájdalom jelenlétében fokozódik a szorongás,
mellyel fordítottan arányos a mozgással és a doboz középén töltött idő, továbbá az
időegység alatt érintett mezők száma, míg a mosakodás, ágaskodás, és a sarokban töltött
idő azzal egyenesen arányos (Gaszner és mtsai. 2012).
A motoros koordináció vizsgálata
A motoros funkció és a koordináció vizsgálatát
RotaRod (Ugo Basile, 37400, Comerio,
Olaszország) készülékkel vizsgáltuk (11. ábra).
Az egyensúlyozó képesség és az izomerő
vizsgálatához az állatokat egy egyenletesen
gyorsuló forgó hengerre helyeztük, majd a
leesésig eltelt időt detektáltuk. A forgó henger
fordulatszáma (rpm) az első 10 másodpercben
konstans 4 rpm volt, majd 5 perc alatt 40 rpm-re
gyorsult fel.
In vitro vizsgálati módszerek:
Gyulladásos neuropeptidek és citokinek meghatározása szövet homogenizátumokból
A gyulladásos neuropeptidek és citokinek meghatározásához a kivett szövetmintákat apró
darabokra vágtuk, majd 2 ml jéghideg kétszer desztillált vízben homogenizáltuk 0 °C
fokon 2 percen keresztül 21.000 rpm-en, Miccra D-9 homogenizátorral (Art-moderne
18
Labortechnik, Németország). Ezután a mintákat lecentrifugáltuk (4 °C, 10000 rpm 10
percig), majd a felülúszókat összegyűjtöttük és további mérésig -20 °C-on tároltuk. A
szöveti homogenizátumokból meghatározható CGRP- és SP-szerű immunreaktivitás
mérésére rádioimmunesszé (RIA) módszert alkalmaztunk a korábban leírtak szerint
(Németh és mtsai. 1998, 1999). A vérminták IL-6 illetve IL1-béta szintjét Luminex®
100™ x MAP módszerrel (Invitrogen gyulladásos panel egerekhez, AtheNA Multi-Lyte)
határoztuk meg a gyártó cég ajánlása szerint.
Etikai vonatkozások
A kísérleteink során alkalmazott vizsgálatok minden esetben megfeleltek az állatkísérletek
végzéséről szóló 243/1998. számú kormányrendelet előírásainak. A kísérleti eljárásokat a
Pécsi Tudományegyetem állatkísérletekkel foglalkozó Etikai Bizottság javaslatára a
Baranya Megyei Állategészségügyi és Élelmiszer-ellenőrzési Főosztály engedélyezte
(szám: BA 02/2000-9-2011). Kísérleteink során minden esetben eleget tettünk az IASP
által lefektetett állatkísérletekre vonatkozó etikai alapelveknek (Zimmermann 1983).
Minden esetben igyekeztünk a kísérlet elvégzéséhez szükséges legkisebb állatszámmal
dolgozni, és a kísérletbe bevont állatok szenvedését minimálisra csökkenteni.
19
12. ábra: A kapszaicin és reziniferatoxin
kémiai struktúrája
1. fejezet: TRPV1 receptor agonisták deszenzibilizáló
antinociceptív hatásainak vizsgálata fájdalmas hő- és
hidegküszöb mérésével patkányban
Bölcskei K., Tékus V., Dézsi L., Szolcsányi J., Pethő G.: Antinociceptive desensitizing
actions of TRPV1 receptor agonists capsaicin, resiniferatoxin and N-oleoyldopamine as
measured by determination of the noxious heat and cold thresholds in the rat. Eur. J. Pain
14 (5), 2010, 480-486. (megosztott első szerzős publikáció)
IRODALMI HÁTTÉR, ELŐZMÉNYEK
A kapszaicin, RTX és deszenzibilizáció
A kapszaicin-kutatás első adatai az 1870-es évekre
mutatnak vissza, Hőgyes Endre vizsgálta először a
csípős paprika anyagát, megállapítva, hogy az az
érzőidegekre hat (Hőgyes 1878). A hő, mechanikai
és kémiai ingerekkel is aktiválható polimodális
nociceptorok szerepének ˗ melyek a TRPV1
receptorokat is expresszálják ˗ vizsgálata a
kapszaicin szelektív aktiváló és az azt követő gátló
hatásának felismerésével kezdődött. A kapszaicin
kémiai struktúrája (12. ábra) 8-metil-N-vanillil-6-
nonénamid, mely hasonlít a vanillin szerkezetéhez.
A természetes körülmények között a marokkói
Euphorbia resinifera növényben előforduló
reziniferatoxin (RTX) (12. ábra) is képes a
TRPV1 receptort aktiválni. Kapszaicinnél százszor potensebb, vagyis meghatározott
koncentrációjú kapszaicin által kiváltott hatás eléréséhez az RTX százszor kisebb
koncentrációja is elegendő (Szolcsányi 1990, Szállási 1999).
Ha a receptor aktiválódik, Na+ és Ca
2+ ionok áramlanak be a sejtbe, melyet K
+ ion
kiáramlás követ. A beáramló Na+ ionok hatására a membrán depolarizálódik és kialakul az
akciós potenciál, ezáltal a fájdalomérzet (nocicepció), míg a sejtbe kerülő Ca 2+
ionok
hatására az idegvégződésből szenzoros neuropeptidek szabadulnak fel. Ha a TRPV1
20
tartósan vagy gyakran kerül aktivált állapotba, a sejten belüli kation koncentráció
megnövekszik, melynek következtében a citoplazma és a mitokondriumok megduzzadnak,
ezáltal a sejtek energiaforgalma csökken, majd idővel az idegvégződés működésképtelenné
válik. Ezt a folyamatot deszenzibilizációnak nevezzük, melynek két formája ismert.
Előkezelésként kis dózisban vagy rövidebb ideig alkalmazva adott kapszaicin és más
TRPV1 receptor agonisták hatására csak ezen anyagokra nézve szűnik meg a
válaszkészség, feltételezhetően ekkor csak a TRPV1 receptor deszenzibilizálódik.
Magasabb koncentrációban és hosszabb ideig alkalmazva a kapszaicin-érzékeny érzőideg-
végződés válaszkészsége az összes ingerre nézve csökken vagy megszűnik, tehát mind a
hő, mechanikai és kémiai ingerekre egyaránt érzéketlen lesz. Ez esetben a TRPV1
receptort expresszáló nociceptív idegvégződés egészének funkciócsökkenéséről van szó,
melynek hátterében dózistól függően ultrastruktúrális vagy markánsabb morfológiai
eltérések állnak (Szolcsányi és mtsai. 1975, 1987, Szállási és mtsai. 1989, Bevan és
Szolcsányi 1990, Szolcsányi 1993).
N-oleoildopamin
Az N-oleoildopamin (OLDA) a TRPV1 receptor aktivátora, bár affinitása kisebb, mint a
kapszaicinnek (Chu és mtsai 2003, Szolcsányi és mtsai 2004). Az OLDA az N- acil
dopaminszármazékok családjába tartozik, melyek egy új csoportot alkotnak a biológiailag
aktív lipidek között. Mivel hosszú szénláncú telítetlen zsírsavak és a terminális részen
amino-csoportot tartalmazó dopamin kondenzációs termékei, ezért a dopamid elnevezést
kapták. Az OLDA-t eredetileg a központi idegrendszer striátum régiójában azonosították.
A perifériás szövetekben eddig még nem sikerült igazolni a jelenlétét, azonban a nem
neuronális eredetű dopamin fő forrása a mesenteriális szövetekben van. Ez felveti annak a
lehetőségét, hogy az OLDA a bélben is szintetizálódhat, azonban ennek mechanizmusai és
központi idegrendszeri jelentősége nem ismert (Chu és mtsai 2003).
21
CÉLKITŰZÉS
Célunk a kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződés és a TRPV1 receptor
deszenzibilizációjának vizsgálata volt patkányok fájdalmas hő- illetve hidegküszöb
meghatározásán alapuló módszerekkel. Az idegvégződés deszenzibilizációjának
analíziséhez az állatok mindkét talpába beadott különböző koncentrációjú kapszaicin, RTX
vagy OLDA fájdalmas hideg- illetve hőküszöb befolyásoló hatásait monitoroztuk naponta.
Az agonisták TRPV1 receptor deszenzibilizáló tulajdonságainak vizsgálatához azok akut
TRPV1 receptor izgató (nocifenzív és hőköszöb-csökkentő) hatását elemeztük.
KÍSÉRLETI MODELLEK
Kísérleti állatok
Kísérleteinkhez 150-250 g közötti nőstény Wistar patkányokat használtunk. Az állatokat
egy folyamatosan kontrollált, állandó hőmérsékletű és páratartalmú elkülönített
állatszobában tartottuk 12 órás megvilágítás mellett, élelemmel és vízzel ad libitum ellátva.
A termonociceptív küszöbök meghatározása
Patkányok lábán mért fájdalmas hő- illetve hidegküszöbök meghatározásához a már
ismertetett készüléket az emelkedő/csökkenő hőmérsékletű forró/hideg lapot alkalmaztuk
(lásd 14. oldal). A fémlap fűtését/hűtését szobahőmérsékletről indítottuk, a hőmérséklet-
változás sebessége 6 °C/perc volt. A készüléken beállítható hűtési minimum érték 0 °C,
azonban a legkisebb detektálható hőmérséklet -1 °C volt, mivel a lap a minimum elérése
után passzívan tovább hűlt.
Az érzőideg-végződés deszenzibilizációjának vizsgálata
A TRPV1 receptort expresszáló szenzoros idegvégződések deszenzibilizációjának
vizsgálatához az állatok mindkét talpába egyszeri dózisban 100 µl–t injektáltunk
kapszaicin (3,3 nmol – 1 µmol) vagy RTX (0,016 – 0,5 nmol) illetve OLDA (5nmol - 1,25
µmol) különböző oldataiból. Mindkét talp kezelésére azért volt szükség, hogy az intakt
lábon esetlegesen korábban megjelenő elhárító reakciót kivédhessük. A fájdalmas hő-
illetve hidegküszöb meghatározását ezután naponta ismételtük addig, míg a kiindulási
kontroll értékekhez viszonyított szignifikáns különbség el nem tűnt, de maximum 14
napig. Kísérleteink egy részében a fájdalmas hő- és hidegküszöbök parallel vizsgálatait is
22
elvégeztük. Ugyanazon patkányok csoportjában meghatároztuk a fájdalmas hő és
hidegküszöb értékeket a kezelések előtt, a bilaterálisan beadott kapszaicin (0,1 és 1 µmol
i.pl.) vagy RTX (0,16 és 0,5 nmol i.pl.) kezelés után, majd 1 héten keresztül naponta
detektáltuk a termonociceptív küszöbök változásait (mivel a hidegküszöb értékek kevesebb
mint 7 nap alatt visszatértek a kontroll szintre, ezért a méréseket nem folytattuk tovább).
A TRPV1 receptor deszenzibilizációjának vizsgálata
A TRPV1 receptor deszenzibilizációjának vizsgálatához az állatok egyik talpát RTX vagy
OLDA injekcióval kezeltük, majd a kezelés hatására kialakuló akut válaszokat – a
nocifenzív viselkedés és a fájdalmas hőküszöb csökkenés – detektáltuk. (Almási és mtsai.
2003, Szolcsányi és mtsai. 2004). Az akut nocifenzív viselkedés kvantifikálásához a láb
nyalásával, rázásával és emelésével töltött időt mértük, míg a hőküszöbcsökkenést 5
perccel az RTX és 10 perccel az OLDA injekció után határoztuk meg az emelkedő
hőmérsékletű forró lappal. Kapszaicint kísérleteink e részében azért nem alkalmaztunk,
mert korábbi kísérleteinkben nem találtunk olyan dózist, amely reprodukálható
hőküszöbcsökkenést indukált volna.
Az állatok egyik talpába 50 µl RTX-et (0,016 nmol) vagy annak vehikulumát injektáltuk és
a küszöbcsökkenést detektáltuk. 3 órával később újra meghatároztuk a hőküszöböt és
ismételten 0,016 nmol RTX-et injektáltunk a korábban kezelt talpba (1. táblázat). Ezt
követően ismét elvégeztük a nocifenzív viselkedés időtartamának mérését és a
termonociceptív küszöb vizsgálatát. Az állatok további két csoportját OLDA-val (250
nmol, 50 µl i.pl.) vagy annak vehikulumával (50 µl i.pl.) kezeltük és a kialakuló nocifenzív
viselkedés időtartamát és a hőküszöbcsökkenést detektáltuk. 3 óra elteltével megmértük a
termonociceptív hőküszöböket, majd ismételten mindkét csoport állatainak korábban
kezelt talpába 50µl kisebb koncentrációjú OLDA oldatot (5 nmol i.pl.) injektáltunk. Ezt
követően az OLDA által kiváltott elhárító reakció időtartamát és a hőküszöbcsökkenést
ismét detektáltuk. A kialakuló deszenzibilizáció specifitásának vizsgálatához azonos
koncentrációjú RTX (0,016 nmol), vagy vehikulum előkezelés (3 órával korábban) után az
állatok két csoportjának talpába 1% formalint injektáltunk, majd vizsgáltuk a nocifenzív
reakciókra gyakorolt hatást. Az OLDA és RTX között lehetséges kereszt-deszenzibilizáció
megfigyeléséhez az állatokat intraplantárisan 50µl OLDA-val (250 nmol) vagy annak
vehikulumával előkezeltük, 3 óra elteltével az azonos talpat RTX-szel (0,016 nmol)
23
kezeltük, majd a hatására létrejövő nocifenzív reakció időtartamát és a termonociceptív
küszöbváltozását mértük.
1. stimulus 2. stimulus vizsgálatok célja
RTX RTX homológ deszenzibilizáció
OLDA OLDA homológ deszenzibilizáció
RTX formalin deszenzibilizáció specifitása
OLDA RTX kereszt-deszenzibilizáció
1. táblázat: A TRPV1 receptor deszenzibilizációjának vizsgálata során alkalmazott kezelés-kombinációk.
Felhasznált anyagok
A kapszaicint, a Sigma (St. Louis, USA), az N-oleolil-dopamint a Tocris Cookson
(London, Egyesült Királyság) cégektől szereztük be. Mindkét anyagból törzsoldatot
készítettünk (10 mg/ml illetve 5 mg/ml), 10% etanol, 10% Tween 80 és fiziológiás sóoldat
felhasználásával. A kísérlet elején reziniferatoxinból (Sigma St. Louis, USA) 1 mg/ml-es
törzsoldatot készítettünk 96%-os etanol felhasználásával, majd azt fiziológiás sóoldattal
hígítottuk tovább a megfelelő koncentrációkra.
Statisztikai analízis
A kapott eredmények átlagait és azok standard hibái (SEM) feltüntetésével ábrázoltuk.
Ugyanazon állatok különböző időpontokban vizsgált fájdalmas hő- illetve hidegküszöb
analízisére egyutas ANOVA-t, majd ezt követően Neumann-Keuls post hoc tesztet
alkalmaztunk. Az önkontrollos kísérletekben, az RTX ismételt adása által kiváltott
nocifenzív reakciók és a küszöbcsökkenések összehasonlítására Student-féle egymintás t-
tesztet használtunk. A nem önkontrollos kísérletekben a küszöbcsökkenések, illetve a
nocifenzív viselkedések összehasonlító vizsgálatához Student-féle kétmintás t-tesztet
alkalmaztunk. Az eredmények összehasonlításakor a *p <0,05, **p <0,01 és ***p <0,001
értékeket fogadtuk el szignifikánsnak.
24
EREDMÉNYEK
Az intraplantárisan adott kapszaicin, illetve RTX dózisfüggő módon megemelte az
egymást követő napokon vizsgált nociceptív hőküszöb értékeket (13. ábra). A minimális
effektív dózis (az a legkisebb dózis, mely a kísérlet bármely mérési időpontjában
szignifikáns hőküszöbemelő hatással bír), kapszaicin esetében 10 nmol, míg RTX esetében
0,05 nmol volt. A maximális küszöbemelkedés 2,3 + 0,5 °C volt az általunk alkalmazott
kapszaicin dózisoknál, míg ez az RTX esetében 2,8 + 0,5 °C volt. Mindkét vizsgált
agonista által kiváltott hatás időtartama dózis-függő volt: a kapszaicin 10-33 nmol és RTX
0,05 nmol koncentrációja reverzibilis hőküszöbemelő hatással bírt, mely 2-5 napnál tovább
nem állt fenn. A kapszaicin nagyobb koncentrációban 11 napig, az RTX pedig 9 napig
fennmaradó hőküszöbemelő hatást váltott ki. A legnagyobb alkalmazott RTX dózis által
kiváltott hőküszübemelő hatás monitorozását a 9. napon abbahagytuk, mivel az 5. és 9. nap
között mért értékek 2 °C-kal voltak magasabbak a kiindulási kontrollhoz képest, és
semmilyen csökkenő tendenciát nem mutatta. A tesztelt szerek oldószerei és az OLDA
egyik vizsgált koncentrációja sem rendelkezett szignifikáns hőküszöbemelő hatással (nem
ábrázolt adat).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1442
43
44
45
46
47
48
49
50
3,33
10
33
100
330
nmol kapszaicin i. pl.
Kontroll
**** *
**
*
**
* ** ***
*
** *
* ***
**
A
napok
No
cic
ep
tív
hő
kü
szö
b (
°C)
25
1 2 3 4 5 6 7 8 942
43
44
45
46
47
48
49
500,016
0,05
0,16
Kontroll
nmol RTX i.pl.
* * ** *
* * *
** *
* **
B
napok
No
cic
ep
tív
hő
kü
szö
b (
°C)
13. ábra: Mindkét talpba adott kapszaicin (A) vagy RTX (B) hatására kialakult hőküszöb változások,
melyeket naponta, emelkedő hőmérsékletű forró lappal mértünk. A csillagok a kiindulási kontroll
hőküszöbökhöz viszonyított szignifikáns különbségeket jelölik (n=8-12, * p <0,05; egyutas ANOVA,
Neumann-Keuls post hoc teszt).
Az egyenletesen csökkenő hőmérsékletű hideg lapon mért fájdalmas hidegküszöbök átlaga
kezeletlen patkányokban 1,3 + 0,2°C volt, mely 5 napon keresztül a naponta ismételt
mérések során jól reprodukálhatónak bizonyult (nem ábrázolt adat). A hideg által kiváltott
nocifenzív reakciók lényegében megegyeztek a hőküszöb vizsgálatok során leírtakkal (láb
nyalása, emelése). A fájdalmas hő- illetve hidegküszöbök párhuzamos vizsgálata során
csak a kapszaicin (0,1 és 1 µmol i.pl.) és RTX (0,16 és 0,5 nmol i.pl.) nagyobb dózisai
okoztak szignifikáns csökkenést a hidegküszöb értékekben (14. ábra B és C). Fontos
megemlíteni, hogy a kapszaicin bár mindkét vizsgált dózisban hasonló mértékű csökkenést
okozott a hidegküszöb értékekben, addig hőküszöb emelő hatása dózisfüggő volt (14. ábra
A és D). A hideggel szembeni deszenzibilizáció dózis-függőségének látszólagos hiányát
feltehetően az a tény okozta, hogy a készülékkel -1 °C-nál alacsonyabb hőmérsékletet nem
tudtunk mérni. Mindkét vizsgált anyag esetében, ugyanazon állatok hidegküszöb értékei 2-
4 nap alatt visszaálltak a kiindulási kontroll állapotba, még mielőtt a fájdalmas hőküszöb
értékek normalizálódtak volna.
26
1 2 3 442
43
44
45
46
47
48
49
50 Kapszaicin 0,1 mol i.pl.Kapszaicin 1 mol i.pl.
Kontroll
*
** **
***
*
7
napok
No
cic
ep
tív
h
ők
üs
zö
b (°C
)
1 2 3 442
43
44
45
46
47
48
49
50RTX 0,16 nmol i.pl.RTX 0,5 nmol i.pl.
Kontroll 7
**
**
*
* **
*
napok
No
cic
ep
tív
h
ők
üs
zö
b (°C
)
1 2 3 4
0
2
4
Kapszaicin 0,1 mol i.pl.Kapszaicin 1 mol i.pl.
Kontroll
*
*
*
*
*
*
*
7
napok
No
cic
ep
tív
h
ide
gk
üs
zö
b (°C
)
1 2 3 4-1
0
1
2
3
4RTX 0,16 nmol i.pl.RTX 0,5 nmol i.pl.
Kontroll 7
*
*
*
*
napok
No
cic
ep
tív
h
ide
gk
üs
zö
b (°C
)
A
B
C
D
14. ábra: Mindkét talpba adott kapszaicin (A-B) és reziniferatoxin (C-D) hő-és hidegküszöb befolyásoló
hatásainak párhuzamos vizsgálata emelkedő illetve csökkenő hőmérsékletű forró/hideg lappal. A csillagok a
kiindulási kontroll hőküszöbökhöz viszonyított szignifikáns különbségeket jelölik (n=8, p <0,05; egyutas
ANOVA, Neumann-Keuls post hoc teszt).
Korábbi eredményekkel összhangban (Almási és mtsai. 2003, Szolcsányi és mtsai. 2004,)
az intraplantárisan beadott 0,016 nmol RTX illetve 5 nmol OLDA akut elhárító reakciót
(érintett végtag rázása, nyalása) váltott ki, mely 5 illetve 10 percen belül megszűnt (15.
ábra felső rész). Mindkét agonista hatására egy jól kifejezett, 8-10 °C-os
hőküszöbcsökkenés jött létre, (15. ábra alsó rész) mely 30 perc elteltével megszűnt. A
kezeléseket követő 3. órában mért fájdalmas hőküszöb értékek statisztikailag nem
különböztek a kiindulási kontroll értékektől (nem ábrázolt adat). A TRPV1 receptor kémiai
ingerekkel szemben mutatott deszenzibilizációjának mértékének meghatározásához, a
patkányok előzőleg kezelt talpába a korábbival megegyező dózisú RTX-et (0,016 nmol)
illetve OLDA-t (5 nmol) injektáltunk. A 3 óra elteltével adott második RTX injekció
hatására mind a nocifenzív reakció időtartama, mind pedig a hőküszöbcsökkenés mértéke
27
szignifikánsan kisebb volt az első RTX injekció által kiváltott válaszoknál (15. A). 250
nmol OLDA előkezelés után 3 órával a kezelt talpba beadott kisebb dózisú (5 nmol)
OLDA szignifikánsan csökkentette mind a nocifenzív reakció időtartamát, mind pedig a
hőküszöb csökkenést az előkezelés után vehikulumot kapott csoporthoz képest (15. B).
Ugyanakkor az azonos dózisú RTX nem okozott szignifikáns változást a 3 órával később
beadott TRPA1 agonista formalin (McNamara, 2007) 1%-os oldatával kiváltott a
nocifenzív reakció időtartamában (15. A). Az OLDA előkezelés (250 nmol i.pl.)
ugyancsak csökkentette 3 óra múlva a kezelt talpba beadott RTX (0,016 nmol) akut
hatásait a vehikulumos előkezelést kapott állatokkal összehasonlítva. Tehát az elhárító
reakció időtartamát és a hőküszöbcsökkenést is mérsékelte (15. C), mely a két TRPV1
agonista között létrejövő kereszt-deszenzibilizációra utal.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
i.pl. RTX utánkontroll/szolvens i.pl.
RTX i.pl. FORMALIN i.pl.
*
No
cifen
zív
reakció
id
őta
rtam
a (
s)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200szolvens + OLDA i.pl.
*
OLDA + OLDA i.pl.
No
cif
en
zív
reakció
idő
tart
am
a (
s)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
szolvens + RTX i.pl.
*
OLDA + RTX i.pl.
No
cif
en
zív
re
ak
ció
id
őta
rta
ma
(s)
0
2
4
6
8
10
12
Hő
kü
szö
b c
sö
kk
en
és
(°C
)
*
0
2
4
6
8
10
12
14
16Hő
kü
szö
b c
sö
kken
és (
°C)
*
A B C
0
2
4
6
8
10
12Hő
kü
szö
b c
sö
kken
és (
°C)
*
15. ábra: Előkezelésben (3 órával a kezelés előtt) alkalmazott intraplantáris RTX (0,016 nmol, A) vagy
OLDA (250 nmol, B-C) elhárító reakciót kiváltó és hőküszöb-csökkentő hatásai ugyanazon talpba adott
ismételt kezelést (0,016 nmol RTX vagy 5 nmol OLDA) követően. Az ábra A része az ismételt RTX kezelés
hatásait, illetve az RTX előkezelés utáni 1 %-os formalin által kiváltott nocicepciót szemlélteti. A B rész a
kétszeri OLDA injekció hatásait, míg a C rész az OLDA előkezelés utáni RTX által kiváltott válaszokat
szemlélteti. A csillagok a statisztikailag szignifikáns különbségeket jelölik a kétszeri RTX adás által kiváltott
küszöb-csökkenések között (A, n=8, p <0,05; Student-féle egymintás t-teszt), illetve az agonista- és szolvens-
kezelt csoportok között (B és C, n=8, p <0,05; Student-féle egymintás t-teszt).
28
MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK
Munkacsoportunk korábbi közölt kísérleteiben sikeresen validálta az emelkedő
hőmérsékletű „forró lap” (hot plate) módszerét, mellyel megbízható módon ismételhető
mérésekkel naponta meghatározhatók a patkányok fájdalmas hőküszöb értékei (Almási és
mtsai. 2003). A patkányokon végzett szisztémás kapszaicin kezelés hosszantartó termális
antinociceptív hatása a tradícionális, állandó hőmérsékletű forró lap és „tail flick”
módszerekkel vizsgálva ellentmondásos (Szolcsányi 1976, Obál és mtsai. 1979, Hayes és
Tyers 1980, Gamse 1982, Bittner és Lahann, 1984), ugyanakkor elektrofiziológiai
kísérletekben teljes egészében deszenzibilizálja a kapszaicin-érzékeny polimodális
nociceptorokat (Szolcsányi 1987, Szolcsányi és mtsai. 1988). A kapszaicin hosszantartó
dózisfüggő termális antinociceptív hatását patkányokban korábban már leírták (Szolcsányi
1985), de a mérésére alkalmazott technika nem volt megfelelő a fájdalmas hőküszöb
pontos meghatározására. Jelen kísérleteinkben a lokálisan (talpba adott) alkalmazott
kapszaicin és RTX tartós hőküszöb emelkedést okozott, ezáltal jelezve a termális
antinocicepciót. Az általunk megállapított minimális effektív dózisok összehasonlításakor
az RTX a kapszaicinnél kb. kétszázszor potensebbnek bizonyult, tehát ugyanazon hatás
kiváltásához kétszázszor kisebb koncentrációja is elegendő volt. Ez megegyezik azon
korábbi irodalmi adatokkal, melyek szerint az RTX jellemzően a deszenzibilizációban
nagy hatáserősséggel rendelkezik (Szállási és Blumberg, 1999). Mindkét hatóanyag
maximális küszöbemelő hatása közel azonos volt, alátámasztva teljes TRPV1 receptor
agonista hatásukat (Ralevic és mtsai. 2003).
Mind a kapszaicin, mind az RTX hőküszöbemelő hatásának időtartama dózisfüggő volt: az
alacsonyabb dózisok hatásai 2-5 napig tartottak, míg nagyobb dózisok esetében a hatás
több mint egy hétig, de legfeljebb 11 napig volt megfigyelhető. Korábbi tanulmányokban
is hasonló eredményeket kaptak klasszikus, latenciaidő mérésen alapuló termonocicepciós
módszerekkel (Xu és mtsai. 1997, Neubert és mtsai. 2003, Pan és mtsai. 2003, Karai és
mtsai. 2004). Ezzel szemben kapszaicin perineurális alkalmazásakor már a küszöbdózis is
sokáig fennmaradó termális válaszkészség csökkenést idézett elő, mely a kísérlet 120 napja
alatt sem normalizálódott (Szolcsányi 1993).
Érdemes megemlíteni, hogy a hot plate módszerrel a lábon mért hőküszöb értékek nem
változtak sem TRPV1 génhiányos egerekben, sem pedig patkányokban előkezelésként
helyileg talpba adott TRPV1 antagonista, a jód-reziniferatoxin után (Almási és mtsai.
29
2003). Hasonlóan, a TRPV1 receptor szerepe nem volt igazolható termonocicepcióban a
klasszikus latenciaidő mérésen alapuló módszerekkel sem TRPV1 génhiányos egerek in
vitro kísérleteiben, sem pedig in vivo viselkedés vizsgálatokban (Caterina és mtsai. 2000,
Davis és mtsai. 2000, Woodbury és mtsai. 2004, Zimmermann és mtsai. 2005). Mindezek
alapján a kapszaicin és RTX kísérleteinkben tapasztalt hőküszöbemelő hatása sem tudható
be kizárólag a kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződésen található TRPV1 receptor
deszenzibilizációjának. Az általunk kiváltott hosszantartó hőküszöb emelő hatás hátterében
a funkcionális deszenzibilizáció vagyis a TRPV1 receptort expresszáló polimodális
idegvégződések károsodása állhat, melynek következtében minden őket ért ingerre kevésbé
reagálnak. Kapszaicin és RTX in vivo nagyobb dózisú alkalmazása során az
ultrastrukturális változásokon kívül (Szolcsányi és mtsai. 1975), a sejten belüli Ca2+
szint
hosszantartó és nagymértékű emelkedése az idegvégződés degenerálódásához vezet
(Simone és mtsai. 1998, Dux és mtsai. 1999, Nolano és mtsai. 1999). In vitro kísérletekben
kapszaicin és RTX kisebb, deszenzibilizáló dózisainak alkalmazásakor csak funkcionális
elváltozások jelentek meg, többek közt gátlódtak a feszültségfüggő Na+ és Ca
2+ csatornák
(Liu és mtsai. 2001, Wu és mtsai. 2005). A jelentős neurotoxikus hatást cáfolják a
reverzibilis elváltozások. A csak pár napig fennálló, alacsonyabb dózisú RTX vagy
kapszaicin által kiváltott hőküszöb emelkedés legvalószínűbb magyarázata a
kapszaicin˗érzékeny érzőideg˗végződések funkcióinak reverzibilis károdása, nem pedig a
neurotoxikus hatás. Ez pedig teoretikusan új támadáspontot jelenthet új típusú, perifériás
fájdalomcsillapítás területén.
A nemrég azonosított TRPV1 receptor agonista OLDA 50-szer gyengébb
hatáserősségűnek és körülbelül 40%-kal kisebb hatékonyságúnak bizonyult a
kapszaicinhez viszonyítva, in vitro patkányok heterológ módon expreszált TRPV1
receptorainak Ca2+
beáramlás vizsgálataiban (Szolcsányi és mtsai. 2004). Ezzel ellentétben
a kapszaicin minimális effektív dózisánál 125- ször nagyobb dózisban beadott OLDA sem
okozott hosszantartó hőküszöbemelkedést. Ezért feltételezhetjük, hogy ennél az OLDA
dózisnál a receptor okkupancia már 100 %-os volt, tehát az OLDA kezelés következtében
elmaradó hőküszöbemelkedés az OLDA korlátozott hatékonyságával magyarázható. Ezt
alátámasztja egy másik tanulmány is, melyben az OLDA parciális agonistának bizonyult
patkányokban, viszont humán vizsgálatokban nem (Chu és mtsai. 2003). Az OLDA által
kiváltott TRPV1 receptor aktivációja következtében beáramló Ca2+
ionok megelőzik a
30
polimodális nociceptív idegvégződések károsodásához vezető folyamatokat, azáltal, hogy
deszenzibilizálják a receptort.
A hidegérzékenységet párhuzamosan vizsgáltuk a forró ingerek által kiváltott
hőérzékenységgel patkányok ugyanazon csoportján csökkenő/emelkedő hőmérsékletű
hideg/forró lappal. Érdekes, hogy míg az emberben mért fájdalmas hidegküszöb értékek
15°C körül vannak (Davis és Pope 2002), addig méréseink alapján patkányok ezen értékei
sokkal alacsonyabbak, 2°C körüliek. A hidegérzékenység nem tipikusan a polimodális
nociceptorok által mediált folyamat, azonban egy kisebb részük szerepet játszhat a nagy
intenzitású hideg ingerek detektálásában (Leem és mtsai. 1993). A fájdalmas intenzitású
hideg ingerek érzékeléséért leginkább a C és Aδ mechano-hideg érzékeny nociceptorok a
felelősek (Simone és Cajander, 1996). A jelenleg ismert hideg által stimulálható ion
csatornák a TRP család tagjai, a TRPM8 (McKemy és mtsai. 2002, Peier és mtsai. 2002) és
a TRPA1 (Story és mtsai. 2003), melyek in vitro körülmények között 25°C, illetve 17°C
körüli küszöbhőmérsékletnél kerülnek aktivált állapotba. Tudomásunk szerint elsőként
szolgáltattunk adatokat a TRPV1 agonisták hosszantartó hatásainak szerepéről a hideg
nocicepcióban. A kapszaicin és RTX hatására létrejövő hidegküszöbcsökkenés
legvalószínűbb magyarázata a TRPV1 receptort is expresszálni képes hidegérzékeny
nociceptorok károsodása lehet. Ezt a magyarázatot támasztja alá Story és mtsai 2003-ban
megjelent publikációja, mely szerint a TRPA1 és TRPV1 receptorok az esetek nagy
részében koexpresszálódnak a hátsó gyöki ganglionok neuronjaiban. A TRPV1 receptor
agonisták által a hideg-érzékeny nociceptorok végződésein kiváltott deszenzibilizáció
molekuláris mechanizmusa mindezidáig ismeretlen, de hasonló funkcionális eltéréseket
tapasztaltunk, mint a hőérzékeny polimodális nociceptorok esetében. Azon megfigyelés,
mely szerint a hidegküszöb értékek hamarabb térnek vissza a kontroll, kiindulási szintre,
mint ahogy a hőküszöb értékek normalizálódnának, arra enged következtetni, hogy a
fájdalmas intenzitású hő- illetve hideg-válaszkészség ˗ legalább részben ˗ különböző
rostokon közvetítődik.
Kutatócsoportunk korábbi eredménye, hogy a talpba adott RTX vagy OLDA az állatokban
akut nocifenzív reakciót vált ki, és jelentős hőküszöbcsökkentő hatással bír (Almási és
mtsai. 2003, Szolcsányi és mtsai. 2004). Ezen akut hatások kísérleteinkben szinte teljesen
kivédhetők voltak, ha az állatokat intraplantárisan hosszantartó hőküszöbemelő hatással
nem rendelkező dózisú ugyanazon TRPV1 agonista előkezelésben részesítettük. A kapott
eredményekből kitűnik, hogy ez esetben maga a TRPV1 receptor deszenzibilizálódik, nem
31
pedig az egész érzőideg˗végződés. Kísérleteinkben a kis dózisú RTX ismételt adása gátolta
a hatására kialakuló akut elhárító reakciók megjelenését. Ugyanakkor nem befolyásolta a
formalin okozta akut nocifenzív reakciókat, tehát ez azt bizonyítja, hogy a receptor
deszenzibilizációja az érzőideg-végződés funkciójának károsodása nélkül valósult meg. A
TRPV1 receptor deszenzibilizációja következtében nem változik meg azon ágensek hatása,
melyek a receptort nem, de az őt expresszáló afferenseket aktiválni képesek. Ilyen ágens
például a TRPA1 ioncsatorna egyik aktivátora, a formalin (McNamara és mtsai. 2007). Az
általa kiváltott nocifenzív reakciók nagy dózisú kapszaicin előkezeléssel meggátolhatók
(Chen és mtsai. 2007), következésképp a formalin képes aktiválni a kapszaicin-érzékeny
afferenseket. Az OLDA előkezelés hatására megszűnő akut RTX hatások alátámasztják az
OLDA és RTX között kialakuló kereszt-deszenzibilizáció lehetőségét. A TRPV1 receptor
deszenzibilizációja jellegében hasonlít a TRPV1 génhiányos egereknél tapasztaltakhoz,
ahol elmarad a hőküszöbemelő hatás, mivel a termonociceptív csatornák elvesztik
válaszkészségüket.
Kísérleteinkben a két TRPV1 receptor agonista (kapszaicin és RTX) intraplantáris adása
után erőteljes hiperalgézia alakult ki, melynek mértékét több napon keresztül mindkét
hőmérsékleti tartományban meghatároztuk. A hidegtartományban a kezelés hatására
lecsökkent fájdalomküszöb értékek gyorsabban normalizálódtak a meleg tartományban
mért fájdalmas hőküszöb értékeknél. Ezen változások a TRPV1 receptort expresszáló
szenzoros neuronok perifériás végződéseinek funkcionális deszenzibilizációját jelzik.
Továbbá felelőssé tehetők a fájdalmas hő illetve hideg által kiváltott válaszok
elmaradásáért, azonban feltételezhetően különböznek a kis dózisú RTX illetve OLDA által
kiváltott TRPV1 receptor deszenzibilizációtól. A deszenzibilizáció mindkét típusa nagy
jelentőséggel bír a periférián ható új tipusú analgetikumok kifejlesztésének szempontjából
(Immke és Gavva, 2006). A TRPV1 receptor deszenzibilizáció során funkcionálisan
hasonló állapot jön létre, mint amilyen az újonnan kifejlesztett periférián ható TRPV1
receptor antagonisták alkalmazása során várható. Az idegvégződés deszenzibilizációja
azonban a fájdalomcsillapítás terén már kiaknázásra került, TRPV1 agonisták (pl.
kapszaicin˗Qutenza tapasz vagy RTX-klinikai vizsgálat alatt) helyileg alkalmazva
neuropátiás vagy más fájdalom állapotok kezelésére alkalmas (lásd 2. fejezet). Ezért az
általunk alkalmazott fájdalmas küszöbhőmérséklet mérésen alapuló technika, a későbbiek
során új típusú in vivo preklinikai szűrő módszerként szolgálhat.
32
2. fejezet: TRPV1 antagonisták hatásainak vizsgálata különböző
termális hiperalgézia modellekben
Tékus V., Bölcskei K., Kis-Varga A., Dézsi L., Szentirmay E., Visegrády A., Horváth C.,
Szolcsányi J., Pethő G.: Effect of transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) receptor
antagonist compounds SB705498, BCTC and AMG9810 in rat models of thermal
hyperalgesia measured with an increasing-temperature water bath.
Eur. J. Pharmacol. 641(2-3), 2010, 135-141.
IRODALMI HÁTTÉR, ELŐZMÉNYEK
A preklinikai kutatások során számos olyan molekuláris mechanizmust azonosítottak,
melyek szerepet játszanak a fájdalom kialakulásában és fenntartásában, ezáltal kiváló
célpontok lehetnek a gyógyszerfejlesztés során. A tény, hogy a TRPV1 receptor a
fájdalmas ingerek molekuláris integrátora, világszerte elfogadottá vált (Tominaga és mtsai.
1998). Központi szerepet játszik a perifériás szenzitizáció folyamatában (Immke és Gavva
2006), továbbá a gyulladás vagy sérülés hatására kialakuló upregulációs és szenzitizációs
folyamatokban (Bishnoi és Premkumar 2011). Tekintve, hogy nagyszámú endogén
fájdalomkeltő (nociceptív) / szenzitizáló ágens hat ezen az ioncsatornán, ezért a receptor
ígéretes célpontja lehet olyan új típusú analgetikus vegyületek fejlesztésének, melyek
direkt módon blokkolják a perifériás nociceptorokat (Brederson és Szállási 2013).
Az egyik elsőként kifejlesztett TRPV1 receptor blokkoló a kapszazepin (CZP) volt, melyet
a farmakológiai kutatásokban mind in vivo, mind pedig in vitro intenzíven használtak
klasszikus kompetitív antagonistaként (Maggi és mtsai. 1993, Walpole és mtsai. 1994).
Hátránya, hogy a TRPV1 receptorra nézve nem szelektív, gátolja a nikotin receptorokat, a
feszültségfüggő Ca2+
csatornákat (Szállási és mtsai. 2007), illetve a TRPM8 ioncsatornát
(Weil és mtsai. 2005) is. Ezért számos gyógyszercég invesztált nagy összegeket olyan új,
szelektív TRPV1 antagonisták fejlesztésébe, melyek kiváló alapjai lehetnek új, hatékony
fájdalomcsillapító gyógyszereknek. Az újonnan fejlesztett szintetikus vegyületek (lásd 3.
táblázat), hasonlóak a CZP-hez, mely a csatorna pórus régiójába kötődik és a tetramer
ioncsatorna összes monomerjének oldalláncával kapcsolatot (Messeguer és mtsai. 2006).
Kísérleteink során az intézetünkben korábban beállított három eltérő kinetikájú termális
hiperalgézia modellt alkalmaztunk. A termális küszöbcsökkenést egyrészt a TRPV1
receptor direkt aktivációja révén váltottuk ki potens receptor agonista RTX-szel.
33
Vizsgáltuk továbbá a termonociceptív küszöbcsökkenést enyhe hőtraumával illetve
plantáris talpbőr incízióval kiváltott hiperalgézia modellekben, mivel ezekben az
állaptokban a TRPV1 receptor feltehetően fontos szerepet játszik a hőhiperalgézia/
szenzibilizáció közvetítésében (Bölcskei és mtsai. 2005, Wu és mtsai. 2008, Banik és
Brennan 2009), így várhatóan alkalmasak TRPV1 antagonisták tesztelésére.
A megbízhatóan működő preklinikai fájdalomtesztelő módszerek fejlesztése nagy
fontossággal bír, hiszen alkalmazásukkal csak az igazán hatékony gyógyszerjelölt
molekulák válhatnak a rendkívül költséges klinikai tanulmányok főszereplőivé.
CÉLKITŰZÉSEK
PhD munkám e részének vizsgálata során a következő célokat tűztük ki:
1.) Három különböző gyógyszercég által kifejlesztett TRPV1 receptor antagonista vegyület
(SB705498, BCTC és AMG9810) hatásának összehasonlítása RTX által kiváltott, plantáris
bőr-izom incíziót követő, illetve enyhe hőtrauma következtében kialakuló
hőhiperalgéziában, melyet a fájdalmas hőküszöbök mérésével határoztunk meg az
intézetünkben korábban validált emelkedő hőmérsékletű vízfürdő segítségével.
2.) Ezen antagonisták hatásainak vizsgálata az RTX által indukált hőhiperalgézia
modellben az elhárító reakció latenciaidejének mérésével plantár-teszt módszerrel. A
klasszikus latenciaidő mérésen alapuló és az általunk korábban kifejlesztett
fájdalomküszöb-mérő módszer érzékenységének összehasonlítása.
KÍSÉRLETI MODELLEK
Kísérleti állatok:
Kísérleteinkhez 140-200 g közötti nőstény Sprague-Dawley patkányokat használtunk,
melyeket a Harlan cégtől vásároltunk. Az állatokat egy állandó hőmérsékletű és
páratartalmú elkülönített állatszobában tartottuk, 12 órás megvilágítás mellett, élelemmel
és vízzel ad libitum ellátva.
RTX-szel kiváltott nociceptív hőküszöbcsökkenés
A fájdalmas hőküszöbcsökkenést a potens TRPV1 agonista RTX-szel váltottuk ki (Almási
és mtsai. 2003). A kontroll mérések elvégzése után előkezelésként TRPV1 antagonista
vegyületeket vagy azok vehikulumát adtunk szájon át (0,5 ml / 100 g per os), majd 1 óra
34
elteltével 0,01 µg RTX-et injektáltunk a patkányok egyik hátsó lábának talpába. Az
előkezelésre azért volt szükség, mert irodalmi adatokból ismert (Almási és mtsai. 2003),
hogy az RTX küszöbcsökkentő hatása 25 percnél rövidebb ideig tart, azonban ez az
időtartam vélhetően nem elegendő az orálisan adott antagonisták teljes felszívódásához. Az
RTX kezelést követő 5., 10., 15., 20. percben meghatároztuk a fájdalmas hőküszöb
értékeket emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel (lásd 15. oldal).
Enyhe hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenés
Patkányok hátsó lábán mért hőküszöb csökkenést enyhe hőtraumával váltottunk ki.
Korábbi eredményeink alapján ismert, hogy az enyhe hőtrauma alkalmazása minimum 1
óráig fennmaradó hőhiperalgéziát eredményez (Bölcskei és mtsai. 2007). A kontroll
mérések elvégzése után az állatokat halotánnal altattuk, majd az egyik hátsó lábukat 20 s-ig
51°C -os forró vízbe merítettük. A pár perces altatást követő ébredés után a hőtrauma
alkalmazását követő 10. és 20. percekben poszttraumás kontroll hőküszöb méréseket
végeztünk, hogy megállapítsuk a hiperalgézia tényleges kialakulását. Azon állatokat,
amelyeknél a minimális 3°C-os hőküszöbcsökkenés nem jött létre, nem vizsgáltuk tovább.
A hőtraumát követő 20. percben az antagonistákat illetve azok vehikulumát
intraperitoneálisan (i.p. 0.5 ml / 100 g) adtuk, majd 40, 50, és 60 percnél ismételten
meghatároztuk az állatok fájdalmas hőküszöbét. Az antagonisták orális adása ez esetben
nem volt célszerű, mivel viszonylag rövid idő (20 perc) telt el a kezelés és az első mérés
között. Ezen időtartam pedig nem elegendő a maximális orális hasznosulás eléréséhez.
Plantáris incízióval kiváltott hőküszöbcsökkenés
A hőküszöbcsökkenést az állatok egyik hátsó lábán elvégzett talpi incíziós műtéti eljárással
váltottuk ki (Füredi és mtsai. 2009). A kontroll hőküszöb mérések után, a patkányokat
pentobarbitállal (50 mg / kg i.p.) elaltattuk, majd fél cm-re a saroktól 1 cm hosszan a talp
középvonala mentén bemetszettük a bőrt, az izmot és az inakat is (16. ábra). A sebet 4.0
fonallal zártuk, majd Betadine-nal ecseteltük be. 24 órával a műtét után újabb kontroll
hőküszöb mérést végeztünk a hiperalgézia kialakulásának megállapításához, melyet 30
perc múlva ismételtünk. Az antagonisták illetve a vehikulum orális adása (p. o. 0,5 ml /
100 g) után 1, 2, 3, 4 óra múlva a termonocicepciós küszöbök ismételt mérésével
vizsgáltuk a hiperalgéziát.
35
16. ábra: Plantáris bőr-izom incízió
RTX indukálta hiperalgézia mérése Plantar Test készülékkel (latenciaidő mérés)
Az általunk fejlesztett hőküszöb-mérő módszer érzékenységének vizsgálatához az állatok
egy külön csoportjában RTX-szel hőhiperalgéziát hoztunk létre. Majd összehasonlítottuk a
három antagonista hatását állandó intenzitású küszöb feletti hőinger által indukált elhárító
reakció latenciaidejének mérésével. Ehhez az értekezés elején bemutatott Plantar testet
használtuk (lásd 14. oldal), és a lábon mért elhárító reakció latenciaidejét detektáltuk. A
kontroll mérések elvégzése után 0,06 µg RTX-et injektáltuk a patkányok egyik talpába,
majd 10 perc elteltével újból megmértük a latenciaidőt. Az állatok egyik csoportja
előkezelésként TRPV1 antagonistát (0,5 ml / 100 g p. o.), míg a másik csoport, azonos
térfogatú vehikulumot kapott 1 órával az RTX kezelés előtt.
Felhasznált anyagok
A reziniferatoxint a Sigma (St. Louis, Amerikai Egyesült Államok) cégtől szereztük be.
Etanolban oldottuk, majd 1 mg/ml-es törzsoldatát fiziológiás sóoldattal hígítottuk a
megfelelő koncentrációkra. Az SB705498 (N-(2-bromofenil)-N′-[((R)-1-(5-trifluorometil-2
piridil) pirrolidin-3-il)] urea), a BCTC (N-(4-tertiaributilfenil)-4-(3-kolorfiridin-2-il)
tetrahidropriazin-1(2H)-karbox-amid) és az AMG9810 ((E)-3-(4-tbutilfenil)- N-(2,3-
dihidrobenzo[b][1,4]dioxin-6-il)-acrilamid) 99%-os tisztaságú vegyületeit a Richter
Gedeon Gyógyszergyárban szintetizálták. Az antagonistákat minden koncentráció esetén
5% Tween 80 és fiziológiás sóoldat keverékében oldottuk, melyből 0,5 ml-t adtunk 100 g
testtömegre. Vehikulumként is ebben a volumenben alkalmaztuk, ez esetben antagonista
nélkül.
36
Statisztikai analízis
Az egyes antagonisa dózisok hatását mindig az aktuális, azonos térfogatú vehikulumot
kapott kontroll csoportokhoz viszonyítottuk. A vizsgálatot végző személy nem ismerte a
kezelési elrendezést.
A vehikulummal vagy antagonistával kezelt állatokon mért termonociceptív küszöb-
csökkenések egyes időpontokban történő összehasonlító analízisére Student-féle kétmintás
t-próbát alkalmaztunk. A vehikulummal kezelt és a különböző koncentrációjú antagonista
csoportok összehasonlítására egyutas variancia analízist (ANOVA) használtunk, Tukey-
Kramer post hoc teszttel kiegészítve. A különböző csoportok közötti eredmények
összehasonlításakor a *p <0,05, **p <0,01 és ***p <0,001 értékeket fogadtuk el
szignifikánsnak. Az antagonisták hatását a hiperalgézia százalékos gátlásának
ábrázolásával fejeztük ki. A fájdalmas hőküszöbök vizsgálata során egy integratív
paraméterrel, a küszöbcsökkenések összegével számoltunk a következő képlet szerint:
(csökkenésvehikulum ˗ csökkenésantagonista) / csökkenésvehikulum x 100, ahol csökkenésvehikulum és
csökkenésantagonista a különböző időpontokban a vehikulummal illetve antagonistával kezelt
csoportokban mért hőküszöbcsökkenések összegét jelölik. A lábon mért latenciaidő
vizsgálatoknál a következő képlet szerint számoltunk: (LCSvehikulum ˗ LCSantagonista) /
LCSvehikulum x 100, ahol az LCSvehikulum illetve LCSantagonista a vehikulummal vagy
antagonistával kezelt csoportokban mért latenciaidő-csökkenések átlagát jelöli.
A dózis-hatás görbén minden esetben a kialakult hőhiperalgézia százalékos gátlását
ábrázoltuk úgy, hogy az egyes időpontokban mért hőküszöb értékeket csoportonként
átlagoltuk, majd ezeket viszonyítottuk a traumát követően mért kontrollok átlagához. Az
antihiperalgetikus hatás jellemzésére a legkisebb alkalmazott hatékony dózist, azaz a
minimális effektív dózist (MED) használtuk.
EREDMÉNYEK
TRPV1 receptor antagonisták hatásai a nociceptív hőküszöbök vizsgálatakor
RTX által kiváltott hőküszöbcsökkenés gátlása
A patkányok kontroll termonocicepciós küszöbe 43,2 + 0,4°C volt (n=36). Az
intraplantárisan adott RTX injekció azonnali, de legkésőbb 5 perc alatt lezajló nocifenzív
reakciót váltott ki, mely a láb rázásával, nyalásával járt. Ezután az emelkedő hőmérsékletű
vízfürdővel mérve nagymértékű (8-10 °C) küszöbcsökkenést detektáltunk, mely a vizsgálat
37
20 perce alatt végig fennmaradt. Az előkezelésben alkalmazott antagonisták mindegyike
dózisfüggően gátolta az RTX által indukált küszöbcsökkenést mindegyik mérési
időpontban 1-30 mg/kg p.o. dózisban (17. ábra). A minimális hatékony dózis 1 mg/kg volt
mindhárom antagonista esetében (2. táblázat). Az SB705498 legnagyobb koncentrációban
adva (10 mg/kg) teljesen megszüntette a kialakult hőküszöbcsökkenést, míg a BCTC (30
mg/kg) 74,5% és az AMG9810 (10 mg/kg) 66,2% maximális gátlást okozott.
32
34
36
38
40
42
44
46
48
vehikulum p.o.
1 mg/kg p.o.
3 mg/kg p.o.
10 mg/kg p.o.
SB705498
RTX 0,01g i.pl.
Kontroll 5 10 15 20
* * * *
****
* *
perc
Fájd
alm
as
hő
kü
szö
b (
°C)
32
34
36
38
40
42
44
46
48vehikulum p.o.
1 mg/kg p.o.
3 mg/kg p.o.
10 mg/kg p.o.
30 mg/kg p.o.
BCTC
RTX 0,01g i.pl.
Kontroll 5 10 15 20
*
**
* **
**
*
**
*
*
**
*
perc
Fá
jda
lma
s h
ők
üs
zö
b (
°C)
32
34
36
38
40
42
44
46
48
vehikulum p.o.
1 mg/kg p.o.
3 mg/kg p.o.
10 mg/kg p.o.
Kontroll 5 10 15 20
AMG9810
RTX 0,01g i.pl.
*
*
**
*** *
**
*
*
perc
Fá
jda
lma
s h
ők
üs
zö
b (°C
)
0
20
40
60
80
100
BCTC
AMG9810
SB705498
1 3 10 30
dózis (mg/kg)
Hő
hip
era
lgézia
gátl
ás
a (
%)
A B
C D
17. ábra: Előkezelésben (1 óra) adott TRPV1 antagonisták hatásai az RTX-szel kiváltott
hőküszöbcsökkenésre emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel mérve. A csoportonként 6-12 állat eredményeinek
átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. A csillagok a vehikulummal illetve az antagonistákkal kezelt
csoportok közötti statisztikailag szignifikáns (p <0,05) különbségeket jelölik (Student-féle kétmintás t-teszt).
Az ábra D része a hiperalgézia százalékos gátlása alapján számolt dózis-hatás görbéket mutatja.
Az enyhe hőtraumával kiváltott hőküszöbcsökkenés gátlása
A hőtrauma kiváltásához szükséges altatásból a patkányok egy percen belül felébredtek.
Ébredés után egyik állatnál sem tapasztaltunk semmilyen nocifenzív reakciót, nem rázták
és nem is nyalták a lábaikat. A hőtraumát követő 10. és 20. percben emelkedő
38
hőmérsékletű vízfürdővel mért hőküszöb értékekben 7-8 °C csökkenést tapasztaltunk a
kontrollhoz képest (18. ábra). Azon állatokat, melyeknél a hiperalgézia nem alakult ki,
vagyis a csökkenés mértéke nem volt legalább 3 °C, kizártuk a további kísérletekből (120
patkányból összesen 5-öt). A termális hiperalgézia kialakulása utáni 20. percben i.p.
beadott antagonisták mindegyike szignifikánsan mérsékelte a küszöbcsökkenést. A
minimális effektív dózis SB705498 esetében 10 mg/kg, BCTC adásakor 3 mg/kg, míg az
AMG9810 vegyületnél 1 mg/kg volt (2. táblázat). Az SB705498 és BCTC dózis-hatás
görbéi a maximális beadott dózisnál (30 mg/kg) már enyhe csökkenést mutattak és
maximális gátló hatásukat a 10 mg/kg-os koncentrációnál érték el (54,1% és 74,2%). Ezzel
szemben az AMG9810 maximális gátló hatását a 30 mg/kg dózisban fejtette ki, amely
60,3% volt.
32
34
36
38
40
42
44
46 vehikulum i.p.
3 mg/kg i. p.
10 mg/kg i. p.
30 mg/kg i.p.
SB705498
hőtrauma (51°C, 20s)
kezelés
*
*
*
*
*
Kontroll 10 20 30 40 50 60
perc
Fá
jda
lma
s h
ők
üs
zö
b (°C
)
32
34
36
38
40
42
44
46
vehikulum i.p.
1 mg/kg i. p.
3 mg/kg i. p.
10 mg/kg i. p.
30 mg/kg i.p.
BCTC
hőtrauma (51°C, 20s)
kezelés
Kontroll 10 20 30 40 50 60
****
*
**
**
perc
Fá
jda
lma
s h
ők
üs
zö
b (
°C)
32
34
36
38
40
42
44
46vehikulum i.p.
1 mg/kg i. p.
3 mg/kg i. p.
10 mg/kg i. p.
30 mg/kg i.p.
AMG9810
hőtrauma (51°C, 20s)
Kontroll 10 20 30 40 50 60
kezelés*** *
*
**
**
***
perc
Fá
jda
lma
s h
ők
üs
zö
b (
°C)
0
20
40
60
80
100
BCTC
AMG9810
SB705498
1 3 10 30
dózis (mg/kg)
Hő
hip
era
lgé
zia
gá
tlá
sa
(%
)
A B
C D
18. ábra: TRPV1 receptor antagonisták hatásai enyhe hőtraumával kiváltott termális nociceptív küszöb-
csökkenésre emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel mérve. A csoportonkénti 6-11 állat eredményeinek átlagát a
standard hibával együtt ábrázoltuk. A csillagok a vehikulummal illetve az antagonistákkal kezelt csoportok
közötti statisztikailag szignifikáns (p <0,05) különbségeket jelölik (Student-féle kétmintás t-teszt). Az ábra D
része a hiperalgézia százalékos gátlása alapján számolt dózis-hatás görbéket mutatja.
39
A plantáris bőr-izom incízió okozta hőküszöbcsökkenés gátlása
Az állatok a pentobarbitál altatás után 2-4 óra múlva felébredtek, a méréseket másnap
reggel végeztük. Semmilyen elhárító viselkedést sem tapasztaltunk a gyógyulási idő alatt,
habár a patkányok óvatosabban terhelték a műtött lábukat. A műtét után 24 órával az
emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel mért hőküszöb értékek 7-8 °C-ot csökkentek. A 18-20
állatot tartalmazó kísérleti csoportokból maximum 1-2 állatot zártunk ki a további
kísérletből (ezen állatoknál a küszöbcsökkenés mértéke nem érte el a 3°C-ot). Az
alkalmazott antagonisták mindegyike dózisfüggően gátolta a sebészi incízió következtében
kialakult küszöbcsökkenést 3-30 mg/kg p.o. dózisban (19. ábra). A minimális hatékony
dózis SB705498 esetében 10 mg/kg, míg a BCTC és az AMG9810 egyaránt 3 mg/kg volt
(2. táblázat). A maximális gátló hatás SB705498-nál 40,5%, BCTC esetében 52,9%, és
84,4% volt az AMG9810 antagonistánál.
32
34
36
38
40
42
44
46
SB705498
íncizió
op. előtti op. utáni 1 2 3 4
kezelés
***
**
*
** *
kontroll (24 ó)
vehikulum p.o.3 mg/kg p.o.
10 mg/kg p.o.
30 mg/kg p.o.
óra
Fá
jda
lma
s h
ők
üs
zö
b (°C
)
32
34
36
38
40
42
44
46vehikulum p.o.3 mg/kg p.o.
10 mg/kg p.o.
30 mg/kg p.o.
BCTC
íncizió
op. előtti op. utáni 1 2 3 4
kezelés
*
*
*
*
**
*
* *
*
*
kontroll (24 ó)
*
óra
Fá
jda
lma
s h
ők
üs
zö
b (°C
)
32
34
36
38
40
42
44
46
AMG9810
íncizió
op. előtti op. utáni 1 2 3 4
kezelés **
** *
**
* **
*
kontroll (24 ó)
*
vehikulum p.o.3 mg/kg p.o.
10 mg/kg p.o.
30 mg/kg p.o.
óra
Fá
jda
lma
s h
ők
üs
zö
b (°C
)
0
20
40
60
80
100 BCTC
AMG9810SB705498
3 10 30
dózis (mg/kg)
Hő
hip
era
lgé
zia
gá
tlá
sa
(%
)
A B
C D
19. ábra: TRPV1 receptor antagonisták hatásai plantáris bőr-izom incízióval kiváltott termális nociceptív
küszöb-csökkenésre emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel mérve. A csoportonkénti 6-8 állat eredményeinek
átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. A csillagok a vehikulummal illetve az antagonistákkal kezelt
csoportok közötti statisztikailag szignifikáns (p <0,05) különbségeket jelölik (Student-féle kétmintás t-teszt).
Az ábra D része a hiperalgézia százalékos gátlásából számolt dózis-hatás görbéket mutatja.
40
TRPV1 receptor antagonisták hatásai az alap hőküszöbre
A kontroll mérések elvégzése után mindhárom antagonistát vagy a vehikulumot is beadtuk
i. p. (n=9, 30 mg/kg dózisban), majd 30 illetve 60 perc elteltével emelkedő hőmérsékletű
vízfürdővel megmértük a termonocicepciós küszöböket. A tesztelt antagonisták egyike sem
változtatta meg szignifikánsan az alap (nem szenzitizált) nociceptív hőküszöböket (nem
ábrázolt adat).
TRPV1 antagonisták hatásai az RTX által kiváltott latenciaidő-csökkenésre
A lábon mért alap elhárító reakció latenciaideje 11,03 + 0,3 s volt, amely az i.pl. adott
RTX injekció (0,06 µg) hatására 4,38 + 0,3 s-ra csökkent. Az 1 órával az RTX kezelés
előtt p. o. beadott antagonista vegyületek mindegyike antihiperalgéziás hatással
rendelkezett. Bár meghosszabították az elhárító reakció latenciaidejét, szignifikáns
különséget csak a legnagyobb alkalmazott dózis beadásakor detektáltunk, ekkor a gátlás
SB705498, BCTC és AMG9810 esetében 43%, 38% és 37% volt (20. ábra).
0
2
4
6
8
10
12
14
vehikulum p.o.
3 mg/kg p.o.
10 mg/kg p.o.
30 mg/kg p.o.
*
SB705498
Kontroll 10 perccel az RTX kezelés után
No
cif
en
zív
re
ak
ció
lé
ate
nc
iaid
eje
(s
)
0
2
4
6
8
10
12
14
vehikulum p.o.
3 mg/kg p.o.
10 mg/kg p.o.
30 mg/kg p.o.
*
BCTC
Kontroll 10 perccel az RTX kezelés után
No
cif
en
zív
re
ak
ció
lé
ate
nc
iaid
eje
(s
)
0
2
4
6
8
10
12
14
vehikulum p.o.
3 mg/kg p.o.
10 mg/kg p.o.
30 mg/kg p.o.
*
AMG9810
Kontroll 10 perccel az RTX kezelés után
No
cif
en
zív
re
ak
ció
lé
ate
nc
iaid
eje
(s
)
A B
C
20. ábra Az előkezelésben (1 óra) alkalmazott TRPV1 receptor antagonisták (A, SB-705498; B, AMG9810,
C: BCTC) hatása RTX (0,06 µg, i. pl.) által kiváltott hőhiperalgéziában plantar teszttel vizsgálva a nocifenzív
reakció megjelenéséig eltelt időt. A csoportonkénti 6-7 állat eredményeinek átlagát a standard hibával együtt
ábrázoltuk. A csillagok a vehikulummal illetve az antagonistákkal kezelt csoportok közötti statisztikailag
szignifikáns (p <0,05) különbségeket jelölik (egyutas ANOVA és Tukey-Kramer multifaktor variancia teszt).
41
MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK
Elsőként szolgáltattunk összehasonlító adatokat különböző gyógyszercégek által
kifejlesztett három TRPV1 antagonista hatásairól, új fájdalmas hőküszöbmérő és a
tradicionális elhárító reakciók latenciaidejének mérésén alapuló módszerekkel.
Eredményeink alapján elmondható, hogy a nociceptív hőküszöb csökkenés megvalósulhat
direkt TRPV1 receptor aktiváción keresztül, enyhe hőtrauma alkalmazásával vagy sebészi
incíziót követően, mely jól mérhető, nagyfokú érzékenységet mutat a vizsgált TRPV1
antagonisták mindegyikével szemben.
Munkám e részében bemutatott mindhárom antagonista orális előkezelésben alkalmazva
dózisfüggő módon gátolta a TRPV1 agonista RTX fájdalmas hőküszöb csökkentő hatását.
Az RTX intraplantáris adása rövid ideig tartó, de enyhe nocifenzív reakciót vált ki a
patkányokból, majd 20 percig fennmaradó küszöbcsökkenést eredményez (Almási és
mtsai. 2003). Az SB705498 maximálisan beadott dózisa teljesen, míg a BCTC és
AMG9810 75% illetve 66% védte ki a kialakult hiperalgéziát. Mivel az érintett végtagon
viszonylag nagy koncentrációban volt jelen a TRPV1 agonista RTX, ez a nagyfokú gátlás
igen figyelemre-méltó hatás.
A TRPV1 antagonisták igen alacsony dózisban alkalmazva antihiperalgéziás hatással
rendelkeztek, így minimális effektív dózisuk mindhárom esetben 1 mg/kg volt. Korábbi
publikációkben ezen TRPV1 antagonisták termális vagy mechanikai hiperalgéziát
csökkentő minimális effektív dózisai 3-10-szer nagyobbak voltak, (Rami és mtsai. 2006,
Pomonis és mtsai. 2003, Gavva és mtsai. 2005, lásd 2. táblázat), amely módszerünk
érzékenységét bizonyítja.
Az általunk kidolgozott hőküszöbmérő módszerrel mindhárom tesztelt antagonista
esetében 30-szor kisebb volt a minimális effektív dózis, összehasonlítva a tradicionális
latenciaidő mérő teszttel (Hargreaves és mtsai. 1988) kapott eredményekkel, melyek
további bizonyítékot szolgáltatnak módszerünk érzékenységére.
42
Modell SB705498 BCTC AMG9810
RTX- indukált hőküszöb
csökkenés 1 mg/kg p.o. 1 mg/kg p.o. 1 mg/kg p.o.
RTX által kiváltott lábon
mért elhárító reakció-
latenciaidő csökkenés
30 mg/kg p.o. 30 mg/kg p.o. 30 mg/kg p.o.
Enyhe hőtrauma okozta
hőküszöb csökkenés 10 mg/kg i.p 3 mg/kg i.p. 1 mg/kg i.p.
Sebészi incízió okozta
hőküszöb csökkenés 10 mg/kg p.o. 3 mg/kg p.o. 3 mg/kg p.o.
Kapszaicin által kiváltott
másodlagos mechanikai
hiperalgézia
10 mg/kg p.o.a
Kapszaicin-indukált
szemtörlések száma 3 mg/kg i.p.
c
CFA- indukált termális
hiperalgézia 3 mg/kg p.o.
b 30 mg/kg i.p.
c
CFA-indukált mechanikai
hiperalgézia 3 mg/kg p.o.
b 100 mg/kg i.p.
c
Részleges ideglekötés
okozta mechanikai
hiperalgézia 10 mg/kg p.o.
b
Részleges ideglekötés
okozta mechanikai
allodínia 10 mg/kg p.o.
b
2. táblázat: TRPV1 receptor antagonisták (SB705498, BCTC és AMG9810) minimális hatékony dózisai
patkányokban különböző in vivo nociceptív tesztekben vizsgálva, a jelen tanulmány és korábbi irodalmi
adatok alapján. a Rami és mtsai. (2006.);
b Pomonis és mtsai. (2003.);
c Gavva és mtsai. (2005.)
Vizsgálataink során még két, intézetünkben korábban validált modellben (Bölcskei és
mtsai. 2007, Füredi és mtsai. 2009) − egy akut / szubakut (enyhe hőtrauma), illetve egy
krónikus (sebészi incízió) − határoztuk meg a vizsgált antagonisták antihiperalgetikus
hatásait. Mindkét alkalmazott modell szerepét igazolták TRPV1 receptor aktivációs illetve
szenzitizációs folyamatokban mind TRPV1 génhiányos egerek, illetve patkányokon
TRPV1 antagonisták alkalmazásával (Bölcskei és mtsai. 2005, Pogatzki-Zahn és mtsai.
2005, Wu és mtsai. 2008, Banik és Brennan 2009). Az enyhe hőtrauma és a sebészi incízió
módszerek jobban modellezik a valóságot, a humán klinikai kórképekhez közelebb állnak,
mind a tünetek hasonlóságát, mind pedig a sérülés bekövetkezése után elkezdett kezelési
protokollokat tekintve. Mindkét hiperalgézia modell rendkívül érzékenyen reagált a
vizsgált antagonistákra, az SB705498 illetve a BCTC MED értéke 1 mg/kg volt, míg az
AMG9810 vegyületé 3 mg/kg. A korábbi publikációkban megjelent adatokkal
összehasonlítva elmondható, hogy módszerünk legalább annyira, vagy még érzékenyebb a
fenti kísérletes paradigmák vizsgálatára (Rami és mtsai. 2006, Pomonis és mtsai. 2003,
Gavva és mtsai. 2005, 2. táblázat).
43
Az enyhe hőtrauma okozta hőhiperalgéziát mindhárom vegyület gátolta, mégis a
leghatékonyabb vegyületnek az AMG9810 bizonyult, mivel a legkisebb MED értékkel a
legnagyobb gátlást érte el, míg a legkevésbé hatékony ez esetben az SB705498 volt.
Érdekes módon mind az SB705498, mind pedig a BCTC hatása a legnagyobb alkalmazott
dózisban csökkenést mutatott, melynek oka ismeretlen. A sebészi incíziót követő hőküszöb
csökkenés gátlása dózis-hatás összefüggéseket mutatott mindhárom vizsgált antagonista
esetében. Meglepő módon, habár mindhárom anyag hatékonysága hasonló, az AMG9810
mégis határozottan nagyobb mértékű gátlást ért el a másik két antagonistához viszonyítva.
E modellben mind a BCTC, mind pedig az AMG9810 minimális effektív dózisa azonos, de
kisebb volt, mint az SB705498-é.
Említésre méltó, hogy ugyanazon TRPV1 antagonisták esetében az egyes modellekben
eltérő hatékonyságot tapasztaltunk. Például az SB705498 esetében, ahol maximális gátlást
értünk el az RTX-indukálta hőhiperalgézia modellben, míg ez a gátlás az enyhe hőtrauma
modellben 50%, illetve a sebészi incízió okozta hiperalgézia modellben pedig 40% volt.
Hasonló, de kevésbé kifejezett mintázat figyelhető meg a BCTC esetében is. Ennek egyik
magyarázata lehet, hogy a TRPV1 receptor korlátozott szerepet játszik a hőtrauma, illetve
a sebészi incíziót követő hőhiperalgézia fenntartásában. Korábbi publikációkban
patkányokon vizsgálva, az incízió következtében létrejövő hőhiperalgéziát más TRPV1
antagonisták is csak részben gátolták (A-425619, ABT-102 és AMG0347, Honoré és
mtsai. 2005, 2008, Wu és mtsai. 2008). Másik lehetséges magyarázat az lehet, hogy a
TRPV1 antagonisták hatékonysága csökken, ha a TRPV1 receptor szenzitizálódik.
A legnagyobb dózisban alkalmazott TRPV1 receptor antagonisták egyike sem változtatta
meg az alap kontroll hőküszöb értékeket. Ez az eredmény megegyezik a korábban, más
kutatócsoportok által közöltekkel, melyeknél nem volt kimutatható változás a patkányok
alap (kontroll, nem érzékenyített), lábon mért elhárító reakció latenciaidejében TRPV1
receptor antagonisták (BCTC, A-425619 és ABT-102) adása után (Pomonis és mtsai. 2003,
Honoré és mtsai. 2005, 2008).
A TRPV1 receptor szenzitizációjának valószínűsített mechanizmusa, számos intracelluláris
protein-kináz foszforilációja révén valósul meg, főként a protein-kináz C (Premkumar és
mtsai. 2000, Vellani és mtsai. 2001) vagy protein-kináz A (Bhave és mtsai. 2002, Varga és
mtsai. 2006) játszik fontos szerepet a folyamatban. Bizonyos gyulladásos mediátorok, mint
pl. bradikinin és prosztaglandinok is közreműködnek a TRPV1 receptorok
aktívációjában/szenzitizációjában a protein-kináz A és C útvonalon keresztül (Sugiura és
44
mtsai. 2002, Moriyama és mtsai. 2005). Mind az intraplantárisan adott ciklooxigenáz-
gátlók (Bölcskei és mtsai. 2007, Füredi és mtsai. 2009), mind pedig a B2 bradikinin
receptor antagonista HOE 140 gátolta az enyhe hőtrauma- illetve a sebészi incízió-okozta
hőküszöb csökkenést (Füredi és mtsai. 2010).
A TRPV1 receptor nélkülözhetetlen más típusú hiperalgéziás illetve szenzitizációs
mechanizmusokban is (Caterina és mtsai. 2000, Davis és mtsai. 2000, Walker és mtsai.
2003, Pomonis és mtsai. 2003, Gavva és mtsai. 2005, Honoré és mtsai. 2005, Zimmermann
és mtsai. 2005). A gyógyszerfejlesztésben a TRPV1 antagonisták jövője továbbra is
problémás, köszönhetően potenciális, súlyos hipertermiát okozó hatásuknak (Gavva és
mtsai. 2007, Holzer és mtsai. 2008, Szolcsányi 2008). Azonban irodalmi adatok szerint
hipertermizáló hatásuk szétválasztható a TRPV1 receptor antagonizáló hatástól, ahogy ez
néhány újonnan kifejlesztett TRPV1 ligand esetében is tapasztalható (Letho és mtsai.
2008). A klinikai fázisig eljutó első szerek, melyek 3 aktivátor (kapszaicin, hő és protonok)
hatását képesek blokkolni, vagy erős hipertermiát okozó mellékhatásaik vagy
hatástalanságuk miatt pedig nem kerültek forgalomba.
Antagonista neve Terápiás indikáció Fejlesztési stádium
DWP-05195 neuropátiás fájdalom
post herpeszes neuralgia Fázis I./II.
PHE377
PHE 575 neuropátiás fájdalom
Fázis I. (folyamatban)
Preklinikai fejlesztés
MR-1817 per os fájdalomcsillapító Fázis I.
ABT-102
ABT-116
ABT-443
gyulladás, szöveti sérülés vagy
iszkémia következtében
kialakuló fájdalom
Fázis I.
Fejlesztés alatt
Fejlesztés alatt
AMG-517
AMG-628 fájdalom
Fázis I.B (leállított)
Fejlesztés alatt
AZD-1386 krónikus fájdalom /özofágeális
reflux Fázis II. (leállított)
GRC-6211
fájdalom, migrén és
oszteoartritisz, fájdalmas
hólyag szindróma
Fázis II. oszteoartritisz vizsgálat
(felfüggesztve)
JTS-653 fájdalom Fázis II. (felfüggesztve)
MK-2295 fájdalom Fázis II. (teljesített)
SB-705498 rinitisz, krónikus köhögés,
Fázis II. migrén és rektális fájdalom
(befejezett),
Fázis II. nem allergiás rinitisz
(intranazális adás-folyamatban),
JNJ-39729209 cisztitis, köhögés, és pruritusz fejlesztés alatt
AS(P)-1928370
AS-1725195 fájdalom fejlesztés alatt
3. táblázat: Klinikai vizsgálatokba bevont TRPV1 antagonisták státuszai (Forrás: Trevisani és Gatti 2013,
módosított).
45
Az újabb antagonisták, melyek blokkolják a kapszaicin TRPV1 receptor aktiváló hatását,
de nem befolyásolják sem az alacsony pH, sem pedig a hő által kiváltott stimulációt,
feltehetően nem változtatják meg a maghőmérsékletet. Ezen szerek klinikai fázisvizsgálati
eredményei ezidáig nem ismertek. Mindezek alapján reménykeltő annak a lehetősége,
hogy sikerül TRPV1-antagonizmuson alapuló perifériás támadáspontú analgetikumokat
kifejleszteni.
46
3. fejezet: A TRPV1 és TRPA1 receptorok szerepének
vizsgálata az alap hőérzékelésben és mustárolaj által kiváltott
hiperalgézia modellben receptor génhiányos egerek
felhasználásával
Absztrakt: Tékus V, Hajna Z, Horváth A, Kun J, Bölcskei K, Szolcsányi J, Helyes Z: Role
of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 and Ankyrin 1 (TRPV1 and TRPA1) ion
channels in thermonociception in mice. CLINICAL NEUROSCIENCE 65:(1) p. 68. (2012)
(eredeti közlemény elküldése folyamatban)
BEVEZETÉS, IRODALMI HÁTTÉR
A homeosztázis fenntartásában nélkülözhetetlen a környezeti hőmérséklet érzékelése, a
szövetek károsodásával is járó extrém hideg, illetve forró ingerek elkerülése alapvető
fontosságú az élővilágban. A hőérzékelésben szerepet játszó pontos mechanizmusok
mindezidáig nem tisztázottak. Kutatásaink során a forró ingerek detektálására alkalmas
TRPV1 receptor és a hidegérzékelésben máig vitatott jelentőséggel bíró TRPA1 receptor
funkciójára (lásd 10. oldal) fókuszáltunk. A TRPV1 receptor szerkezetének pontosabb
megismerésére a receptor klónozása adott lehetőséget, melynek segítségével derült fény
arra, hogy a receptort a fájdalmas hőingerek és az alacsony pH közvetlenül képes aktiválni,
valamint, hogy központi szerepet játszik a nociceptort érő fájdalmas stimulusok
integrálásában is (Caterina és mtsai. 1997; Tominaga és mtsai. 1998). A gyulladásos illetve
fájdalommal járó folyamatokban betöltött szerepének részletesebb tanulmányozása akkor
vált lehetővé, amikor 2000-ben két kutatócsoport egymástól függetlenül TRPV1 receptor
génhiányos egereket állított elő (Caterina és mtsai. 2000; Davis és mtsai. 2000).
A TRPA1 receptort már 1999-ben klónozták (Jaquemar és mtsai. 1999), ennek ellenére
neuronokon való expresszálódását csak 2003-ban közölték (Story és mtsai. 2003), akik a
receptort, a fájdalmas intenzitású hideg ingerek szenzoraként azonosították. Mivel
korábban e két receptor szerepének feltérképezése főként akut modellekben volt lehetséges
antagonisták adása révén, génhiányos egerek alkalmazásával a receptorok működése és
jelentősége vizsgálhatóvá vált krónikus kísérletekben is. Az eltelt évtizedben a TRPV1
génhiányos egerek intenzív kutatása zajlott, hogy pontosabban meghatározzák a receptorok
szerepét normál fiziológiai és patológiás körülmények között.
47
Az egyik elsőként TRPV1 génhiányos egereken elvégzett kísérletben megállapították,
hogy a receptor esszenciális termális hiperalgéziában (Davis és mtsai. 2000), azonban
szerepe az alap
hőérzékelésben nem tisztázott (Caterina és mtsai. 2000). Ezt erősítik kutatócsoportunk
korábbi eredményei is, melyekben a TRPV1 génkiütött egerek nociceptív hőküszöbe nem
különbözött a vad típusúakétól (Almási és mtsai. 2003), azonban TRPV1-/-
állatokban
szignifikánsan kisebb mértékű volt a hőtraumával kiváltott termális és mechanikai
hiperalgézia mértéke (Bölcskei és mtsai. 2005).
A mustárolaj a természetben is megtalálható növényi eredetű irritáns, melyet hosszú ideje
alkalmaznak a népi gyógyászatban. Korábban a TRPA1 receptor szelektív exogén
agonistájaként tartották számon (Jorgt és mtsai. 2004), azonban szelektivitása
megkérdőjelezhető, mivel feltehetően szerepet játszik a TRPV1 receptor aktivációjában is
(Gees és mtsai. 2013, Everaerts és mtsai. 2011). A benne található allil-izotiocianátot
(AITC) ˗ a kapszaicinhez hasonlóan ˗ kémiai fájdalomkeltő hatása miatt régóta használják
a gyulladás mechanizmusainak vizsgálatához. Az RTX-szel deszenzibilizált egerek
elvesztették válaszkészségüket kapszaicinnel szemben ugyanakkor csökkent érzékenységet
mutattak mustárolajjal szemben is, melynek egyik lehetséges magyarázata a két receptorra
jellemző nagyfokú koexpresszió (Pecze és mtsai. 2009).
Egereken egyenletesen emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel végzett lábon mért nociceptív
hőküszöb-vizsgálatok nem ismertek az irodalomban. Mivel az egerek rosszul tűrik a
kézben tartást, továbbá a relatív kisméretű lábon a mérés nehézkes, ezért figyelmünk
központjába az egérfarok vizsgálata került. Kísérleteink során az intézetünkben fejlesztett
emelkedő hőmérsékletű vízfürdőt egy egérkaloda alkalmazásával alkalmassá tettük az
egerek farkán mért nociceptív hőküszöb vizsgálatokra.
CÉLKITŰZÉS
PhD munkám e részének célja volt a korábban intézetünkben patkány lábon mért hőküszöb
meghatározására kidolgozott emelkedő hőmérsékletű vízfürdő módszertani fejlesztése,
mely lehetőséget teremt az egerek farkán mért hőküszöb értékek meghatározására is.
Mivel az irodalomban ellentmondásos adatok állnak rendelkezésre mind a TRPV1, mind
pedig a TRPA1 receptor hő- és mechanikai-érzékelésben betöltött szerepével kapcsolatban
(lásd. 10. oldal), munkám további célja volt génhiányos egerek felhasználásával tisztázni
és vizsgálni e receptorok funkcióit fájdalmas küszöbmérésre alkalmas módszerekkel.
48
21. ábra: Emelkedő hőmérsékletű
vízfürdő, egerek részére kifejlesztett
kalodával
Mivel a receptorok szerepe feltehetően függ az érzőideg-végződések aktivációs
mechanizmusától, a választott kísérleti modellektől, illetve az alkalmazott vizsgálati
módszerektől, kidolgoztunk és validáltunk egy megbízhatóan működő, mustárolaj által
kiváltott hiperalgézia modellt, melyben az eltérő testtájak tanulmányozása vált lehetővé.
KÍSÉRLETI MODELLEK
Kísérleti állatok
Az előkísérleteket hím CD1 állattörzsbe tartozó egereken (25-35g), míg további
vizsgálatainkat hím TRPV1 és TRPA1 génhiányos egereken és ezek vad típusú
megfelelőin végeztük. Mindkét génhiányos állattörzs genetikai alapját a C57Bl/6 törzs
képezi. A TRPV1 génkiütött egerek (TRPV1-/-
) eredeti szülőpárjait a Jackson Laboratories
(USA) cégen keresztül vásároltuk, míg a TRPA1 génhiányos állatok eredeti szülőpárjait
(TRPA1-/-
) Dr. Pierangelo Geppetti a firenzei Egyetem professzora bocsátotta
rendelkezésünkre. A kísérletekhez felhasznált állatokat a Pécsi Tudományegyetem
Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézetének állatházában tenyésztettük, standard 25 °C-
on vízzel és élelemmel ad libitum ellátva.
Felhasznált anyagok
A mustárolajat (allil-izotiocianát, AITC) a Sigma-Aldrich Kft.-től (Magyarország), míg a
96% etanolt, a paraffin olajat és a dimetil-szulfoxidot (DMSO) a Reanal
Finomvegyszergyár Zrt.-től vásároltuk.
Előkísérletek és módszertani fejlesztések
Előkísérleteink során az egyenletesen emelkedő
hőmérsékletű vízfürdőt adaptáltuk egerekre. Az
egerek többnyire rosszul tűrik a kézbevételt, ezért a
mérések standardizálásához egy egérkalodát
fejlesztettünk ki, melyeket szellőzőlyukakkal ellátott
műanyag csövekből alakítottunk ki. Az állatok
behelyezése után a kalodákat egy állványon
rögzítettük, úgy hogy a farkuk pont a megfelelő
mélységben érjen bele a víztartályba (21. ábra). Pár
perc habituáció után megmértük az állatok fájdalmas
49
hőküszöbét, majd a mérést 10 percenként 1 órán keresztül ismételtük két egymást követő
napon. Összehasonlításképpen a vizsgált állatok alomtestvéreinek hőküszöb értékeit
detektáltuk, úgy, hogy az egereket a vizsgálatot végző személy a kezében tartotta.
Mustárolaj hatására létrejövő hiperalgézia modell kidolgozásakor a legalkalmasabb
oldószer kiválasztásához a mustárolajat 96% etanolban, paraffin olajban, illetve 30%
dimetil - szulfoxidban (DMSO) oldottuk, majd a hőküszöb-csökkentő hatást detektáltuk.
Ezután további kísérleteket végeztünk 0, 5, 1, 2, 5% mustárolaj alkalmazásával a megfelelő
mustárolaj koncentráció kiválasztásához.
Az alap termonociceptív küszöbök meghatározása
Az egerek fájdalmas hőküszöbét a bevezetőben (lásd 14. oldal) bemutatott egyenletesen
emelkedő hőmérsékletű forró lap alkalmazásával detektáltuk a hátsó lábon, míg a farkon,
az előző pontban bemutatott módosított emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel vizsgáltuk az
újonnan kifejlesztett csövek segítségével.
Mustárolaj által kiváltott termális hiperalgézia vizsgálata
A mustárolaj hatására kialakuló hőküszöbcsökkenést a hátsó lábon vagy farkon az
emelkedő hőmérsékletű forró lappal vagy vízfürdővel határoztuk meg. A kontroll mérések
elvégzése után az állatok lábát 60 s-ig, míg farkát 30 s-ig 1%-os, 30% DMSO-t tartalmazó
mustárolajba merítettük, majd a hőküszöb-változást 1 órán keresztül 10 percenként
detektáltuk.
Mustárolaj hatására kialakuló mechanikai hiperalgézia vizsgálata
Az egerek lábán mért érintési érzékenységet dinamikus plantáris észteziométerrel
vizsgáltuk. A szoktató és kontroll mérések elvégzése után az egerek egyik hátsó lábát 60
másodpercre 1%-os mustárolajba merítettük, majd 30, 60, 120, 180 perccel később
megmértük az állatok mechanonociceptív küszöbét.
Mustárolaj hatására kialakuló akut nocifenzív reakció latenciaidejének vizsgálata
Az állatok farkát, illetve lábát 1%-os mustárolajba merítettük és az elhárító reakció
megjelenéséig eltelt időt detektáltuk. Elhárító reakciónak a farok illetve láb erőteljes
megrázását tekintettük. A latenciaidő maximális értékét 3 percben határoztuk meg.
50
Statisztikai analízis
A kapott eredmények statisztikai értékelését kétutas ANOVA utáni Bonferroni módosított
post hoc teszttel végeztük. Minden esetben a * p <0,05 értéket tekintettük szignifikáns
eltérésnek.
EREDMÉNYEK
Előkísérletek
Az emelkedő hőmérsékletű vízfürdő módszertani fejlesztésekor egyik mérési pontban sem
tapasztaltunk szignifikáns eltérést az állatok kézben tartása, illetve csőbe zárása között.
Ugyanakkor, a kaloda alkalmazásával jelentősen csökkent a vizsgálati állatok
előkészítésének ideje, ezáltal időegység alatt több állat mérésére nyílt lehetőség (22. ábra).
0 10 20 30 40 50 6042
43
44
45
46
47
48
Fá
jda
lma
s h
ők
üs
zö
b (
°C) kézben tartott
csőbe zárt
idő (perc)
22. ábra: Farkon mért fájdalmas hőküszöb meghatározása csőbe zárva illetve kézben tartva egyenletesen
emelkedő hőmérsékletű vízfürdő segítségével. Fűtési sebesség: 12°C/perc. A csoportonkénti 8 állat
eredményeinek átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. Egyik vizsgálati időpontban sem tapasztaltunk
statisztikailag szignifikáns (p <0,05) különbségeket.
Előkísérleteteink következő részében a mustárolaj megfelelőnek oldószerének
kiválasztásához, 5% MO-t oldottunk 96% -os etanolban vagy paraffin olajban, illetve 30%
DMSO-ban. Az emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel detektálható hőküszöb csökkenés az
első két esetben csak 1-2 °C fok volt, míg 30% DMSO-ban oldva jóval nagyobb,
szignifikáns küszöbcsökkenést mértünk. A 30%-os DMSO oldat önmagában nem okozott
változást a termonociceptív küszöbben, így a későbbi kísérleteink során kontrollként
alkalmaztuk (23. A ábra).
51
A 2, illetve 5% százalék mustárolajat tartalmazó oldatok alkalmazása során jelentős
küszöbcsökkenést és esetenként szobahőmérsékleten jelentkező spontán fájdalmat
detektáltunk. Mivel az 1%-nál kisebb MO tartalmú oldatok esetében nem találtunk
szignifikáns küszöbcsökkentő hatást, ezért kísérleteink további részében a 10-12°C
csökkenést eredményező, szobahőmérsékleten spontán fájdalmat nem indukáló 1 %-os
mustárolaj-oldatot használtuk (23. B).
0 10 20 30 40 50 60
34
36
38
40
42
44
46
48
50
5% MO paraffinban oldva
5% MO 30% DMSO-ban oldva
30% DMSO
5% MO 96%-os etanolban oldva
***
Kezelés után eltelt idő (perc)
Fá
jda
lma
s h
ők
üs
zö
b
(°C
)
0 10 20 30 40 50 60-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
200% MO 0,5% MO1% MO 2% MO 5% MO
***
*****
Kezelés után eltelt idő (perc)
Fá
jda
lma
s h
ők
üs
zö
b v
álto
zá
sa
(°C
)
A B
23. ábra: A termális hiperalgézia kiváltásához szükséges megfelelő vivőanyag és mustárolaj koncentráció
meghatározása egyenletesen emelkedő vízfürdő módszerrel vizsgálva. Az ábra A része a fájdalmas hőküszöb
értékeket mutatja 5%-os mustárolaj (MO) kezelés (farok oldatba merítése) előtt és 10-60 perccel később,
paraffinban, 96%-os etanolban és 30% DMSO-ban oldva. Az ábra B része különböző koncentrációjú MO
(30% DMSO-ban oldott) oldatok hőküszöb csökkentő hatását szemlélteti. A csoportonkénti 6-9 állat
eredményeinek átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. A csillagok az oldószerrel kezelt (0% MO-
tartalmazó) illetve a különböző koncentrációjú MOcsoportok közötti statisztikailag szignifikáns (p<0,05)
különbségeket jelölik (Kétutas ANOVA és Bonferroni post hoc teszt).
Alap (kontroll) hőküszöb értékek meghatározása
Meglepő módon a TRPV1 génhiányos egerek a farkán szignifikánsan magasabb hőküszöb
értéket detektáltunk (TRPV1-/-
: 45,42 + 0,34°C), mint vad típusú megfelelőiknél
(TRPV1+/+
: 42,98 + 0,4°C). A láb vizsgálatakor azonban nem találtunk statisztikai
különbséget (TRPV1-/-
: 46,04 + 0,4°C illetve TRPV1+/+
: 45,52 + 0,4 °C) (24. A ábra).
TRPA1 génhiányos egerekben sem a farkon (TRPA1-/-
: 43,57 + 0,7 °C, TRPA1+/+
: 43,07 +
0,4 °C), sem a lábon (TRPA1-/-
: 44, 87 + 0,5 °C, TRPA1+/+
: 45,22 + 0,6 °C) nem volt
szignifikáns különbség (24. B ábra). A különböző testtájak vizsgálatakor csak az alap
hőküszöb értékek meghatározásához használtuk fel ugyanazon állatokat, tekintve, hogy
52
ezen mérések nem voltak invazívak. Az eltérő testtájon történő mustárolaj kezelések során,
kezelésenként egymás alomtestvéreit használtuk.
40
42
44
46
48
TRPV1-/-TRPV1+/+
FAROK LÁB
**
Fá
jda
lma
s h
ők
üs
zö
b (°
C)
40
42
44
46
48
TRPA1-/-TRPA1+/+
FAROK LÁB
Fá
jda
lma
s h
ők
üs
zö
b (°
C)
A B
24. ábra: A TRPV1 (A) és TRPA1 (B) génhiányos egerek és azok vad típusú megfelelőinek farkon
(emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel) illetve lábon (hot plate készülékkel) mért alap fájdalmas hőküszöb
értékei. A csoportonkénti 6-9 állat eredményeinek átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. A csillagok a
génhiányos és vad típusú egerek közötti statisztikailag szignifikáns (p <0,05) különbségeket jelölik (Student-
féle t-próba).
Mustárolaj által kiváltott termális hiperalgézia vizsgálata
TRPV1+/+
állatok farkon mért fájdalmas hőküszöb értékei 10 perccel a mustárolaj kezelést
követően a kiindulási kontroll szintről (43,53 + 0,33 °C) 35,96 + 1,23 °C-ra csökkent.
Ezzel szemben a TRPV1 génhiányos egerekben ez a csökkenés szignifikánsan kisebb volt
(46,05 + 0,35°C-ról 40,6 + 0,6 °C-ra). A két csoport közti küszöbcsökkenés különbsége
(átlagosan 4-6 °C) a kísérlet folyamán végig fennmaradt (25. A ábra). TRPA1 receptor
hiánya illetve megléte esetében közel azonos mértékű hőküszöbcsökkenést detektáltunk az
egerek farkán (25. B ábra). TRPV1+/+
és TRPA1+/+
állatok lábon mért kontroll
fájdalomküszöbeinek átlaga (44,8 + 0,4°C és 45,0 + 0,2 °C), 20 perccel a mustárolaj
kezelést követően átlagosan 12-14°C–kal csökkent. A kísérlet végéig fennmaradó
csökkenés a TRPA1-/-
állatok esetében nem (25. D ábra), míg a TRPV1 génhiányos
egereknél szignifikánsan kisebb volt vad típusú megfelelőikhez képest (25. C ábra).
53
0 10 20 30 40 50 6032
34
36
38
40
42
44
46
48
50
TRPV1-/-
TRPV1+/+
*
*
*
**
* *
1%-os mustárolaj kezelés után eltelt idő (perc)
Fájd
alm
as
hő
kü
szö
b (
°C)
0 10 20 30 40 50 6032
34
36
38
40
42
44
46
48
50
TRPA1-/-TRPA1+/+
1%-os mustárolaj kezelés után eltelt idő (perc)
Fájd
alm
as
hő
kü
szö
b (
°C)
0 10 20 30 40 50 6030
32
34
36
38
40
42
44
46
48
TRPV1-/-TRPV1+/+
Fá
jdalm
as
hők
üsz
öb
(°C
)
*** **
**
*****
1%-os mustárolaj kezelés után eltelt idő (perc)
0 10 20 30 40 50 6030
32
34
36
38
40
42
44
46
48
Fá
jdalm
as
hők
üsz
öb
(°C
)
TRPA1-/-TRPA1+/+
1%-os mustárolaj kezelés után eltelt idő (perc)
A B
C D
FAROK
LÁB
25. ábra: 1% mustárolaj által kiváltott termális hiperalgézia vizsgálata TRPV1 és TRPA1 génhiányos állatok
farkán emelkedő hőmérsékletű vízfürdővel (30 s; A-B), illetve lábán (60 s; C-D) emelkedő hőmérsékletű
forró lappal. A csoportonkénti 6 állat eredményeinek átlagát a standard hibával együtt ábrázoltuk. A csillagok
a génhiányos egerek és azok vad tipusú megfelelőik közötti statisztikailag szignifikáns (p <0,05)
különbségeket jelölik (kétutas ANOVA és Bonferroni post hoc teszt).
Mustárolaj által kiváltott mechanikai hiperalgézia meghatározása
A mustárolaj kezelés után 30 perccel a vad típusú állatoknál 45-55%-os
mechanonociceptív küszöbcsökkenést detektáltunk. Ez a csökkenés a TRPV1 génhiányos
egereknél szignifikánsan kisebb mértékű, 25% körüli volt, mely különbség a kísérlet
végéig fennmaradt (26. A ábra). Érdekes módon a mustárolaj-kezelés mind a TRPA1
receptorral rendelkező, illetve nem rendelkező állatokban hasonló hatást ért el, vagyis a
kialakult mechanikai hiperalgézia közel azonos mértékű volt (26. B ábra).
54
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180-60
-55
-50
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
TRPV1 -/-TRPV1 +/+
***
***
*** ***
1% mustárolaj kezelés után eltelt idő (perc)
Mech
an
on
ocic
ep
tív k
üsz
öb
vá
lto
zása
(%
)
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
-60
-55
-50
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
TRPA1 -/-TRPA1 +/+
1% mustárolaj kezelés után eltelt idő (perc)
Mech
an
on
ocic
ep
tív
kü
szö
b v
ált
ozá
sa (
%)
A B
26. ábra: 1%-os (60s) mustárolaj hatására kialakuló mechanikai hiperalgézia lábon dinamikus plantáris
észteziométerrel mérve. A TRPV1 (A) és TRPA1 (B) génhiányos egerek és azok vad típusú megfelelőinek
mechanonociceptív küszöbváltozásainak átlagát azok standard hibáival együtt ábrázoltuk (*** p <0,001; n=
7-11, kétutas ANOVA Bonferroni post hoc-teszt).
Mustárolaj által kiváltott akut nocifenzív reakció
A TRPV1+/+
állatok farkán mért elhárító reakció megjelenéséig eltelt idő 103 + 14 s volt a
mustárolajat nem tartalmazó oldatban, mely szignifikánsan nagyobb volt, mint a
mustárolajat tartalmazó oldatban töltött idő (48 + 5 s). Ezzel szemben a TRPV1-/-
állatok a
nocifenzív reakció megjelenéséig mustárolajban töltött ideje szignifikánsan nagyobb volt
(89 + 13 s) (27. A ábra). Hasonló eredményt kaptunk a TRPA1+/+
állatok vizsgálata során,
mustárolaj nélküli oldatban 63 + 8 s töltöttek a nocifenzív reakció megjelenéséig, míg 1%-
os mustárolaj oldatban ez az idő szignifikánsan kisebb volt (26 + 4 s). A TRPA1-/-
állatok
farkán mustárolajban detektált elhárító reakció megjelenéséig eltelt idő szignifikánsan
magasabb volt vad típusú társaikhoz képest (82 + 13 s) (27. B ábra).
55
0
20
40
60
80
100
120
140
TRPV1+/+
szolvens TRPV1+/+
1% MOTRPV1 -/-
1% MO
#
*
Mu
stá
rola
jban
tö
ltö
tt i
dő (
s)
0
20
40
60
80
100
120
140
#
***
TRPA1 +/+
szolvensTRPA1 -/-
1% MOTRPA1+/+
1% MO
Mu
stá
rola
jban
tö
ltö
tt i
dő (
s)
A B
27. ábra: Mustárolajjal kiváltott akut nocifenzív reakció latenciaideje génhiányos (TRPV1 (A), TRPA1 (B))
és vad típusú egerek farkán. A csoportonkénti 8-16 állat eredményeinek átlagát a standard hibával együtt
ábrázoltuk. A * p <0,05, *** p <0,001 a vad tipusú egerekhez viszonyított, míg a # p <0,05 statisztikailag
szignifikáns különbségeket jelölik. (egyutas ANOVA és Bonferroni post hoc teszt).
3.5. MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK
Az emelkedő hőmérsékletű vízfürdő készülék metodikai továbbfejlesztésével lehetőségünk
nyílt az egérfarok vizsgálatára, melyre a korábban alkalmazott módszerek nem voltak
alkalmasak. Alkalmazásával a mérési folyamat illetve az állatok előkészítése gyorsabbá
vált, standardizálva ezzel az emberi jelenlétből adódó különbségeket és az állatokat érő
stressz mértékét. A kidolgozott új metodika megbízható, gyors, preklinikai szűrőmódszerré
válhat.
A fájdalmas hőinger aktiválja a TRPV1 receptort (Caterina és mtsai. 1997), azonban
szerepét az irodalomi adatok szerint eddig kizárólag lábon vizsgálták, amely végtagon az
alap-hőérzékelésben betöltött funkciójának jelentőségét nem tudták igazolni (Caterina és
mtsai. 2000; Almási és mtsai. 2003; Bölcskei és mtsai. 2005), kivéve egy publikációt
(Hoffmann és mtsai. 2013). A TRPV1 receptor eltérő módon vesz részt a hő által kiváltott
nocifenzív viselkedés indukálásában (Caterina és mtsai. 2000). Vizsgálataik során a
TRPV1 génhiányos egerek kevésbé voltak érzékenyek egyes hővel kiváltott ingerekre,
(például a farok 48°C fokos vízbe merítésére), míg másokra fokozottabban reagáltak
(lábon vizsgált fókuszált sugárzó hő). Hasonló ellentmondásos eredményről számolt be
Davis és mtsai., akik TRPV1 receptorokat nem expresszáló DRG neuronokat vizsgáltak
elektrofiziológiai módszerekkel. A vizsgált sejtek fájdalmas intenzitású hőingerekkel nem
56
voltak aktiválhatók, azonban a TRPV1 génhiányos egerek normál módon reagáltak a forró
ingerekre (Davis és mtsai. 2000). Hoffmann és munkatársai TRPV1 és TRPA1 génhiányos,
illetve egyik gént sem tartalmazó TRPV1-/-
/TRPA1-/-
állatok latenciaidejét detektálták
plantar teszt segítségével. Kísérleteik során elsőként tapasztaltak normál körülmények
között mindhárom génhiányos törzsben megnyúlt latenciaidőt vad típusú megfelelőikhez
képest. Feltételezéseik szerint a TRPA1 receptor is részt vesz a hő által kiváltott
nocicepció detektálásában, azonban a TRPV1 receptortól eltérő módon (Hoffmann és
mtsai. 2013).
A módosított emelkedő hőmérsékletű vízfürdő és forró lap módszerek alkalmazásával
lehetőség nyílik a láb és a farok hőérzékelésének egyidejű összehasonlítására. E módszerek
segítségével elsőként szolgáltattunk adatokat arra nézve, hogy TRPV1 génhiányos egerek
farkán mérve szignifikánsan magasabb hőküszöbértékek detektálhatók, mint vad típusú
társaiknál, míg a lábon hot plate-tel mérve nem tapasztaltunk különbséget.
Az általuk tapasztalt eltérő testtájakon vizsgált adatok alátámaszthatják az általunk közölt
és tapasztalt szignifikáns különbségeket, melyeket a TRPV1 génhiányos egerek farkán
mért alap fájdalom küszöbértékekben találtunk. A korábbi adatokkal megegyezően, ez a
különbség a lábon mérve kísérleteinkben sem jelentkezett (Caterina és mtsai. 2000, Almási
és mtsai. 2003). Mindezek alapján feltételezhető, hogy az egerek hőérzékelésében a farok
nagyobb relevanciával bír, mint a láb, illetve az egyes testtájak feltehetően eltérő receptor
denzitással jellemezhetők.
A metodikai fejlesztésünk másik része egy megbízhatóan működő, validált mustárolaj által
kiváltott hiperalgézia modell beállítása volt. Korábbi irodalmi adatokból ismert, hogy a
mustárolaj TRPA1 receptor aktivátor (Jorgt és mtsai. 2004, Bandell és mtsai. 2004).
Kísérleteinkben a TRPA1 génhiányos egerekben és vad típusú kontrolljaikban a mustárolaj
által kiváltott gyulladásos hiperalgézia mind a farkon, mind pedig a lábon ugyanakkora
mértékű volt, amelyből arra következtettünk, hogy bár a mustárolaj számos rendszerben
aktiválja a TRPA1 receptort, esetünkben csak a mustárolaj kiváltotta nocifenzív
viselkedésben játszott szerepet. A mustárolaj a TRPV1 vad típusú egerekben is testtájtól
függetlenül indukált gyulladásos (termális és mechanikai) hiperalgéziát. A kialakuló
hiperalgézia mértéke azonban TRPV1 génhiányos egerek esetében szignifikánsan kisebb
mértékű volt. Mivel azonban a TRPV1-/-
egerekben is kialakult a hiperalgézia, feltehetően
más, még nem azonosított elemek is szerepet játszhatnak kialakulásának
mechanizmusaiban.
57
A kapott eredmények alapján erősen feltételezhető, hogy a mustárolaj nem szelektív a
TRPA1 receptorra nézve, hanem a TRPV1 receptort is aktiválja. Ezt a nézetet támasztja alá
Everaerts és munkatársai, akik szerint a mustárolaj a TRPV1 ioncsatorna meghatározó
mediátora. (Everaerts és mtsai. 2011). Feltételezésük szerint a mustárolaj a TRPV1 lassú
és tartós aktiválásával az akut fájdalomérzést, míg a TRPA1 gyors és átmeneti
stimulálásával a már korábban részletezett neurogén gyulladást hozza létre (Everaerts és
mtsai. 2011). Az elektrofil ágensek e csatornákat a citoszolikus cisztein oldalláncok
kovalens modifikációja révén aktiválják (Hinman és mtsai. 2006), azonban a mustárolaj
okozta TRPV1 aktiváció mechanizmusa nem pontosan ismert. Feltételezések szerint a
mustárolaj által kiváltott TRPV1 receptor aktivációban a cisztein oldalláncok kovalens
módosulása mellett az aktiváció eredményessége nagymértékben függ az S513-as
kapszaicin kötőhelyet is tartalmazó oldallánc modifikációjától (Gees és mtsai. 2013). In
vitro kísérletek során Alpizar és munkatársai TRPV1 receptor-overexpresszált
sejtvonalakat vizsgáltak patch clamp és intracelluláris Ca2+
imaging módszerekkel. A
vizsgált sejtvonalak hőingerekre mustárolaj jelenlétében szignifikánsan nagyobb
csatornaaktivációt mutattak, mint kontroll körülmények között (Alpizar és mtsai. 2014).
Kísérleteinkban a TRPA1 receptor a mustárolaj indukálta hiperalgézia modellben nem,
csak a nocifenzív reakció vizsgálatakor játszott szerepet. Ezen eredmények
ellentmondanak Salas és munkatársai génexpressziós hipotézisének, mely szerint TRPV1
gén kiütésével, a TRPA1 receptor génexpressziója is csökken egy még nem ismert
mechanizmusú interakció révén, és ennek eredményeképpen a sejtfelszínen a TRPA1
receptor „down-regulálódik” (Salas és mtsai. 2009). Így a mustárolaj csak azokon az
idegvégződéseken tudja kifejteni a hatását, ahol e két ioncsatorna nem koexpresszálódik,
azonban ezek a neuronok az összmennyiséghez képest kis hányadot képviselnek, így a
gyulladásos hiperalgázia kisebb és az akut fájdalom elhárító viselkedés reakcióideje
hosszabb lesz a TRPV1 gén hiánya esetén. Tehát fájdalommodelljeinkben a TRPV1
játszotta a kulcsszerepet, hiszen esszenciálisnak bizonyult mind a fájdalomérzékelésben,
mind a mustárolaj-indukált hiperalgéziában.
A perifériás és centrális szenzitizáció patomechanizmusaiban feltételezhetően a TRPV1 és
TRPA1 receptorok is szerepet játszanak. Szöveti károsodás során a bőrben vagy a belső
szervekben található nociceptorok ingerküszöbe lecsökken a felszabaduló gyulladásos
mediátorok hatására, így kialakul a perifériás szenzitizáció (Mezei és mtsai. 2002). Ezek a
gyulladásos mediátorok (pl. lipoxigenáz termékek, prosztaglandinok, bradikinin stb., lásd
58
9. oldal) a TRPV1 és a TRPA1 receptorokon keresztül fejtik ki hatásukat. Ezt követően a
gerincvelő hátsó szarvában elhelyezkedő neuronok érzékenysége fokozódik, mivel a
nociceptorok felől érkező folyamatos ingerek hatására excitátoros neurotranszmitterek (pl.
glutamát) szabadulnak fel. Krónikus fájdalomingerek hatására ezen neurotranszmitterek
túlprodukciója eredményeként a hátsószarvi gátló interneuronok egy része elpusztul.
Fokozódik a Na+- és a Ca
2+ csatornák illetve a kolecisztokinin (CCK) receptorok
expressziója, ami hiperexcitabilitáshoz és leszálló fájdalom-moduláló pálya gátlásához
vezet (a CCK antagonizálja az endogén opioidok hatását). Mindezek következtében
csökken a fájdalomküszöb, az agyat egyre több fájdalominger bombázza, amely az agyi
fájdalom-feldolgozásban részt vevő struktúráinak túlérzékenységéhez, vagyis a centrális
szenzitizációhoz vezet (Meyer 2006). A TRPV1 receptor hiánya feltehetően csökkentette a
mustárolaj beadása után (korai fázisban) a perifériás szenzitizáció révén kialakuló termális
hiperalgéziát, illetve a centrálisan (késői fázisban) kialakuló mechanikai hiperalgéziát.
59
4. fejezet: Komplex Regionális Fájdalom Szindróma (CRPS)
passzív transzfer-trauma egérmodellje
Valéria Tékus, Zsófia Hajna, Éva Borbély, Adrienn Markovics, Teréz Bagoly, János
Szolcsányi, Victoria Thompson, Ágnes Kemény, Zsuzsanna Helyes, Andreas Goebel: A
CRPS-IgG-transfer-trauma model reproducing inflammatory and positive sensory signs
associated with Complex Regional Pain Syndrome.
Pain. 2014 Feb; 155 (2):299-308. doi: 10.1016/j.pain.2013.10.011. Epub 2013 Oct 18
IRODALMI HÁTTÉR, ELŐZMÉNYEK
Neuro-immun interakciók
Az idegrendszer és az immunrendszer között kétirányú kapcsolat áll fenn. Az
idegvégződésekből felszabaduló mediátorokaz immunsejtek működésének modulálása
révén a gyulladásos folyamatokat fokozni vagy csökkenteni képesek. Az aktivált
immunsejtekből felszabaduló transzmitterek visszahatnak az érzőideg-végződésekre,
stimulálják, szenzitizálják azokat, amely a fájdalom fokozódásához, további neuropeptid-
kiáramláshoz vezet (Gallowith-Puerta és Pavlov 2007).
A neurogén gyulladásos mechanizmusok fontos szerepet játszanak számos krónikus,
perzisztáló fájdalommal járó gyulladásos kórképben, pl. rheumatoid artritiszben (Levine és
mtsai. 1986), így feltételezésünk szerint a Komplex Regionális Fájdalom Szindróma
(Complex Regional Pain Syndrom: CRPS) kialakulásában is.
A CRPS klinikai jellemzői
Pontos epidemiológiai adatok a betegség sokféle formája és diagnosztikus nehézségei miatt
nem állnak rendelkezésre. A nemek közti megoszlási aránya 4:1, melyben a nők aránya
sokkal nagyobb. A megbetegedettek átlagos életkora 37 év (de M és mtsai. 2007). Sem a
betegség etiológiája sem pedig pontos patofiziológiai mechanizmusai nem ismertek.
Hátterében kisebb sérülés (rándulás, ficam, törés) hatására az érzőideg végződésekből
felszabaduló antigének elleni túlzott immunválaszt és összetett neuro-immun interakciókat
valószínűsítenek (Blaes és mtsai. 2007) (28. ábra).
60
28. ábra: A betegség kialakulásának feltételezett mechanizmusa.
A betegség korábbi elnevezése volt többek közt a reflex szimpatikus disztrófia (CRPS I)
vagy kauzalgia (CRPS II). Az egyes tünetek egyénenként eltérő módon és gyakorisággal
jelentkeznek, mely rendkívül nehézzé teszi a diagnózis felállítását. Az IASP 2010-ben
egységesítette az elnevezését és meghatározta a diagnosztikus kritériumokat (Harden és
mtsai 2010). Két fő típusát különböztetik meg: 1) egyes megbetegedések (vírusfertőzés,
szívroham) után kialakuló valódi idegsérüléssel nem járó típusát (CRPS I), illetve 2)
tényleges idegsérüléssel járó formáját (CRPS II).
A betegség klinikai tüneteit 4 nagy csoportba oszthatjuk: a; abnormálisan fokozott
fájdalomérzékelés, b; ödéma, vasomotor és szudomotor abnormalitások, c; a bőr színének
és hőmérsékletének megváltozása, d; motoros funkciózavarok és trófikus elváltozások (29.
ábra).
29. ábra: CRPS-ben szenvedő páciensek végtag- elváltozásai.
61
A tünetek az esetek egy részében spontán gyógyulnak, azonban nagyobb részüknél
fokozódnak és hosszan, akár hónapokig, sőt évekig fennmaradó perzisztáló intenzív
fájdalomállapot alakul ki. A jelenleg rendelkezésre álló terápia nem kielégítő, az
alkalmazott gyógyszerek nem, vagy kismértékben hatásosak, ugyanakkor súlyos
mellékhatásokkal járnak. A betegség lefolyását nagymértékben meghatározza a kezelés
megkezdésének időpontja.
A korábban néhány páciensnél alkalmazott plazmaferezis hatékonynak bizonyult, mely az
autoantitestek által mediált immunreakciók lehetséges szerepére utalnak (Goebel és mtsai.
2010, 2011, Kohr és mtsai. 2011, Marinus és mtsai. 2011). A patogén autoantitestek által
okozott megbetegedések vizsgálatára alkalmazható egyik módszer a humán vérszérumok
tisztított IgG frakcióinak intraperitoneális beadása rágcsálókba (passzív transzfer).
Miaszténia gravisz és pemfigusz vizsgálata során leírták, hogy a sejtfelszíni epitópok
felismerésének képessége a fajok közti transzfert követően megőrződtek (Toyka és mtsai
1975, Anhalt és mtsai. 1982). A sikeres passzív transzfer kísérletek e típusa ezért alkalmas
az autoantitestek betegségben betöltött szerepének közvetlen vizsgálatára (Rose és mtsai.
1993), emellett megfelelő modellként szolgál az egyes patomechanizmusok
feltérképezésére, illetve új terápiás eszközök fejlesztésére. Kollaborátorunk korábbi
eredménye (Goebel és mtsai 2011, 2013), hogy hosszan fennálló CRPS-ben szenvedő
páciensek passzív transzferrel átvitt tisztított IgG frakciói csökkentik intakt egerek (sérülés
nélküli) exploráló viselkedését, bár fokozott fájdalomérzetet (hiperalgézia) és ödémát nem
tapasztaltak. Mivel a CRPS főként valamilyen trauma után alakul ki, feltételezhető, hogy a
passzív transzfer sikere függ a trauma meglététől, például valamilyen sérülés által kiváltott
helyi gyulladás szükséges a keringő autoantitestek megkötéséhez (a megkötött antitestek
pedig valószínűleg tovább fokozzák a már kialakult gyulladás mértékét).
A SP, CGRP, TNF-alfa és interleukin-6 (IL-6) szintek kórosan emelkedtekCRPS-sel
érintett bőrből vett ödémafolyadékban (Weber és mtsai 2001, Huygen és mtsai 2002).
CRPS csonttöréses rágcsáló modelljeiben az interleukin 1-béta (IL-1 béta) szintje és a
korábbi eredeményekkel összhangban a szöveti SP koncentrációja is megemelkedett (Guo
és mtsai. 2004, Kingery és mtsai 2010). Kísérleteink során a szöveti mikrosérülés
modellezésére plantáris bőr-izom incíziót végeztünk az állatokon.
62
CÉLKITŰZÉS
Mivel a betegség etiológiája és patofiziológiai mechanizmusai nem ismertek, a
rendelkezésre álló terápia pedig sok esetben egyáltalán nem hatásos, feltétlenül szükség
van a pontos kórélettani folyamatok feltérképezésére és potenciális új típusú
gyógyszercélpontok azonosítására. Ez megfelelő állatmodell hiányában ezidáig nehéznek
bizonyult.
PhD munkám e részének célja ezért egy megbízhatóan működő CRPS passszív-transzfer
egérmodell beállítása és integratív vizsgálata volt a Liverpooli Egyetem Fájdalom
Központjával való kollaboráció segítségével (dr. Andreas Goebel, Department of
Translational Medicine, és Walton Pain Center, University of Liverpool).
KÍSÉRLETI MODELLEK ÉS VIZSGÁLATI MÓDSZEREK
Vizsgálati alanyok és mintagyűjtés
Kísérleteinkben dr. Andreas Goebel által küldött 6 CRPS szindrómában szenvedő páciens
és 6 egészséges önkéntes szérumaiból tisztított IgG frakciót vizsgáltuk az általunk
kidolgozott egérmodell kísérleti paradigmájában. A kiválasztott 6 beteg mindegyike esetén
a 12 hónapnál régebben fennálló tüneteik kielégítették az IASP által elfogadott CRPS
diagnosztikus kritériumait (Harden és mtsai. 2010), perzisztáló fájdalmaik intenzitása 5
vagy annál magasabb volt a numerikus fájdalom-mérő skálán (0-10), nem szenvedtek más
krónikus fájdalommal vagy gyulladással járó megbetegedésben, illetve a Walton Pain
Center gondozása alatt álltak minimum egy éve. Egészséges önkénteseknek a páciensekkel
megegyező korú és nemű (+ 10 év) alanyokat választottunk, akik nem szenvedtek
semmilyen krónikus fájdalommal járó kórképben és elsőfokú rokonaik között nem volt
autoimmun beteg.
A vizsgálati alanyoktól 150 ml vért vettek, melyet lecentrifugáltak. Az IgG frakciók
elválasztásához az így kapott szérumokat affinitás kromatográf módszer alkalmazásával G
protein-kötő microgyöngyöket (Sigma Aldrich, Gillingham, UK) tartalmazó oszlopon
engedték át a korábban leírt módszer alapján (Buckley és mtsai 2005). Az etikai
engedélyek száma: ISRCTN63226217, 12/NW/0126.
Kísérleti állatok
Kísérleteinkhez C57Bl/6 állattörzsbe tartozó nőstény egereket (8-10 hetes, 18-23 g)
használtunk. Az eredeti szülőpárokat a Jackson Laboratories (USA) cégtől vásároltuk
63
magyarországi forgalmazójukon a Charles River Hungary-n keresztül, majd intézetünk
állatházában tartottuk és szaporítottuk 24-25 °C-on, normál rágcsálótáppal és vízzel ad
libitum ellátva. Az egyes vizsgálatokat minden esetben azonos személy végezte, aki a
pontos kezelési protokollt nem ismerte.
Kísérleti protokoll
6 CRPS beteg véréből származó tisztított IgG frakciót adtunk be i. p. az állatoknak (5-7
egér/csoport/páciens). A kontroll egerek csoportjai egészséges önkéntesekből származó
tisztított IgG-t vagy fiziológiás sóoldatot kaptak. A beadott egészséges és CRPS-ben
szenvedő betegekből származó IgG-k koncentrációi megegyeztek.
A három egymást követő napon mért kontrollmérések előtt minden esetben szoktató
mérést végeztünk, melynek eredményeit a kiértékelésnél nem vettük figyelembe. A kísérlet
0. napjának a talpbőr-izom incízió műtét idejét tekintettük. A kezeléseket a -1., 0. illetve
az 5. és 6. napokon alkalmaztuk i.p. injekció formájában napi kétszer. Minden egér
összesen 6 ml IgG szérumot, illetve fiziológiás sóoldatot kapott (reggelente 1ml, és késő
délután 0,5 ml minden kezelési napon). A kísérlet 8. napja alatt mértük a mechanikai
érzékenységet (fájdalomküszöböt) dinamikus plantáris észteziométerrel, a lábtérfogatot
pletizmométerrel, a hideg érzékenységet a 0°C-os vízből való végtagkihúzás
latenciaidejének detektálásával, a spontán lokomotoros aktivitást open field teszttel, a
mozgáskoordinációt RotaRod kerékkel, továbbá a talphőmérsékletet kontakthőmérővel-,
ill. a testsúlyt. A kísérlet 8. napján az állatokat túlaltattuk, a hátsó végtagokat a tibio-
tarzális ízületekkel együtt eltávolítottuk és -80°C-on tároltuk a szövetek neuropeptid és
citokin koncentrációinak meghatározásáig (30. ábra).
64
30. ábra A kísérleti protokoll.
Vizsgálati modell
A kísérleti elrendezést és paradigmát a 30. ábra foglalja össze.
Plantáris bőr és izom incízió
Az értekezésem korábbi fejezetében már ismertetett, eredetileg patkány modellen (Brennan
és mtsai. 1996) kidolgozott, de egérre is adaptált (Banick és mtsai. 2006, Pogatzki-Zahn és
mtsai. 2007) plantáris bőr-izom incíziót alkalmaztunk. Az állatokat ketamin és xylazin
keverékével (100 és 5 mg/kg i.p) altattuk, majd a jobb talp bőrét 0,2 cm-re a saroktól 0,5
cm hosszan hosszanti irányban bemetszettük az izmot és kötőszövetet is érintve. A sebet
5.0 steril fonallal zártuk, majd fertőtlenítettük. Az állatok mindhárom kezelési csoportban
az inciziót követően maguk távolították el a varratokat 1-2 napon belül.
VIZSGÁLATI MÓDSZEREK
Érintési érzékenység vizsgálata
A CRPS egyik leggyakoribb klinikai tünete a fájdalom és a mechanikai hiperalgézia. A
talpbőr érintési érzékenységének vizsgálatára a korábban már bemutatott dinamikus
plantáris észteziométert használtuk. A méréseket a passzív-transzfer kezelés előtt és az 1.,
2., 3., 7. és a 8. napokon végeztük.
65
Lábtérfogat mérése
Mivel a CRPS másik meghatározó klinikai tünete az érintett végtagok erőteljes duzzadása,
kísérleteinkben a láb térfogatának változásait pletizmométerrel vizsgáltuk a passzív-
transzfer kezelés előtt (kontroll) és 1., 2., 3., 7. és a 8. napon.
Hő- és hidegérzékenység
Mind a hő, mind a hideg hiperalgézia/allodínia a CRPS-ben szenvedő páciensek közel
egyharmadát érinti. A korábban már bemutatott emelkedő hőmérsékletű forró lappal
vizsgáltuk az állatok fájdalmas hőküszöbét a műtét előtt, valamint az 1., 2., 3., 7. és 8.
napokon. A hideg érzékenység meghatározásához az egerek érintett végtagját 0°C-os
(jeges) vízbe merítettük és az elhárító reakció latenciaidejét detektáltuk a kezelések előtt,
illetve a 3., 7. és 8. napokon.
Spontán súlyeloszlás vizsgálata
A hátsó végtagok spontán súlyeloszlásának vizsgálatát a kontroll mérések elvégzése után a
kísérlet 1, 2, 3, 7 és 8. napján végeztük.
Spontán lokomotoros aktivitás
Spontán lokomotoros aktivitás mérésére open field tesztet alkalmaztunk. A méréseket a
kísérlet 0. és 6. napján végeztük.
Motoros koordináció
A motoros funkció és a koordináció vizsgálatát RotaRod készülékkel vizsgáltuk a kísérlet
0. és 6. napján. A forgó henger sebessége az első 10 másodpercben konstans 4 rpm volt,
majd 5 perc alatt 40 rpm-re gyorsult fel.
Talphőmérséklet meghatározása
A talp hőmérsékletét kontakthőmérővel mértük meg a kísérlet 7. napján.
Testtömeg monitorozása
Az állatok testsúlyát a kísérlet minden napján azonos időben mértük.
Gyulladásos neuropeptidek és citokinek meghatározása szövet-homogenizátumokból
Miután az összes funkcionális tesztet elvégeztük a kísérlet 8. napján (30. ábra), az
egereken ketamin-xilazin altatás alatt cervikális dislokációt végeztünk. Ezt követően
66
mindkét hátsó lábat lemetszettük a tibiotarzális ízülettel együtt, majd az ujjakat
eltávolítottuk és a mintákat steril foszfát pufferben homogenizáltuk. A CGRP- és SP- szerű
immunreaktivitás mérésére rádioimmunesszé (RIA) módszert alkalmaztunk, míg a
vérminták IL-6 illetve IL1-béta szintjét Luminex® 100™ x MAP módszerrel határoztuk
meg a gyártó cég ajánlása szerint. A kapott értékeket a neuropeptidek esetében fmol/mg-
ban, míg a citokinek esetében pg/mg-ban, 1 mg nedves szövetre vizsgálva ábrázoltuk.
EREDMÉNYEK
A kísérletsorozatba bevont 6 CPRS-ben szenvedő páciens demográfiai megoszlását és
betegség karakterisztikáját az 4. táblázat mutatja.
Páciensek
1 2 3 4 5 6
Kor 48 43 60 34 37 50
Nem nő férfi férfi nő nő nő
Érintett végtag alsó mindkét
alsó felső alsó alsó alsó
Kiváltó ok táncolás kis ütés
plexus
brachiális
malignus
tumor operáció
Freiberg-
szindróma
operáció
és
reoperáció
Morton-
neuroma
operáció
bokatörést
követő
operáció
CRPS típusaa 1 1 2 1
nincs
meghatá-
rozva
1
Betegség
fennállása 6 5,1 7 5-7
b 1 8-10
b
Fájdalom
intenzitásac
7 7,5 10 7 5,5 8
Nyomásérzékeny-
ség az érintett
végtagon
+ + + + + +
További
megbetegedések
pikkelysömör
, glutén-
érzékeny
enteropátia,
anémia
pernicióza
nincs
korábbi
miokardiális
infarktus
Freiberg-
szindróma asztma
diabetes
mellitusz 2-es
típus, magas
vérnyomás,
magas
koleszterin,
pajzsmirigy
túlműködés
4. táblázat A vizsgált páciensek demográfiai és betegség jellemzői a 1 = tényleges idegsérülés nélküli típus, 2 = tényleges idegsérüléssel járó típus
b A sorozatos operációk miatt a megbetegedés pontos időpontja nem meghatározható vagy a páciens nem
emlékszik c
: 24 órán keresztül a 11 pontos numerikus skálán (0-10) vizsgált fájdalom átlaga, ahol 0= nincs fájdalom,
10= az elképzelhető legnagyobb fájdalom
67
Mechanikai hiperalgézia
A műtött lábon az operációt megelőzően mért mechanonociceptív küszöbök átlagai között
nem volt szignifikáns különbség, 7,22 + 0,09 g volt a fiziológiás sóoldatottal kezelt, 7,23 +
0,09 g és 7,09 + 0,10 az egészséges és CRPS IgG-t kapott csoportokban. Az elvégzett talp
bőr-izom incízió 45-50%-kal csökkentette a küszöbértéket az 1. napon mindhárom
csoportban, mely a fokozott fájdalomérzékenységet demonstrálta. A fiziológiás sóoldattal
kezelt kontroll csoportban a mechanikai hiperalgézia 25,74 + 2,30 %-ra és 16,01 + 2,24 %
-ra mérséklődött a műtétet követő 2. és 3. napra, majd később ez utóbbi szinten állandósult.
Szignifikánsan nagyobb mechanikai küszöbcsökkenést detektáltunk a CRPS IgG-vel kezelt
állatcsoportban a 7. napon az egészséges IgG-vel kezelt állatokhoz képest (Bonferroni post
hoc teszt, p <0,001, 31. ábra). A 7. napon mért átlag küszöbcsökkenés a CRPS IgG
csoportban 31,41 + 1,7 % volt, mely szignifikánsan nagyobb volt az egészséges IgG-vel
kezelt csoport küszöbcsökkenésénél (-19,94 + 3,42 %). Az ellenoldali, nem műtött lábon a
küszöbcsökkenés 5 %-nál kisebb volt mindhárom csoportban (nem ábrázolt adatok).
-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
Fiz. só
Egészséges IgG
CRPS IgG
***
###
++ ++
### ###
Mûtét után eltelt napok
Me
ch
an
on
oc
ice
ptí
v k
üs
zö
b
vá
lto
zá
sa
(%
)
Fiz. só Egészséges IgG CRPS IgG-40
-30
-20
-10
0
**###
Me
ch
an
on
oc
ice
ptív
kü
szö
b
vá
lto
zá
sa
(%
)
A B
31. ábra: CRPS-ben szenvedő páciensek és egészséges önkéntesek tisztított IgG frakcióinak, vagy a
fiziológiás sóoldat hatása plantáris incízió által kiváltott mechanikai hiperalgéziában egérlábon. A szérum
IgG-k vagy a fiziológiás sóoldat teljes mennyisége 1,5 ml/nap/ egér, a kezelések a kísérlet -1. 0. 5. és 6.
napján intraperitoneálisan történtek. Az ábra A része az összes kísérletből származó eredményt szemlélteti,
melyek az egyes kezelt csoportok érintési érzékenységének százalékos változásainak átlagait a standard
hibával együtt ábrázolják (n=30-37 egér/csoport). *** p <0,001 CRPS vs. Egészséges IgG; ### p <0,001
CRPS vs. fiziológiás sóoldat; + p <0,05 Egészséges IgG vs. fiziológiás sóoldat (kétutas ANOVA Bonferroni
post hoc teszttel). Az ábra B része a 7. napon mért adatokat muatatja, ahol az egyes pontok az állatok azon
csoportját (n=5-7) reprezentálják, melyek 1 beteg illetve 1 egészséges önkéntes tisztított IgG frakcióit vagy
normál fiziológiás sóoldatot kaptak, míg a vízszintes vonalak az átlagot jelzik.
68
Lábduzzadás
Az operációt megelőzően mért lábtérfogat-értékek átlaga mindhárom csoportban
(fiziológiás sóoldattal, illetve egészséges- vagy CRPS- IgG–vel kezelt egerek) hasonló,
10,29 + 0,2 cm3, 10,04 + 0,1 cm
3 és 9,97 + 0,1 cm
3 volt. A plantáris inciziót követő 1.
napon a lábduzzadás 20,56 + 2,52 % volt a fiziológiás sóoldattal kezelt csoportban, majd a
7. napig fokozatosan csökkent 10,52 + 1,83 % -ra. A CRPS IgG-vel kezelt csoportnál a 2.
és 3. napon szignifikánsan nagyobb volt a lábduzzadás mértéke az egészséges IgG-vel
kezelt állatokhoz képest (Bonferroni post hoc teszt, p <0,001, 32. A ábra). A CRPS
betegekből származó IgG-vel kezelt csoportban a 2. napon mért átlag lábtérfogat 32,3 + 1,8
% volt, mely 45 %-kal magasabbnak bizonyult az egészséges IgG-vel kezelt állatok
lábtérfogat értékénél (22,3 + 2,2 %). A lábtérfogat változások minden sorozatban
nagyobbak voltak a beteg IgG-vel kezelt állatoknál, mint az egészséges IgG-vel kezelt
csoportban. Az ellenoldali, nem műtőtt lábon mért lábtérfogat-változás minden csoportban
3%-nál kisebb volt (nem ábrázolt adat).
-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 80
10
20
30
40
Fiz. só
CRPS IgG
Egészséges IgG
***###
# ##
+
*###
Műtét után eltelt napok
Lá
bd
uzza
dá
s (
%)
Fiz. só Egészséges IgG CRPS IgG0
10
20
30
40
**###
Lá
bd
uzza
dá
s (
%)
A B
32. ábra: CRPS-ben szenvedő páciensek illetve egészséges önkéntesek tisztított IgG frakcióinak, vagy
fiziológiás sóoldat hatása plantáris incízió által kiváltott lábduzzadásra. A kezelés időpontjait lásd a 33.
ábrán. Az ábra A része a kísérletsorozat összesített eredményét mutatja (n=30-37/kezelés/állat, melyben a
megfelelő kezdeti kontroll értékekhez viszonyított százalékos változásokat ábrázoltuk. *** p <0,001 CRPS
vs. Egészséges IgG; ### p <0,001 CRPS vs. fiziológiás sóoldat; + p <0,05 Egészséges IgG vs. fiziológiás
sóoldat (Kétutas ANOVA Bonferroni post hoc teszttel). Az ábra B része a 7. napon mért adatokat mutatja,
ahol az egyes pontok az állatok azon csoportját (n=5-7) reprezentálják, melyek 1 beteg illetve 1 egészséges
önkéntes tisztított IgG frakcióit vagy normál fiziológiás sóoldatot kaptak, míg a vízszintes vonalak az
átlagokat jelölik.
69
Hő- és hideghiperalgézia
A termonociceptív hőküszöböt emelkedő hőmérsékletű forró lappal határoztuk meg
kísérleteink első két sorozatában, azonban szignifikáns változásokat nem találtunk az egyes
csoportok között (33. A ábra). Ezért későbbi kísérleteink során e módszerrel nem
folytattuk tovább a tesztelést, helyette a hideg érzékenységet kezdtük el vizsgálni. A
fiziológiás sóoldattal kezelt kontroll állatoknál a 0 °C-on mért lábkihúzás átlag
latenciaideje az incízió előtt 157,25 + 8,26 s volt, mely a műtétet követő 3. napon 52,04 +
6,45 s-ra csökkent, ehhez hasonló eredményeket tapasztaltunk a CRPS-es és az egészséges
IgG–vel kezelt csoportoknál is. A kialakuló hideg hiperalgézia a kísérlet elejétől a 8. napig
mindhárom csoportban fennállt, az egyes csoportok között szignifikáns különbség nem
volt (33. B. ábra).
Spontán súlyeloszlás
A spontán súlyeloszlást kísérleteink első két sorozatában vizsgáltuk. Mivel azonban a 3.
napon mindhárom csoportban a műtőtt oldali terhelésben csak kismértékű, de nem
szignifikáns csökkenést detektáltunk, kísérleteink további részében a vizsgálatokat nem
folytattuk tovább (33. C ábra).
Spontán lokomotoros aktivitás és motoros koordináció
A 0. és 6. napon meghatározott spontán lokomotoros aktivitást a keresztezett mezők és az
ágaskodások száma, a vizsgálati mező közepén tartozkodás ideje, illetve a mozgással és
mosakodással töltött idő alapján értékeltük, azonban egyik paraméterben sem volt
szignifikáns eltérés (33. D ábra).
A kísérlet 0. napján RotaRod készülékkel elvégzett motoros koordinációs mérésekben sem
találtunk szignifikáns különbséget az egyes csoportok között (nem ábrázolt adat).
Kísérleteink első két sorozatában a 6. napon is végeztünk méréseket. Mindhárom kezelési
csoportban egyformán megnyúlt a leesésig eltelt idő, az ebben szerepet játszó tanulási
folyamatnak köszönhetően (Butriago és mtsai 2004), így a későbbiekben a 6. napon már
nem folytattuk a tesztelést.
70
Talphőmérséklet és a testsúly változása
Nem találtunk szignifikáns különbséget sem a műtőtt lábon mért talphőmérsékletek
abszolút értékeinek átlagaiban, sem pedig a 7. napon mért átlag talphőmérséklet
különbségekben egyik vizsgált csoportban sem. Így a 3. sorozat után abbahagytuk a
talphőmérséklet vizsgálatát (33. E ábra).
A fiziológiás sóoldattal kezelt kontroll csoport testsúlyának átlaga 18,26 + 0,25 g volt, míg
az egészséges IgG-vel illetve betegekből származó IgG-vel kezelt csoportoknál 18,95 +
0,29 g és 18,53 + 0,23 g volt. A kísérletek során mért súlyváltozások nem voltak
szignifikánsan különbözőek (33. F ábra).
1 2 3 4 5 6 7 842
43
44
45
46
47
48
Fiz. sóEgészséges IgG
CRPS IgG
Műtét után eltelt napok
Fá
jda
lma
s h
ők
üs
zö
b (
°C)
0 1 2 3 4 5 6 7 8
40
60
80
100
120
140
160
180
Fiz. só
Egészséges IgG
CRPS IgG
Műtét után eltelt napok
0°C
fo
ko
s v
ízb
en
tö
ltö
tt id
ő (
s)
0 1 2 3 4 5 6 7 8-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
Fiz. só
Egészséges IgG
CRPS IgG
Műtét után eltelt napok
Te
sts
úly
-vá
lto
zá
s (
%)
A B
C D
E F
0 1 2 3 4 5 6 7 8-10
-5
0
5
Fiz. só
Egészséges IgG
CRPS IgG
Műtét után eltelt napok
Éri
nte
tt v
ég
tag
sú
lye
los
zlá
s
vá
lto
zá
sa
(%
)
Fiz. só Egészséges IgG CRPS IgG0.0
0.5
1.0
1.5
7. n
ap
on
mé
rt
job
b é
s b
al
talp
hő
mé
rsé
kle
t
kü
lön
bs
ég
e (
°C)
0
5
10
15
20
25
30
35
400. nap 6. nap
Fiz. só Fiz.só EgészségesIgG
EgészségesIgG
CRPSIgG
CRPSIgG
Ág
asko
dáso
k s
zám
a
33. ábra A humán IgG kezelés és a plantáris bőr-izom incízió következtében kialakuló viselkedésbeli
eltérések valamint a testsúly változásai. Az ábra A része az első két szériában vizsgált emelkedő
hőmérsékletű forró lappal mért fájdalmas hőküszöböt, a B rész a jeges vízből való lábkihúzási
latenciaidőkkel jellemzett hideg érzékenységet mutatja a két első széria kivételével az összes vizsgálati
71
csoportban, míg a C rész az első 2 széria érintett végtagon mért spontán nehézkedését ábrázolja. A D
grafikon a kísérlet 0. és 6. napján open field tesztben mért ágaskodások számát szemlélteti, míg az E
grafikonon a kontakthőmérővel a 7. napon mért talphőmérsékleti különbségek (abszolút értékű különbségek
a műtött és kezeletlen talpak között) látszanak. Az F grafikon a kísérlet során naponta megmért testsúly
változásait szemlélteti. Az adatok átlagait a standard hibákkal együtt ábrázoltuk.
Lábhomogenizátumokban mért gyulladásos neuropeptidek és citokinek
koncentrációja
Az intakt lábak homogenizátumaiból meghatározott SP immunreaktivitásban nem találtunk
szignifikáns különbséget a csoportok között. Incízió hatására a 8. napon kivett mintákban
nagymértékben megemelkedett a SP koncentráció mindhárom csoportban a kontroll lábhoz
viszonyítva, ugyanakkor a műtött lábból mért a SP koncentráció a CRPS IgG-vel kezelt
csoportban szignifikánsan magasabb volt az egészséges IgG-vel kezelt állatokhoz képest
(34. A ábra, CRPS csoport: 30,3 + 9,3 fmol/mg, egészséges csoport: 22,9 + 6 fmol/mg,
átlag különbség: 7,5 fmol / mg, a különbség 95%-os konfidencia intervalluma: 2,8-12,1
fmol/mg, p <0,001 egyutas ANOVA Bonferroni post hoc teszttel). Ezzel szemben a CGRP
immunoreaktivitás nem változott sem az incízió, sem pedig az IgG kezelések hatására (34.
B ábra). Az IL-1béta, IL-6 illetve TNF-alfa koncentrációi nem különböztek az egyes
kezelési csoportok között (34. C-E ábra).
Potenciálisan befolyásoló tényezők
A kísérletsorozat során vizsgált betegek közül az egyik kísérőbetegségként
pikkelysömörben (arthritis psoriatica) szenvedett (4. táblázat), mely ugyan fájdalommal
járó, de nem autoantitestek által mediált megbetegedés. Összességében a 6 vizsgált beteg
többé-kevésbé eltérő etiológiai tényezői és klinikai jellegzetességei ellenére a 6
egérkísérlet-sorozat eredményeiben jelentős különbségeket nem tapasztaltunk.
72
0
5
10
15
20
25
30
35
40
intakt műtőtt
SP
##
***+++
###
#
Fiziológiás
sóoldat
Egészséges
IgGCRPS
IgG
Fiziológiás
sóoldat
Egészséges
IgGCRPS
IgG
P-a
ny
ag
(S
P)
ko
nc
en
trá
ció
(fm
ol/m
g)
CGRP
0
5
10
15
20
25
30
35
40
intakt műtött
Fiziológiás
sóoldat
Egészséges
IgGCRPS
IgGFiziológiás
sóoldat
Egészséges
IgGCRPS
IgG
CG
RP
ko
nc
en
trá
ció
(fm
ol/m
g)
IL-1
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
intakt műtött
Fiziológiás
sóoldat
Egészséges
IgGCRPS
IgG
Fiziológiás
sóoldat
Egészséges
IgG
CRPS
IgG
pg
/1m
g n
ed
ve
s s
zö
ve
t
IL-6
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
intakt műtött
Fiziológiás
sóoldat
Egészséges
IgGCRPS
IgG
Fiziológiás
sóoldat
Egészséges
IgG
CRPS
IgG
pg
/1m
g n
ed
ve
s s
zö
ve
t
TNF-
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
intakt műtött
Fiziológiás
sóoldat
Egészséges
IgGCRPS
IgG
Fiziológiás
sóoldat
Egészséges
IgG
CRPS
IgG
pg
/1m
g n
ed
ve
s s
zö
ve
t
A B
C D
E
34. ábra A humán IgG kezelés hatásai szenzoros neuropeptidek és gyulladásos citokinek hátsó lábakban
mért koncentrációira. A műtét utáni 8. napon a szöveti P-anyag (SP; A ) és kalcitonin gén- rokon peptid
(CGRP; B) koncentrációit a hátsó lábak homogenizátumaiból vizsgáltuk rádióimmunesszé módszerrel. Míg
az interleukin 1-béta (IL-1β; C), interleukin-6 (IL-6; D) és tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-α; E)
koncentrációit Luminex módszerrel és/vagy enzim-kötött immunspecifikus módszerrel (ELISA) határoztuk
meg ugyanazon mintákból. Az oszlopok a koncentrációk átlagait jelölik a standard hibával együtt, ahol n=
30-37 egér/ kezelés (SP, CGRP, TNF- α) és n= 6-13 egér/ kezelés (IL-1β, IL-6). # p <0,05, ## p <0,01, ### p
<0,001 vs. a megfelelő intakt láb,*** p <0,001vs. Egészséges IgG kezelés és +++ p <0,001vs. fiziológiás
sóoldat a kezelt lábon vizsgálva (kétutas ANOVA Bonferroni post hoc teszttel).
73
MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK
Elsőként igazoltuk, hogy mikrosérülést követően kialakuló CPRS legjelentősebb klinikai
tünetei (perzisztáló fájdalom/hiperalgézia, ödéma) a betegek tisztított IgG frakcióival,
passzív transzferrel átvihetők egerekbe. A CRPS-ben szenvedő betegek a kiváltó trauma
után nem sokkal, tipikusan erős fájdalomról illetve jelentős, a végtagot érintő különböző
kóros változásokról számolnak be. A betegek többsége viszonylag hamar spontán gyógyul,
míg az esetek körülbelül 15 %-ban a tünetek krónikussá válnak (Birklein és mtsai. 2004, de
MM és mtsai. 2009), a fájdalom perzisztál, a kezdeti végtag-elváltozások, mint pl. az
ödéma, fokozódik. Egérmodellünk is jellemzően ez utóbbi mintázatot követi. A kapott
eredmények arra utalnak, hogy a CRPS-es megbetegedésekben az autoantitestek fontos
szerepet játszanak. Az ínciziós műtét nélküli passzív transzferes kezelés korábban közölt
irodalmi adataihoz hasonlóan, jelenlegi kísérleteinkben is minden funcionális eltérés
viszonylag gyorsan, a 8. napra normalizálódott, amely az egereknek beadott humán IgG
metabolizmusával magyarázható (Goebel és mtsai. 2005). Ennek kivédésére a 7. illetve 8.
napon alkalmazott újbóli IgG-kezelés jó megoldásnak ígérkezik, azonban ehhez szükség
lenne mind a rendelkezésre álló szérum mennyiségének növelésére, vagy kiegészítő
ciklofoszfamid kezelésre, mely mérsékli az ismeretlen immunmechanizmusok
következtében kialakuló szérumbetegséget (Bucley és mtsai. 2005).
A hideg hiperalgézia feltehetően elsősorban a perifériás idegvégződések szenzibilizációja
révén alakul ki, míg a mechanikai hiperalgézia kialakulásában centrális szenzibilizációs
mechanizmusok is játszanak fontos szerepet (Meyer 2006). Bár a hideg hiperalgéziában az
egyes csoportok között nem volt különbség, a mechanikai hiperalgézia súlyosbodott a
CRPS- IgG-vel kezelt állatokban. Ennek oka feltehetően az, hogy a centrális szenzitizáció
is szerepet játszhat a CRPS IgG által közvetített mechanikai hiperalgézia súlyosságának
kialakításában. A centrális szenzitizáció, perifériás trauma által kiváltott érzékenység-
fokozódás a hátsó gyöki primér szenzoros neuronokban és a gerincvelői szekunder érző-
idegsejtekben, melynek következtében perifériás hiperérzékenység alakul ki (Latremoliere
és Woolf 2009). Scherer és mtsai. 2010-ben publikált eredménye, hogy plantáris inciziót
követően nem változott egerekben a hidegérzékenység, ha az állatokat 0°C-os lapra
állították és a lábnyalási latenciaidejőt vizsgálták. Ezzel szemben mia kísérleteink során
erős posztoperatív hideg hiperalgéziát detektáltunk. Az eltérő eredmények magyarázata az
lehet, hogy a műtőtt láb 0°C-os vízbe merítésekor sokkal nagyobb terület válik érintetté,
mint a hideg lapon, ahol csak a talp van kitéve a stimulusnak. Mivel hidegtolerancia-
74
csökkenés a CRPS kezeléstől függetlenül jelentkeztek, nem tekinthetők a CRPS-transzfer
következményének.
Kollaborátorunk (Goebel és mtsai. 2011) intakt egreken mért korábbi eredményeivel
szemben az open field tesztben nem találtunk lényeges eltérést az egyes vizsgált csoportok
között, melynek oka az lehet, hogy a 6. posztoperatív napon a kiváltott végtag trauma még
jelentős befolyásoló hatást gyakorolt a viselkedési paraméterekre.
A funkcionális eredmények mellett további jelentős megállapítás, hogy a humán
megbetegedéssel párhuzamban (Weber és mtsai. 2001) szignifikáns emelkedést
tapasztaltunk a gyulladáskeltő szenzoros neuropeptid, a SP, szöveti koncentrációjában a
CRPS-kezelést kapott állatok műtött lábában az incízió utáni 8. napon. Ezzel szemben a
CGRP, TNF-alfa, IL-1-béta és IL-6 koncentrációi nem változtak az intakt állapothoz
viszonyítva ellentétben a CRPS szindrómában szenvedő betegek bőr mintájának
vizsgálatával (Weber és mtsai. 2001, Huygen és mtsai. 2002) és azon állatmodellek
eredményeivel, melyeknél a trauma létrehozásához csonttörést alkalmaztak (Sahbaie és
mtsai. 2009, Wei és mtsai. 2012). Míg a CGRP főként szenzoros neuronális eredetű (Brain
és mtsai. 2006), addig a SP, a kapszaicin érzékeny peptiderg afferensek mellett
immunsejtekben is megtalálható (Howard 2008). E két peptid csak részben ko-
lokalizálódik a szenzoros idegvégződésekben (Schulze és mtsai. 1997). Mivel azonban a
funkcionális eltérések többsége a mintavétel (8. nap) idejére normalizálódott (31. és 32.
ábra), lehetséges, hogy a CGRP és a citokinek koncentrációi is emelkedtek a kísérlet
korábbi időpontjában. Más csoportok korábban közölt adatai szerint, a plantáris incízió
modelljében (IgG transzfer nélkül) a SP-nek alapvető szerepe van a hiperalgézia
fenntartásában: SP génhiányos egerekben incízió után csökkent mértékű mechanikai
hiperalgéziát detektáltak vad típusú kontrolljaikhoz viszonyítva (Sahbaie és mtsai. 2009).
A megfigyelt CRPS IgG hatások és a SP hatásai közti kölcsönhatások tisztázására további
vizsgálatok szükségesek.
Eredményeink legnagyobb jelentősége, hogy elsőként sikerült olyan jól reprodukálható,
megbízható egérmodellt kidolgoznunk, amelyben mind a végtag sérülése, mind aspecifikus
IgG autoantitestek jelen vannak, a humán betegséghez hasonlóan. Emberi CRPS IgG
hatására sikerült kimutatnunk egerekben a legjelentősebb klinikai eltéréseket (fájdalom,
duzzadás), a P-anyagot fontos pathofiziológiai tényezőként azonosítottuk. Modellünk
egyik korlátozó tényezője, hogy a CRPS klinikai kórképét teljes mértékben nem tudtuk
reprodukálni. Ilyen tünet például, a humán CRPS megbetegedésre jellemző változó
75
hőmérsékleti különbség az érintett és az ép végtag között, melyet részben a szimpatikus
diszfunkció okoz (Krumova és mtsai. 2008). Önmagában csak a hiperalgézia és ödéma
súlyosbodása, melyet modellünkben is tapasztaltunk, még nem elégítené ki szükségszerűen
a CRPS Nemzetközi Fájdalom Társaság (IASP) által 2010-ben megállapított diagnosztikus
kritériumait (Harden és mtsai. 2010). Ugyan modellünk nem képes az összes humán CRPS
tünetet utánozni, azonban ezek kialakulásában is összetett mechanizmusok (Goebel és
mtsai. 2011, Marinus és mtsai. 2011), illetve más klinikai tünetek esetében egymással
össze nem függő mechanizmusok sorozata játszhat szerepet. Azonkívül, mivel ebben az
első kísérletsorozatban nem volt lehetőségünk a fenotípusosan eltérő klinikai tüneteket
mutató páciensekből (pl. mechanikai hiperalgéziával rendelkező, illetve nem rendelkező)
vett szérum IgG-k hatásainak összehasonlítására, nem vonható le messzemenő
következtetés azzal kapcsolatban, hogy az adott páciensek klinikai tünetei korrelálnak-e az
állatoknál tapasztalt funkcionális és viselkedésbeli eltérésekkel. A modell
használhatóságának gyakorlati korlátja az a viszonylag rövid „időablak”, melyben a
szignifikánsan emelkedett mechanikai hiperalgézia vagy lábduzzadás jelen van. Erre
vonatkozóan a közeljövőben 14 napos kísérletsorozatokat indítunk naponta történő IgG
adással.
A patogén antitestek epitóp specifitása egyelőre ismeretlen, és további kutatást igényel.
Eredményeink klinikai szempontból is meghatározóak, mivel igazolhatják a hosszantartó
CRPS egyik fontos terápiás lehetőségét, az autoantitestek plazmaferezissel való
eltávolítását. A modell lehetőséget nyújt a betegség pontos mechanizmusainak feltárására
kulcsmediátorok és célmolekuláik azonosítására, mely új gyógyszerfejlesztési
perspektívákat is nyithat.
76
AZ ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA
PhD munkám során a fájdalomban szerepet játszó mechanizmusok komplex állatkísérletes
vizsgálatára törekedtem. A disszertációban bemutatott legfontosabb új eredményeim,
megállapításaim a következők:
1. Kísérleteinkben a két TRPV1 receptor agonista (kapszaicin és RTX) intraplantáris
adása után több napon keresztül mindkét hőmérsékleti tartományban meghatároztuk azt a
pontos küszöbhőmérsékletet, melynél az állatok nocifenzív reakciót mutattak. A
hidegtartományban mért küszöbértékek gyorsabban normalizálódtak a fájdalmas hőküszöb
értékeknél. E változások a TRPV1 receptort expresszáló szenzoros neuronok perifériás
végződéseinek reverzibilis deszenzibilizációját jelzik, mely felelős a fájdalmas hő, illetve
hideg által kiváltott válaszok elmaradásáért. Kis dózisú RTX illetve OLDA adásakor a
TRPV1 receptor deszenzibilizálódott, az érzőideg-végződés funkciójának károsodása
nélkül, hiszen a TRPA1 receptor agonista formalin képest volt hatást kifejteni. A
deszenzibilizáció mindkét típusa nagy jelentőséggel bír a periférián ható új típusú
analgetikumok kifejlesztése szempontjából. Az idegvégződés deszenzibilizációja a
fájdalomcsillapítás terén már kiaknázásra került, viszont az általunk alkalmazott fájdalmas
küszöbhőmérséklet mérésen alapuló technika a jövőben új in vivo preklinikai szűrő
módszerként szolgálhat.
2. Adatokat szolgáltattunk különböző gyógyszercégek által kifejlesztett három TRPV1
antagonista hatásainak közvetlen összehasonlításáról, új fájdalmas hőküszöbmérő és a
tradicionális elhárító reakciók latenciaidejének mérésén alapuló módszerekkel.
Eredményeink alapján elmondható, hogy a nociceptív hőküszöbcsökkenés RTX adás,
enyhe hőtrauma vagy sebészi talpincízió után TRPV1 receptor aktiváción keresztül valósul
meg, mely jól mérhető, nagyfokú érzékenységet mutat a vizsgált TRPV1 antagonistákkal
szemben. A nociceptív hőküszöbök vizsgálatára az emelkedő hőmérsékletű vízfürdő
megbízhatóan müködő, érzékenyebb módszernek bizonyult a hagyományos latenciaidő
mérésen alapuló Plantar Test készülékhez képest.
3. Kimutattuk, hogy a farkon mért fájdalmas hőküszöb értékek a TRPV1 génhiányos
egerekben szignifikánsan magasabbak voltak vad típusú megfelelőikhez képest, míg a
77
talpon nem volt különbség. Ez azt jelenti, hogy a korábbi adatokkal ellentétben a TRPV1
receptor szerepet játszik a forró ingerek detektálásában, legalábbis az egerek farkán. A
mustárolajjal kiváltott gyulladásos termális hiperalgézia a TRPV1 génhiányos egerekben
mindkét testtájon, míg a mechanikai hiperalgézia csak a lábon csökkent szignifikánsan.
TRPA1 receptor hiánya esetén egyik testtájon sem detektáltunk különbséget. Az akut
nocifenzív reakció latenciaidejének vizsgálata során TRPA1 és a TRPV1 génhiányos
egerek is később mutattak elhárító reakciót vad típusú társaikhoz képest. Ezek alapján
feltételezhető, hogy a TRPA1 agonista mustárolaj nem szelektív a TRPA1 receptorra,
hanem a TRPV1 receptort is képes aktiválni. Ez utóbbi mechanizmus közvetítheti a
gyulladásos hiperalgéziát és szerepet játszhat a nocifenzív reakcióban is.
4. Elsőként dolgoztunk ki egy megbízható passzív-transzfer-trauma modellt CRPS
vizsgálatára, melyben a páciensekből származó tisztított szérum IgG intraperitoneális
kezelésével váltottuk ki egerekben a humán megbetegedés legfontosabb klinikai tüneteit.
Eredményeink igazolták az IgG antitestek meghatározó szerepét a CRPS
pathomechanizmusában. Egérmodellünk lehetőséget teremt a folyamatok kísérletes
vizsgálatára, kulcsmediátorok és célmolekuláig azonosítására, amely új gyógyszerek
kifejlesztéséhez is segítséget nyújthat.
78
IRODALOMJEGYZÉK
Almási R, Pethö G, Bölcskei K, Szolcsányi J. (2003). Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold
temperature in the rat: a novel heat allodynia model sensitive to analgesics. Br. J. Pharmacol. 139, 49–58.
Alpizar YA, Boonen B, Gees M, Sanchez A, Nilius B, Voets T, Talavera K. (2014). Allyl isothiocyanate
sensitizes TRPV1 to heat stimulation. Pflugers Arch. 466(3):507-15. doi: 10.1007/s00424-013-1334-9.
Anhalt GJ, Labib RS, Voorhees JJ, Beals TF, Diaz LA. (1982). Induction of pemphigus in neonatal mice by
passive transfer of IgG from patients with the disease. The New England Journal of medicine; 306,
(20):1189-1196.
Atkinson TJ, Fudin J, Pandula A, Mirza M. (2013). Medication pain management in the elderly: unique and
underutilized analgesic treatment options. Clin Ther. (11):1669-89. doi: 10.1016/j.clinthera.
Bandell M, Story GM, Hwang SW, Viswanath V, Eid SR, Petrus MJ, Earley TJ, Patapoutian A. (2004).
Noxious cold ion channel TRPA1 is activated by pungent compounds and bradykinin. Neuron 41: 849–857.
Banik, RK, Brennan, TJ.( 2009). Trpv1 mediates spontaneous firing and heat sensitization of cutaneous
primary afferents after plantar incision. Pain 141, 41–51.
Banik RK, Woo YC, Park SS, Brennan TJ. (2006). Strain and sex influence on pain sensitivity after plantar
incision in the mouse. Anesthesiology; 105 (6):1246-1253.
Bautista DM, Jordt SE, Nikai T, Tsuruda PR, Read AJ, Poblete J, Yamoah EN, Basbaum AI, Julius D.
(2006.) TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents. Cell.
24;124(6):1269-82.
Bessac BF, Jordt SE. (2008a). Breathtaking TRP channels: TRPA1 and TRPV1 in airway chemosensation
and reflex control. Physiology (Bethesda). 23:360-70. doi: 10.1152/physiol.00026.2008.
Bessac BF, Sivula M, von Hehn CA, Escalera J, Cohn L, Jordt SE. (2008b). TRPA1 is a major oxidant
sensor in murine airway sensory neurons. J Clin Invest 118: 1899–1910.
Bevan S, Andersson DA. (2009). TRP channel antagonists for pain--opportunities beyond TRPV1. Curr
Opin Investig Drugs.10(7):655-63.
Bevan S, Szolcsányi J. (1990). Sensory neuron-specific actions of capsaicin: mechanisms and applications.
Trends in Pharmacological Sciences 11: 330-333.
79
Bánvölgyi A, Pozsgai G, Brain SD, Helyes ZS, Szolcsányi J, Ghosh M, Melegh B, Pintér E. (2004). Mustard
oil induces a transient receptor potential vanilloid 1 receptor-independent neurogenic inflammation and a
non-neurogenic cellular inflammatory component in mice. Neuroscience. (2):449-59.
Bhave G, Zhu W, Wang H, Brasier DJ, Oxford GS, Gereau RW. (2002). cAMP dependent protein kinase
regulates desensitization of the capsaicin receptor (VR1) by direct phosphorylation. Neuron 35, 721–731.
Birklein F, Riedl B, Sieweke N, Weber M, Neundorfer B. (2000/4). Neurological findings in complex
regional pain syndromes--analysis of 145 cases. Acta NeurolScand; 101(4):262-269.
Bishnoi M, Premkumar LS. (2011). Possible consequences of blocking transient receptor potential vanilloid.
Curr Pharm Biotechnol. 12(1):102-14.
Bittner MA, Lahann TR. (1984). Biphasic time-course of capsaicin-induced substance P depletion: failure to
correlate with thermal analgesia in the rat. Brain Res. 322:305–9.
Blaes F, Tschernatsch M, Braeu ME, Matz O, Schmitz K, Nascimento D, Kaps M, Birklein F. (2007).
Autoimmunity in complex-regional pain syndrome. Ann N Y Acad Sci. 1107:168-73.
Brain SD, Cox HM. (2006). Neuropeptides and their receptors: innovative science providing novel
therapeutic targets. British Journal of Pharmacology; 147 Suppl 1: S202-211.
Brederson JD, Kym PR, Szallasi A. (2013). Targeting TRP channels for pain relief. Eur J Pharmacol. 716
(1-3):61-76. doi: 10.1016/j.ejphar.2013.03.003.
Brennan TJ, Vandermeulen EP, Gebhart GF. (1996). Characterization of a rat model of incisional pain.
Pain. 64(3):493-501.
Bölcskei K, Horváth D, Szolcsányi J, Pethö G. (2007). Heat injury-induced drop of the noxious heat
threshold measured with an increasing-temperature water bath: a novel rat thermal hyperalgesia model. Eur.
J. Pharmacol. 564, 80–87.
Bölcskei K, Helyes Z, Szabó A, Sándor K, Elekes K, Németh J, Almási R, Pintér E, Pethő G, Szolcsányi J.
(2005). Investigation of the role of TRPV1 receptors in acute and chronic nociceptive processes using gene-
deficient mice. Pain. 117(3):368-376.
Buckley C, Vincent A. (2005). Autoimmune channelopathies. NatClinPractNeurol. 1(1):22-33.
Buitrago M.M., J.B. Shulz, J. Dichgans, A.R. Luft. (2004). Short and long-term motor skill learning in an
accelerated rotarod training paradigm. Neurobiol. Learn. Mem. 81(3): 211-6.
80
Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius D. (1997). The capsaicin
receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389: 816-824.
Caterina MJ, Leffler A, Malmberg AB, Martin WJ, Trafton J, Petersen-Zeitz KR, Koltzenburg M, Basbaum
AI, Julius D. (2000). Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science.
288, 306–313.
Chen HS, He X, Wang Y, Wen WW, You HJ, Arendt-Nielsen L. (2007). Roles of capsaicinsensitive primary
afferents in differential rat models of inflammatory pain: a systematic comparative study in conscious rats.
Exp Neurol. 204:244–51.
Chu CJ, Huang SM, De Petrocellis L, Bisogno T, Ewing SA, Miller JD, Zipkin RE, Daddario N, Appendino
G, Di Marzo V, Walker JM. (2003). Noleoyldopamine, a novel endogenous capsaicin-like lipid that produces
hyperalgesia. J Biol Chem. 278:13633–9.
Davis JB, Gray J, Gunthorpe MJ, Hatcher JP, Davey PT, Overend P, Harries MH, Latchman J, Clapham C,
Atkinson K, Hughes SA, Rance K, Grau E, Harper AJ, Pugh PA, Rogers DC, Bingham S, Randall A,
Sheardown AS. (2000). Vanilloid receptor-1 is essential for inflammatory thermal hyperalgesia. Nature. 405,
183–187.
Dai Y, Wang S, Tominaga M, Yamamoto S, Fukuoka T, Higashi T. (2007). Sensitization of TRPA1 by
PAR2 contributes to the sensation of inflammatory pain. J Clin Invest 117: 1979–1987.
Davis KD, Pope GE. (2002). Noxious cold evokes multiple sensations with distinct time courses. Pain.
98:179–85.
Dray A, Bettaney J, Forster P. (1990). Resiniferatoxin, a potent capsaicin-like stimulator of peripheral
nociceptors in the neonatal rat tail in vitro. Br J Pharmacol. 99:323–6.
de M Mos, de Bruijn AG, Huygen FJ, Dieleman JP, Stricker BH, Sturkenboom MC. (2007). The incidence
of complex regional pain syndrome: a population-based study. Pain. 129:12–20.
de M M, Huygen FJ, Hoeven-Borgman M, Dieleman JP, Ch Stricker BH, Sturkenboom MC. (2009).
Outcome of the complex regional pain syndrome. Clin. J. Pain. 25(7):590-597.
Dux M, Sann H, Schemann M, Jancsó G. (1999). Changes in fibre populations of the rat hairy skin following
selective chemodenervation by capsaicin. Cell Tissue Res. 296:471–7.
Eddy N.B, Leimbach D. (1953). Synthetic analgesics II. Dithienylbutenyl and dithienylbutylamines J.
Pharmacol. Exp. Ther, 45, p. 339.
81
Everaerts W, Gees M, Alpizar YA, Farre R, Leten C, Apetrei A, Dewachter I, van Leuven F, Vennekens
R, De Ridder D, Nilius B, Voets T, Talavera K. (2011). The capsaicin receptor TRPV1 is a crucial mediator
of the noxious effects of mustard oil. Curr Biol. 21(4):316-21.
Fernandes ES, Fernandes MA, Keeble JE. (2012). The functions of TRPA1 and TRPV1: moving away from
sensory nerves. Br J Pharmacol. 166(2):510-21.
Fernandes ES, Russell FA, Spina D, McDougall JJ, Graepel R, Gentry C, Staniland AA, Mountford DM,
Keeble JE, Malcangio M, Bevan S, Brain SD. (2011). A distinct role for transient receptor potential ankyrin
1, in addition to transient receptor potential vanilloid 1, in tumor necrosis factor α-induced inflammatory
hyperalgesia and Freund's complete adjuvant-induced monarthritis. Arthritis Rheum. (3):819-29. doi:
10.1002/art.30150.
Füredi R, Bölcskei K, Szolcsányi J, Pethő G. (2009). Effects of analgesics on the plantar incision-induced
drop of the noxious heat threshold measured with an increasingtemperature water bath in the rat. Eur. J.
Pharmacol. 605, 63–67.
Füredi R, Bölcskei K, Szolcsányi J, Pethő G. (2010). Comparison of the peripheral mediator background of
heat injury- and plantar incision-induced drop of the noxious heat threshold in the rat. Life Sci. 86, 244–250.
Gallowitsch-Puertaa M, Pavlova V. (2007). Neuro-immune interactions via the cholinergic anti-
inflammatory pathway. Life Sciences. 80. 24–25. 2325–2329.
Gamse R. (1982). Capsaicin and nociception in the rat and mouse. Possible role of substance P. Naunyn
Schmiedebergs Arch Pharmacol. 320:205–16.
Gaszner B, Kormos V, Kozicz T, Hashimoto H, Reglodi D, Helyes Z. (2012). The behavioral phenotype of
pituitary adenylate–cyclase activating polypeptide-deficient mice in anxiety and depression tests is
accompanied by blunted c-Fos expression in the bed nucleus of the stria terminalis, central projecting
Edinger–Westphal nucleus, ventral lateral septum, and dorsal raphe nucleus. Neuroscience. pp. 283–299.
Gavva NR, Tamir R, Qu Y, Klionsky L, Zhang TJ, Immke D, Wang J, Zhu D, Vanderah TW, Porreca F,
Doherty EM, Norman MH, Wild KD, Bannon AW, Louis JC, Treanor JJ. (2005). AMG 9810 [(E)-3-(4-t-
butylphenyl)-N-(2, 3 dihydrobenzo[b][1, 4] dioxin-6-yl)acrylamide], a novel vanilloid receptor 1 (TRPV1)
antagonist with antihyperalgesic properties. J. Pharmacol. Exp. Ther. 313, 474–484.
Gavva NR, Bannon AW, Surapaneni S, Hovland Jr, DN Lehto SG, Gore A, Juan T, Deng H, Han B,
Klionsky L, Kuang R, Le A, Tamir R, Wang J, Youngblood B, Zhu D, Norman MH, Magal E, Treanor JJ,
82
Louis JC. (2007). The vanilloid receptor TRPV1 is tonically activated in vivo and involved in body
temperature regulation. J. Neurosci. 27, 3366–3374.
Gavva NR, Treanor JJ, Garami A, Fang L, Surapaneni S, Akrami A, Alvarez F, Bak A, Darling M, Gore A,
Jang GR, Kesslak JP, Ni L, Norman MH, Palluconi G, Rose MJ, Salfi M, Tan E, Romanovsky AA,
Banfield C, Davar G. (2008). Pharmacological blockade of the vanilloid receptor TRPV1 elicitsmarked
hyperthermia in humans. Pain 136, 202–210.
Gees M1, Alpizar YA, Boonen B, Sanchez A, Everaerts W, Segal A, Xue F, Janssens A, Owsianik G, Nilius
B, Voets T, Talavera K. (2013). Mechanisms of transient receptor potential vanilloid 1 activation and
sensitization by allyl isothiocyanate. Mol Pharmacol. 84(3):325-34. doi: 10.1124/mol.113.085548.
Geppetti P, Nassini R, Materazzi S, Benemei S. (2008). The concept of neurogenic inflammation. BJU
Int.;101 Suppl 3:2-6. doi: 10.1111/j.1464-410X.2008.07493.x. Review.
Gierthmuhlen J, Maier C, Baron R, Tolle T, Treede RD, Birbaumer N, Huge V, Koroschetz J, Krumova
EK, Lauchart M, Maihofner C, Richter H, Westermann A. (2012). Sensory signs in complex regional pain
syndrome and peripheral nerve injury. Pain. 153(4):765-774.
Goebel A. (2011).Complex regional pain syndrome in adults. Rheumatology (Oxford) 50(10):1739-1750.
Goebel A, Baranowski AP, Maurer K, Ghiai A, McCabe C, Ambler G. (2010). Intravenous Immunoglobulin
Treatment of Complex Regional Pain Syndrome: A Randomized Trial. AnnInternMed. 152(3):152-158.
Goebel A, Leite MI, Yang L, Deacon R, Cendan CM, Fox-Lewis A, Vincent A. (2011). The passive transfer
of immunoglobulin G serum antibodies from patients with longstanding Complex Regional Pain Syndrome.
Eur J Pain 15(5):504 e501-506.
Goebel A, Misbah, S., McKiver, K., Haynes, L., Burton, J., Philips, C., Frank, B., Poole, H. (2013).
Immunoglobulin Maintenance Therapy in Lonstanding Complex Regional Pain Syndrome. Rheumatology
(Oxford). 52(11):2091-3. doi: 10.1093/rheumatology/ket282.
Goebel A, Stock M, Deacon R, Sprotte G, Vincent A. (2005). Intravenous immunoglobulin response and
evidence for pathogenic antibodies in a case of complex regional pain syndrome 1. AnnNeurol 3;57(3):463-
464.
Gu Q, Lin RL. (2010). Heavy metals zinc, cadmium, and copper stimulate pulmonary sensory neurons via
direct activation of TRPA1. J Appl Physiol 108: 891–897.
83
Gunthorpe MJ, Benham CD, Randall A, Davis JB. (2002). The diversity in the vanilloid (TRPV) receptor
family of ion channels. Trends Pharmacol Sci. 23: 183-191.
Guo TZ, Offley SC, Boyd EA, Jacobs CR, Kingery WS. (2004). Substance P signaling contributes to the
vascular and nociceptive abnormalities observed in a tibial fracture rat model of complex regional pain
syndrome type I. Pain. 108(1-2):95-107.
Harden RN, Bruehl S, Perez RS, Birklein F, Marinus J, Maihofner C, Lubenow T, Buvanendran A, Mackey
S, Graciosa J, Mogilevski M, Ramsden C, Chont M, Vatine JJ. (2010). Validation of proposed diagnostic
criteria (the "Budapest Criteria") for Complex Regional Pain Syndrome. Pain. 8; 150 (2):268-274.
Hargreaves K, Dubner R, Brown F, Flores C, Joris J. (1988). A new and sensitivemethod for measuring
thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain 32, 77–88.
Hayes AG, Tyers MB. (1980). Effects of capsaicin on nociceptive heat, pressure and chemical thresholds
and on substance P levels in the rat. Brain. Res.189:561–4.
Helyes Zs, Pintér E, Németh J, Szolcsányi J. (2003). Pharmacological targets for the inhibition of neurogenic
inflammation. Anti-Inflammatory and Anti-Allergy Agents in Curr. Med. Chem. 2: 191-218.
Hinman A, Chuang HH, Bautista DM, Julius D. (2006). TRP channel activation by reversible covalent
modification. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103(51):19564-8.
Hoffmann T, Kistner K, Miermeister F, Winkelmann R, Wittmann J, Fischer MJ, Weidner C, Reeh PW.
(2013). TRPA1 and TRPV1 are differentially involved in heat nociception of mice. Eur J Pain. May 29. doi:
10.1002/j.1532-2149.2013.00331.
Holzer P. (1991). Capsaicin: cellular targets, mechanisms of action, and selectivity for thin sensory neurons.
Pharmacol. Rev. 43: 143-201.
Holzer P. (2008). The pharmacological challenge to tame the transient receptor potential vanilloid-1
(TRPV1) nocisensor. Br. J. Pharmacol. 155, 1145–1162.
Honoré P, Wismer CT, Mikusa J, Zhu CZ, Zhong C, Gauvin DM, Gomtsyan AE, Kouhen R, Lee CH, Marsh
K, Sullivan JP, Faltynek CR, Jarvis MF. (2005). A- 425619 [1-isoquinolin-5-yl-3-(4-trifluoromethyl-benzyl)-
urea], a novel transient receptor potential type V1 receptor antagonist, relieves pathophysiological pain
associated with inflammation and tissue injury in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 314, 410–421.
84
Honoré P, Chandran P, Hernandez G, Gauvin DM, Mikusa JP, Zhong C, Joshi SK, Ghilardi JR, Sevcik MA,
Fryer RM, Segreti JA, Banfor PN, Marsh K, Neelands T, Bayburt E, Daanen JF, Gomtsyan A, Lee CH, Kort
ME, Reilly RM, Surowy CS, Howard MR, Millward-Sadler SJ, Vasilliou AS, Salter DM, Quinn JP. (2008).
Mechanical stimulation induces preprotachykinin gene expression in osteoarthritic chondrocytes which is
correlated with modulation of the transcription factor neuron restrictive silence factor. Neuropeptides. 42(5-
6):681-686.
Hőgyes E (1878). Beitrage zur physiologischen Wirkung der Bestandsteile de capsicum anuum. Archiv für
Experimentelle Pathologie und Pharmakologie 9: 117-130.
Hu H, Bandell M, Petrus MJ, Zhu MX, Patapoutian A. (2009). Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion
channels. Nat Chem Biol 5: 183–190.
Huygen FJ, De Bruijn AG, De Bruin MT, Groeneweg JG, Klein J, Zijistra FJ. (2002). Evidence for local
inflammation in complex regional pain syndrome type 1. MediatorsInflamm. 11(1):47-51.
Immke DC, Gavva NR. (2006). The TRPV1 receptor and nociception. Semin Cell Dev Biol. 17:582–91.
Inoue K, Koizumi S, Fuziwara S, Denda S, Inoue K, Denda M. (2002). Functional vanilloid receptors in
cultured normal human epidermal keratinocytes. Biochem Biophys Res Commun. 291(1):124-9.
Jaquemar D, Schenker T, Trueb B. (1999). An ankyrin-like protein with transmembrane domains is
specifically lost after oncogenic transformation of human fibroblasts. J Biol Chem. 274(11):7325-33.
Jancsó N, Jancsó-Gábor A, Szolcsányi J. (1967). Direct evidence for neurogenic inflammation and its
prevention by denervation and by pretreatment with capsaicin. British Journal of Pharmacology 31: 138-151.
Jancsó N. (1960). Role of nerve terminals in the mechanism of inflammatory reactions. Bull. Millard
Fillmore Hosp. Buffalo N.Y. 7: 53-77.
Jordt SE, Bautista DM, Chuang HH, McKemy DD, Zygmunt PM, Högestätt ED, Meng ID, Julius D. (2004).
Mustard oils and cannabinoids excite sensory nerve fibres through the TRP channel ANKTM1. Nature 427:
260–265.
Julius D. (1997). Another opiate for the masses? Nature. 386 (6624):442.
Jung SR, Kim MH, Hille B, Nguyen TD, Koh DS. (2004). Regulation of exocytosis by purinergic receptors
in pancreatic duct epithelial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 286(3):C573-9.
85
Karai L, Brown DC, Mannes AJ, Connelly ST, Brown J, Gandal M, Wellisch OM, Neubert JK, Olah
Z, Iadarola MJ. (2004). Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control.
J Clin Invest.113:1344–52.
Kingery WS. (2010). Role of neuropeptide, cytokine, and growth factor signaling in complex regional pain
syndrome. Pain Med.11(8):1239-1250.
Kohr D, Singh P, Tschernatsch M, Kaps M, Pouokam E, Diener M, Kummer W, Birklein F, Vincent A,
Goebel A, Wallukat G, Blaes F. (2011). Autoimmunity against the beta(2) adrenergic receptor and
muscarinic-2 receptor in complex regional pain syndrome. Pain. 152(12):2690-2700.
Krumova EK, Frettloh J, Klauenberg S, Richter H, Wasner G, Maier C. (2008). Long-term skin temperature
measurements - a practical diagnostic tool in complex regional pain syndrome. Pain. 140(1):8-22.
Kuner R, (2007). Genetic approaches for the study of pain. in: Zhuo M, Gebrhardt GF editors. Molecular
Pain. Vol.1. Higher education Press. p. 235-244.
Kym PR, Mantyh PW, Sullivan JP, Jarvis MF, Faltynek CR. (2009). Repeated dosing of ABT-102, a potent
and selective TRPV1 antagonist, enhances TRPV1-mediated analgesic activity in rodents, but attenuates
antagonist-induced hyperthermia. Pain. 142, 27–35.
Kwan KY, Allchorne AJ, Vollrath MA, Christensen AP, Zhang DS, Woolf CJ, Corey DP. (2006).
TRPA1 contributes to cold, mechanical, and chemical nociception but is not essential for hair-cell
transduction. Neuron. 20;50(2):277-89.
Latremoliere A, Woolf CJ. (2009). Central sensitization: a generator of pain hypersensitivity by central
neural plasticity. J Pain. 10(9):895-926.
Lehto SG, Tamir R, Deng H, Klionsky L, Kuang R, Le A, Lee D, Louis JC, Magal E, Manning BH, Rubino
J, Surapaneni S, Tamayo N, Wang T, Wang J, Wang J, Wang W, Youngblood B, Zhang M, Zhu D, Norman
MH, Gavva NR. (2008). Antihyperalgesic effects of (R, E)-N-(2-hydroxy-2, 3-dihydro-1H-inden-4-yl)-3- (2-
(piperidin-1-yl)-4-(trifluoromethyl)phenyl)-acrylamide (AMG8562), a novel transient receptor potential
vanilloid type 1 modulator that does not cause hyperthermia in rats. J. Pharmacol. Exp. Ther. 326, 218–229.
Leem JW, Willis WD, Chung JM. (1993). Cutaneous sensory receptors in the rat foot. J Neurophysiol.
69:1684 99.
Levine JD, Collier DH, Basbaum AI, Moskowitz MA, Helms CA. (1986). Hypothesis: the nervous system
may contribute to the pathophysiology of rheumatoid arthritis. J Rheumatol 12: 406-11.
86
Liu L, Oortgiesen M, Li L, Simon SA. (2001). Capsaicin inhibits activation of voltage-gated sodium currents
in capsaicin-sensitive trigeminal ganglion neurons. J Neurophysiol. 85:745–58.
Macpherson LJ, Hwang SW, Miyamoto T, Dubin AE, Patapoutian A, Story GM. (2006). More than cool:
promiscuous relationships ofmenthol and other sensory compounds. Mol. Cell. Neurosci. 32:335–343.
Macpherson LJ, Geierstanger BH, Viswanath V, Bandell M, Eid SR, Hwang S, Patapoutian A. (2005). The
pungency of garlic: activation of TRPA1 and TRPV1 in response to allicin. Curr. Biol. 15: 929–934.
Maggi CA, Bevan S, Walpole CS, Rang HP, Giuliani S. (1993). A comparison of capsazepine and ruthenium
red as capsaicin antagonists in the rat isolated urinary bladder and vas deferens. Br. J.
Pharmacol. 108(3):801-5.
Marinus J, Moseley GL, Birklein F, Baron R, Maihofner C, Kingery WS, Van Hilten JJ. (2011). Clinical
features and pathophysiology of complex regional pain syndrome. Lancet Neurol.10(7):637-648.
McKemy DD, Neuhausser WM, Julius D. (2002). Identification of a cold receptor reveals a general role for
TRP channels in thermosensation. Nature. 416:52–8.
McNamara CR, Mandel-Brehm J, Bautista DM, Siemens J, Deranian KL, Zhao M, Hayward NJ, Chong JA,
Julius D, Moran MM, Fanger CM. (2007). TRPA1 mediates formalin-induced pain. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 104(33):13525-30.
Merskey & Bogduk (Eds.) (1994). Classification of Chronic Pain. Seattle: IASP Task Force on Taxonomy
Messeguer A, Planells-Cases R, Ferrer-Montiel A. (2006). Physiology and pharmacology of the vanilloid
receptor. Curr. Neuropharmacol. (1):1-15.
Mezei M, Pénzes I. (2002) Megelőzhető-e az akut fájdalom krónikusáá válása? Hippocrates. IV. évf. 4.
szám.
Meyer RA, Ringkamp, M., Campbell, J.N, Raja, S.N. (2006). Peripheral mechanisms of cutaneous
nociception. In: SB McMahon, Kotzenburg, M., editor. Textbook of Pain. Amsterdam: Elsevier. pp. 3-33.
Miyamoto R, Otsuguro K, Ito S. (2011). Time- and concentration-dependent activation of TRPA1 by
hydrogen sulfide in rat DRG neurons. Neurosci Lett. 499(2):137-42.
Moriyama T, Higashi T, Togashi K, Iida T, Segi E, Sugimoto Y, Tominaga T, Narumiya S, Tominaga M.
(2005). Sensitization of TRPV1 by EP1 and IP reveals peripheral nociceptive mechanism of prostaglandins.
Mol. Pain 1, 3.
87
Mousa SA, Zhang Q, Sitte N, Ji R, Stein C. (2001). Beta-endorphin-containing memory-cells and mu-opioid
receptors undergo transport to peripheral inflamed tissue. J. Neuroimmunol. 115:71-78.
Nagata K, Duggan A, Kumar G, García-Añoveros J. (2005). Nociceptor and hair cell transducer properties
of TRPA1, a channel for pain and hearing. J. Neurosci. 25(16):4052-61.
Nemeth J, Gorcs T, Helyes Z, Oroszi G, Kocsy T, Pinter E, Szolcsanyi J. (1998). Development of a new
sensitive CGRP radioimmunoassay for neuropharmacological research. Neurobiology (Bp). (4):473-475.
Nemeth J, Oroszi G, Than M, Helyes ZS, Pinter E, Farkas B, Szolcsanyi J. (1999). Substance P
radioimmunoassay for quantitative characterization of sensory neurotransmitter release. Neurobiology (Bp).
7(4):437-444.
Neubert JK, Karai L, Jun JH, Kim HS, Olah Z, Iadarola MJ. (2003). Peripherally induced resiniferatoxin
analgesia. Pain. 104:219–28.
Nolano M, Simone DA, Wendelschafer-Crabb G, Johnson T, Hazen E, Kennedy WR. (1999). Topical
capsaicin in humans: parallel loss of epidermal nerve fibers and pain sensation. Pain. 81:135–45.
Obál Jr F, Benedek G, Jancsó-Gábor A, Obál F. (1979). Salivary cooling, escape reaction and heat pain in
capsaicin-desensitized rats. Pflügers Arch. 382:249–54.
Obata K, Katsura H, Mizushima T, Yamanaka H, Kobayashi K, Dai Y, Fukuoka T, Tokunaga A, Tominaga
M, Noguchi K. (2005). TRPA1 induced in sensory neurons contributes to cold hyperalgesia after
inflammation and nerve injury. J. Clin. Invest. 115(9):2393-401.
O'Callaghan JP, Holzman SG. (1975). Quantification of the analgesic activity of narcotic antagonists by a
modified hot plate procedure. J. Pharmacol. Exp. Ther. 192: 497-505.
Pan HL, Khan GM, Alloway KD, Chen SR. (2003). Resiniferatoxin induces paradoxical changes in thermal
and mechanical sensitivities in rats: mechanism of action. J Neurosci. 23. 2911–9.
Peier AM, Moqrich A, Hergarden AC, Reeve AJ, Andersson DA, Story GM, Earley TJ, Dragoni I, McIntyre
P, Bevan S, Patapoutian A. (2002). A TRP channel that senses cold stimuli and menthol. Cell. 108:705–15.
Pecze L, Pelsoczi P, Kecskés M, Winter Z, Papp A, Kaszás K, Letoha T, Vizler C,. Oláh Z. (2009).
Resiniferatoxin mediated ablation of TRPV1+ neurons removes TRPA1 as well. Can. J. Neurol. Sci. 234–
141.
88
Pingle SC, Matta JA, Ahern GP. (2007). Capsaicin receptor: TRPV1 a promiscuous TRP channel. Handbook
of Experimental Pharmacolog. 179:155-171.
Pizziketti RJ, Pressman NS, Geller EB, Cowan A, Adler MW. (1985). Rat cold water tail-flick: a novel
analgesic test that distinguishes opioid agonists from mixed agonist-antagonists. European Journal of
Pharmacology. 119(1-2):23-29.
Pogatzki-Zahn EM, Shimizu I, Caterina M, Raja SN. (2005). Heat hyperalgesia after incision requires
TRPV1 and is distinct from pure inflammatory pain. Pain. 115, 296–307.
Pogatzki-Zahn EM, Zahn PK, Brennan TJ. (2007). Postoperative pain--clinical implications of basic
research. Best Practice & Research Clin. Anaesthesiology; 21 (1):3-13.
Pomonis JD, Harrison JE, Mark L, Bristol DR, Valenzano KJ, Walker K. (2003.) N-(4- tertiarybutylphenyl)-
4-(3-cholorphyridin-2-yl) tetrahydropyrazine-1(2H)-carboxamide BCTC), a novel, orally effective vanilloid
receptor 1 antagonist with analgesic properties: II. In vivo characterization in ratmodels of inflammatory and
neuropathic pain. J. Pharmacol. Exp. Ther. 306, 387–393.
Premkumar LS, Ahern GP. (2000). Induction of vanilloid receptor channel activity by protein kinase C.
Nature 408, 985–990.
Ralevic V, Jerman JC, Brough SJ, Davis JB, Egerton J, Smart D. (2003). Pharmacology of vanilloids at
recombinant and endogenous rat vanilloid receptors. Biochem. Pharmacol. 65:143–51.
Rami HK, Thompson M, Stemp G, Fell S, Jerman JC, Stevens AJ, Smart D, Sargent B, Sanderson D,
Randall AD, Gunthorpe MJ, Davis JB. (2006). Discovery of SB-705498: a potent, selective and orally
bioavailable TRPV1 antagonist suitable for clinical development. Bioorg. Med. Chem. Lett. 16, 3287–3291.
Rose NR, Bona C. (1993). Defining criteria for autoimmune diseases (Witebsky's postulates revisited).
Immunol.Today. 9;14(9):426-430.
Salas MM, Hargreaves KM, Akopian AN. (2009). TRPA1-mediated responses in trigeminal sensory
neurons: interaction between TRPA1 and TRPV1. Eur. J. Neurosci. (8):1568-78.
Sahbaie P, Shi X, Guo TZ, Qiao Y, Yeomans DC, Kingery WS, Clark JD. (2009). Role of substance P
signaling in enhanced nociceptive sensitization and local cytokine production after incision. Pain.145(3):341-
349.
Scherer M, Reichl SU, Augustin M, Pogatzki-Zahn EM, Zahn PK. (2010). The assessment of cold
hyperalgesia after an incision. Anesthesia and analgesia. 110(1):222-227.
89
Schulze E, Witt M, Fink T, Hofer A, Funk RH. (1997). Immunohistochemical detection of human skin nerve
fibers. Acta histochemica. 99(3):301-309.
Sawada Y, Hosokawa H, Matsumura K, Kobayashi S. (2008). Activation of transient receptor potential
ankyrin 1 by hydrogen peroxide. Eur J Neurosci. 27(5):1131-42.
Simone DA, Nolano M, Johnson T, Wendelschafer-Crabb G, Kennedy WR. (1998). Intradermal injection of
capsaicin in humans produces degeneration and subsequent reinnervation of epidermal nerve fibers:
correlation with sensory function. J Neurosci. 18:8947–59.
Simone DA, Cajander KC. (1996). Excitation of rat cutaneous nociceptors by noxious cold. Neurosci Lett.
213. 53–6.
Staud R, Craggs JG, Robinson ME, Perlstein WM, Price DD. (2007). Brain activity related to temporal
summation of C-fiber evoked pain. Pain. 129(1-2):130-42.
Stein C, Hassan AH, Przewłocki R, Gramsch C, Peter K, Herz A. (1990). Opioids from immunocytes
interact with receptors on sensory nerves to inhibit nociception in inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87, 5935-5939.
Story GM, Peier AM, Reeve AJ, Eid SR, Mosbacher J, Hricik TR, Earley TJ, Hergarden AC, Andersson
DA, Hwang SW, McIntyre P, Jegla T, Bevan S, Patapoutian A. (2003). ANKTM1, a TRP like channel
expressed in nociceptive neurons, is activated by cold temperatures. Cell. 112:819–29.
Sugiura T, Tominaga M, Katsuya H, Mizumura K. (2002). Bradykinin lowers the threshold temperature for
heat activation of vanilloid receptor 1. J. Neurophysiol. 88, 544–548.
Szabo A, Helyes Z, Sandor K, Bite A, Pinter E, Nemeth J, Banvolgyi A, Bolcskei K, Elekes K, Szolcsanyi J.
(2005). Role of transient receptor potential vanilloid 1 receptors in adjuvant-induced chronic arthritis: in vivo
study using gene-deficient mice. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 314(1):111-
119.
Szallasi A, Szabó T, Bíró T, Modarres S, Blumberg PM, Krause JE, Cortright DN, Appendino G. (1999).
Resiniferatoxin-type phorboid vanilloids display capsaicin-like selectivity at native vanilloid receptors on rat
DRG neurons and at the cloned vanilloid receptor VR1. Br J Pharmacol. 128(2):428-34.
Szallasi A, Cortright DN, Blum CA, Eid SR. (2007). The vanilloid receptor TRPV1: 10 years from channel
cloning to antagonist proof-of-concept. Nat. Rev. Drug Discov. 6(5):357-72.
90
Szallasi A, Joo F, Blumberg PM. (1989). Duration of desensitization and ultrastructural changes in dorsal
root ganglia in rats treated with resiniferatoxin, an ultrapotent capsaicin analog. Brain Res. 503(1):68-72.
Szolcsányi J. (2008). Hot target on nociceptors: perspectives, caveats and unique features. Br. J. Pharmacol.
155, 1142–1144.
Szolcsányi J, Sándor Z, Petho G, Varga A, Bölcskei K, Almási R, Riedl Z, Hajos G, Czéh G. (2004). Direct
evidence for activation and desensitization of the capsaicin receptor by Noleoyldopamine on TRPV1-
transfected cell, line in gene deleted mice and in the rat. Neurosci Letter. 361:155–8.
Szolcsányi J, Helyes Zs, Oroszi G, Németh J, Pintér E. (1998a). Release of somatostatin and its role in the
mediation of the anti-inflammatory effect induced by antidromic stimulation of sensory fibres of rat sciatic
nerve. British Journal of Pharmacology. 123: 936-942.
Szolcsányi J, Pintér E, Helyes Zs, Oroszi G, Németh J. (1998b). Systemic anti-inflammatory effect induced
by counter-irritation through a local release of somatostatin from nociceptors. British Journal of
Pharmacology 125: 916-922.
Szolcsányi J. (1993). Actions of capsaicin on sensory receptors. In: Wood J, editor. Capsaicin in the Study of
Pain. London: Academic Press. p. 1–26.
Szolcsanyi J, Szallasi A, Szallasi Z, Joo F, Blumberg PM. (1990). Resiniferatoxin: an ultrapotent selective
modulator of capsaicin-sensitive primary afferent neurons. J Pharmacol Exp Ther. 255(2):923-8.
Szolcsányi J. (1988). Antidromic vasodilatation and neurogenic inflammation. Agents Actions. 23: 4-11.
Szolcsányi J. (1987). Selective responsiveness of polymodal nociceptors of the rabbit ear to capsaicin,
bradykinin and ultra-violet irradiation. J Physiol (Lond). 388:9–23.
Szolcsányi J. (1985). Sensory receptors and the antinociceptive effects of capsaicin. In: Hakanson R, Sundler
F, editors. Tachykinin Antagonists. Amsterdam: Elsevier. p45–54.
Szolcsányi J. (1984a.) Capsaicin and neurogenic inflammation: history and early findings. In: Antidromic
Vasodilatation and Neurogenic Inflammation (eds: Chahl LA, Szolcsányi J, Lembeck F), pp. 7-26,
Akadémiai Kiadó, Budapest.
Szolcsányi J. (1984b). Capsaicin-sensitive chemoceptive neural system with dual sensoryefferent function.
In: Antidromic Vasodilatation and Neurogenic Inflammation (eds: Chahl LA, Szolcsányi J, Lembeck F), pp.
27-53, Akadémiai Kiadó, Budapest.
91
Szolcsányi J, Jancsó-Gábor A. (1976). Sensory effects of capsaicin congeners II: Importance of chemical
structure and pungency in desensitizing activity of capsaicin type compounds. Arzneimittelforschung. 26: 33-
37.
Szolcsányi J, Jancsó-Gábor A. (1975). Sensory effects of capsaicin congeners I: Relationship between
chemical structure and pain-producing potency of pungent agents. Arzneimittelforschung. 25: 1877-1881.
Tajti J, Vécsei L. (2006). Mozgásszervi megbetegedéseket utánzó neuropátiás fájdalmak patomechanizmusa
és terápiája. Magyar Tudomány 167: 1191-1196.
Taylor-Clark TE, Undem BJ, Macglashan DW Jr, Ghatta S, Carr MJ, McAlexander MA. (2008).
Prostaglandin-induced activation of nociceptive neurons via direct interaction with transient receptor
potential A1 (TRPA1). Mol Pharmacol 73: 274–281.
Teeling JL, Felton LM, Deacon RM, Cunningham C, Rawlins JN, Perry VH. (2007). Sub-pyrogenic
systemic inflammation impacts on brain and behavior, independent of cytokines. Brain Behav.Immun.
21(6):836-850.
Tominaga M, Caterina MJ, Malmberg AB, Rosen TA, Gilbert H, Skinner K, Raumann, B.E., Basbaum,
A.I., Julius, D. (1998). The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-producing stimuli. Neuron.
21:531-543.
Toyka KV, Brachman DB, Pestronk A, Kao I. (1975). Myasthenia gravis: passive transfer from man to
mouse. Science. 190. (4212):397-399.
Trevisani M, Gatti R. (2013). TRPV1 Antagonists as Analgesic Agents. The Open Pain Journal. 108-118.
Trevisani M, Siemens J, Materazzi S, Bautista DM, Nassini R, Campi B, Imamachi N, Andrè E, Patacchini
R, Cottrell GS, Gatti R, Basbaum AI, Bunnett NW,Julius D, Geppetti P. (2007). 4-Hydroxynonenal, an
endogenous aldehyde, causes pain and neurogenic inflammation through activation of the irritant receptor
TRPA1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:13519–13524.
Varga A, Bölcskei K, Szőke É, Almási R, Czéh G, Szolcsányi J, Pethő G. (2006). Relative roles of protein
kinase A and protein kinase C in modulation of transient receptor potential vanilloid type 1 receptor
responsiveness in rat sensory neurons in vitro and peripheral nociceptors in vivo. Neuroscience 140, 645–
657.
Vellani V, Mapplebeck S, Moriondo A, Davis JB, McNaughton PA. (2001). Protein kinase C activation
potentiates gating of the vanilloid receptor VR1 by capsaicin, protons, heat and anandamide. J. Physiol. 534,
813–825.
92
Xu XJ, Farkas-Szállási T, Lundberg JM, Hökfelt T, Wiesenfeld-Hallin Z, Szállási A. (1997). Effects of the
capsaicin analogue resiniferatoxin on spinal nociceptive mechanisms in the rat: behavioral,
electrophysiological and in situ hybridization studies. Brain Res.752:52–60.
Walker KM, Urban L, Medhurst SJ, Patel S, Panesar M, Fox AJ, McIntyre P. (2003). The VR1 antagonist
capsazepine reverses mechanical hyperalgesia in models of inflammatory and neuropathic pain. J.
Pharmacol. Exp. Ther. 304, 56–62.
Walpole CS, Bevan S, Bovermann G, Boelsterli JJ, Breckenridge R, Davies JW, Hughes GA, James
I, Oberer L, Winter J. (1994). The discovery of capsazepine, the first competitive antagonist of the sensory
neuron excitants capsaicin and resiniferatoxin. J Med Chem. 37(13):1942-54.
Weber M, Birklein F, Neundorfer B, Schmelz M. (2001). Facilitated neurogenic inflammation in complex
regional pain syndrome. Pain. 91(3):251-257.
Wei T, Guo TZ, Li WW, Hou S, Kingery WS, Clark JD. (2012). Keratinocyte expression of inflammatory
mediators plays a crucial role in substance P-induced acute and chronic pain. Journal of Neuroinflammation.
9:181.
Weil A, Moore SE, Waite NJ, Randall A, Guntrope MJ. (2005). Conservation of functional and
pharmacological properties in the distantly related temperature sensors TRPV1 and TRPM8 . Mol.
Pharmacol. 68(2): 518-27.
Woodbury CJ, Zwick M, Wang S, Lawson JJ, Caterina MJ, Koltzenburg M, Albers KM, Koerber
HR, Davis BM. (2004). Nociceptors lacking TRPV1 and TRPV2 have normal heat responses. J Neurosci.
24:6410–5.
Wu C, Gavva NR, Brennan TJ. (2008). Effect of AMG0347, a transient receptor potentialtype V1 receptor
antagonist, and morphine on pain behavior after plantar incision. Anesthesiology 108, 1100–1108.
Zimmermann M. (1983). Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals.
Pain 16, 109–110.
Zimmermann K, Leffler A, Fischer MM, Messlinger K, Nau C, Reeh PW. (2005). The TRPV1/2/3 activator
2-aminoethoxydiphenyl borate sensitizes native nociceptive neurons to heat in wildtype but not TRPV1
deficient mice. Neuroscience 135, 1277–1284.
93
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Ezúton szeretném kifejezni köszönetemet mindazoknak, aki az eltelt évek során segítették
a munkámat.
Köszönöm témavezetőimnek, dr. Helyes Zsuzsanna és dr. Pethő Gábor professzoroknak,
hogy bevezettek a kutatás világába, szakmai felkészültségükkel, lelkesedésükkel és
precizitásukkal mutatva jó és követendő példát.
Köszönettel tartozom dr. Bölcskei Katának, akihez mind a kísérletes munka során, mind
pedig az értekezés készítésekor mindig bizalommal fordulhattam. Hálával tartozom dr.
Pintér Erika és dr. Szolcsányi János professzoroknak, akik rendkivül magasszintű szakmai
tanácsaikkal folyamatosan segítették munkámat.
Köszönöm „szobatársaimnak” dr. Borbély Évának és dr. Hajna Zsófiának, hogy
barátságukkal, lelkesedésükkel és szakmai tanácsaikkal folyamatosan inspiráltak és jobb
teljesítményre ösztökéltek.
Köszönöm a kísérletek során nyújtott nélkülözhetetlen segítséget Ömböliné Dórának,
Góglné Katinak, Zádor Csillának, Bagoly Teréznek, Zöldhegyi Máriának, dr. Scheich
Bálintnak, dr. Markovics Adriennek, dr. Kemény Ágnesnek, dr. Botz Bálintnak, Boros
Melindának és diákköröseimnek Horváth Ádámnak és Kóger Tamásnak.
Köszönöm dr. Andreas Goebelnek a komplex regionális fájdalom szindrómával
kapcsolatos kooperációt.
Köszönöm a „volt Richteres” kollegáimnak dr. Szőke Évának, dr. Sándor Zoltánnak, dr.
Tóth Dániel Mártonnak és dr. Dézsi Lászlónak, hogy mindig számíthattam szakmai
tanácsaikra.
Továbbá köszönettel tartozom a Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet összes
munkatársának.
Végül, de nem utolsó sorban köszönöm családom támogatását, férjem türelmét és mindazt
a szeretetet, amit tőlük kaptam.
94
Publikációs lista
Értekezés alapjául szolgáló eredeti közlemények:
Valéria Tékus, Zsófia Hajna, Éva Borbély, Adrienn Markovics, Teréz Bagoly, János Szolcsányi, Victoria
Thompson, Ágnes Kemény, Zsuzsanna Helyes, Andreas Goebel: A CRPS-IgG-transfer-trauma model
reproducing inflammatory and positive sensory signs associated with Complex Regional Pain Syndrome.
Pain. 2014 Feb; 155 (2):299-308. doi: 10.1016/j.pain.2013.10.011. Epub 2013 Oct 18. (IF:5,644)
Tékus V., Bölcskei K., Kis-Varga A., Dézsi L., Szentirmay E., Visegrády A., Horváth C., Szolcsányi J.,
Pethő G.: Effect of transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) receptor antagonist compounds
SB705498, BCTC and AMG9810 in rat models of thermal hyperalgesia measured with an increasing-
temperature water bath.
Eur. J. Pharmacol. 641(2-3), 2010, 135-141. (IF: 2.737 FC:4)
Bölcskei K., Tékus V., Dézsi L., Szolcsányi J., Pethő G.: Antinociceptive desensitizing actions of TRPV1
receptor agonists capsaicin, resiniferatoxin and N-oleoyldopamine as measured by determination of the
noxious heat and cold thresholds in the rat.
Eur. J. Pain 14 (5), 2010, 480-486. (IF:3.819 FC:3) (megosztott első szerző)
Az értekezés alapját képező publikációk kumulatív impact faktora: 12,2
Független citációk száma: 7
Egyéb teljes közlemények:
de Oliveira C, Garami A, Lehto SG, Pakai E, Tekus V, Pohoczky K, Youngblood BD, Wang W, Kort
ME, Kym PR, Pinter E, Gavva NR, Romanovsky AA.: Transient receptor potential channel ankyrin-1 is not
a cold sensor for autonomic thermoregulation in rodents.
J. Neurosci. 2014 Mar 26;34 (13):4445-52. doi: 10.1523/JNEUROSCI.5387-13.2014. (IF: 7,271; FC:0)
Helyes Zs., Sándor K., Borbély É., Tékus V., Pintér E., Elekes K., Tóth D.M., Szolcsányi J., J.J. McDougall:
Involvement of Transient Receptor Potential Vanilloid 1 receptors in Protease-Activated Receptor 2-induced
joint inflammation and nociception.
Eur. J. Pain 14(4), 2010, 351-358. (IF: 3.819; FC: 7)
Elekes K., Helyes Zs., Kereskai L., Sándor K., Pintér E., Pozsgai G., Tékus V., Bánvölgyi Á., Németh J.,
Szűts T., Kéri Gy., Szolcsányi J.: Inhibitory effects of synthetic somatostatin receptor subtype 4 agonists on
acute and chronic airway inflammation and hyperreactivity in the mouse. Eur. J. Pharmacol. 578(2-3), 2008,
313-322. (IF:2,787, FC:14)
95
Az értekezés alapját képező konferencia-prezentációk:
Valéria Tékus, Hajna Zsófia, Borbély Éva, Markovics Adrienn, Bagoly Teréz, Szolcsányi János, Thompson
Victoria, Kemény Ágnes, Andreas Goebel, Zsuzsanna Helyes: Passive- transfer-trauma model for the
Complex Regional Pain Syndrome (CRPS) in mice
II. Pécs-Oklahoma Szimpózium, Pécs, 2013. (előadás)
Hajna Zsófia, Valéria Tékus, Borbély Éva, Markovics Adrienn, Bagoly Teréz, Szolcsányi János, Thompson
Victoria, Kemény Ágnes, Andreas Goebel, Zsuzsanna Helyes: Passive- transfer-trauma model for the
Complex Regional Pain Syndrome (CRPS) in mice
Neuroinflammation Crongess, Prága, 2013. (poszter)
Valéria Tékus, Hajna Zsófia, Borbély Éva, Markovics Adrienn, Bagoly Teréz, Szolcsányi János, Thompson
Victoria, Kemény Ágnes, Andreas Goebel, Zsuzsanna Helyes: Passive- transfer-trauma model for the
Complex Regional Pain Syndrome (CRPS) in mice
From Bionics to Medicine 1st European Ph.D. Conference Budapest, 2013. (poszter)
Tékus Valéria, Kóger Tamás, Scheich Bálint, Hajna Zsófia Pintér, Erika, Szolcsányi János, Helyes
Zsuzsanna: A Tranziens Receptor Potenciál Ankyrin 1 (TRPA1) ioncsatorna szerepe fájdalomérző
folyamatokban
Magyar Élettani Társaság, a Magyar Anatómusok Társasága, a Magyar Biofizikai Társaság és a Magyar
Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Kongresszusa, Budapest, 2013. (előadás)
Zsuzsanna Helyes, Valéria Tékus, Hajna Zsófia, Borbély Éva, Markovics Adrienn, Bagoly Teréz,
Szolcsányi János, Thompson Victoria, Kemény Ágnes, Andreas Goebel: A komplex regionális fájdalom
szindróma (CRPS) passzív transzfer-trauma egérmodellje
Magyar Élettani Társaság, a Magyar Anatómusok Társasága, a Magyar Biofizikai Társaság és a Magyar
Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Kongresszusa, Budapest, 2013. (poszter)
Valéria Tékus, Tamás Kóger, Bálint Scheich, Zsófia Hajna, Éva Borbély, Erika Pintér, János Szolcsányi,
Zsuzsanna Helyes: Role of the Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) ion channel in nociceptive
processes
10th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the Summer Neuropeptide Conference, Gdynia
2013. (poszter)
Valéria Tékus, Bálint Scheich, Tamás Kóger, Ádám Horváth, Zsófia Hajna, Éva Borbély, Erika Pintér,
János Szolcsányi, Zsuzsanna Helyes: Role of Transient Receptor Ankyrin 1 ( TRPA1) ion channel in
nociceptive processes
Magyar Idegtudományi Társaság XIV. Konferenciája, 2013. Budapest (poszter)
96
Tékus V., Helyes Z., Hajna Z., Horváth Á,, Kun J., Bölcskei K., Pintér E., Szolcsányi J.:
Transient Receptor Potential Vanilloid (TRPV1), but not Ankyrin 1 (TRPA1) ion channels mediate mustard
oil-induced hyperalgesia in mice
I. International Doctoral Workshop of Natural Sciences 2012. Pécs (előadás)
Tékus, V, Hajna, Z, Horváth, A, Kun J, Bölcskei, K, Szolcsányi, J and Helyes Z. :
Role of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 and Ankyrin 1 (TRPV1 and TRPA1) ion channels in
thermonociception in mice
IBRO International Workshop 2012. Szeged, Hungary (poszter)
Tékus, V, Helyes Z., Hajna, Z, Horváth, A, Kun J, Bölcskei, K, Pintér E. Szolcsányi, J:
Involvement of Transient Receptor Vanilloid 1 (TRPV1) but not Ankyrin 1 (TRPA1) ion channels in
mustard oil-induced hyperalgesia in the mouse
9th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the Summer Neuropeptide Conference, London
2012. (poszter)
Bölcskei Kata, Tékus Valéria, Pethő Gábor, Szolcsányi János: A termonocicepció új állatkísérletes
vizsgálómódszerei: a magatartási nociceptív hőküszöb mérése
Magyar Élettani Társaság, a Magyar Anatómusok Társasága, a Magyar Biofizikai Társaság és a Magyar
Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Kongresszusa, Debrecen, 2012. (előadás)
Valéria Tékus, Kata Bölcskei, Ágnes Kis-Varga, László Dézsi, Csilla Horváth, Gábor Pethő, János
Szolcsányi: Antihyperalgesic effect of Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1) receptor
antagonists SB705498, BCTC, AMG9810 in the rat measured with an increasing-temperature water bath
IBRO International Workshop, Pécs, 2010. (poszter)
Gábor Pethő, Kata Bölcskei, Valéria Tékus, Ágnes Kis-Varga, László Dézsi, Csilla Horváth, János
Szolcsányi: Models for screening in rats the effects of TRPV1 receptor antagonists on thermal hyperalgesia
and thermoregulation
WorldPharma, Copenhagen, 2010. (poszter)
Valéria Tékus, Kata Bölcskei, László Dézsi, János Szolcsányi: Effects of the TRPV1 receptor antagonists
SB705498, BCTC, AMG9810 in rat models of thermal hyperalgesia using noxious heat threshold
measurements
12th World Congress of Pain, Glasgow, 2008 (poszter)
97
Dézsi László, Bölcskei Kata, Tékus Valéria, Szolcsányi János: Kapszaicin (TRPV1) receptor blokkolók
hatása a nociceptív hőküszöbre patkány termális hiperalgézia modellekben
Gyógyszerkémiai és Gyógyszertechnológiai Szimpózium, 2008. Zalakaros (előadás)
Dézsi László, Bölcskei Kata, Sándor Zoltán, Tékus Valéria, Szőke Éva, Tóth Dániel Márton és Szolcsányi
János: Kísérletes mérési módszerek alkalmazása a fájdalomcsillapítók kutatásában
In: Proc. of BUDAMED '08 14. MATE, 5 MEDING Orvostechnikai Konferencia, 2008. Budapest
Valéria Tékus, Kata Bölcskei, László Dézsi, János Szolcsányi: Effects of the TRPV1 receptor antagonists
SB705498, BCTC, AMG9810 in rat models of thermal hyperalgesia using noxious heat threshold
measurements
Richter Gedeon Kutatási Fórum, Visegrád 2008. (poszter)
Tékus Valéria, Dézsi László, Bölcskei Kata, Szolcsányi János: TRPV1 receptor antagonisták hatása a
fájdalmas hőküszöbre patkány termális hiperalgézia modellekben MKKFT-MÉT Vándorgyűlés, Debrecen
2008. (poszter)
Tékus Valéria, Bölcskei Kata, Tóth Dániel Márton, Dézsi László, Szolcsányi János: Az SB705498 TRPV1
receptor antagonista vegyület hatásai patkány in vivo nociceptív modellekben. Magyarországi Fájdalom
Társaság Konferenciája, Kecskemét, 2007. (poszter)
Dézsi László, Bölcskei Kata, Tékus Valéria, Tóth Dániel Márton, Horváth Csilla,Pethő Gábor, Szolcsányi
János: Kísérleti módszerek kapszaicin érzékenyreceptorok által közvetített fájdalom vizsgálatára.
Gyógyszerkémiai és Gyógyszertechnológiai Szimpózium, Eger, 2007. (előadás)
Dézsi László, Tékus Valéria, Tóth Dániel Márton, Bölcskei Kata, Horváth Csilla, Pethő Gábor és
Szolcsányi János: Nocicepció vizsgálata patkány in vivo modelleken a PTE-RG Analgetikum
Kutatólaboratóriumban
Richter Gedeon Kutatási Fórum, Dobogókő, 2007. (előadás)
Egyéb konferencia-prezentációk:
Bálint Scheich, Viktória Kormos, Valéria Tékus, Zsófia Hajna, Balázs Gaszner, Kristóf László, László
Lénárd, Erika Pintér, János Szolcsányi, Zsuzsanna Helyes
Functional and immunocytochemical evidence for anxiolytic and antidepressant actions of somatostatin
receptor subtype 4 activation in mice Neuroinflammation Crongess, Prága, 2013. (poszter)
Pintér Erika, Hajna Zsófia, Szabadfi Krisztina, Gábriel Róbert, Balla Zsolt, Bíró Zsolt, Degrell Péter,
Kőszegi Tamás, Tékus Valéria, Helyes Zsuzsanna, Dobos András, Farkas Sándor, Szűcs Gyula: Az 1-es
98
típusú diabetes mellitus modellezése diabeteses neuropathia, nephropathia és szemelváltozások vizsgálatára
patkányban
Magyar Élettani Társaság, a Magyar Anatómusok Társasága, a Magyar Biofizikai Társaság és a Magyar
Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Kongresszusa, Budapest, 2013. (előadás)
Kemény Ágnes, Boros Melinda, Sétáló György, Tékus Valéria, Perkecz Anikó, Helyes Zsuzsanna: A
citokin profil változása monojód-acetáttal kiváltott izületi gyulladás modellben
Magyar Élettani Társaság, a Magyar Anatómusok Társasága, a Magyar Biofizikai Társaság és a Magyar
Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Kongresszusa, Budapest, 2013. (poszter)
Scheich Bálint, Kormos Viktória, Tékus Valéria, Hajna Zsófia, Gaszner Balázs, Pintér Erika, Szolcsányi
János, Helyes Zsuzsanna: Inhibitory function of Somatostatin Receptor Subtype 4 (sst4) in anxiety and
depression-like behaviours in the mouse
10th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the Summer Neuropeptide Conference, Gdynia
2013. (poszter)
Kemény Ágnes, Boros Melinda, Sétáló György, Tékus Valéria, Perkecz Anikó, Helyes Zsuzsanna: Changes
of cytokyne profile in monosodium-iodoacetate-induced joint inflammation in TRPA1 WT and KO mice
10th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the Summer Neuropeptide Conference, Gdynia
2013. (poszter)
Éva Borbély, Liza Nabi, Zsófia Hajna, Valéria Tékus, Kristóf László, Tamás Ollmann, Zoltán Karádi,
László Lénárd, John P.Quinn, Alexandra Berger, Christopher J Paige, Julie Keeble, János Szolcsányi, Erika
Pintér, Zsuzsanna Helyes: Role of Hemokinin-1 and NK1 receptors in anxiety, stress and depression-like
behaviour in mice
10th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the Summer Neuropeptide Conference, Gdynia
2013. (poszter)
Hajna Zsófia, Szitter István, Kemény Ágnes, Kereskai László, Tékus Valéria, Markovics Adrienn,
Szolcsányi János, Pintér Erika, Helyes Zsuzsanna: Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) receptor
plays a protective role in endotoxin-induced acute pneumonia, but not in smoking-related chronic bronchitis
of the mouse
10th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the Summer Neuropeptide Conference, Gdynia
2013. (poszter)
Zsófia Hajna, Éva Borbély, Valéria Tékus, István Tóth, Alexandra Berger, Christopher J. Paige, Erika
Pintér, József Kun, János Szolcsányi, Zsuzsanna Helyes: Hemokinin-1 induces hyperalgesia in inflammatory
and neuropathic pain models of the mouse
99
Magyar Idegtudományi Társaság XIV. Konferenciája, 2013. Budapest (poszter)
Éva Borbély, Zsófia Hajna, Lisa Nabi, Valéria Tékus, Kristóf László, Tamás Ollmann, Zoltán Karádi,
László Lénárd, John P. Quinn, Alexandra Berger, Christopher J. Paige, Julie Keeble, János Szolcsányi, Erika
Pintér, Zsuzsanna Helyes: Role of hemokinin-1 and NK1 receptors in anxiety, stress and depression-like
behaviour in mice
Magyar Idegtudományi Társaság XIV. Konferenciája, 2013. Budapest (poszter)
Bálint Scheich, Viktória Kormos, Valéria Tékus, Zsófia Hajna, Balázs Gasztner, Kristóf László, László
Lénárd, Erika Pintér, János Szolcsányi, Zsuzsanna Helyes: Funtional and immunochemical evidence for
anxiolytic and antidepressant actions of somatostatin receptor subtype 4 activation in mice
Magyar Idegtudományi Társaság XIV. Konferenciája, 2013. Budapest (poszter)
Sándor K., Tékus V., Pintér E., Elekes K., Tóth D.M., Szolcsányi J., J.J. McDougall, Helyes Zs.:
Involvement of Transient receptor potential vanilloid 1 receptors in proteinase-activated receptor 2-induced
joint inflammation and nociception. 30th Winter Neuropeptide Conference, Breckenridge, Colorado, USA,
2009 (poszter)
Dániel Márton Tóth, Éva Szőke, Kata Bölcskei, Valéria Tékus, László Dézsi, Zoltán Sándor, János
Szolcsányi: Inhibition of the expression of the rat TRPV1 receptor by RNA interference. European Opioid
Conference-European Neuropeptide Club, 2008, Ferrara (poszter)
Sándor Z, Tóth DM, Szőke É, Bölcskei K, Tékus V, Dézsi L, Szolcsányi J: RNS interferencia alkalmazása a
TRPV1 receptor kutatásában. A Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság és a MÉT LXXII.
Vándorgyűlése, Debrecen, Magyarország, 2008 (előadás)
Sándor Zoltán, Tóth Dániel Márton, Szőke Éva, Bölcskei Kata, Tékus Valéria, Dézsi László, Szolcsányi
János: RNS interferencia alkalmazása a TRPV1 receptor kutatásában.
A Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság és a MÉT LXXII. Vándorgyűlése, 2008, Debrecen
Tóth Dániel Márton, Szőke Éva, Bölcskei Kata, Tékus Valéria, Dézsi László, Sándor Zoltán, Szolcsányi
János: Patkány TRPV1 receptor expressziójának gátlása RNS interferenciával.
Membrán-transzport Konferencia, 2008, Sümeg
Tóth Dániel Márton, Szőke Éva, Bölcskei Kata, Tékus Valéria, Dézsi László, Sándor Zoltán, Szolcsányi
János: Patkány TRPV1 receptor expressziójánakgátlása RNS interferenciával.
A Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság és a MÉT LXXII. Vándorgyűlése, 2008, Debrecen
100
Idézhető absztraktok:
Tékus, V, Hajna, Z, Horváth, A, Kun J, Bölcskei, K, Szolcsányi, J and Helyes Z. :
Role of the Transient Receptor Potential Vanilloid 1 and Ankyrin 1 (TRPV1 and TRPA1) ion channels in
thermonociception in mice Clinical Neuroscience 2012; 65: (1). pp.68 (IF:1.247)
Scheich B, Kormos V, Tékus V, Hajna Z, Gaszner B, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Z: Somatostatin
receptor subtype 4 (sst4) plays an inhibitory role in anxiety and depression-like behaviours of mice
Clinical Neuroscience 2012; 65: (1). pp.57 (IF:1.247)
Pethő G, Bölcskei K, Tékus V, Dézsi L, Szolcsányi J. Antinociceptive desensitizing actions of TRPV1
receptor agonists capsaicin, resiniferatoxin and N-oleoyldopamine as measured by determination of the
noxious heat and cold thresholds in the rat.
Acta Physiol Hung 2010; 97:(1) pp. 129-130 (IF: 0.453)
Helyes Z, Sandor K, Tekus V, Pinter E, Elekes K, Toth DM, Szolcsanyi J, McDougall JJ
Involvement of TRPV1 receptors in protease-activated receptor 2-induced joint inflammation and
nociception NEUROPEPTIDES 43: (5)451 (2009) (IF:2.036)
Helyes Zs., Sándor K., Tékus V., Pintér E., Elekes K., Tóth D.M., Szolcsányi J., J.J. McDougall:
Involvement of TRPV1 receptors in protease-activated receptor 2-induced joint inflammation and
nociception. Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and Summer Neuropeptide Conference,
Salzburg, Austria, 2009 - absztrakt: Neuropeptides 43(5), p.451., 2009. (IF:2.438)
Tékus V, Dézsi L, Bölcskei K, Szolcsányi J.: Effects of TRPV1 receptor antagonists on the noxious heat
threshold in rat thermal hyperalgesia models. Acta Physiol Hung 96:(1), 2009. p. 68. (IF: 0.75)
Tóth DM, Szőke É, Bölcskei K, Tékus V, Dézsi L, Sándor Z, Szolcsányi J; Inhibition of the expression of
the rat TRPV1 receptor by RNA interference. A Magyar Kísérletes és Klinikai Farmakológiai Társaság és a
MÉT LXXII. Vándorgyűlése, Debrecen, Magyarország, 2008 (poszter). absztrakt: Acta Physiol Hung 2009,
96:(1): p.138 (IF: 0.75)
Dézsi L, Laszy J, Kocsis P, Bölcskei K, Tékus V, Tarnawa I, Gyertyán I, Szolcsányi J. Hippocampus-
dependent learning and cortical spreading depression unaffected by TRPV1 receptor.
Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and Summer Neuropeptide Conference, Salzburg, Austria,
2009 - absztrakt: Neuropeptides 2009; 43:(5) pp. 450-451 (IF: 2.036)
Az összes publikáció kumulatív impact factora: 26,077
Összes független citációk száma: 27