Fluoróforos y sus aplicaciones

Chris WoodOctubre 2015

Laboratorio Nacional de Microscopía Avanzada

Una breve historia de fluoróforos…

Coatli .....patli, yoan aqujxtiloni, matlatic iniayo axixpatli..

“it is a medicine, and makes the water of blue color, its

juice is medicinal for the urine”

Sahagún, Florentine Codex Vol. III f. 266; CM-RAH, f. 203v.

La primera reporte de fluorescencia se escribió en Mexico por el misionario franciscanoBernardo de Sahagún

Charles de L’Écluse (1526-1609) llamó el palo Ligno

Nephriticum por sus propiedades medicinales en

mejorar el funcionamiento del riñon en 1574

John Frampton escribió un poco más tarde sobre un “.. white woodde which

gives a blewe color” que es muy bueno “for them that doeth not pisse liberally

and for the pains of the Raines of the stone..”

Robert Boyle (1670) atribuyó el color a un “sal esencial” ya que con

tiempo inmerso la madera perdió su propiedad. También descubrió

que los ácidos destruyen el efecto y que se puede recuperar la

fluorescencia agregando sustancias alcalinas.

Es decir, inventó el primer sensor de pH!

La identidad exacta de L. nephriticum se perdió, y no se descubrió otra vez hasta el siglo pasado

Y no fue hasta 2009 hasta que se caracterizó el fluoróforo

Matlaline

Prof David Jameson

Fluorescencia

Un fenómeno asociado con moléculas policíclicasaromáticas altamente conjugadas

Transferencia de energía y transicioneselectrónicas representadas en

el “diagrama de Jablonski”

Cada fluoróforo tiene su espectro de excitación (absorción) y emisión

Cómo caracterizamos a los fluoróforos?

1. Coeficiente de extinción (Ɛ) es la absorbanciade un fluoróforo en su pico de excitación

2. Rendimiento cuántico (ɸ) es la probabilidad de emitir un fotón para cada fotón absorbido

Cómo caracterizamos a los fluoróforos?

1. Coeficiente de extinción (Ɛ) es la absorbanciade un fluoróforo en su pico de excitación

2. Rendimiento cuántico (ɸ) es la probabilidad de emitir un fotón para cada fotón absorbido

“Brightness” = Ɛɸ

Cómo caracterizamos a los fluoróforos?

1. Coeficiente de extinción (Ɛ) es la absorbanciade un fluoróforo en su pico de excitación

2. Rendimiento cuántico (ɸ) es la probabilidad de emitir un fotón para cada fotón absorbido

“Brightness” = Ɛɸ

3. Vida media o “Lifetime” de la fluorescencia

Vida media de la fluorescenciaSi damos un pulso de luz de excitación a unapoblación de fluoróforos en un solvente unforme, la fluorescencia se decae exponentialmente.

La mayoría de los fluoróforos tienen una vida media (τ) en el rango de nansegundos

Vida media de la fluorescencia1. Independiente de la concentración de

fluoróforo, y fenómenos como fotoblanqueo.

2. Sensible a interacciones en el entornomolecular del fluoróforo – solventación, oxígeno, pH, proximidad a otros fluoróforos etc

3. Medir la vida media convierte algunosfluoróforos en sensores moleculares de temperatura, pH, iones, oxígeno etc

“Quenching” y fotoblanqueo

1. El quenching (cuencheo?) es la disminución enla emisión fluorescente por la actividad de mecanismos de regreso al estado energéticobasal no radiativos.

2. El fotoblanqueo es la destrucción permanentedel fluoróforo por modificación covalente de su estructura.

Propiedades idóneas de losfluoróforos

1. Buen coeficiente de absorción y de rendimiento cuántico

2. Resistencia a fotoblanqueo y entrar el estado triplete

Secundarias: Solubilidad, baja toxicidad (sistemas biológicas), un Stokes shift grande, estable, barato, espectros compatibles con líneas laser comunes, entre otras

2x Real Time

Alexa Fluor 488 vs Fluorescein fotoblanqueo

Cortesia invitrogen.com

Clases de fluoróforo

Fluoróforos intrínsecos naturales

1. Triptofano , tirosina y fenilalanina

Espectro se desplaza por grado de solventación, susceptible al quenchingpor aa ácidos como Asp y Gln en proximidadcercana

Utilizado para estudios estructurales sobre proteínas y péptidos, cambios conformacionales, seguimiento de plegamiento etc

Fluoróforos intrínsecos naturales

2. Metábolitos (NADH, FAD)

Varone et al CancRes 2014;74:3067-3075 midieron la variación en estado redox entre diferentes regions en tejidos.

Vida media de NADH cambia siestá libre en solución o unido a proteínas, y la proporciónlibre:unido es relacionado al equilibrio entre glicólisis y OXPHOS en los tejidos

En este estudio, midieron y mapearon los cambios en estaproporción (y por ende la transición en su estadometabólico) durante la diferenciación de célulastroncales germinales a gamétos en C. elegans

Stringari et al (2011) PNAS 108 (33) 13582–13587

Fluoróforos intrínsecos naturales

3. Clorofila

www.nasa.gov

Fluoróforos intrínsecos naturales

4. Proteínas fluorescentes

Shimomura, Johnson and Saiga (1962)

discovered Green Fluorescent Protein in

the Aequorea victoria jellyfish

Purificaron 70 mgs de GFP de unas 30,000

Medusas con un peso total de 1.5 toneladas

Aislaron los “anillos exteriores”

de las medusas. Empezaron con

tijeras, pero al final diseñaron y

construyeron un equipo “corta-

anillos” para aumentar el

rendimiento

En.wikipedia.org/wiki/fluorescence

Múltiples colores

Marcar organelos subcelulares

Fusionarla con otrasproteínas

Convertirlo en un sensor

Medir la expresión de genes

Generar organismostransgénicos

Actina-GFP en las raíces de Arabidopsis

noble.org

Múltiples colores

Marcar organelos subcelulares

Fusionarla con otrasproteínas

Convertirlo en un sensor

Medir la expresión de genes

Generar organismostransgénicos

Microscopyu.com

Múltiples colores

Marcar organelos subcelulares

Fusionarla con otrasproteínas

Convertirlo en un sensor

Medir la expresión de genes

Generar organismostransgénicos

Visualización de procesos dinámicos in vivo

Epithelial cell migration and interchangeduring angiogenesis in the retina of zebrafish embryo (48hpf) depends on VEGF signalling

Jakobsson et al Nature Cell Biology 12, 943–953 (2010)

Proteínas fluorescentes como sensores de parámetros intracelulares

Algunas FPs son intrínsecamente sensiblesal estado de su entorno, e.g. pH, cloro

La proteína se fusiona con un dominiosensor. Cambios conformacionalesprovocados por unión de ligando o modificación del dominio sensor se trasmiteal dominio FP y la fluorescencia aumenta o disminuye.

Cambios de Ca2+ intracelular en subdominios de células de astrocito, medido a través de los cambios de intensidad de fluorescencia en el sensor genético CGamP2

Shigetomi et al J Gen Phys (2011) 141, 633-647

Transferencia de energía por resonancia

1 – Sobrelape entre los espectros de emisión del donador y de excitación del aceptor2 – una proximidad en el rango de 2 – 10 nm

CFP YFP

A B

CFPYFP

A B

CFP-NIPP1(proteína de

andamio nuclear)

YFP-IPP1(proteína fosfatasa)

CFP-NIPP1-MUTANTE

YFP-IPP1

Eficiencia FRET

Cortesía www.olympusamerica.com

1 -10nm

Truong et al. Nat Struct Biol, 8: 1069

FRET Intramolecular

Existen sensores para Ca2+, actividad de cinasas, proteasas, nucleótidos cíclicos, el cociente ATP/ADP, superóxido, peróxido, potencial de membrana etc etcc

Proteínas fluorescentes fotoactivables

Fotoactivación paGFP-Actina 5 minutos después 60 minutos después

J. Cell Science 2007,120, 4257

Proteínas fluorescentes reversibles

DRONPA-actina

J. Cell Science 2007,120, 4257

Proteínas fluorescentes fotocrómicas

Dendra2-actina

Fotoconversión 20 minutos después 40 minutos después

J. Cell Science 2007,120, 4257

Fluoróforos extrínsecos

1. Fluoróforos orgánicos

¿Como generamos especificidad molecular en las tinciones?

Algunos fluoróforos como DAPI tiñen moléculas blancos específicas (el ADN en este caso)

Otros no tienen ningún especificidad intrínseca, pero se puede acoplar a otros moléculas que si tienen esta característica.

Marcaje directo con fluoróforos químicos

• Life Technologies, Thermo, Pierce y otros venden kits para marcar y purificar casi cualquier proteína

• Conjugan el fluoróforo con lisinas y cisteínas

• Requiere proteínas recombinantes• Requiere lisinas o cisteínas reactivos

expuestos• Puede interferir con función• Difícil controlar la estequiometria

Marcaje indirecto con fluoróforos químicos(vía anticuerpos)

• No requiere proteínas recombinantes (pero si un anticuerpo primario)• Puede interferir con función• Puede generar puentes (aglomeraciones) en proteínas membranales• En células fijadas para proteínas intracelulares

Afinidad directa Indirecta

DAPI marca ADN Anticuerpos fluorescentes

Múltiples colores

Azul – citoesqueleto Rojo – mitocondria Verde - núcleo

Microscopyu.com

Sensores

Ca2+

pH

Calcium Green

BCECF

Proteínas marcados con fluoróforos compatibles pueden reportar

cambios conformacionales

www.olympusmicro.com

“Quantum dots” – fluoróforos inorgánicos

Cristales semiconductores de dimension nanométrica, clásicamente con composición de un centro de CdSe envuelta enuna cápsula de ZnS y una capa externa polimérico

La supercicie se funcionaliza uniendo anticuerpos, péptidos, lípidos etc

Las longitudes de emisión dependen del tamaño del nanocristal: mientras más grande, el espectro recorre hacía el rojo.

Los QDs contienen desde 100 hasta 100,000 átomos y tienen un diámetro de ~ 10 a 50 átomos equivalente a 2 a 10 nanómetros, hasta 15nm con sus grupos funcionales, el tamaño de una proteína grande

Sus picos de emisión son simétricos y estrechos, y por la relación tamaño-longitud, es fácil generar uno con las características exactas de espectro deseadas

Altamente resistente al fotoblanqueo, con coefficientes de absorción grandes

Químicamente estables

Emisión discontinua (alta taza de parpadeo)

Toxicidad por contener cadmio o otros metales pesados

Biocompatibilidad celular – permeabilidad de membranas y secuestro en organelos

“Quantum dots” 650nm

Franziska Curdt, LNMA

• Nuevas materiales libres de metales pesados

• Nuevas formulaciones con tazas de parpadeo reducidas

• Capas poliméricas más delgadas (20 -> 9nm)

BMC Biotechnology 2007, 7:67

Nature Communications 5,Article number: 3796

Los vicios de ayer son las virtudesde hoy…

Nuevos paradigmas en microscopía han cambiado nuestra visión sobre lo que constituye un “buen fluoróforo”

Microscopía de súper-resolución

Haydee Hernández, Adan Guerrero, LNMA, datos no publicados

Ensayo bi-colorAnálisis 3B

Mandy Juarez, Mario Zurita, Adán Guerrero, unpublished

Verde: p52 -YFPRojo: Histone H2av-RFP

En ciertas implementaciones, la súper-resolución se genera a través del análisis estadístico de la emisión discontinua de fluoróforos adyacentes, para determinar la posición del fluoróforo con mayor precisión (mayor resolución espacial)

¡VIVA EL PARPADEO!

Fluoróforos para microscopíamultifotónica

Parece que los espectros de absorpción en modalidad de dos fotones deben estar alrededor del doble de λ

En realidad tienden ser espectros más anchos y corridos hacía el azul

Two-photon cross section (GM)

• Por lo general empleamos los mismos fluoróforos para estudios en 2 fotón que en 1 fotón.

• Estos fluoróforos tiene valores de GM en el rango de 1 a 10 hasta 100.

• Fluoróforos desarrollados y optimizados específicamente para uso en estudios de multifotóndesde hace 20 años

• Tienden tener sistemas conjugados grandes, y los valores de GM alcanzan hasta dos órdenes de magnitud mayor

Algunos ejemplos

200 m2 purpose-built facility with 6 dark rooms

Microscopes & Imaging Equipment

• 3 confocal microscopes (2 equipped for multiphoton excitation)

• Spinning disk confocal microscope (with FLIM module)

• Total Internal Reflection Microscope (TIRF)

• Macroscope

• Bioluminescence microscope

• Imaging citometer (flow microscope)

• Bioimager (whole-organism)

• 2 Epifluorescence microscopes

• Oportunidades de ser anfitrión a estudiantes de posgrado y investigadores pos-doctorales

• Posgrado de Ciencias Bioquimicas (PNPC – Internacional)

• Ciencias Biomédicas, Ciencias Computacionales, Disciplinas enÓptica

• Cursos de entrenamiento y capacitación.

• Colaboraciones en proyectos de investigación

Laboratorio Nacional de Microscopía Avanzada

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Técnicas disponibles y en desarrollo

• Rastreo de partículas/moléculas individuales

• FRET y Complementación Bimolecular

• Fluorescence Correlation Spectroscopy /FCCS/ Number&Brightness

• Bioluminiscencia

• TIRF

• Macroscopía

• Imagenología in vivo

• Súper-resolución

• FLIM

• Microscopía de flujo

• Análisis de imágenes

16/10/2015

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Adán Guerrero

Haydee HernándezFranziska Curdt

Arturo Pimentel

XochitlAlvarado

Andrés Saralegui

Alberto Darszon

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Daniel Fuentes

Aimée Bastidas

Rodrigo Migueles

Maria Cruz

LNMA

CONACyT & CIC UNAM

Instituto de Biotecnología, UNAM

Red Temática en Biofotónica

Fisicos Ópticos

Médicos

Biólogos

Gracias por su atención!

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Dr. Rachel O. Wong and Philip Williams,

Department of Biological Structure,

University of Washington