fluorometria en veterinaria

7/26/2019 Fluorometria en veterinaria

http://slidepdf.com/reader/full/fluorometria-en-veterinaria 1/14

AN. VET. (MURCIA) 20: 35-47 (2004). FLUOROMETRÍA EN TIEMPO RETARDADO: GENERALIDADES. PARRA, Mª.D., et al. 35

FLUOROMETRÍA EN TIEMPO RETARDADO: CONCEPTOSGENERALES Y APLICACIONES EN MEDICINA VETERINARIA

Time-resolved fluorometry: General concepts and applications in Clinical Pathology.

Parra Mª D.*, Martínez-Subiela S., Cerón J. J.*Departamento de Medicina y Cirugía Animal. Facultad de Veterinaria. 30100 Campus de Espinardo.Murcia

*Autor de referencia: [email protected]

RESUMEN

La fluorometría en tiempo retardado es una tecnología novedosa que surge con la intención de reemplazar al radioinmunoanálisis y se presenta como una posible alternativa al ELISA. Este sistema de detección ha permitido el desarrollo de inmunoensayos altamente sensibles en los que antígenos o anticuerpos son marca-dos con quelatos de lantánidos, emisores de fluorescencia susceptible de ser cuantificada. Su gran sensibilidadhace que sea una herramienta eficaz en el análisis de compuestos que se encuentran en pequeñas concentracio-nes en diferentes fluidos orgánicos, tales como orina, sangre o saliva. Los crecientes avances en esta metodo-logía han proporcionado ensayos ultrarápidos y ultrasensibles para la determinación de proteínas de fase aguday marcadores de infarto de miocardio en medicina humana, mientras que en medicina veterinaria una de sus principales aplicaciones se centra en la determinación de hormonas.

Palabras clave: TRF, europio, DELFIA, lantánido, quelato.

ABSTRACT

Time-resolved fluorometry is a novel technology that emerges to replace radioimunoassay and appears asa feasible alternative to ELISA. This detection system has led to the development of highly sensitive immu-noassays in which antigens or antibodies are labelled with lanthanide chelates, which emit fluorescencecapable of being quantified. The high sensitivity makes this technology very useful in the measurement of substances present in small quantities in different organic fluids, such as urine, blood or saliva. Recentadvances in fluorometry have provided ultrarapid and ultrasensitive assays for the quantification of acute phase proteins and myocardial infarction markers in human medicine, whereas in veterinary medicine one of its main applications focuses on hormones determination.

Key words: TRF, europium, DELFIA, lanthanide, chelate.



AN. VET. (MURCIA) 20: 35-47 (2004). FLUOROMETRÍA EN TIEMPO RETARDADO: GENERALIDADES. PARRA, Mª.D., et al.36

1. INTRODUCCIÓN

El comienzo del empleo de la fluorescenciaen inmunología data de 1941 cuando Coons ycolaboradores marcaron por primera vez anti-cuerpos con compuestos fluorescentes para vi-sualizar antígenos. A partir de los años ochenta,la determinación fluorométrica con sus aplica-ciones en fluoroinmunoensayos homogéneos yen técnicas in situ (inmunocitoquímica, citome-tría de flujo), empezó a ser considerada comoun sistema de detección muy sensible e inclusocomo una alternativa para reemplazar a los mar-cadores radiactivos en el campo de los inmu-noensayos. De hecho, la detección fluorométri-ca es una técnica extremadamente sensible, demanera que un compuesto fluorescente puedeser excitado más de 200.000 veces en un segun-

do y producir aproximadamente el mismo nú-mero de fotones emitidos.

Sin embargo, los fluoroinmunoensayos decompuestos biológicos estuvieron durante mu-cho tiempo limitados por el background o fluo-rescencia residual producida por la unión noespecífica de los compuestos fluorescentes adeterminados componentes del ensayo o el equi- po, tales como los propios anticuerpos, plásti-cos, lentes, espejos...etc. Era evidente pues, que para que la fluorometría pudiera sustituir el con-taje radiactivo, la señal específica tenía que ser separada de las interferencias de fondo o bienser ampliada varios órdenes de magnitud. Unade las alternativas más exitosas para solventar el problema fue el desarrollo de lafluorome-tría en tiempo retardado (TRF). En este siste-ma la señal se distingue del background resi-

Figura 1:Principio de la fluorometría en tiempo retardado. Las barras negras verticalesrepresentan pulsos de excitación de la sonda fluorescente. Tras el primer pulso se produce unespectro de emisión con largo periodo de caída; también se puede apreciar que la ventana decontaje queda retrasada con respecto a dicho pulso para evitar así el background.




dual por resolución temporal, es decir, la fluo-rescencia no es medida inmediatamente despuésde la excitación del compuesto fluorescente, sinoque se deja pasar un cierto tiempo (400 micro-segundos en el caso de compuestos marcadoscon europio) que permite excluir el backgroundde corta duración (Figura 1).

2. LANTÁNIDOS COMO MARCADORES.

Para un uso práctico, los marcadores fluo-rescentes empleados deben tener un tiempo deestado excitado en el rango de 10 microsegun-dos a 10 milisegundos. Aparte de algunos compuestos fosforescentes como las metaloporfiri-nas, sólo los quelatos de lantánidos, fundamen-talmente los de europio (III) (Eu3+), terbio(III)(Tb3+), samario(III) (Sm3+) y diprosio(III) (Dy3+),muestran una emisión de larga duración, quehace de ellos los candidatos ideales para losinmunoensayos fluorométricos en tiempo retar-dado (Hemmilä et al., 1995).

Los lantánidos son elementos situados en la parte más baja de la tabla periódica de los ele-mentos y deben usarse asociados aquelatos,que son moléculas orgánicas en las que se pue-den diferenciar tres partes (Figura 2), cada una

de ellas con una función específica. Dichas fun-ciones son:

1. Unión lantánido-molécula . Disponen de ungrupo reactivo (S=C=N-) que se une a losgrupos -NH2 de las proteínas y posibilita launión de los iones de lantánidos a la biomo-lécula que va a ser marcada (anticuerpo, hap-teno).

2. Transferencia de energía al lantánido . Pre-sentan una región que tiene como funciónabsorber la luz de excitación siendo capacesde transferir energía al ión del lantánido encuestión, el cual producirá un espectro deemisión específico.

3. Protección del lantánido . Constan de unaserie de grupos quelantes que actúan prote-giendo al ión en soluciones acuosas, ya queéstas debilitan su fluorescencia.

Uno de los grupos de quelatos más amplia-mente utilizados en los inmunoensayos basadosen fluorometría en tiempo retardado han sidolos derivados de poliaminocarboxilatos, comoel EDTA (ácido etilendiaminatetraacético),DTTA (ácido dietilelentriaminatetracético) oDTPA (ácido dietilelentriamina-pentacético)

Figura 2.Representación esquemática de un quelato de lantánido que podría ser utilizadocomo marcador en un ensayo de bioafinidad.




Cuadro 1:Comparación de la sensibilidad de las técnicas ELISA y TRF en la determinaciónde distintos compuestos biológicos

Ensayo Sensibilidad TRF Sensibilidad ELISA

Francisella tularensis 8 pg/ml 16 ng/ml48 CFU/ml 9,4 x 104 CFU/ml

Enterotoxina B de 10 pg/ml 30,5 pg/mlStaphylococcus aureus 2,2 x 108 moléculas/ml 6,6 x 108 moléculas/ml

Toxina botulínica A 200 pg/ml 4 ng/ml2,4 x 108 moléculas /ml 4,8 x 109 moléculas/ml

Cuadro 2: Componentes y propiedades de la solución intensificadora DELFIA

COMPONENTE PROPIEDADES

Tampón acidificado Disocia los iones de los quelatos, pero permite la formación denuevos quelatos.

β-NTA Quelato que absorbe la energía de excitación y la transfiere al ión deeuropio.

TOPO Mejora el movimiento de los quelatos dentro de las micelas, intensi-fica la fluorescencia y prolonga su duración.

Triton X-100 Solubiliza los compuestos formados y proporciona condiciones óp-timas para la fluorescencia.

(Mukkala et al., 1989). Otros grupos de quela-tos de lantánidos son los criptatos (comerciali-zados por CIS-Bio International y Packard Ins-truments), la terpiridina, el 4,7-bis (clorosulfo-fenil)-1,10-phenanthroline-2,9-ácido dicarboxí-lico (BCPDA) (de CyberFluor Inc, Toronto,Canada) y LANCE (comercializado por PerkinElmer) (Selvin, 2002).

3. VENTAJAS SOBRE MÉTODOS TRADI-CIONALES

Diversos autores como Adlercreutz et al.(1998) o Lövgren y Peterson, (2000) han seña-

lado que la fluorometría en tiempo retardadoofrece numerosas ventajas sobre métodos tradi-cionales entre las que se incluyen:

1. Alta sensibilidad . En general la caracterís-tica más relevante de esta metodología esla elevada sensibilidad que proporciona encomparación con otras técnicas como el ra-dioinmunoensayo o el enzimoinmunoensa-yo. De hecho, esta propiedad ha sido desta-cada por numerosos autores (McNair et al.,1995; Yuan et al., 1997), y algunos hablanincluso de técnica supersensible (Soukka etal., 2001) o ultrasensible (Tarkkinen et al.,




2002). Su gran sensibilidad hace que seauna herramienta eficaz en la determinaciónde compuestos que se encuentran en pe-queñas concentraciones en diferentes flui-dos orgánicos tales como orina, saliva olíquido cefalorraquídeo; incluso puede ser empleada en el seguimiento de sustanciassecretadas por cultivos celulares (Kropf etal., 1991). En el cuadro 1 se compara lasensibilidad de las técnicas ELISA y fluo-rometría en tiempo retardado en la determi-nación de distintos compuestos biológicos(Peruski et al., 2002).

2. Estabilidad de reactivos . Los reactivos tie-nen una vida media larga, lo que supone unaventaja de la fluorometría sobre el radioin-munoanálisis, cuyos reactivos presentan unavida limitada.

3. Carencia de efectos nocivos por radiación .El radioinmunoensayo constituye un peligro potencial debido a la radiación y requierelaboratorios especiales, por lo que hay cier-tas limitaciones para su utilización; sin embargo, la fluorometría está exenta de estoscaracteres negativos.

4. Posibilidad de automatización . Los ensayosdesarrollados recientemente han hecho posible que el usuario sólo necesite identificar ycolocar la muestra en los sistemas automáti-cos para comenzar el proceso de medida. Elaparato se hace cargo de todo lo demás, por lo que no es necesario un personal entrena-do y especializado.

5. Posibilidad de medir analitos en sangreentera . Los últimos quelatos de lantánidos producidos han permitido el análisis demuestras de sangre entera, además de lasconvencionales de suero y plasma, con elconsiguiente ahorro de tiempo a la hora de procesar las muestras. Estos quelatos tam- poco se ven afectados por las interferen-cias causadas por hemólisis, lo que consti-tuye un gran avance para la cuantificaciónde determinados compuestos como la hap-toglobina, cuyo método de análisis tradi-

cional no permitía el empleo de muestrashemolíticas.

6. Determinación simultánea de varios compuestos . Ésta ha sido posible gracias a quelos quelatos de lantánidos presentan picosde fluorescencia a longitudes de onda biendiferenciadas. Normalmente se empleancombinaciones de dos lantánidos, fundamen-talmente europio y samario (Aggerbeck etal., 1996; Barnard y Kohen, 1998; Matsu-moto et al., 1999; Kimura et al., 2000), aun-que también se ha empleado el combinadoeuropio-terbio (Eriksson et al., 2000) e in-cluso se han realizado ensayos con cuatromarcadores: Eu3+, Tb3+, Sm3+, Dy3+( (Xu etal., 1992). Las ventajas conseguidas con estetipo de ensayo incluyen: – ahorro de tiempo, reactivos y trabajo. – reducción de costes globales. – empleo de muestras de volumen limitado,muy interesante en neonatos o en animalesde pequeño tamaño.

7. Amplio rango de ensayo . Se han obtenidoensayos que permiten medir concentracio-nes desde microgramos a miligramos (Tark-kinen et al., 2002).

4. INMUNOENSAYOS BASADOS ENFLUOROMETRÍA EN TIEMPO RETAR-DADO

Tradicionalmente los inmunoensayos esta- ban basados en el marcaje de antígenos o anti-cuerpos con isótopos radioactivos, en el casodel radioinmunoensayo (RIA) o con enzimas,en el sistema de detección conocido como ELI-SA.

En el fluoroinmunoensayo en tiempo retar-dado antígenos, anticuerpos o fragmentos deanticuerpos (Eriksson et al., 2000) son marca-dos con quelatos de lantánidos, que bien desa-rrollan fluorescencia gracias a una solución in-tensificadora o bien presentan fluorescencia in-trínseca estable, sin la necesidad de ninguna in-tensificación (Pettersson et al., 2000).




Todos los inmunoensayos que emplean fluo-rometría en tiempo retardado se pueden dividir en dos grandes grupos:

– competitivos , basados en el marcaje de antí-genos, normalmente de pequeño tamaño, queen el caso de la fluorometría en tiempo re-tardado se denominan fluoroinmunoensayos propiamente dichos y abreviadamente se co-nocen con las siglasTR-FIA (Figura 3).

– no competitivos o tipo sándwich , basados enel marcaje de anticuerpos en lugar de antí-genos y a los que nos referimos como ensa-yos inmunofluorométricos oTR-IFMA (Fi-gura 4), son los ensayos de elección paraantígenos de gran tamaño. Pueden ser variasórdenes de magnitud más sensibles que losensayos competitivos y se caracterizan por una especificidad elevada, optimización deensayo simple y rango de ensayo amplio.

4.1. Fluoroinmunoensayos comercializados.

A pesar de las últimas novedades surgidasen el campo de los fluoroinmunoensayos entiempo retardado, podemos simplificar y dividir los sistemas disponibles a nivel comercial endos grandes grupos (Degan et al., 1999):

1. El primer sistema, DELFIA engloba inmu-noensayos basados en el principio de «in-tensificación disociativa de la fluorescencia»y en fluorometría en tiempo retardado, sien-do el europio el marcador de elección (Mor-ton y Diamandis, 1990) y un derivado delEDTA o el ácido N1-(p-isotiocianatobencil)-dietilelentriamina-N1,N2,N3,N4-tetracético,los quelatos más empleados en esta metodo-logía. Dichos quelatos dan lugar a comple- jos no-luminosos con Eu3+, que se emplean para marcar antígenos o anticuerpos. Unavez finaliza la reacción antígeno-anticuerpose añade una solución intensificadora (Cua-dro 2) que es capaz de liberar los iones deEu3+ al medio acuoso. Por otra parte, ciertos

componentes de la solución, entre los que seincluye un segundo quelato (β-NTA), sonresponsables de la formación de nuevos com- plejos altamente fluorescentes y de la crea-ción de un ambiente micelar que protege alos iones de europio del ambiente acuoso y posibilita el desarrollo de la fluorescencia(Hemmilä y Harju, 1995).El único inconveniente del sistema descritoes que es vulnerable a la contaminación exó-gena por europio procedente de material delaboratorio contaminado (Ci et al., 1995) ytambién presenta un background elevadodebido al exceso de b-NTA libre en la solu-ción final (Yuan et al., 1998).

2. El segundo sistema, CyberFluor Inc, empleaun quelato diferente, el BCPDA, que es capaz de absorber y transmitir energía lumino-

Figura 3:Ejemplo de un ensayo competitivopara progesterona.

Figura 4:Ejemplo de un ensayo no competiti-vo para TSH humana.




sa al ión de Eu3+ y el estreptavidin (SA)marcado, que es el reactivo de detecciónuniversal junto a anticuerpos biotinilados(Morton y Diamandis, 1990; Scorilas et al.,2000). La fotoluminiscencia es medida enfase sólida, una vez que los pocillos hansido secados mediante aire a presión, por loque el background es menor que en el siste-ma anterior, ya que no hay exceso de ligan-do en solución. Sin embargo, la fluorescen-cia del marcador es mucho más débil (Yuanet al., 1998).

3. También podemos encontrar inmunoensayosque emplean una combinación de los dossistemas tradicionales, como es el de Kropf et al., (1991), primariamente basado en elmétodo de CyberFluor pero con mediciónde la florescencia en solución, análogamen-te al sistema DELFIA.

4.2. Fluoroinmunoensayos según el soporte

Tradicionalmente todos los inmunoensayos basados en fluorometría en tiempo retardado sonllevados a cabo en una configuración similar alELISA, de manera que se empleanplacas demicrotitulación recubiertas y todas las opera-ciones son realizadas en el mismo soporte, in-cluyendo la medición final de la fluorescencia(Figura 5).

Dentro de los ensayos en placa hay que des-tacar la creación de los denominados inmunoen-sayos de un sólo paso, todo en uno, de químicaseca (Lövgren et al., 1996). Estos ensayos con-tienen todos los reactivos necesarios (anticuerpos de captura y anticuerpos o haptenos marca-dos con quelatos de lantánidos) en forma seca,de forma que para comenzar el inmunoensayosólo se necesita añadir la muestra y un tampón(Figura 6).

Recientemente se ha desarrollado un nuevosistema denominado Innotrac Aio! (all-in-one)que emplea una especie delápiz que contienepocillos, similares a los de las placas, de formasuperpuesta (Pettersson et al., 2000) y permite

una automatización completa del análisis demuestras (Figura 7).

Otro tipo de soporte opcional a los pocilloso tiras de microtitulación son lasmicropartícu-las (Figura 8), que han posibilitado el desarrollode ensayos de bioafinidad cuantitativos en unformato miniaturizado. Estos ensayos se carac-terizan por ser extremadamente sensibles, y congran probabilidad permitirán la fabricación deensayos múltiples para la determinación simul-tánea de distintos analitos, ya que es posibleidentificar de forma individual micropartículasespecíficas frente a un analito en concreto(Lövgren et al., 1997; Tarkkinen et al., 2002).

5. FLUORÍMETROS

El examen visual de muestras marcadas conreactivos fluorescentes se venía realizando conmicroscopios de fluorescencia, proporcionandounos resultados semi-cuantitativos y subjetivos.La necesidad de determinar la fluorescencia deforma cuantitativa, con elevada sensibilidad yreproducibilidad, llevó a la creación de sistemasde detección luminosos capaces de registrar lafluorescencia específica con elevada resolución:los fluorímetros (Figura 9). Dichos instrumen-tos básicamente constan de una lámpara flashde xenón UV (también puede ser láser) que pro-

Figura 5:Placas de microtitulación emplea-

das rutinariamente en inmunoensayos basa-dos en fluorometría en tiempo retardado.




Figura 6:Representación esquemática del funcionamiento del sistema Aio.

Figura 7:Reactivos empleados en el formatoAIO, que incluye lápices que contienen poci-llos con todos los reactivos en forma seca.

Figura 8:Micropartículas empleadas en fluo-rometría en tiempo retardado.




duce una luz de excitación la cual pasa a travésde un filtro. Esta luz es dirigida mediante unsistema de lentes y espejos a la muestra conteni-da en un pocillo, excitando al lantánido de lamisma. La excitación conlleva la emisión de luzque a través de otra serie de lentes y filtrosllegará a un fotomultiplicador que realizará lalectura.

6. APLICACIONES PRÁCTICAS

La fluorometría en tiempo retardado es unatécnica de actualidad que está proporcionandoexcelentes resultados en la determinación denumerosos compuestos tanto en medicina hu-mana como veterinaria, entre los que destacan(Figura 10):

1. Hormonas, tales como: cortisol (Diamandiset al., 1988), tiroxina (Papanastasiou-Dia-mandis et al., 1989), LH y FSH (Menjívar etal., 1993), insulina (Storch et al., 1993), hCG

(Stenman et al., 1994) o 21-deoxicortisol(Fiet et al., 2000), todas ellas en medicinahumana. Por otra parte, la fluorometría se haaplicado en el campo de la veterinaria paramedir androstenona porcina (Tuomola et al.,1997), cortisol bovino (Erkens et al., 1998)y cortisol y tiroxina libre canina (Parra etal., 2004).El análisis de algunos de estos compuestoses de gran utilidad en el diagnóstico de nu-merosas endocrinopatías, tales como el hi- poadrenocorticismo, síndrome de Cushing oel hipotiroidismo.

2. Proteínas de fase aguda, entre las que seincluyen la haptoglobina bovina (McNair etal., 1995, 1997) o la proteína C-reactiva hu-mana (Tarkkinen et al., 2002), con un ensa-yo que permite la medición de la proteína entan sólo 2 minutos. Estas proteínas de faseaguda son marcadores de inflamación o dañotisular y están siendo ampliamente utiliza-das para el diagnóstico, así como para la

Figura 9:Fluorímetro VICTOR 1420 (PerkinElmer Lifesciences, Wallac Oy; Turku, Finlan-dia).




monitorización y evaluación de la respuestaal tratamiento de diversas enfermedades(Martínez-Subiela et al., 2002).

3. Marcadores tumorales. El análisis de dis-tintos compuestos como la enterolactona(Adlercreutz et al., 1998), los fitoestrógenos(Uehara et al., 2000) o el antígeno prostáticoespecífico (PSA) (Soukka et al., 2001) esotra de las aplicaciones de esta metodologíaen medicina humana.

4. Marcadores de infarto de miocardio. Losúltimos avances se centran en el desarrollode ensayos rápidos y ultrasensibles como eldesarrollado por Pettersson et al., (2000) parala determinación de mioglobina, creatín qui-nasa y troponina en 15 minutos.

5. Anticuerpos. La fluorometría en tiempo re-tardado se ha empleado igualmente para ladetección de anticuerpos de la difteria y eltétanos (Aggerbeck et al., 1996), inmunog-lobulinas E, relacionadas con varias alergias(Yuan et al., 1997), IgGs frente a Chlamydia pneumoniae (Wong et al., 1999), anticuerpos frente a la rubeola (Maple y Jones 2002)o anticuerpos frente a agentes infecciososcomo Francisella tularensis , neurotoxina A/B de Clostridium botulinum y enterotoxina

B de Staphylococcus aureus (Peruski et al.,2002).

6. Otros compuestos, como la proteína plas-mática A asociada a la preñez que permitedescartar síndrome de Down (Qin et al.,1997), determinados fármacos (Kimura etal., 2000) o enzimas como la creatín quinasa porcina (Tuomola et al., 2002) también hansido cuantificados mediante TRF.

CONCLUSIÓN

La fluorometría en tiempo retardado es unatecnología con un futuro prometedor. Actual-mente existen numerosas líneas de investiga-ción que buscan la creación de inmunoensayosultrasensibles, rápidos y totalmente automatiza-dos basados en esta metodología. Probablemen-te el gran interés que suscita esta sistema enmedicina humana, pronto se verá reflejado ennumerosas aplicaciones veterinarias tanto en elcampo de pequeños como grandes animales.

BIBLIOGRAFÍA

Aggerbeck H., Norgaard-Pedersen B., Heron, I.1996. Simultaneous quantitation of diphthe-

HORMONAS

ANTICUERPOS

ENZIMASPROTEÍNAS FASE

AGUDA

MARCADORES- cáncer - infarto

INMUNOENSAYOSbasados en TRF

FÁRMACOS

Figura 10:Aplicaciones de la fluorometría en tiempo retardado en inmunoensayos para ladetección de diversos compuestos.




of a time-resolved fluoroimmunoassay usinga biotinylated tracer with a radioimmunoas-say using125iodine. J. Steroid. Biochem. Mol.Biol. 72: 55-60.

Hemmilä I., Harju R. 1995. Time-resolved Fluo-rometry. En: Bioanalytical applications of labelling technologies, pp. 83-119. Eds. He-mmilä I., Stahlberg T., Mottran P. Turku.

Kimura H., Mukaida M., Wang G., Yuan J.,Matsumoto K. 2000. Dual-label time-resol-ved fluoroimmunoassay of psychopharma-ceuticals and stimulants in serum. ForensicSci. Int. 113: 345-351.

Kroft J., Quitte E., Gressner A.M. 1991. Time-resolved immunofluorometric assays withmeasurement of a europium chelate in solu-tion: application for sensitive determinationof fibronectin. Anal. Biochem. 197: 258-265.

Lövgren T., Pettersson P. 2000. Time-resolvedfluoroimmunoassay, advantages and limita-tions. En: Luminescence immunoassay andmolecular applications, pp. 233-253. Eds.Van Dyke K., Van Dyke R. CRC Press, BocaRaton, Florida.

Lövgren T., Merio L., Mitrunen K., MakinenM., Makela M., Blomberg K., Palenius T.,Pettersson K. 1996. One-step all-in-one dryreagent immunoassays with fluorescent europium chelate label and time-resolved fluoro-metry. Clin. Chem. 42: 1196-1201.

Lövgren T., Heinonen P., Lehtinen P., HakalaH., Heinola J., Hatju R., Takalo H., Mukka-la V., Schmid R., Lönnberg H., PetterssonK., Iitiä A. 1997. Sensitive bioaffinity as-says with individual microparticles and time-resolved fluorometry. Clin. Chem. 43: 1937-1943.

Maple P.A.C., Jones C.S. 2002. Time-resolvedfluorometric immunoassay for rubella anti- body- a useful method for serosurveillancestudies. Vaccine 20: 1378-1382.

Martínez-Subiela S., Tecles F., Eckersall P.D.,Cerón J.J. 2002. Serum concentrations of acute phase proteins in dogs with leishma-niasis. Vet. Rec. 150: 241-244.

ria and tetanus antibodies by double antigen,time-resolved fluorescence immunoassay. J.Immunol. Methods 190: 171-183.

Adlercreutz H., Wang G.J., Lapcik O., HamplR., Wähälä K., Mäkelä T., Lusa K., TalmeM., Mikola H. 1998. Time-resolved Fluoro-immunoassay for plasma Enterolactone.Anal. Biochem. 265: 208-215.

Barnard G., Kohen F. 1998. Monitoring ovarianfunction by the simultaneous time-resolvedfluorescence immunoassay of two urinarysteroid metabolites. Clin. Chem. 44: 1520-1528.

Ci Y., Yang X., Chang W. 1995. Fluorescencelabelling with europium chelate of b-diketo-nes and application in time-resolved fluoro-immunoassays (TR-FIA). J. Immunol. Me-thods 179: 233-241.

Degan P., Podesta A., Montagnoli G. 1999.Time-resolved fluoroimmunoassay. Mol.Biotechnol. 13: 215-22.

Diamandis E.P., Bhayana V., Conway K., Rei-chstein E., Papanastasiou-Diamandis A.1988. Time-Resolved Fluoroimmunoassay of Cortisol in Serum with a Europium Chelateas Label. Clin. Biochem. 21: 291-296.

Eriksson S., Vehniäinen M., Jansen T., Mere-toja V., Saviranta P., Pettersson K.,Lövgren T. 2000. Dual-label time-resol-ved immunofluorometric assay of free andtotal prostate-specific antigen based onrecombinant Fab fragments. Clin. Chem.46: 658-666.

Erkens J.H.F., Dieleman S.J., Dressendörfer R.A., Strasburger C.J. 1998. A Time-resol-ved Fluoroimmunoassay for Cortisol inUnextracted Bovine Plasma or Serum withOptimized Procedures to Eliminate SteroidBinding Protein Interference and to Minimi-ze Non-specific Streptavidin-europium Bin-ding. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 67:153-161.

Fiet J., Boudi A., Giton F., Villette J.M., BouduPh., Soliman H., Morineau G., Galons H.2000. Plasma 21-deoxycortisol: comparison




Matsumoto K., Yuan J., Wang G., Kimura H.1999. Simultaneus Determination of a-Feto- protein and Carcinoembryonic Antigen inHuman Serum by Time-Resolved Fluoroim-munoassay. Anal. Biochem. 276: 81-87.

McNair J., Elliott C.T., Mackie D.P. 1995. De-velopment of a sensitive and specific timeresolved fluorimetric immunoassay for the bovine acute phase protein haptoglobin (Hp).J. Immunol. Methods 184, 199-205.

McNair J., Kennedy D.G., Bryson D.G., ReillyG.A.C., McDowell S.W.J., Mackie D.P.1997. Evaluation of a competitive immu-noassay for the detection of bovine haptog-lobin. Res. Vet. Sci. 63: 145-149.

Menjívar M., Ortiz G., Cárdenas M., Garza-Flores J. 1993. Comparación de los métodosDELFIA y RIA en la medición de las hor-monas luteinizante y folículo estimulante ensuero. Rev. Invest. Clin. 45: 579-584.

Morton R.C., Diamandis E.P. 1990. Streptavi-din-based macromolecular complex labeledwith a europium chelator suitable for Time-resolved fluorescence immunoassay appli-cations. Anal. Chem. 62: 1841-1845.

Mukkala V., Mikola H., Hemmilä I. 1989. Thesynthesis and use of activated N-enzyl deri-vates of diethylenetriaminetetraacetic acids:alternative reagents for labelling antibodieswith metal ions. Anal. Biochem. 176: 319-325.

Ogine T., Kohsaka T., Taya K. 1999. Time-resolved fluoroimmunoassay (TR-FIA) of porcine relaxin. Exp. Clin. Endocril. Diabe-tes 170: 276-280.

Papanastasiou-Diamandis A., Bhayana V., Dia-mandis E.P. 1989. A simple time-resolvedfluoroimmunoassay of total thyroxine inserum. Ann. Clin. Biochem. 26: 238-243.

Parra M.D., Bernal L.J., Cerón J.J. (2004). Cor-tisol and free thyroxine determination byTime-resolved fluorometry in canine serum.Can. J. Vet. Res. 68: 98-104.

Peruski A.H., Johnson L.H., Peruski L.F. 2002Rapid and sensitive detection of biological

warfare agents using time-resolved fluores-cence assays. J. Immunol. Methods 263: 35-41

Pettersson K., Katajämi T., Irjala K., LeppänenV., Majamaa-Voltii K., Laitinen P. 2000.Time-resolved fluorometry (TRF)-based im-munoassay concept for rapid and quantitati-ve determination of biochemical myocardialinfarction markers from whole blood, serumand plasma. Luminescence 15: 399-407.

Qin Q., Christiansen M., Oxvig C., PetterssonK., Sottrup-Jensen L., Koch C., Norgaard-Pedersen B. 1997. Double-monoclonal im-munofluorometric assays for pregnancy-as-sociated plasma protein A/proeosinophilmajor basic protein (PAPP-A/proMBP) complex in first-trimester maternal serum scree-ning for Down syndrome. Clin. Chem. 43:2323-2332.

Scorilas A., Bjartell A., Lilja H., Moller C.,Diamandis E.P. 2000. Streptavidin-polyvin-ylamine conjugates labeled with europiumchelate: applications in immunoassay, im-munohistochemistry, and microarrays. Clin.Chem. 46: 1450-1455.

Selvin P.R. 2002. Principles and BiophysicalApplications of Lanthanide-Based Probes.Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31: 275-302.

Soukka T., Paukkunen J., Harma H., LonnbergS., Lindroos H., Lövgren T. 2001. Super-sensitive time-resolved immunofluorometricassay of free prostate-specific antigen withnanoparticle label technology. Clin. Chem.47: 1269-1278.

Storch M.J., Marbach P., Kerp L. 1993. A time-resolved fluoroimmunoassay for human in-sulin based on two monoclonal antibodies.J. Immunol. Methods 157: 197-201.

Stenman J., Alfthan H., Stenman U. 1994. Strep-tavidin-biotin based time-resolved immu-noflurometric assay for direct measurementof high concentrations of human chorionicgonadotropin (hCG). J. Immunol. Methods175: 161-167.

fluorometria en veterinaria

Documents