Sistema de LC Agilent 1260 Infinity Bio-inertAs colunas Agilent Bio-Monolith Protein são compatíveis com todos os sistemas HPLC/UHPLC

A coluna Bio-Monolith Protein A tem uma tira branca e a coluna Bio-Monolith Protein G tem uma tira amarela ao redor da coluna.

O HCl tem um índice de refração menor que outros eluentes. Se uma amostra de baixa concentração for usada e o ruído na linha de base e os picos do artefato forem motivos de preocupação, o HCl poderá ser usado como eluente.

Fases móveisTampão de ligação: Tampão de fosfato de sódio de 50 mM, pH 7,4. Tampão de eluição: Consulte a tabela abaixo.

Injeção da amostra (G5667A)Injeção de 1 a 5 µL para amostras contendo de 1 a 5 mg/mL de mAb. As amostras podem ser dissolvidas em H2O ou na fase móvel A. As colunas podem receber até 50 µL ou até 400 a 500 mg de mAb/injeção.

Temperatura da coluna (G1316C)25 °C é a temperatura típica para separações eficazes. As colunas podem ser operadas com temperaturas de 4 a 40 °C.

Detecção (G1315C)UV a 280 nm

Taxa de fluxo (G5611A)1,0 a 3,0 mL/min para alta velocidade. 1,0 mL/min gera picos mais altos e agudos, além de um sinal-ruído melhor.

FLUXO DE TRABALHO DE CARACTERIZAÇÃO DE BIOMOLÉCULASCOLUNAS DE SEPARAÇÃO POR AFINIDADE PROTEICA AGILENT BIO-MONOLITH PROTEIN A E PROTEIN G

Nesse documento, os químicos de aplicações da Agilent compartilham suas recomendações para obter um sistema de LC ideal e a sua configuração necessária para caracterizar biomoléculas. Eles também oferecem orientação sobre um método genérico para você iniciar e como otimizá-lo para atender a seus objetivos específicos de separação.   Informações adicionais sobre a aplicação estão disponíveis em www.agilent.com/chem/advancebio

Tampões de eluição compatíveisColuna Tampão de eluição Concentração pH

Bio-Monolith Protein A Ácido cítrico 0,1 M 2,5 a 3,0Glicina 0,1 M 2,5 a 3,0Ácido acético 5 a 20%HCl 12 mM a 0,1 M

Bio-Monolith Protein G Ácido cítrico 0,1 M 2,0 a 2,5Glicina 0,1 M 2,0 a 2,5Ácido acético 5 a 20%HCl 12 mM a 0,1 M

Extremidade pontiaguda

Direção do fluxo

Extremidade plana

Direção do fluxo

Protocolos de separação rápida As colunas podem ser operadas em até 3 mL/min. As tabelas de gradiente podem ser usadas também para Bio-Monolith Protein A, apenas ajuste o tampão de eluição (fase móvel B) para pH 2,5 a 3,0.

Coluna: Bio-Monolith Protein GAmostra: IgG3 (2 mg/mL)Injeção: 5 µLFase móvel A: Tampão de fosfato de sódio de 50 mM, pH 7,4Fase móvel B: 0,1 M de ácido cítrico, pH 2,0Temp.: 25 °CHPLC: LC quaternário Agilent 1260 Bio-inert Detecção: UV a 280 nm

Coluna: Bio-Monolith Protein A cAmostra: proteína da célula hospedeira de célula CHO e IgG1 (célula CHO de 7 mg/mL com adição de IgG1 de 2 mg/mL)Injeção: 5 µLFase móvel A: Tampão de fosfato de sódio de 50 mM, pH 7,4Fase móvel B: 0,1 M de ácido cítrico, pH 2,8Taxa de fluxo: 1,0 mL/min (consulte a tabela de gradientes abaixo)

Referências 1. Richman, D. D.; Cleveland, P. H.; Oxman, M. N.; Johnson, K.

M. The binding of 1. Staphylococci protein A by the sera of different animal species. J. Immunol. 1982, 128, 2300-2305.

2. Frank, M. B. Antibody Binding to Protein A and Protein G beads; 5. In Molecular Biology Protocols; Frank, M. B., Ed.; Oklahoma Medical Research Foundation, Oklahoma City, USA, 1997.

Afinidade proteica relativa de Protein A e G para os respectivos anticorpos.++++ = Afinidade forte+++ = Afinidade moderada++ = Afinidade fraca+ = Pouca afinidade- = Nenhuma afinidade

0,5 1 1,5 2 2.5 3 3.5 4

0 100 200 300 400 500

0,5 1 1,5 2 2.5 3 3.5 4

0 100 200 300 400 500

0,5 1 1,5 2 2,5 3 3.5 4

0 100 200 300 400 500

0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

0 100 200 300 400 500

2,5 mL/min

2,0 mL/min

+1,5 mL/min

1,0 mL/min

IgG3

IgG3

IgG3

IgG3

Abso

rbân

cia (U

V 28

0 nm

)

Tempo de retenção (min)

Anticorpo Anticorpo Protein A

Protein G

Humano IgG1 humano ++++ ++++IgG2 humano ++++ ++++IgG3 humano - ++++IgG4 humano ++++ ++++IgA humano ++ -IgD humano ++ -IgE humano ++ -IgM humano ++ -

Camundongo IgG1 de camundongos

+ ++

IgG2 de camundongos

++++ ++++

IgG2b de camundongos

+++ +++

IgG3 de camundongos

++ +++

IgM de camundongos

+/- -

1,0 mL/minTempo (min)

% A

% B

0 100 00,4 100 00,5 0 1002,0 0 1002,1 100 04,2 100 0

1,5 mL/minTempo (min)

% A

% B

0 100 00,3 100 00,4 0 1001,7 0 1001,8 100 03,2 100 0

2,0 mL/minTempo (min)

% A

% B

0 100 00,2 100 00,3 0 1001,2 0 1001,3 100 02,2 100 0

2,5 mL/minTempo (min)

% A

% B

0 100 00,1 100 00,2 0 1000,8 0 1000,9 100 01,7 100 0

AnticorpoFragmentos

Protein A

Protein G

Fab humano + +F(ab’)2 humano

+ +

scFv humano + -Fc humano ++ ++K humano - -λ humano - -

A Agilent Technologies não será responsável por erros contidos neste documento ou por danos incidentais

ou consequenciais em relação ao fornecimento, desempenho ou uso deste material.

As informações, descrições e especificações nesta publicação estão sujeitas a mudanças sem aviso prévio.

© Agilent Technologies, Inc., 2015 Impresso nos EUA, 1º de agosto de 2015

Número de publicação 5991-6105PTBRDiretrizes de seleção de coluna. Afinidades de ligação de Protein A e Protein G a anticorpos [1, 2]

Abso

rbân

cia (U

V 28

0 nm

)

Tempo de retenção (min)0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 min

IgG1

Proteínas de CHO(sem ligação)

mAU

0

200

400

600

800