flowcytometry analysis 123

Flowcytometry Analysis 123

May 7, 2010

Morphology Flowcytometry

Flowcytometry step 1

3

PB/ 骨髓血 / 骨髓 / CSF/LNs…◦ 一般 3cc (heparin 綠頭管 )◦ 須打洞者，約 5cc

準備 mononuclear cells◦ < 方法一 > 加入 Ficoll 離心◦ < 方法二 > 加入 NH4Cl RBC lysis( 無核 RBC), wash

染色◦ PE 螢光強 , FITC 螢光弱 ( 所以想看什麼盡量用 PE)

福馬林固定上機 (BD Canto-II 可測 8+2 色螢光 )

◦ 一般收 10,000 events◦ MRD 收 100,000 events

Flow 上機前準備工作

4

需打洞打洞，染色，固定，約需 5cc 的血 Tissue flow:

◦ 花生大小，切片完盡速丟入 N/S 或 RPMI◦ 須加入 7AAD 辨認細胞 viability ( 染不上色為活細胞 )

細胞存活 :◦ PB/BM blood 可保存於室溫 72 小時◦ Tissue 可丟入 N/S 中，亦可丟入 RPMI 存活更久

Sorting:◦ 目前借用中研院的 sorter (Coulter)◦ Sorting 後的細胞為活細胞，可做 cytogenetic 、 FISH 、

PCR

特別事項

5

Flow 原理— FSC, SSC

2-16° Forward Scatter (FSC)

“Size”

90° Side Scatter (SSC)

“Granularity”

FITC

GFP

PE

Cy3

PI

PerCP

PerCP-Cy5.5

PE-Cy7

APC

Tube FITC PE PerCP

# 1 (control) auto-fluorescence ( 不使用 isotope) CD45

# 2 HLA-DR CD11b CD45

# 3 CD5 CD19 CD45

# 4 CD56 CD38 CD45

# 5 CD16 CD13 CD45

# 6 CD15 CD34 CD45

# 7 CD14 CD33 CD45

# 8 CD7 CD56 CD45

# 9 HLA-DR CD34 CD45

舉例 : Myeloid panel

7

檢體處理 :◦ Ficoll 會損失大量 neutrophil ，無法準確評估 mature myeloid cells◦ 可能會有 dying cells ( 各種 marker 都變弱 )

Lab:◦ 可能會有 doublets (2 cells connected)◦ 可能會有 auto-fluorescence 過強 ( 通常呈一直線 )◦ 可能會有 bubbles ( 飄在頂端 )

Analysis:◦ 可能會有 over-compensation 或 under-compensation◦ Plasma cells 極端脆弱，評估 % 實在不準，僅供參考◦ APL 很難判讀◦ Erythroid 在分析上很困難◦ Megakaryocytes 無法分析

Flow 可能的陷阱

8

華山派

劍宗氣宗

歷史的分歧

Flow analysis-Fresh case

強調百分比 %

( 螢光 control ，受限於 cursor)

形態為重 (auto-

fluorescence control ，

不拘泥於 cursor)

Flow analysis-MRD

需要初診斷原始資料才好判讀

任何時刻偏離正常就是異常

10

記住位置記住 gating 順序及意義 (R1, R2, R3, R4, R5)

基本 : FSC-SSC, SSC-CD45R2 R3

R4

R5

R1 NEC

11

RBC/ NRBC 在哪裡 ?

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評估 myeloid maturation

DR-11b 呈一直線 CD16-CD13 呈鉤狀，且 neutrophil 應佔 20%

以下

Promye

Mye/Meta

Neu

An

tig

en D

ensi

ty

101

102

103

Neutrophil Maturation

CD45

CD16

CD33

CD13

CD117

DR

CD15 CD11b

I II III IV V

CD34

Myeloid series

CD10

AB

C

D

E

F

Phenotypic changesoccur together

on/off, up/down, splicing正常 : 跳躍式的 phenotype 表現

A

B

C

d

F

Cell death/ apoptosis

Each patient unique

異常 : 某些 phenotype 增加 / 減少

16

Basophil

EosinophilNK

T-lym

17

記住 B cells 位置— stage 1234 記住 CD20-CD10 呈ㄣ字形

評估 B lymphoid maturation

CD19+

6 7

8 9

10 30 50 70 90 120

FSC -->

101

102

103

104

SS

C -

->

ML

101 102 103 104

SSC -->

101

102

103

104

CD

45

Pe

rC

P -

->

LymphMonoMyeloid

101 102 103 104

SSC -->

101

102

103

104

CD

19

-AP

C -

->

CD19+

101 102 103 104

CD20 FITC -->

101

102

103

104

CD

45

Pe

rC

P -

->

101 102 103 104

CD10 PE -->

101

102

103

104

CD

45

Pe

rC

P -

->

101 102 103 104

CD20 FITC -->

101

102

103

104

CD

10

PE

-->

III

III, IVT

III

III

IV

III

IIIIVT

18

B-lymphoid series

I II III IV

B lymphoid maturation

CD 10

FMC 7 CD 34

CD 45

CD 19

CD 20

CD 22 TdT CD 5

CD 23

Anti

gen E

xpre

ssio

n 103

102

101

19

Lineage infidelity◦ Lymphoid on myeloid◦ Myeloid on lymphoid

Maturational asynchrony◦ Immature antigens on mature cells◦ Mature antigens on immature cells

Antigeneic absence◦ Loss of marker that should be present

Quantational abnormality◦ Over-expression◦ Under-expression

Wells DA, Benesch M, Loken MR et al, Blood, 2003, 102: 394-403

異常的 flow 形態

20

通則◦ FSC-SSC 的最左側有 cell debris 、 dying cells 、 erythroid ，不要

gate◦ Auto-fluorescence 處無法判讀 ( 通常呈一直線 )◦ 要常常注意 FSC (size) ，大細胞常常是 target cells

◦ 如果有多出異常 marker ，要注意是不是 doublets◦ Marker+ 會比 marker- 更重要，也比較容易將來當 MRD 的重要工具

◦ 報告 cell % 時，不同 tubes 可能會略有出入，以最有意義的那一管來報結果

◦ 使用 NH4Cl RBC lysis 後的 cell percentage 約等同於 NEC

◦ 善用 forward gating 與 backward gating ，及其他 gating strategy ( 選擇適當的 G1, G5…) 來幫助判斷是否 grouping/homegenous

◦ 想一想檢查 MRD 時 : 如果異常只出現在一管 ? 會是 lab error? 如果異常反覆出現在多管 ? 比較有信心

你需要背的幾點…

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Myeloblast◦ 與 lymphoblast 位置不同， size 也較大◦ CD34 、 DR 用來辨認 immature cells ， CD34 先消失， DR 後消失

( 所以沒有 CD34+/DR- cells)◦ Myeloblast 需與 basophil 鑑別 (DR-/11b+)◦ Myeloblast 如果有 aberrant CD19+ ，常為 M2

Myeloid maturation◦ 依 DR-11b 與 CD13-CD16 的形狀來決定◦ Promyelocyte 多時 ( 如 APL 或 maturation arrest) ， fluorescence

很強，正常情況下 promyelocyte 約占 8% (>15% 表示 left shifting)◦ Neutrophil 為 CD15+ ，但此管的 CD34+% 比較不準◦ CD16 是 GPI-anchor protein (for PNH)


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Mono◦ DR+, CD14+ 是最重要 marker ，也會 CD16+◦ CD33+ ( 強過 myeloid)◦ CD16 是 GPI-anchor protein (for PNH)◦ Monocyte 某一 stage 會帶有 CD4+

Eosinophil◦ Eosinophil cap 是一大特徵 (SSC-CD45)◦ Eosinophil 在 FSC-SSC 的最左方◦ CD16-CD13 的位置也很有特色

Basophil◦ SSC-CD45 位置與 myeloblast 接近 , 但 DR-/11b+◦ CD16-CD13 的位置也很有特色◦ (RBC 與 basophil 沒有 CD38)


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Lymphoblast◦ CD34+ 為 stage 1 ， CD34-/DR+ 為 stage 2 (1+2 就是所謂

hematogone ，在 regeneration 時常常很旺盛 )◦ TdT 也是不成熟細胞的表徵 ( 出現在 TB ，極少在 myeloid)◦ 以 cCD79a 來辨認 B-lineage, cCD3 來辨認 T-lineage

◦ BM 裡沒有 T-lymphoblast ( 所以任何 BM immature blasts with CD2/3/5/7... 都是異常 ) ，只有 T-lymphocytes, NK cells

◦ CD1a 為 thymic antigen ，是不成熟 T 細胞的表徵

◦ 大部分的 B-ALL 是 CD10+ (Common ALL)◦ 大約一半的 B-ALL ， CD45 表現為 dim ，甚至 negative


24

B-lymphocytes◦ Light chain restriction 大多用 CD19+ 搭配 κ 或 λ 看， low grade 較明顯， DLBCL 常常較 dim

◦ DR+◦ 正常人本來就有一小部分 CD19+/CD5 dim 的細胞 ( 所以可解釋 CLL)

T-lymphocytes◦ DR- ，但 activating T or NK 會 DR+ ( 所以 DR+ 會出現在 B 及

activating T or NK ， DR- 的 aberrant T cells得優先考慮 T-lymphoma)

◦ CD45+ ，且比 B 強

NK cells◦ cCD3+ ，但是 CD3- ， CD5- ( 與 T cell 重要的不同 )◦ CD2+ ， CD7+ ， CD16+ ， CD56+ ， 11b+◦ 位置也很特別，靠近 myeloblast 處 (SSC-CD45)◦ Activating T or NK 會 DR+


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Plasma cells◦ 因為很脆弱， % 一般不準，只能看有無◦ CD38 bright( 通常在天花板 ) ， CD138+◦ Light chain restriction 大多用 CD38+ 或 CD138+ 搭配κ 或 λ 看◦ Myeloma cells: CD45 dim ( 所以落點特殊 ) ，大多 CD56+

如果 CD25+ ，考慮HCL 或 ATLL

Erythroid◦ CD45-, CD38-, 幾乎全部的 marker 都陰性 (RBC 與 basophil 沒有 CD38)◦ 很難判讀 , 因此 flow 無法確診 M6 ，也很難與 MDS區分

打洞◦ 打洞後需要另外拉 control組才能判讀

Tissue flow◦ 活細胞為 7AAD- ，我們只判讀 7AAD- 的細胞


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