francisco j. morales fernando correa v

Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2, 2002

FITOPATOLOGÍA

COLOMBIANA

VOLUMEN 26 NÚMERO 2 DICIEMBRE 2002

Revista

“FITOPATOLOGÍA COLOMBIANA” ÓRGANO DE DIFUSIÓN DE LA ASOCIACIÓN

COLOMBIANA DE FITOPATOLOGÍA Y CIENCIAS

AFINES- ASCOLFI

ISSN 01120-0143

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5004, Nit. : 891 –301.725-6

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abril 1º de 1977

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Fecha de impresión: Junio de 2003

Artículo Página

Combinaciones de genes en arroz para el desarrollo de

resistencia durable a Pyricularia grisea en Colombia

Fernando .J. Correa-V, D. Tharreau, César Martínez,

Michel. Vales, Fabio Escobar, Gustavo Prado

y Girlena Aricapa ................................................................................... 47

Evidencias del mildeo velloso (Peronosclerospora sorghi

(W. Weston & uppal) C. G. Shaw) en cultivos de maíz y sorgo

en Colombia

Carlos A. Huertas D., Greicy Sarria V. y Benjamín Pineda-L................. 55

Genética de la resistencia a pudrición causada por

Phythophthora tropicalis en dos poblaciones segregantes

de yuca (Manihot esculenta Crantz)

Elizabeth Álvarez, John Loke, Sandra Rivera y Germán Llano................ 61

Purificación del virus del síndrome de la hoja amarilla de

la caña de azúcar (Sugarcane Yellow Leaf luteovirus SCYLV)

y producción de antisuero.

Juan Carlos Ángel S., Mavir C. Avellaneda B.,Jorge I.

Victoria K., Mónica Betancourt V., Cristina Díaz-Granados,

José A. Arroyave P. y Mauricio Castaño J................................................. 68

Caracterización parcial de un potexvirus aislado de pitahaya

amarilla (Selenicereus megalanthus) afectada por mosaico en

Colombia

Helena Reichel, Rosalía Pérez y Ana Karine Martínez,

Raúl Sedano, Maritza Cuervo, José A. Arroyave

y Francisco J. Morales............................................................................... 73

Nuevos brotes de begomovirus en Colombia

Francisco J. Morales, Ana K. Martínez y Ana C. Velasco........................ 75

Enfermedades virales de la palma de aceite en el suroccidente

colombiano y sus agentes causales

Francisco J. Morales, Iván Lozano, José A. Arroyave,

Mauricio Castaño, Raul Sedano y Ana C. Velasco.................................. 81

Nematodos asociados a la granadilla Passiflora ligularis Juss

en el Valle del Cauca

Zulaima E. Vargas Z, Francia Varón de A. y

Eider D. Gómez ....................................................................................... 87

Nematodos asociados al tomate de árbol Solanum betaceum

en el Valle del Cauca

Sandra L. Lozada S., Francia Varón de A. y Eider D. Gómez................. 93

CONTENIDO

Fitopatología Colombiana /Volumen 26, 2002

i

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Nuestra carátula

Síntomas de mildeo velloso (P. sorghi) en maíz ICA V 109:

Inflorescencia masculina severamente afectada por filodia.

( Figura 1 b, página 58)

Fotografía C. A. Huertas D.

2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2

COMBINACIONES DE GENES EN ARROZ PARA EL DESARROLLO DE RESISTENCIA

DURABLE A Pyricularia grisea EN COLOMBIA

Fernando J. Correa-Victoria1, Didier Tharreau2, César Martínez1, Michel. Vales1,2, Fabio Escobar1, Gustavo Prado1 y Girlena Aricapa1

1Centro Internacional de Agricultura Tropical, CIAT, AA 6713 Cali, Colombia, 2Centre de Coopération Internationale en Recherche

Agronomique pour le Développement, CIRAD-CA, 34032 Montpellier, France

RESUMEN

El añublo del arroz causado por Pyricularia grisea (Magnaporthe

grisea) es el principal limitante de la producción en Colombia. La

perdida de la resistencia ocurre en períodos de uno a tres años, con la

excepción de los cultivares Oryzica Llanos 5 liberado en 1989 y Fe-

dearroz 50 liberado en 1998. Con el objetivo de desarrollar cultivares

con resistencia durable al añublo hemos analizado la estructura genéti-

ca de poblaciones del patógeno utilizando técnicas moleculares como

MGR-DNA y rep-PCR “fingerprinting” y estudiamos la diversidad y

frecuencias de los genes de avirulencia/virulencia del hongo. P. grisea

en Colombia es principalmente clonal. Cada clon o linaje exhibe un

espectro de virulencia amplio. Sin embargo, algunos genes de resisten-

cia son efectivos contra todos los aislamientos de un linaje. Los genes

de avirulencia varían en frecuencia, sugiriendo que dichos genes de

avirulencia pueden estar asociados con la supervivencia y reproduc-

ción, y por lo tanto, los genes de resistencia correspondientes a dichos

genes de avirulencia serían más relevantes en el mejoramiento para

una resistencia durable. Nuestros estudios nos permiten identificar y

predecir la durabilidad de combinaciones de genes de resistencia

basados en las frecuencias de genes de avirulencia. Hemos identificado

los posibles genes de resistencia presentes en nuestras variedades de

arroz e iniciado un programa de retrocruzamiento para incorporar las

combinaciones de genes de resistencia deseadas en variedades de arroz

de América Latina, a través de una selección asistida por marcadores

moleculares, inoculaciones controladas con aislamientos del patógeno,

y evaluaciones de campo.

Palabras claves: Oryza sativa, añublo, enfermedades del arroz. fi-

tomejoramiento, resistencia

SUMMARY

Rice blast caused by Pyricularia grisea (Magnaporthe grisea) is the

main limiting factor of rice production in Colombia. Resistance break-

down occurs after one to three years of cultivar release, with the ex-

ception of the commercial cultivars Oryzica Llanos 5 released in 1989

and Fedearroz 50 released in 1998. With the objective of developing

rice cultivars with durable resistance to blast we have analyzed the

genetic structure of blast pathogen populations using techniques such

as MGR-DNA and rep-PCR fingerprinting and studied the diversity

and frequencies of avirulence/virulence genes in the fungus. P. grisea

in Colombia is mainly clonal. Each clone or lineage exhibits a broad

spectrum of virulence. However, some resistance genes are effective

against all isolates of a linage. Avirulence genes vary in frequency,

suggesting that these genes could be associated with pathogenic fit-

ness. Therefore, the resistance genes corresponding to those avirulence

genes would be more relevant in breeding for durable resistance. Our

studies are allowing us to identify and predict the durability of re-

sistance gene combinations based on the frequency of avirulence

genes. We have identified the possible resistance genes present in our

commercial rice cultivars and initiated a backcrossing program for

incorporating desired combinations of resistance genes in rice varieties

of Latin America through marker assisted selection, controlled inocu-

lations with pathogenic isolates, and field evaluations.

Keywords: rice, resistance, breeding, rice blight

INTRODUCCIÓN

El añublo del arroz, causado por Pyricularia

grisea Sacc., estado asexual de Magnaporthe

grisea (Hebert) Barr, es la enfermedad mas

ampliamente distribuida y dañina del arroz

cultivado, tanto en zonas tropicales como

templadas. El hongo ataca prácticamente

todas las partes de la planta, pero los daños

más frecuentes ocurren en las hojas y las

panículas.

Por muchos años, las investigaciones se

han concentrado en la identificación de razas

del patógeno y la incorporación de genes de

resistencia a dichas razas en los cultivares

comerciales. Sin embargo, la resistencia de

los cultivares en Colombia se ha perdido

después de su liberación en períodos de tan

solo uno a tres años (Correa-V y Martínez,

1994), con la excepción de los cultivares

comerciales Oryzica Llanos 5 liberado en

1989 y el cultivar Fedearroz 50 liberado en

1998 (Tabla 1).

Grandes esfuerzos se están haciendo en el

Centro Internacional de Agricultura Tropical,

CIAT, para entender la gran variabilidad

observada en este patógeno, la cual es consi-

derada como la principal causa de la perdida

de la resistencia de los cultivares liberados.

Un extenso estudio de la diversidad de P.

grisea en Colombia fue iniciado en el año

1990. Estos estudios han considerado tanto la

diversidad y frecuencia de los genes de aviru-

lencia así como el espectro de virulencia de

varias centenas de aislamientos del hongo

recolectados de diferentes cultivares de arroz.

Aislamientos del hongo han sido inoculados

en condiciones de invernadero sobre cultiva-

res de arroz con genes de resistencia conoci-

dos, cultivares de arroz liberados en Colom-

bia en un período de 30 años, fuentes de

resistencia durable, cultivares diferenciales

internacionales, y un conjunto de líneas iso-

génicas que contienen genes de resistencia

reportados en la literatura.

Dactiloscopia del ADN, utilizando técni-

cas moleculares de RFLP y PCR, han sido

usadas para determinar la estructura genética

de las mismas poblaciones del hongo analiza-

das por su virulencia. La complejidad del

patógeno ha sido de esta forma simplificada

en seis familias genéticas, denominadas SRL-

1 a SRL-6 (Levy et al, 1993) las cuales son

principalmente compatibles con arroz de

riego tipo indica, y un linaje genético deno-

minado A-7 compatible con arroz de secano

tipo japónico (Figura 1). Estudios sobre la

relación entre el espectro de virulencia y una

familia o linaje genético del patógeno, indi-

can que denominado A-7 compatible con

arroz de secano tipo japónico (Figura 1).

Estudios sobre la relación entre el espec-

tro de virulencia y una familia o linaje genéti-

co del patógeno, indican que lo más impor-

tante de esta interacción es que existen genes

de resistencia en el arroz, los cuales son

2002 Fitopatología Colombiana /Volumen 26 No 2 48

efectivos o controlan todos los aislamientos o

individuos de un mismo linaje.

De esta forma, el proyecto de Arroz de

CIAT como objetivo ha venido desarrollando

una estrategia de mejoramiento para el desa-

rrollo de resistencia durable al añublo del

arroz, la cual está basada en estudios sobre la

composición y frecuencia de los genes de

avirulencia del patógeno, la caracterización

de la estructura genética, la identificación e

incorporación en los cultivares de combina-

ciones de genes de resistencia efectivos con-

tra las poblaciones del hongo de cada familia

genética, y la evaluación continua y selección

de líneas del programa de mejoramiento bajo

una alta presión de la enfermedad y una alta

diversidad del patógeno (Correa-V y

Zeigler,1993a; 1993b; 1995).

Caracterización de la virulencia y estruc-

tura genética de Pyricularia grisea en Co-

lombia

El Proyecto de arroz del CIAT realiza sus

actividades de mejoramiento por resistencia a

P. grisea bajo condiciones de secano favore-

cido en la estación experimental “Santa Ro-

sa” de FEDEARROZ en el departamento del

Meta, Colombia, sitio de alta presión de la

enfermedad y diversidad del patógeno. Una

alta incidencia de la enfermedad es mantenida

en las parcelas de mejoramiento durante todo

el ciclo del cultivo mediante el uso de surcos

esparcidores, los cuales están compuestos por

una mezcla de cultivares comerciales suscep-

tibles a las diferentes familias genéticas del

hongo. Estos surcos son sembrados en forma

perpendicular a las líneas de arroz a ser eva-

luadas por su resistencia. Gran cantidad de

esporas del hongo son producidas sobre los

Tabla 1 Cultivares de arroz liberados en Colombia, fuentes de resistencia y año del rompimiento de la

resistencia a Pyricularia grisea

Cultivar

Fuente de Resistencia

Año de Libe-

ración

Rompimiento de la

Resistencia

Años de

Resistencia

Cica 4 Peta 1971 1972 1

Cica 6 IR-822-432 1974 1975 1

Cica 7 Colombia 1 1976 1978 2

Cica 9 C 46-15 1976 1977 1

Cica 8 Tetep 1978 1980 2

Metica 1 Colombia 1 1981 1982 1

Oryzica 1 C 46-15, Colombia 1,

Tetep

1982 1985 3

Oryzica 3 Colombia 1, Tetep 1984 1985 1

Línea 2 C 46-15, Colombia 1,

Tetep

1988 1989 1

Oryzica

Llanos 5

IR 36, 5685, Colombia

1, Cica 9

1989 ? > 10

Oryzica

Caribe 8

Tetep, IR 665, Colom-

bia 1, Cica 9

1993 1995 2

Fedearroz 50 IR 665, 5685, Colombia

1, Cica 9

1998 ? > 4

Figura 1. Huella del ADN (“fingerprinting”) de P. grisea determinado por Pot 2-PCR (George et al, 1997). Linajes genéticos SRL-1 a SRL-6 y Altillanura 7 (A-

7) de Colombia


surcos esparcidores siendo estas diseminadas

por el viento y el agua sobre las líneas de

mejoramiento, aumentando la probabilidad de

exposición de una línea al patógeno y redu-

ciendo la posibilidad de escape a la infección

(Figura 2).

Bajo estas condiciones de evaluación y

selección, se ha encontrado que la resistencia

seleccionada es más estable y duradera que

bajo condiciones de menor presión. Sin em-

bargo, la durabilidad de la resistencia depen-

de no solo de la planta, sino de la dinámica

del patógeno y sus cambios en la virulencia.

El establecimiento entonces de un sistema

para entender la variabilidad patogénica y su

dinámica es esencial para el desarrollo de una

estrategia de control de la enfermedad con

resistencia genética.

Estudios de poblaciones de P. grisea re-

colectadas durante 12 años en este sitio han

mostrado la existencia de mas de 50 razas del

hongo, presentando virulencia o compatibili-

dad con mas de 13 genes de resistencia. Bajo

condiciones de invernadero plántulas de arroz

de 21 días de edad son inoculadas en tres

replicaciones (10 plantas por repetición)

mediante la aspersión de una suspensión de

5x105 esporas/mL, incubadas por 15 días con

una alta humedad relativa, y evaluadas por el

tipo de lesión y porcentaje de área foliar

afectada. Estudios sobre frecuencias de viru-

lencia sobre 42 cultivares de arroz con dife-

rentes genes de resistencia estuvieron entre

0,0 y 0,86 (Correa-V y Zeigler, 1993 a). La

mayoría de los aislamientos presentan perdida

de un gran número de genes de avirulencia,

pero ningún aislamiento es virulento sobre

todos los genes de resistencia (Tabla 2) sugi-

riendo la necesidad de piramidar estos genes

para poder lograr resistencia efectiva contra

el patógeno (Correa et al, 1994).

El análisis molecular de estas poblacio-

nes del patógeno sugieren que este se repro-

duce principalmente de forma asexual, estan-

do agrupado en pocas familias genéticas.

La estructura genética es relativamente

simple a pesar de la gran diversidad observa-

da en la virulencia. La similitud genética de

los aislamientos dentro de un mismo linaje es

mayor al 90%, mientras que la similitud entre

aislamientos de diferentes linajes está entre

37 a 85% (Levy et al, 1993. El espectro de

virulencia de aislamientos dentro de cada

linaje es altamente similar, difiriendo en tan

solo unos pocos factores de virulencia. Aun-

que las familias genéticas del hongo compar-

ten un alto número de genes de avirulencia, se

ha detectado una alta interacción específica

entre algunos genes de avirulencia en el

patógeno y algunos genes de resistencia en la

planta, siendo esta interacción de mucha

importancia desde el punto de vista de mejo-

ramiento para el desarrollo de cultivares

resistentes (Tabla 2). Esta interacción especí-

fica es la base para la selección de progenito-

res que deben ser incluidos en un programa

de mejoramiento para resistencia al añublo

del arroz.

La caracterización de la estructura genéti-

ca o linajes, junto con el espectro de virulen-

cia y las frecuencias de los genes de avirulen-

cia en la población del patógeno deben enton-

ces proveer un estimativo más real de la

durabilidad de la resistencia que el estudio de

estos componentes por separado. En la Tabla

2 se observa que un gen de resistencia puede

ser atacado por aislamientos de diferentes

linajes genéticos como es el caso de los genes

Pi-t y Pi-ks. Por otro lado, ciertos genes de

resistencia son efectivos controlando todos

los patotipos de una misma familia genética o

de varias, aunque sean susceptibles a los

patotipos de otras familias. De esta forma, se

presentan cultivares con genes de resistencia

complementarios, los cuales en combinación

o después de acumularlos en un mismo culti-

var confieren resistencia a toda la población

del patógeno en estudio. Las líneas isogénicas

CT 13432-68, CT 13432-54 y CT 13432-55

que contienen los genes de resistencia Pi-1,

Pi-2 y Pi-33, respectivamente, tienen genes

de resistencia complementarios, los cuales en

combinación o piramidados en la línea isogé-

nica CT 13432-34 confieren resistencia con-

tra todos los aislamientos del patógeno perte-

necientes a las diferentes familias genéticas

del hongo encontradas en Colombia (Tabla

2).

La frecuencia de los diferentes genes de

virulencia y linajes genéticos depende de los

genes de resistencia utilizados en los cultiva-

res comerciales sembrados por el agricultor.

La frecuencia de los linajes genéticos cam-

bian entre años dependiendo del área sembra-

da con un cultivar y del espectro total de

virulencia de dicho linaje. En un estudio

sobre la frecuencia de compatibilidad de los

aislamientos mas virulentos de Colombia

sobre 201 cultivares de arroz de América

Latina (Correa-V, et al 2000), se observó que

la mayoría de los cultivares son susceptibles

al linaje SRL-6 (80,6%) seguido por el linaje

SRL-5 (68,7%). El patrón de compatibilidad

observado con los linajes SRL-6 y SRL-5

deben ser el resultado de una base genética

estrecha y similar presente en el germoplasma

que ha sido utilizado en América Latina para

el desarrollo de sus cultivares.

El linaje SRL-6 ha sido por muchos años

el mas frecuente en la población del hongo en

Colombia. Los linajes SRL-2 y SRL-4 han

aumentado en frecuencia ya que el área sem-

brada con cultivares susceptibles a estos

linajes ha aumentado en los últimos años.

Aislamientos de estos dos linajes exhiben

un amplio espectro de virulencia sobre los

cultivares de arroz de Colombia y líneas

isogénicas. La frecuencia de los linajes SRL-

1 y SRL-5 han disminuido en el tiempo ya

que los cultivares susceptibles a estos linajes

han casi desaparecido de los campos de los

agricultores. Estos dos linajes exhiben sin

embargo una alta compatibilidad con los

cultivares de arroz de América Latina. La

frecuencia de los linajes SRL-1 y SRL-3 ha

sido casi cero durante los últimos años debido

Figura 2. Estación experimental Santa Rosa para la evaluación de la resistencia a P. grisea utilizando la

metodología de esparcidores para la multiplicación y diseminación del patógeno manteniendo una alta

presión de la enfermedad


a la ausencia de cultivares susceptibles en

campos comerciales y al espectro de virulen-

cia estrecho exhibido por ellos sobre los

cultivares de Colombia.

Se ha observado también una ganancia en

virulencia (perdida de genes de avirulencia)

para la mayoría de los linajes mas predomi-

nantes como se observa en la subdivisión del

linaje SRL-6 en SRL-6B y el linaje SRL-4 en

la Tabla 2. La identificación temprana o antes

de que aumenten en frecuencia, de patotipos

con un amplio espectro de virulencia es de

uso practico para la identificación de genes de

resistencia que puedan ser usados en el even-

to que se pierda la resistencia de un cultivar

comercial.

En el CIAT los fitomejoradores han desa-

rrollado cultivares de arroz con resistencia

durable por mas 10 años tal como el cultivar

Oryzica Llanos 5 (Tabla 1) cuyos padres

exhiben susceptibilidad a los diferentes lina-

jes genéticos del patógeno (Figura 3). Nues-

tros estudios a partir de poblaciones del hon-

go recolectadas en campo a partir de cada uno

de los cinco progenitores demuestran que los

linajes que son aislados son específicos con

cada cultivar como se muestra en la Figura 3.

Inoculaciones bajo condiciones de inver-

nadero también demuestran que estos mismos

linajes son los que reinfectan al cultivar de

Tabla 2. Genes de avirulencia presentes en aislamientos de Pyricularia grisea de Colombia

Fuente

Gen Aislamiento/ Linaje Genético

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Resistencia L6B L6B L6 L4 L4 L4 L4 L2 L5

CT 13432-68 Pi-1 R R R R R R

CT 13432-54 Pi-2 R

CT 13432-55 Pi-33 R1 R R R R

C 104 PKT Pi-3 R

C 101 PKT Pi-4a R

C 105 TTP4 (L23) Pi-4b R

F 124-1 Pi-ta

F 128-1 Pi-ta2 R R R

F 80-1 Pi-k R R

F 98-7 Pi-km

F 129-1 Pi-kp R

F 145-2 Pi-b R R

Aichi Asahi Pi-a R

K 3 Pi-kh R R R R R R

K 59 Pi-t

Rico 1 Pi-ks

Norin 2 Pi-sh R R

Nato Pi- i

OU 244 Pi-z R R R R R

Toride Pi-zt R R R

CT 13432-34 Pi-1, Pi-2, Pi-33 R R R R R R R R R

1R = Reacción resistente o incompatible como resultado de la interacción entre un gen de avirulencia en el patógeno y un gen de resistencia en la planta.

Figura 3. Genealogía de la variedad Oryzica Llanos 5 con resistencia durable a P. grisea mostrando la reacción complementaria de la resistencia de los progenito-

res a diferentes linajes genéticos del patógeno


origen, y que cada progenitor presenta genes

de resistencia efectivos contra el resto de los

linajes del patógeno. Estos resultados sugie-

ren que estos padres contienen genes de

resistencia complementarios los cuales en

combinación confieren la resistencia durable

observada por mas de 10 años en este culti-

var. De acuerdo a Johnson (1984), resistencia

durable “es la resistencia que permanece

efectiva después de ser usada en grandes

extensiones por un período largo de tiempo

bajo condiciones ambientales favorables para

el desarrollo de la enfermedad”. El cultivar

Oryzica Llanos 5 ha cumplido con esta defi-

nición de durabilidad y es por esta razón que

es de nuestro interés determinar la composi-

ción genética del mismo para la identificación

de la combinación de genes que le confieren

su durabilidad.

Identificación y uso de combinaciones de

genes de resistencia a Pyricularia grisea

para el desarrollo de cultivares de arroz

con resistencia durable

Un total de 283 líneas recombinantes F7

originadas a partir del cruce entre las líneas

isogénicas C 101 LAC (genes de resistencia

Pi-1y Pi-33) x C 101 A51 (gen de resistencia

Pi-2) fueron desarrolladas para la identifica-

ción de microsatélites (McCouch et al, 2001)

asociados con estos tres genes de resistencia y

el desarrollo de líneas isogénicas con diferen-

tes combinaciones de dichos genes para

evaluar su resistencia a P. grisea tanto en

campo como en inoculaciones controladas.

Los resultados demuestran que la combina-

ción de los tres genes de resistencia Pi-1, Pi-2

y Pi-33 es la mas relevante para el mejora-

miento y desarrollo de cultivares con una

resistencia durable al patógeno.

La frecuencia de virulencia sobre cada

uno de los tres genes de resistencia es alta

dentro de algunos linajes genéticos pero

ningún aislamiento es compatible con los tres

genes (Tabla 2, Tabla 3). Hemos demostrado

tanto en inoculaciones de invernadero como

en evaluaciones de campo que la combina-

ción de los tres genes de resistencia (Pi-1 +

Pi-2 + Pi-33) en las líneas isogénicas CT

13432-34, CT 13432-107, CT 13432-189, y

CT 13432-246 (Tabla 2, Tabla 3, Figura 4)

confiere resistencia completa a las poblacio-

nes de P. grisea presentes en Colombia, las

cuales son compatibles con cualquiera de los

genes o la combinación de dos de ellos (Tabla

3, Figura 4).

De acuerdo a nuestros estudios, los genes

de avirulencia avr-Pi-1 y avr Pi-33 se en-

cuentran altamente conservados en la pobla-

ción del patógeno en Colombia, sugiriendo

que estos genes de avirulencia tienen una

menor frecuencia de mutación hacia virulen-

cia y probablemente son genes muy impor-

tantes en el “fitness” o sobrevivencia del

hongo función del correspondiente gen de

avirulencia para poder sobrepasar dicho gen

de resistencia. Por otro lado, el gen de aviru-

lencia avr Pi-2 está presente solo en el linaje

genético SRL-5, sugiriendo que este gen de

avirulencia tiene una mayor tasa de mutación

hacia virulencia y que el gen por si solo sería

muy poco durable. Esto se confirma en

nuestros resultados dado que la mayoría de

aislamientos en cuatro de los seis linajes

genéticos son compatibles con el gen de

resistencia Pi-2 (Tabla 2). Adicionalmente,

los genes de resistencia Pi-kh, Pi-sh, y Pi-z

pueden ser considerados de mucho uso po-

tencial (Tabla 2) ya que en combinación

también confieren resistencia a toda la pobla-

ción del hongo estudiada.

La interacción patógeno-planta en el

complejo arroz-pyricularia se ha demostrado

de acuerdo a la hipótesis del gen x gen (Flor,

1971), donde la resistencia resulta de la inter-

acción genética entre los genes de resistencia

en la planta y los genes de avirulencia en el

patógeno. Solo basta que se presente uno solo

de estos genes correspondientes en cada uno

de los organismos (planta y patógeno) para

que se manifieste la reacción resistente. La

mutación o perdida de uno de estos genes en

cualquiera de los dos organismos es determi-

nante para que la interacción deje de ser de

resistencia y se manifieste como susceptible.

Muchos genes de avirulencia pueden ser

factores de “fitness” altamente relacionados

con la capacidad de un organismo de sobrevi-

vir y reproducirse (Leach et al, 2001).

Se ha sugerido que los genes de avirulen-

cia de fácil capacidad de mutación en el

patógeno son probablemente menos críticos

sobre los procesos de “fitness” o capacidad de

reproducción y sobrevivencia que aquellos

que raramente mutan (Flor, 1971), y ha sido

indicado que el “fitness” de un patógeno es el

factor o fuerza principal en la evolución y

estabilidad de un patosistema en la agricultu-

ra (Van der Plank, 1968). De esta manera, se

considera que la calidad y durabilidad de un

gen de resistencia es una función directa de

los efectos impuestos al patógeno al perder la

Dos métodos han sido sugeridos para eva-

luar el efecto sobre el “fitness” impuesto por

la mutación de un gen de avirulencia sobre

las poblaciones del patógeno (Leach et al,

2001). Primero, determinar si hay una reduc-

ción de un gen de virulencia (gen de aviru-

Tabla 3. Reacción a Pyricularia grisea en hoja y cuello en líneas isogénicas con diferentes ccombina-

ciones de los genes de resistencia Pi-1, Pi-2 y Pi-33

Línea isogénica Gen Resistencia Añublo Hoja Añublo Cuello Inci-

dencia (%) BL41 BL51

CT 13432-95 Ninguno 9. 9 Muerte

CT 13432-110 Ninguno 9 9 Muerte

CT 13432-68 1 9 9 Muerte

CT 13432-54 2 9 9 Muerte

CT 13432-6 33 9 9 Muerte

CT 13432-230 1 + 2 9 9 Muerte

CT 13432-26 1 + 33 9 9 Muerte

CT 13432-193 2 + 33 8 5 15

CT 13432-34 1 + 2 + 33 2 2 0

CT 13432-107 1 + 2 + 33 2 1 0

CT 13432-189 1 + 2 + 33 2 1 0

CT 13432-246 1 + 2 + 33 2 1 0

1 Cuarta y quinta evaluaciones de añublo en la hoja (BL)

Figura 4 Resistencia completa a Pyricularia grisea de la línea isogénica CT 13432-34 conferida por la

combinación de los genes de resistencia Pi-1, Pi-2, Pi-33


lencia mutado) en ausencia del gen de resis-

tencia correspondiente en el campo. La hipó-

tesis es que si la mutación no confiere venta-

jas selectivas en el patógeno, entonces el gen

mutado desaparecerá de la población. Segun-

do, determinar directamente en el laboratorio

si la inactivación de un gen de avirulencia

conlleva un efecto directo sobre los compo-

nentes del “fitness” del patógeno. Estos estu-

dios requieren de una validación de los resul-

tados de laboratorio en el campo. Respuestas

positivas a estas dos preguntas pueden ser

consideradas como evidencia indicadoras de

que el efecto de los genes de avirulencia

sobre el patógeno puede ser usada como

indicador para predecir la durabilidad de un

gen o la combinación de varios genes de

resistencia. En otras palabras, aquellos genes

de resistencia que imponen al patógeno un

alto valor o efecto deletéreo al perder el gen

correspondiente de avirulencia para poder

adaptarse o romper la resistencia de dicho

gen, probablemente será un gen de resistencia

durable.

De esta forma, nuestros estudios han ve-

nido siendo encaminados hacia el desarrollo

de la capacidad para predecir la durabilidad

de los genes de resistencia con el objetivo de

utilizarlos eficientemente en nuestro progra-

ma de mejoramiento. Líneas isogénicas desa-

rrolladas en IRRI y CIAT con diferentes

genes de resistencia y combinaciones de ellos

han sido útiles para determinar la frecuencia

de los diferentes genotipos del hongo presen-

tes durante diferentes ciclos de cultivo tanto

en la estación experimental como en campos

comerciales. Aunque hay muchos casos que

demuestran que genes individuales de resis-

tencia pueden conferir una resistencia dura-

ble, nuestros estudios indican que este no es

el caso en el control de P. grisea en Colom-

bia. En la Tabla 3 podemos observar que para

los ocho genotipos posibles con la combina-

ción de tres genes de resistencia, el patógeno

presenta muy posiblemente siete genotipos,

excepto aquel que hubiera perdido la función

de los tres genes de avirulencia correspon-

dientes a los genes de resistencia Pi-1, Pi-2 y

Pi-33. Combinación única mostrando una

resistencia completa (Figura 4). Los resulta-

dos sugieren que el patógeno puede perder la

función de cualquiera de los genes de aviru-

lencia, o la combinación de dos de ellos, pero

no los tres genes (Tabla 2). Es posible que al

perder uno o dos de ellos, el otro gen de

avirulencia pueda todavía cumplir con todas

las necesidades metabólicas y de fitness en

general para asegurar la sobrevivencia del

hongo, la cual se vería posiblemente afectada

al perder los tres genes de avirulencia. En este

caso, es necesario que al pretender predecir la

durabilidad de la resistencia al utilizar estos

genes, sea necesario utilizar la combinación

de los tres genes y no uno o dos de los genes.

Es importante observar que aún en aisla-

mientos con un amplio espectro de virulencia

(perdida de muchos genes de avirulencia)

como es el caso del aislamiento 1 del linaje

indicado como L6B (SRL-6) en la Tabla 2,

este aislamiento ha perdido los genes de

avirulencia para los genes de resistencia Pi-1

y Pi-2, pero ha mantenido el gen de avirulen-

cia para Pi-33. Igualmente se observa para el

aislamiento 4 identificado con el linaje L4

(SRL-4), el cual ha perdido los genes de

avirulencia para Pi-2 y Pi-33, pero ha mante-

nido el gen de avirulencia avr-1, y el aisla-

miento 9 identificado con el linaje L5 (SRL-

5) perdiendo los genes de avirulencia avr-1 y

avr-33, pero ha mantenido avr-2. Por otro

lado, la combinación de los genes de resisten-

cia Pi-kh y Pi-z muestra igual exclusión y

resistencia a todos los linajes genéticos en

estudio (Tabla 2).

Las líneas isogénicas con diferentes genes

de resistencia son también útiles para identi-

ficar los posibles genes de avirulencia presen-

tes en diferentes aislamientos del patógeno,

los cuales pueden ser utilizados para predecir

cuales genes de resistencia pueden estar

presentes en un cultivar de arroz. La caracte-

rización de los genes de avirulencia en varios

centenares de aislamientos del hongo en

Colombia nos ha permitido inferir los posi-

bles genes de resistencia presentes en los

cultivares comerciales de arroz de Colombia

(Tabla 4) después de realizar inoculaciones

controladas en el invernadero con dichos

aislamientos.

Los cultivares Oryzica Llanos 5 y Fe-

dearroz 50 que han tenido una resistencia

durable (Tabla 1) presentan el mayor número

e iguales genes de resistencia (Tabla 4).

Estos dos cultivares parecen contener los

genes de resistencia Pi-2 y Pi-33 mas no el

gen Pi-1. La durabilidad de la resistencia en

estos cultivares se debe entonces a la acción

de los genes Pi-2 y Pi-33 junto con los otros

genes de acuerdo a la Tabla 2, y posiblemente

a la presencia de genes de resistencia no

conocidos.

Con el objetivo de predecir el posible

rompimiento de la resistencia durable exhibi-

da por los cultivares Oryzica Llanos 5 y

Fedearroz 50, para adelantar un programa de

mejoramiento que incorpore genes de resis-

tencia a los posibles linajes genéticos del

hongo que estén en proceso de evolución para

romper dicha resistencia, hemos venido

recolectando muestras de lesiones individua-

les en la hoja o en el cuello en estos dos

cultivares. Los resultados del análisis molecu-

lar de los aislamientos recolectados de estos

dos cultivares en los últimos años muestran

que mas del 90% pertenecen al linaje SRL-4

y el resto al linaje SRL-6. Estos aislamientos

no reinfectan a los dos cultivares en inocula-

ciones controladas de invernadero y no indu-

cen lesiones típicas de la enfermedad, y tan

solo los aislamientos del linaje SRL-4 indu-

cen ocasionalmente y bajo estrés nutricional

la formación de pequeñas lesiones sin esporu-

lación. Sin embargo, los resultados sugieren

que el linaje SRL-4 se encuentra en proceso

de evolución con mayores probabilidades de

romper la resistencia de los cultivares

Oryzica Llanos 5 y Fedearroz 50 que los

linajes SRL-6 y SRL-5, aunque el linaje SRL-

6 ha estado siempre en mayor frecuencia en

toda la población del hongo por muchos

años. Nuestra pregunta de porque el linaje

Tabla 4. Posibles genes de resistencia presentes en los cultivares comerciales de arroz de Colombia inferidos de inoculaciones con aislamientos de P. grisea que

poseen los correspondientes genes de avirulencia

Cultivar Arroz Gen de Resistencia

Pi-1 Pi-2 Pi-33 Pi-z Pi-zt Pi-ta2 Pi-sh Pi-kh Pi-k Pi-b

Oryzica 2 X1 X X X X X X

Oryzica 3 X X

Cica 8 X X X X

Cica 9 X X

IR 22 X X X

Linea 2 X

Oryzica Llanos 4 X X X

Oryzica Caribe 8 X X X

Oryzica Yacu 9 X

Oryzica Llanos 5 X X X X X X X X

Fedearroz 50 X X X X X X X X

1 X = Presencia del gen de resistencia


SRL-4 y no los otros dos se recuperan en

mayor frecuencia de los cultivares Oryzica

Llanos 5 y Fedearrroz 50 pudiendo llegar a

romper la resistencia de estos, se puede dedu-

cir de forma lógica de los datos presentados

en la Tabla 2, la cual muestra que en la evo-

lución mas avanzada del linaje SRL-4 mos-

trada en el aislamiento 4 de la misma tabla,

este aislamiento ha perdido todos los genes

de avirulencia hacia los genes de resistencia

presentes en Oryzica Llanos 5 y Fedearroz 50

de acuerdo a la Tabla 4. Este linaje no ha

perdido sin embargo el gen de avirulencia

hacia el gen de resistencia Pi-1, y no lo nece-

sita perder ya que el gen Pi-1 no esta presente

en ninguno de los dos cultivares (Tabla 4).

Por el contrario, los aislamientos que presen-

tan las mayores mutaciones dentro de los

linajes SRL-6 (aislamiento 1, Tabla 2) y

SRL-5 (aislamiento 9, Tabla 2), tendrían que

mutar los genes de avirulencia hacia los genes

de resistencia Pi-33 y Pi-2, respectivamente,

los cuales si estan presentes en los cultivares

Oryzica Llanos 5 y Fedearroz 50. Estos dos

linajes ya han perdido el gen de avirulencia

hacia Pi-1, y por lo tanto para romper la

resistencia de los dos

cultivares estarían perdiendo los tres genes de

avirulencia, avr-1, avr-2, y avr-33, lo cual de

acuerdo a nuestras discusiones anteriores

tendrían posiblemente un efecto deletéreo

sobre el patógeno. El linaje SRL-4 ha perdido

en los últimos años los genes de avirulencia

para los genes de resistencia Pi-ta2, Pi-k, y

Pi-b (Tabla 2), los cuales se encuentran pre-

sentes en dichos cultivares con resistencia

durable (Tabla 4). Este linaje no ha perdido el

gen de avirulencia hacia el gen Pi-kh, el cual

no se encuentra en los cultivares Oryzica

Llanos 5 y Fedearroz 50 y por lo tanto este

gen junto al gen Pi-1, podrían ser usados en

un programa de mejoramiento para ser incor-

porados en los dos cultivares complementan-

do así la resistencia y de alguna forma tratan-

do de ir delante de los procesos evolutivos del

patógeno que le permitan romper a nivel

comercial la resistencia durable. Los resulta-

dos también sugieren que estos cultivares

posiblemente presenten algún otro gen de

resistencia desconocido y que necesita ser

identificado, ya que todos los genes de resis-

tencia en Oryzica Llanos 5 y Fedearroz 50

presentados en la Tabla 4 son atacados por el

aislamiento 4 presentado en la Tabla 2. Dicho

estudio se encuentra en progreso actualmente

con el fin de elucidar e identificar a nivel

molecular todos los genes de resistencia

presentes en el cultivar Oryzica Llanos 5.

Con el objetivo de desarrollar cultivares

de arroz con resistencia durable a P. grisea

para otros países de América Latina, hemos

iniciado un programa de retrocruzamiento

para introducir los genes de resistencia Pi-1,

Pi-2, Pi-33 en 14 variedades comerciales de

arroz de la región (Tabla 5), las cuales toda-

vía juegan un papel importante en la econo-

mía de muchos agricultores a pesar de ser

susceptibles a la enfermedad.

El procedimiento de retrocruzamientos se

describe en la Figura 5 y la incorporación de

los tres genes de resistencia está siendo se-

guida mediante el uso de microsatelites

(McCouch et al, 2001), asociados con los

genes de resistencia, inoculaciones controla-

das en el invernadero con aislamientos apro-

piados que contengan los genes de avirulen-

cia respectivos, y la evaluación de la resisten-

cia en el campo bajo condiciones de alta

presión de la enfermedad y diversidad del

patógeno (Figura 2). Poblaciones y líneas

seleccionadas con los tres genes de resisten-

cia serán distribuidas a los diferentes países

de América Latina para la evaluación y selec-

ción de líneas que incorporen tanto la resis-

tencia como las otras características agronó-

micas deseadas.

CONCLUSIONES

La estructura genética de P. grisea en

Colombia está compuesta por pocas fa-

milias o linajes cuya frecuencia depende

de los genes de resistencia presentes en

las variedades cultivadas

Los estudios de frecuencias de genes de

avirulencia utilizando líneas isogénicas

con diferentes genes de resistencia son

útiles para la identificación de las com-

binaciones de genes de resistencia rele-

vantes para el control de P. grisea

P. grisea en Colombia presenta virulen-

cia a todos los genes de resistencia co-

nocidos. La resistencia durable al pató-

geno debe por lo tanto buscarse median-

te combinaciones de genes de resistencia

Basados en la contribución relativa de

los genes de avirulencia sobre el “fit-

ness” de P. grisea, genotipos de plantas

pueden ser diseñados y generados que

contengan las combinaciones mas efec-

tivas de genes de resistencia

Un patógeno como P. grisea el cual es

principalmente clonal, no parece ser ca-

paz de tolerar un aumento continuo de

mutaciones en sus genes de avirulencia

aún en el caso de que dichos genes con-

tribuyan con efectos pequeños en fitness

La combinación de los genes Pi-1, Pi-2,

y Pi-33 confiere resistencia a las pobla-

ciones de P. grisea en Colombia. El uso

de marcadores moleculares e inocula-

ciones controladas en invernadero son

muy útiles para la incorporación de los

genes de resistencia en poblaciones de

mejoramiento

Las poblaciones desarrolladas en pro-

gramas de mejoramiento con el fin de

acumular diferentes genes de resistencia

a P. grisea deben ser evaluadas y selec-

cionadas utilizando metodologías de

campo que ayuden a mantener una alta

presión de la enfermedad y diversidad

del patógeno

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Tabla 5. Variedades de arroz de América Latina

utilizadas en la incorporación de los genes de

resistencia Pi-1, Pi-2, y Pi-33 mediante retrocru-

zamientos y la ayuda de marcadores moleculares

e inoculaciones de Pyricularia grisea

Variedad País

Fedearroz 2000 Colombia

Colombia XX1 Colombia

Oryzica 1 Colombia

Fedearroz 50 Colombia

Epagri 108 Brasil (riego)

Irga 409 Brasil (riego)

Primavera Brasil (secano)

Bonanza Brasil (secano)

El Paso 144 Uruguay, Argentina

Cimarron Venezuela

Capirona Perú

Panamá 1048 Panamá

CR 1113 Costa Rica

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Figura 5. Programa de retrocruzamientos para la incorporación de los genes de resistencia a P. grisea Pi-1, Pi-2, y Pi-33 en variedades de arroz

de América Latina


EVIDENCIAS DEL MILDEO VELLOSO (Peronsclerospora sorghi (W. Weston &Uppal) C.G. Shaw)

EN CULTIVOS DE MAÍZ Y SORGO EN COLOMBIA

Carlos A. Huertas D1, Greicy Sarria V2 y Benjamín Pineda-L3

1 ICA, Sanidad Vegetal Palmira y Convenio ICA-CIAT, 2 ICA, Laboratorio de Sanidad Vegetal, Palmira,

3 Unidad de Recursos Genéticos, Laboratorio de Sanidad de Germoplasma, CIAT

RESUMEN

A comienzos de la década de los noventa en algunos cultivos de maíz

y sorgo de la costa atlántica colombiana se registró la presencia de

una enfermedad con características de mildeo velloso asociada a Pe-

ronosclerospora sorghi, adoptándose medidas tendientes a evitar su

diseminación y establecimiento; sin embargo recientemente se observó

de nuevo la enfermedad. En este caso se procedió a realizar un recono-

cimiento adicional para precisar su etiología. Se realizaron observa-

ciones “in situ” de la sintomatología y se recolectaron muestras para

análisis de laboratorio. Los síntomas observados estaban caracteriza-

dos por la presencia de crecimiento micelial de aspecto velloso en las

hojas, bandas cloróticas paralelas a las nervaduras, comenzando por la

base de la hoja, filodia de las inflorescencias y desgarramiento del

tejido foliar con la presencia de látigos en sorgo. Los análisis de labo-

ratorio de las muestras procedentes de Córdoba (Tierralta) mostraron

conidióforos ramificados de aproximadamente 305 μ con esterigmas

y conidias ovales a subesféricas con un rango de tamaños entre 25,6

x 20,48 - 25,6 x 23,4 µ, las cuales al germinar emitían un tubo germi-

nativo. En el caso de Sucre (Sincelejo) los conidióforos medían entre

270 y 340 µ, eran ramificados, poseían una célula basal de tipo bulbo-

so y una cicatriz o septa cerca a la base, las conidias eran redondea-

das con tamaños entre 12,2 y 21,95 μ (promedio de 15,8 μ) estaban

localizadas sobre esterigmas agudos y germinaban mediante emisión

de tubos germinativos. En las muestras recolectadas en el Valle del

Cauca (Rozo, Palmira) en sorgo forrajero (Sorghum spp.) se encon-

traron signos similares a los observados en maíz en Sucre y Córdoba,

incluyendo la detección de oosporas esféricas de doble pared y diáme-

tro entre 33,6μ y 43,2μ. Se concluye que la enfermedad presente en los

cultivos es el mildeo velloso, “downy mildew”, mildiu o mildeo del

maíz y el sorgo ocasionado por el hongo Peronsclerospora sorghi (W.

Weston & Uppal) C. G. Shaw.

Palabras claves: cuarentena, mildeos vellosos, diseminación, maíz,

sorgo, pasto Johnson

SUMMARY

In the early 1990s, some maize and sorghum plantings along the Co-

lombian Atlantic coast showed plants with characteristic mildew on

the leaves, which resembled symptoms caused by Peronosclerospora

sorghi. To avoid its dissemination, some regulations were implement-

ed. However, similar symptoms were recently found in the same areas,

making it necessary to initiate additional studies to determine the cor-

rect etiology of the problem. For this, various areas in the region were

surveyed and plants with symptoms were collected for laboratory

analysis. Tissue of infected leaves showed a white mycelial growth

with downy appearance, chlorotic stripes paralel to the midrib starting

at the basis of the leaves, phyllody in the tassel, and leaf-shredding

with leaves resembling a whip in sorghum. In the laboratory, samples

from Tierralta, Córdoba, showed conidiophores of approximately 305

µ, branched, with sterigmata bearing conidias ranging from 25.6 x

20.48µ – 25.6 x 23.4µ, which germinated through a germ tube. In

samples from Sincelejo, Sucre, conidiophores varied in length from

270-340 µ, with a swollen basal cell and a septum at its basis, with

conidia between 12.2-21.95 µ (aver. 15.8µ) over pointed sterigmata,

germinating through germ tubes. Samples collected at Rozo, Palmira,

Cauca valley, in forrage sorghum (Sorghum spp) symptoms similar to

those found at Sucre and Cordoba, including relatively spheric oo-

spores, with double wall measuring between 33.6-43.2 µ. Based on

this survey, it is concluded that the disease present in those crops is

sorghum downy mildew, caused by the fungus Peronosclerospora

sorghi (Weston & Uppal) Shaw.

Key words: Corn, sorghum, Johnson grass, downy mildew, quaran-

tine, dissemination.

INTRODUCCIÓN

El mildeo velloso, mildiu o “downy mildew”

del maíz y sorgo ocasionado por el hongo

Peronsclerospora sorghi (W. Weston &

Uppal) C.G. Shaw es una de las enfermeda-

des cuyo agente causal es considerado para

Colombia un patógeno exótico con estatus de

las plagas cuarentenarias categoría A1, por lo

tanto está sujeto a medidas regulatorias por

parte del ICA como responsable de la pre-

vención de riesgos fitosanitarios. Desde el

punto de vista de sanidad y de comercio in-

ternacional tiene serias implicaciones en la

comercialización de semillas y en el inter-

cambio seguro de germoplasma.

En la actualidad cuando en el país se está

fomentando el cultivo del maíz representa

una amenaza potencial por sus efectos detri-

mentales en la producción del cereal, sí no

son tenidas en cuenta las características gené-

ticas de los materiales de siembra. Existen

referencias en donde se menciona que esta

enfermedad puede ocasionar pérdidas consi-

derables en la producción cuando se utilizan

materiales susceptibles (Frederiksen et al,

1970; Malaguti et al, 1977).

Los mildeos vellosos o “downy mildews”

son un grupo de enfermedades que afectan

numerosos géneros y especies de gramíneas,

entre las cuales están incluídas el maíz, millo

y sorgo. Son ocasionadas por distintas espe-

cies de hongos del orden peronosporales,

familia peronosporaceae y se consideran de

importancia económica y cuarentenaria por

sus efectos negativos sobre la producción

(Frederiksen et al, 1970) y por las implica-

ciones en el movimiento de material de pro-

pagación (Comunidad Andina, 2003). En el caso específico del maíz se han re-

gistrado las especies Peronosclerospora

sorghi, Peronosclerospora maydis, Peronos-

clerospora philipinensis, Peronosclerospora

sacchari, Sclerospora graminícola, Sclerop-

hthora macrospora y Sclerophthora rayssiae

var zeae afectando el cultivo bajo diferentes

circunstancias (Smith y Renfro, 2.000 ; Fre-

deriksen y Renfro, 1977; Frederiksen et al,

1970).

La taxonomía y nomenclatura de Pero-

nosclerospora sorghi, parásito obligado que


pertenece a los Oomycetos, familia Peronos-

poraceae (Alexopoulus, 1966) ha sido some-

tida a cambios a través del tiempo por varios

taxónomos. Esta clasificación se inicia con

Saccardo en 1876, quien observó el hongo en

una muestra de Setaria verticillata, colectada

en la selva (Treviso) Italia y lo clasificó con

el nombre de Protomyces graminicola Sacc,

teniendo como base para su identificación la

presencia de la oospora (Shaw, 1970).

Posteriormente, Saccardo encontró en

1882 el estado imperfecto de éste hongo,

desarrollándose en Setaria viridis y lo reclasi-

ficó como Peronospora graminicola (Sacc.)

Sacc. (Shaw, 1970). Esta clasificación fue

revisada nuevamente por Schroeter en 1879,

quien propuso el nombre de Sclerospora

graminicola (Sacc). Schroet (Waterhouse,

1964). Después el patógeno fue estudiado por

Buttler en Sorghum vulgare (L) Moench y

Penisetum typhoideum L., en 1907 quien

observó que la fase oogonial presente en las

dos gramíneas eran similares, razón por la

cual lo asimiló como un patógeno común.

Sin embargo, en 1913 Kulkarmni, al realizar

estudios sobre el mildeo velloso en sorgo,

encontró las dos fases reproductivas del hon-

go: la oogonial y la conidial. Con relación a

la fase oogonial quedo impresionado por la

similitud que presentaba con la descrita pre-

viamente por Buttler, pero si encontró dife-

rencias en la fase conidial, éstas al germinar

emitían hifas y no zoosporas como era típico

en Sclerospora graminicola; con ésta y otras

característica, como la forma del conidióforo

y del esterigma, justificó ubicar éste patógeno

como una variedad de Sclerospora graminí-

cola (Sclerospora graminícola vr. andropo-

gonis-sorghi) (Weston y Uppal, 1932).

Esta clasificación fue revisada nuevamen-

te en 1932 por Weston y Uppal quienes pro-

pusieron incluír como especie sorghi al hon-

go que estaba causando mildeo velloso en

sorgo ubicándolo dentro del género Scleros-

pora. Para la propuesta tuvieron en cuenta

las diferencias de tipo estructural y fisiológi-

co que observaron, tales como la carencia de

papila de dehiscencia en la fase conidial,

germinación mediante emisión de un tubo

germinativo que luego se desarrollaba en

hifas; la forma típica del conidióforo, el cual

era erecto y constituido por un talo principal

que soportaba tres brazos aproximadamente

de igual tamaño y extensión, la presencia de

una célula basal en forma de bulbo separada

del talo principal por un tabique (Weston y

Uppal, 1932).

Con relación al rango de hospedantes y

restricción del parasitismo también se obtu-

vieron diferencias al inocular oosporas de

Sclerospora graminicola, Sclerospora sorghi

y Sclerospora noblei en diferentes hospede-

ros. Sclerospora sorghi solamente infectó a

Sorghum bicolor y Euchlaena mexicana y a

diferentes variedades del maíz, mientras que

Sclerospora graminícola infectó solamente a

Penisetum typhoideum, Setaria italica y Eu-

chlaena mexicana. Sclerospora noblei no

infectó a las especies de gramíneas mencio-

nadas anteriormente (Weston y Uppal, 1932).

Finalmente, Shaw (1978) propuso elevar a

Peronosclerospora como género y transfirió

a éste las especies que producían conidias y

estaban incluídas dentro del género Scleros-

pora así: Peronosclerospora dichanthiicola,

Peronosclerospora maydis, Peronosclerospo-

ra miscanthi, Peronosclerospora philipinen-

sis,Peronosclerospora sacchari Peronoscle-

rospora spontanea, Peronosclerospora

sorghi y Peronosclerospora westomii.

El ciclo de vida se inicia cuando las oos-

poras (inóculo primario) presentes en el suelo

infectan las plántulas a través de las raíces y

se inicia un proceso de infección sistémica

que invade los tejidos de la planta. En las

hojas se inicia la formación de conidióforos y

la producción de conidias. Las conidias

(inóculo secundario) son diseminadas por el

viento e inducen nuevas infecciones en plan-

tas jóvenes. Las oosporas se producen al final

del ciclo del cultivo cuando las bandas cloró-

ticas sobre las hojas cambian a color marrón,

se rompen los tejidos y éstas se liberan ca-

yendo al suelo (Bonde, 1982; Smith y Renfro,

2000).

P. sorghi se disemina principalmente por

las oosporas que contaminan las semillas o

los residuos de cosecha, por el viento, o en el

suelo de áreas infestadas, por conidias a cor-

tas distancias y por el micelio presente en las

semillas o en los tejidos de los hospedantes

(Frederiksen, 1980).

Las oosporas son estructuras de reposo

de paredes gruesas que se producen en sorgo

infectado sistemícamente y en menor pro-

porción en maíz; generalmente son viables

por lo menos por tres a 10 años bajo diversas

condiciones. Las oosporas infestan el suelo

como esporas libres y son diseminadas por el

viento, aun cuando no se tiene información

detallada al respecto (Frederiksen, 1980).

Las conidias son de muy corta duración

(pocas horas bajo condiciones ideales) y de

poca importancia en la dispersión del pató-

geno a gran escala, pero sí a cortas distancias

especialmente entre plantas o en hospedantes

susceptibles (Frederiksen, 1980).

En cuanto a la diseminación por semilla

se sabe que las plantas infectadas sistémica-

mente son estériles o producen muy pocas

semillas disminuyendo el riesgo de disemina-

ción por este método, sin embargo experi-

mentalmente se ha demostrado en sorgo que a

partir de semillas procedentes de plantas en-

fermas que aún conservan adheridas las glu-

mas se obtienen plántulas infectadas con mildeo. Cuando se remueven totalmente las

glumas no se presentan casos de infección

(Frederiksen, 1980; Bonde, 1982; Smith y

Renfro, 2000) mencionan que existe la posi-

bilidad de trasmisión por semilla por cuanto

el patógeno se localiza en el pericarpio y en

el escutelo, sin embargo considera que esto

puede ocurrir cuando se utilizan semillas

frescas o recién cosechadas. Otro método posible de diseminación es

por el micelio que se encuentra dentro de las

semillas, el cual ha sido observado en la re-

gión del embrión de semillas de sorgo, millo

y maíz aparentemente normales. Este método

de diseminación se menciona a menudo, pero

hay pocas evidencias de que esto ocurra, por

cuanto es difícil que el micelio sobreviva en

semillas con contenido de humedad por de-

bajo del 12% (De León, 2001; Bonde,1982).

Los agentes causales de los mildeos ve-

llosos en gramíneas son originarios del Asia,

desde donde se han diseminado a otros países

(Smith y Renfro, 2000) y al continente ame-

ricano, en donde se han registrado las espe-

cies Sclerospora graminícola, Peronoscle-

rospora sorghi (Sin. Sclerospora sorghi) y

Sclerophthora macrospora (Frederiksen y

Renfro, 1977). P. sorghi llegó a los Estados

Unidos, en el año 1962 y fue localizado en

diferentes sitios de Texas, Kansas Oklahoma,

Nuevo México, Arkansas, Luisiana y Georgia

afectando maíz y sorgo (Frederiksen et al,

1970). En Venezuela el mildeo fue registrado

por primera vez en el año de 1973, infectando

maíz, sorgo y falso Johnson. El agente causal

fue clasificado por Nass et al, (1976) como

Peronosclerospora maydis, sin embargo pa-

rece que hubo una confusión en la clasifica-

ción de la especie presente en Venezuela,

según registros anteriores de la enfermedad

(Malaguti et al, 1977) en donde se le atribuye

a Sclerospora sorghi (Syn Peronosclerospo-

ra sorghi).

En Colombia Scleropthora macrospora

fue registrado por primera vez por Granada y

Varón (1983) en un lote de maíz Pioneer

6816, localizado en la finca “La Lindosa” del

Municipio de Miranda (Cauca). Las plantas

afectadas presentaban filodia en la inflores-

cencia masculina por transformación de ésta

en una multitud de hojas pequeñas. En el

laboratorio observaron las oosporas del hon-

go y concluyeron que el microorganismo

presente era S. macrospora agente causal de

la punta loca o “crazy top”. Este diagnóstico

fue ratificado por Carlos De León del

Cimmyt en México.

En 1990 Osorio y Buriticá informaron

sobre la presencia del mildeo velloso en va-

riedades e híbridos de sorgo, localizados en

un foco en el Departamento de Córdoba y

siete en el Departamento de Cesar (Buriticá

et al, 1992; Arias et al, 1993), Buriticá y

colaboradores enviaron muestras a Richard

A. Fredericksen especialista en “ Downy

mildew” de la Universidad de Texas en Esta-

dos Unidos, quien corroboró en ellas la pre-

sencia de Peronosclerospora sorghi. Adicio-

nal a las observaciones iniciales Buriticá

encontró algunas plantas espontáneas de Pas-

to Johnson (Sorghum halepense (L) Pers) y

Sorghum durra (Orssk) Taof infectadas por

P. sorghi en la inmediaciones de los focos de

la enfermedad, constatando en el laboratorio

la presencia de conidias y oosporas (Buriticá,

1992).

Por otro lado, los funcionarios de Sani-

dad Vegetal del ICA revisaron e hicieron


57

seguimiento a través del tiempo de ésta pro-

blemática fitosanitaria y en el primer semes-

tre de 1992, encontraron tres plantas de sorgo

infectadas con mildeo velloso, localizadas en

el lote “El Pozón” Centro de Investigaciones

Motilonia del ICA en Codazzi (Arias et al

1993). En el segundo semestre de 1992, loca-

lizaron nuevamente tres plantas con la en-

fermedad en socas de la variedad Sinapur ZR

sembrada en la finca Barcelona del Municipio

de Curumaní, Departamento del Cesar. Se

dictaron medidas tendientes a erradicar los

focos y consideraron como comportamiento

monocíclico el desarrollo de la enfermedad.

(Arias et al, 1993). Las medidas adoptadas

consistieron en aplicar al lote el funguicida

metalaxyl, posteriormente glifosato y final-

mente la incorporación del material vegetal al

suelo mediante dos pases de rastra pesada a

30cm de profundidad. Con éste enfoque del

manejo del problema consideraron que era

suficiente para la no declaratoria del estable-

cimiento de ésta enfermedad.

Finalmente, Campo et al (1999) detecta-

ron nuevamente la enfermedad en maíz H-

663 de 20 días de sembrado, localizado en la

Vereda Gramalote del Municipio de Tierralta.

Igualmente, encontraron la enfermedad en

pasto Johnson. Para su identificación, tuvie-

ron en cuenta la descripción de síntomas típi-

cos caracterizados por la presencia de man-

chas cloróticas irregulares que se iniciaban

desde la base de las hojas, la excesiva elon-

gación de tallos y la presencia de hojas erec-

tas y delgadas, síntoma conocido como “caña

flecha; la presencia de oosporas de doble

pared dentro del tejido infectado y la produc-

ción de la fase conidial.

Ante la evidencia de Campo et al (1999)

acerca de la presencia de P. sorghi, un pató-

geno exótico con estatus cuarentenario tipo

A1 en Colombia, el Instituto Colombiano

Agropecuario (ICA) para los fines consi-

guientes, consideró conveniente verificar el

registro mediante la conformación de comi-

siones técnicas lideradas por el autor princi-

pal del presente documento, durante 1999,

2001 y 2002, con el fin de realizar un recono-

cimiento de la enfermedad en algunos de los

sitios en los departamentos de Sucre y Cór-

doba en donde se había observado ël distur-

bio en años anteriores el disturbio, incluyen-

do posteriormente el Valle del Cauca.

METODOLOGÍA Durante la ejecución del reconocimiento en

1999, 2001 y 2002, se practicaron in situ las

inspecciones visuales a los lotes afectados, se

describieron los síntomas y se recolectaron

muestras para la verificación de los signos de

la enfermedad en el laboratorio así:

Departamento de Córdoba

El 16 de julio de 1999, se visitó un lote de

una hectárea de maíz, sembrado con el híbri-

do de maíz C-343 de 60 días de edad, locali-

zado en la vereda Gramalote del municipio de

Tierralta, en donde se encontraron algunas

plantas con clorosis foliar en forma de ban-

das lineales que se extendían paralela a las

nervaduras desde la base hacia el ápice de las

hojas y una estas bandas se observó un hongo

blanco y una clorosis de forma irregular que

se extendía a partir de la base de la hoja, sín-

toma conocido como de “media hoja” (Figura

1a).

Se tomaron muestras para analizarlas en

laboratorio de la Facultad de Agronomía de la

Universidad de Córdoba mediante observa-

ciones al estereoscopio y el microscopio de

luz. Para determinar la presencia de oosporas

se decoloró el tejido con KOH al 5% y con

hipoclorito de sodio al 1%.

Departamento de Sucre

El 27 de julio de 2001 y Junio 12 de 2002 se

visitó una empresa comunitaria, localizada

en la vereda de Castañeda del municipio de

Sincelejo, la cual tenía varios lotes de maíz

sembrados con la variedad ICA V-109, en

diferentes estados de desarrollo.

Durante el recorrido al lote se observaron

plantas de maíz que presentaban a lo largo de

las hojas bajeras clorosis en forma de bandas

paralelas a las nervaduras y sobre estas ban-

das en algunas plantas se observaba el creci-

miento de un hongo de color blanco de cre-

cimiento algodonoso.

También, en algunas plantas se observa-

ron áreas cloróticas de forma irregular que se

desarrollaban a partir de la base de las hojas,

síntoma conocido como de “media hoja”.

También se encontraron alrededor del lote

plantas de pasto Johnson (Sorghum halepen-

se) con los mismos síntomas. En otros lotes

de maíz de la misma empresa comunitaria

aproximadamente 20% de las plantas, exhi-

bían las estructuras florales tanto masculinas

como femeninas completamente deformadas

y con presencia de filodia (Figura 1b). Estas

estructuras se examinaron mediante el desga-

rre de los tejidos para verificar si presentaban

masas negras de esporas de Sphaceloteca

reiliana, agente causal del carbón de las espi-

gas, enfermedad que suele confundirse con el

mildeo velloso del maíz, o en otros casos

estar asociada con ésta (Reyes et al, 1964).

Durante la segunda visita, en junio de

2002, en las observaciones realizadas se

comprobó la misma situación de la primer

visita en cuanto a la presencia del mildeo

velloso y su incidencia sobre la variedad ICA

V-109. Adicionalmente, se observó que la

variedad ICA V-305 sembrado por los agri-

cultores no presentaba la enfermedad, proba-

blemente por poseer resistencia al patógeno.

Las diez muestras de hojas de maíz colec-

tadas en el campo en el departamento de

Sucre con la sintomatología descrita ante-

riormente, se analizaron en el laboratorio de

Sanidad de Germoplasma (LSG) de la Unidad

de Recursos Genéticos en CIAT de acuerdo

con la metodología sugerida por De León

(datos no publicados). Para el caso, se lava-

ron las hojas con agua limpia y jabón, poste-

riormente se colocaron en posición vertical en

un balde plástico que contenía una lámina de

agua de 2-3cm para hidratarlas y obtener una

humedad relativa alta, luego se cubrieron con

una bolsa grande de plástico negro para darle

condiciones de oscuridad y se dejaron en un

cuarto a temperatura ambiente fresca (+ 24

ºC) durante 15 horas. Al final, bajo estas

condiciones se encontró que cuatro de las 10

hojas de la muestra manifestaban la presencia

abundante de un micelio blanquecino de as-

pecto velloso desarrollado en el envés de la

lámina foliar. Este crecimiento se observó en

un microscopio estereoscopio y con la ayuda

de un pincel de pelo de camello No. 6 se

montaron muestras del micelio y de las es-

tructuras sobre portaobjetos con gotas de azul

de algodón, para observarlas en un microsco-

pio de luz y tomar microfotografías de estas

estructuras.

Departamento del Valle

En el mes de marzo del 2003, se visitó en el

corregimiento de Rozo municipio de Palmira

un lote de producción de sorgo forrajero

(Sorghum spp). En la inspección del lote se

observaron plantas que presentaban bandas

amarillentas a blanquecinas siendo más visi-

bles en el haz delas hojas. Las bandas se ini-

ciaban desde la base y llegaban hasta el ápice

de la hoja, distribuyéndose en forma paralela

a la nervadura central (Figuras 1c, 1d). En

estados avanzados, estas bandas presentaban

un aspecto necrótico de color pardo. Las ho-

jas afectadas aparecían rasgadas desde el

ápice hacia la parte interna de la hoja mos-

trando apariencia de látigo (Figura 1 e). Por

el envés se encontró un micelio blanco, sien-

do más abundante en infecciones iniciales.

Las muestras recolectadas para analizarlas en

el Laboratorio de Diagnóstico Vegetal del

ICA Palmira, fueron colocadas en condicio-

nes de alta humedad y oscuridad para inducir

la esporulación del microorganismo. Poste-

riormente fueron analizadas microscópica-

mente para verificar la presencia de signos

del patógeno. De igual manera, se tomó tejido

afectado, especialmente en estados avanza-

dos, se decoloró con KOH al 5% y se lavó

con agua destilada para observarlo al mi-

croscopio y detectar la presencia de oospo-

ras.

RESULTADOS

Departamento de Córdoba

A partir de las muestras colectadas en el

municipio de Tierralta (Córdoba) en el labo-

ratorio de la Universidad de Córdoba se

montaron placas del tejido afectado, por el

sistema de impronta y toma directa de las

estructuras del hongo, las cuales fueron ob-

servadas a través del microscopio de luz y

preparadas para tomar fotomicrografías.


En la muestra tomada bajo el sistema de

impronta, se observó una estructura en forma

de árbol, ramificada en la parte superior con

unas estructuras redondas y ovaladas (Figuras

2a, 2d).

En la toma directa de estructuras, se ob-

servó con nitidez la presencia de las estructu-

ras descritas por el sistema de improntas,

donde las estructuras redondas y ovaladas

correspondían a conidias de paredes delgadas

y sin papilas, que al germinar emitían un tubo

germinativo. Se midieron estas estructuras,

las cuales variaron en promedio entre 25,6 x

20, 48-23,4µ (Figura 2d). No se observaron

oosporas en el tejido enfermo.

Las características del hongo encontrado

eran muy similares a las del hongo Perons-

clerospora sorghi y los síntomas correspon-

dían a los de un típico mildeo velloso según

lo registrado en la literatura (Francis y Wi-

lliams, 1983; Smith y Renfro , 2000; Weston

y Uppal, 1932)

Departamento de Sucre

Las observaciones al estereoscopio de las

muestras de hojas infectadas colectadas en

Sincelejo permitieron constatar la presencia

de un hongo de color blanco con ramificacio-

nes aéreas que contenían unas estructuras

agrupadas y el desarrollo de estructuras indi-

viduales, erectas, que emergían de los esto-

mas. El análisis mediante el microscopio de

luz, permitió determinar que las placas prepa-

radas contenían estructuras características a

las desarrolladas por un hongo de la familia

Peronosporaceae, con conidióforos y conidias

(Figuras 2b, 2c, 2e). Los conidióforos con

una longitud que variaba entre 270 y 340µ,

eran hialinos, constituidos de una rama prin-

cipal, con tres ramificaciones en la parte su-

perior y cada ramificación terminaba en pun-

tas delgadas (esterigmas), donde se observa-

ban adheridas estructuras de aspecto globoso.

También presentaba una célula basal de tipo

bulboso y una cicatriz o septa cerca a la base

(Figuras 2b, 2c). Las estructuras globosas

eran esféricas, de paredes delgadas, lisas y sin

papilas, las cuales germinaban mediante la

emisión de un tubo germinativo (Figura 2e) y

correspondían a conidias y no a esporangios.

Al determinar el diámetro de estas estructuras

se encontró que oscilaba entre 12,2 y 21,95 μ

con un promedio de 15,8μ.

El análisis microscópico por decoloración

de tejidos permitió visualizar unas pocas

oosporas (Figura 1 f) más o menos esféricas

de paredes gruesas con dimensiones aproxi-

madas entre 27,3 μ y 39,4 μ (Víctor H. Caste-

llanos, informe de la comisión técnica, Julio

de 2002)

Las características del hongo encontrado

y la sintomatología también condujeron a la

conclusión de que se trataba, como en el caso

anterior, del mildeo vellosos ocasionado por

Peronsclerospora sorghi.

Departamento del Valle

Las muestras recolectadas en el corregimien-

to de Rozo (Palmira, Valle del Cauca) anali-

zadas microscópicamente mostraron la pre-

sencia de un hongo con conidióforos erectos,

gruesos y ramificadas en la parte superior

(Figuras 2g, 2h). Sobre los esterigmas se

observaron estructuras similares a conidias

redondas u ovaladas, las cuales en algunos

casos presentaron la emisión de un tubo ger-

minativo (Figura 2j). Las muestras de tejido

decoloradas con KOH al 5% al observarlas al

microscopio contenían oosporas más o menos

esféricas con doble pared y color marrón

rojizo, alineadas en forma de bandas interna-

mente en el tejido, sus dimensiones oscilaban

entre 33,6μ y 43,2μ (Figuras 2j, 2i).

DISCUSIÓN

La sintomatología observada consistente en la

presencia de crecimiento fungoso de aspecto

velloso en las hojas, filodia de las inflores-

cencias masculinas y femeninas, bandas clo-

róticas paralelas a las nervaduras de color

marrillo en los tejidos, desgarramiento del

tejido foliar con la presencia de látigos coin-

cide con la descrita para la enfermedad por

Francis y Williams (1983); Smith y Renfro

(2000); Weston y Uppal, (1932).

El tamaño y apariencia de las estructuras

del patógeno presentó variaciones menores en

tamaño entre los tres sitios objeto del estu-

dio, situación apenas normal por cuanto un

organismo suele presentar diferencias de

acuerdo a la localidad por efecto del me-

dioambiente, el genotipo del hospedante y

aún por las propiedades intrínsecas del pató-

geno. De todas maneras las características y

dimensiones determinadas para las estructu-

ras del hongo se localizaban dentro del rango

que caracteriza a P. sorghi, según las descrip-

ciones de Smith y Renfro, (2000), Francis y

Williams, (1983), Shaw (1978) y Weston y

Uppal (1932) resumidas a continuación:

Figura 1. Síntomas de mildeo velloso

(P. sorghi) en maíz ICA V 109 y sorgo

forrajero: a. Clorosis con bandas irregu-

lares localizadas en la base de una hoja

de maíz. b. Inflorescencia masculina

severamente afectada por filodia. c.

Planta de sorgo mostrando bandas cloró-

ticas paralelas a las nervaduras. Nótese

la necrosis del tejido foliar. d. Detalle de

los síntomas de mildeo en una hoja de

sorgo: nótense las bandas cloróticas y el

crecimiento del hongo de aspecto vello-

so en el envés. e. Hoja de sorgo con

necrosis (flecha blanca) y desgarramiento

de tejido con formación de “látigo”

(flecha magenta). Fotos C.A.Huertas D.

a b

c d

e


59

conidióforos hialinos de 180-300 µ de longi-

tud, usualmente dicotómicos ramificados de

dos a tres veces, septados cerca de su base;

las conidias ovales a casi esféricas de 14,4 –

27,3 x 15-28,9µ que germinan mediante un

tubo germinativo y oosporas de color ma-

rrón a subhialinas, esféricas con un diámetro

entre 25-42,9µ, que también emiten tubo

germinativo al momento de germinar.

Es de anotar que durante el estudio no

se encontraron oosporas en las muestras

obtenidas en los lotes de maíz en Tierralta,

pero éstas ya habían sido observadas por

Campo et al durante sus investigaciones en

1999, además se debe tener en cuenta que las

muestras correspondían a maíz y en esta plan-

ta generalmente se encuentran en menor pro-

porción (Frederiksen, 1980).

Para concluir, las observaciones de los

síntomas de la enfermedad presentes en los

cultivos de sorgo en los sitios visitados de

los departamentos de Córdoba, Sucre y Valle

del Cauca, y el análisis en el laboratorio de

las muestras recolectadas para verificar la

presencia de signos permitieron comprobar

que la enfermedad objeto del reconocimiento

correspondía al mildeo velloso, “downy mil-

dew”, mildiu o mildeo del maíz y el sorgo

ocasionado por el hongo Peronsclerospora

sorghi (W. Weston &Uppal) C. G. Shaw;

resultados que concuerdan con los registros

anteriores de otros investigadores quienes

determinaron la presencia del patógeno desde

1990 hasta el 2000 (Buriticá et al, 1992;

Arias et al, 1993; Campo et al, 1999; Huer-

tas,1999).

Respecto a la diseminación de la enfer-

medad desde el primer registro en 1990 hasta

el presente es necesario hacer algunos comen-

tarios que pueden ser de interés, particular-

mente si se quiere establecer un plan de ma-

nejo de la enfermedad en el país.

De acuerdo a la información consultada

(Arias et al, 1993) en los comienzos de la

decada de los noventa se dictaron medidas

tendientes a erradicar los focos de mildeo en

el departamento del Cesar, pero no se men-

ciona nada respecto a los que Buriticá et al

(1992) había registrado en el Departamento

de Córdoba. Esto explicaría la situación ac-

tual de esa región en donde aun está presente

la enfermedad.

Por otra parte las medidas para erradica-

ción de los focos, adoptadas con base en la

consideración de que la enfermedad era de

comportamiento monocíclico, y consistentes

en aplicar al lote metalaxyl, posteriormente

Glifosato y finalmente incorporación del

material vegetal al suelo mediante dos pases

de rastra pesada a 30cm de profundidad

(Arias et al, 1993), probablemente no surtie-

ron los efectos esperados. Es posible que aún

continúe presente la enfermedad en el depar-

tamento del Cesar, situación que debe com-

probarse, pues en el presente estudio no se

incluyó dicha región.

Adicionalmente, en la aplicación de las

medidas regulatorias no se menciona si se

aplicaron o no a los hospedantes del pató-

geno, y estos crecen en los bordes de los cul-

tivos, pasando en muchos casos desapercibi-

dos pero que son fuentes de inoculo perma-

nentes y muy importantes. Para el caso es

fundamental tener en cuenta que el patógeno

P. sorghi tiene hospedantes naturales como

el pasto Johnson (Sorghum halepense (L)

Pers) y Sorghum durra (Orssk) Taof, hallados

por Buriticá (1992) en las cercanías de los

g

e

a c b

d

i

h j

Figura 2. Estructuras microscópicas de Peronosclerospora sorghi detectadas en muestras de maíz y sorgo afecta-

das por mildeo velloso. a. Conidióforo en forma de árbol, ramificado en la parte superior con conidias redondas y

ovaladas encontrado en hojas de maíz (Tierralta, Códoba). b. Conidióforo con tres brazos, esterigmas y conidias,

observado en muestras de maíz ICA V 109 ( Sincelejo, Sucre). Nótese el tabique (flecha) y la célula basal. c.

Detalle del conidióforo b, nótese la terminación de los esterigmas. d. Conidias redondas y ovaladas encontrado en

hojas de maíz (Tierralta, Códoba). e. Conidias germinando mediante tubos germinativos obtenidas de muestras de

maíz ICA V 109 (Sincelejo, Sucre). f. Oosporas encontradas en tejidos de maíz en muestras de maíz ICA V 109.

nótese la doble pared (Sincelejo, Sucre). g. Parte apical de un conidióforo obtenido de muestras de Sorgo forrajero

(Rozo, Palmira, Valle), nótense algunas conidias germinadas. h. Parte inferior del conidióforo g . i. Oosporas en

tejido foliar de sorgo forrajero (Rozo, Palmira, Valle) distribuidas en bandas. j. Detalle de las oosporas i, nótese la

forma y la coloración característica. (Figuras a, b, i x 10X ; d 100X; c, e, g, h, j 40X )

Fotografías a, d O. Campo, Z Lozano, C. A. Huertas; b, c, e B. Pineda –L , C. A. Huertas; f V. C. Castellanos Convenio ICA Centro de

diagnóstico vegetal Unillanos- Facultad de Agronomía-Fitopatología); g.h.i,j F. Varón de A. , G. Sarria, C. A. Huertas D.

f


cultivos afectados.

El papel de las oosporas también es un

elemento importante al diseñar medidas de

control pues son estructuras de resistencia

que sobreviven de tres a diez años en el suelo.

Es muy posible, en el caso del Cesar, que al

enterrar los residuos de cosecha se les prote-

gió y cuando surgieron condiciones favora-

bles iniciaron nuevas infecciones en los culti-

vos, especialmente si se tiene en cuenta que

según Bonde, 1982; Smith y Renfro, 2000 el

ciclo de vida se inicia cuando las oosporas

presentes en el suelo infectan las plántulas a

través de las raíces y se inicia un proceso de

infección sistémica que invade los tejidos de

la planta.

Adicionalmente se sabe que el patógeno

es del tipo policíclico y que puede multipli-

carse rápidamente a través de conidias produ-

ciendo infecciones múltiples durante una

cosecha. Al quedar oosporas en el suelo

(inóculo primario) y presencia de hospederos

peremnes como el pasto Johnson y por las

características del patógeno se generan mu-

chos ciclos secundarios con la producción

constante de conidias que son diseminadas a

corta distancia por el viento, la enfermedad

se mantuvo en el tiempo. Por otra parte las

condiciones ambientales de las regiones (alta

humedad relativa cercana a saturación, tem-

peraturas frescas durante la noche) pudieron

favorecer el desarrollo y establecimiento de la

enfermedad, si se tienen en cuenta las obser-

vaciones de Bonde, (1982); Smith y Renfro,

(2000), pues las temperaturas entre 170C y

290C (óptimas entre 24-26 0 C ), saturación

atmosférica o agua libre y temperaturas mo-

deras entre 210C -250C, favorecen el desarro-

llo de la enfermedad. Por otra parte las oos-

poras caen al suelo cuando se rompe el tejido

(látigos) y pueden ser transportadas por el

agua de riego a distancias largas (Bonde,

1982)

La aparición de los focos de la enferme-

dad en Sucre y Valle del Cauca deberían ser

evaluados en cuanto a su origen, por cuanto

es posible que estén asociados al movimiento

de semillas sin el tratamiento adecuado.

Para el manejo adecuado de la problemá-

tica actual del mildeo velloso (Peronscleros-

pora sorghi (W. Weston & Uppal) C. G.

Shaw) en Colombia se recomienda diseñar un

plan de acción tendiente a frenar el avance de

la enfermedad a los cultivos de maíz y sorgo

establecidos en el país, con base en un reco-

nocimiento detallado de todas las zonas pro-

ductoras. En el reconocimiento se deben tener

en cuenta las malezas hospedantes del pató-

geno. También, como una medida preventiva

se debe recomendar el tratamiento de semillas

con productos específicos como el metalaxyl,

antes de la siembra. Se debe fomentar la

investigación y los planes de obtención y

utilización de genotipos con resistencia a la

enfermedad

Como quiera que aún la investigación

acerca del comportamiento del patógeno en

las condiciones de Colombia aún no se han

concluído es importante continuar con las

investigaciones acerca del comportamiento

del P. sorghi, particularmente en cuanto a la

patogenicidad en maíz y sorgo de las oospo-

ras producidas en Pasto Johnson (Sorghum

halepense ) u otros hospedantes. Además se

deben incluir estudios relacionados con la

presencia de otros agentes causales de mil-

deos en gramíneas que se pueden encontrar

en Colombia.

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan sus agradecimientos

Carlos de León del CIMYT, a Carlos Kleffel,

Víctor Hugo Castellanos, Francia Varón de

Agudelo, Luis Enrique Guevara, P, Antonio

Madroñero del ICA, a Rodrigo Orlando

Campo y Zaida E. Lozano de la Universidad

de Córdoba; a José Luis Ramírez del LSG-

CIAT.

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GENÉTICA DE LA RESISTENCIA A PUDRICIÓN CAUSADA POR

Phytophthora tropicalis EN DOS POBLACIONES SEGREGANTES DE

YUCA (Manihot esculenta Crantz)

Elizabeth Álvarez, John Loke, Sandra Rivera y Germán Llano

Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), AA 6713, Cali, Colombia

RESUMEN

Una de las principales herramientas para el manejo de pudriciones

radicales causadas por diversas especies de Phytophthora, es el uso de

resistencia varietal, para lo cual se hace necesario entender la

complejidad de la base genética de la yuca. Con este propósito, se

evaluó la resistencia de los padres y las progenies de las familias de

yuca K (M Nga 2 x CM 2177-2) y CM 9582 (M Bra 1045 x M Cr 81),

a Phytophthora tropicalis. Además de los parentales de cada familia,

se inocularon raíces frescas de 69 individuos de la familia K y 43 de la

familia CM 9582. Con la evaluación fenotípica y con base en el mapa

molecular de M Nga 2, madre de la familia K, se identificaron y

mapearon QTLs asociados a la resistencia a P. tropicalis, mediante

análisis de marcador simple. Los genotipos de yuca de la familia K,

evaluados durante los años 2000 y 2001 mostraron un porcentaje de

área de raíz afectada entre el 22% y 95%. La correlación entre las

evaluaciones de los años 2000 y 2001, fue –0.15. Los genotipos de

yuca de la familia CM 9582, mostraron un área afectada entre 70% y

90%. La distribución de la frecuencia de los genotipos de yuca de la

familia K de acuerdo al área de raíz afectada por P. tropicalis, corres-

ponde a una distribución normal, con un genotipo que presenta resis-

tencia moderada en los dos años de evaluación, 50 genotipos suscepti-

bles y 17 genotipos altamente susceptibles. Se definieron ocho QTLs,

dos de los cuales explicaron entre 8.6% y 9% de la varianza fenotípi-

ca. Se demostró que genes menores controlan la resistencia a P. tropi-

calis.

Palabras claves: yuca, raices, deterioro, pudriciones, genotipos, QTLs

SUMMARY

Varietal resistance is one of the main tools for managing root rots in

cassava, caused by different Phytophthora species, and it is therefore

necessary to understand the complexity of the genetic base of this

crop. The resistance of parents and progeny of cassava families K (M

Nga 2 x CM 2177-2) and CM 9582 (M Bra 1045 x M Cr 81) to Phy-

tophthora tropicalis was evaluated accordingly. Fresh roots of 69

individuals of family K and 43 of family CM 9582 were also inoculat-

ed, in addition to the parental materials of each family. Based on the

phenotypic evaluation and the molecular map of M Nga 2 (female

parent of family K), QTLs associated to the resistance to P. tropicalis

were identified and mapped, using simple marker analysis. Cassava

family K genotypes, evaluated during 2000 and 2001, showed a per-

centage of infected root area between 22% and 95%. The correlation

between the evaluations of 2000 and 2001 was -0.15. Cassava family

CM 9582 genotypes showed an infected area between 70% and 90%.

The distribution of frequency of cassava family K genotypes, based on

root area affected by P. tropicalis, corresponds to a normal distribu-

tion, with one genotype presenting moderate resistance in both years

of evaluation, 50 genotypes susceptible, and 17 genotypes highly

susceptible. Eight QTLs were defined, two of which accounted for

8.6% and 9% of phenotypic variance. Minor genes were found to

control resistance to P. tropicalis. Keywords: cassava, deterioration, root rots, genotypes, QTLs

INTRODUCCIÓN

Uno de los principales problemas en el culti-

vo de la yuca son las pudriciones radicales,

causadas por varias especies de Phytophtho-

ra. En Colombia se reportan pérdidas entre el

70 y el 80% de la producción y se estima una

reducción promedio de 7,5 Ton/ha, causada

por la enfermedad entre 1981 y 1995.

La enfermedad se encuentra distribuida en

muchas zonas productoras del mundo. En

Brasil se presenta Phytophthora drechsleri

Tucker (Figueiredo y Albuquerque, 1970), la

especie más severa que ataca yuca. En Co-

lombia se identificó Phytophthora tropicalis

(CIAT, 2000), Phytophthora drechsleri (Oli-

veros et al, 1974) y Phytophthora nicotianae

var. nicotianae (Soto et al, 1988; Lozano y

Loke , 1994). Otras especies reportadas como

patógenos de yuca en diferentes países son

Phytophthora erythroseptica (Fassi, 1957) y

Phytophthora cryptogea (CIAT, 1991), Phy-

tophthora meadii y Phytophthora. arecae

(Barragán et al, 1998).

El desarrollo de Phytophthora spp. se ve

favorecido por el uso de prácticas agronómi-

cas no adecuadas, de fungicidas inefectivos e

inadecuados, transporte de material afectado

a zonas libres del patógeno, como también

por la siembra en suelos compactos o muy

arcillosos (Takatsu y Fukuda, 1990).

Actualmente en CIAT, la selección para

resistencia a Phytophthora spp. se hace bajo

condiciones de invernadero, mediante inocu-

lación en brotes y raíces de yuca, de aisla-

mientos que han sido previamente caracteri-

zados mediante técnicas moleculares que

incluyen la digestión del amplificado de la

región ITS (“Internal Transcript Spacer”) o

del gen 5.8s ribosomal, con enzimas de res-

tricción, además de las pruebas de patogeni-

cidad respectivas.

Descifrar la complejidad de la resistencia

genética, es uno de los elementos claves de

fitomejoramiento, particularmente para en-

fermedades como las pudriciones radicales en

yuca; razón por la cual en este estudio se

pretendió evaluar los individuos de las fami-

lias K y CM 9582, por su reacción a pudri-

ción de raíces, para un mejor entendimiento

de la genética de la resistencia a Phytophtho-

ra tropicalis. El mejoramiento genético para

la resistencia de la enfermedad se puede

alcanzar más rápidamente y con eficacia,

apoyándose en el uso de marcadores molecu-

lares.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

En los años 2000 y 2001 se inocularon y

evaluaron raíces de yuca de 69 genotipos

pertenecientes a la familia K (M Nga 2 x CM

2177-2) procedentes de la subestación de

CIAT en Santander de Quilichao. Entre Julio

y Agosto del 2001 se evaluaron 43 genotipos

de yuca pertenecientes a la población CM

9582 (M Bra 1045 x M Cr 81), provenientes

de la granja de CENICAÑA (Centro Nacional

de Caña de Azúcar, Florida, Valle). También

se incluyeron en el estudio, un genotipo resis-

tente (M Bra 1045) y tres susceptibles (M Col

2066, CM 2177-2, M Nga 2) a P. tropicalis,

provenientes de la subestación de CIAT


(Centro Internacional de Agricultura Tropi-

cal) en Santander de Quilichao, Cauca (Tabla

1).

Las plantas de ambas poblaciones se co-

secharon a una edad de aproximadamente un

año. Las raíces se lavaron con agua potable y

detergente, luego se desinfestaron con hipo-

clorito al 1% durante 10 minutos y etanol al

30% durante 10 minutos. Posteriormente, se

secaron las raíces en papel toalla estéril. El

material vegetal desinfestado que no se ino-

culaba el mismo día del tratamiento, se alma-

cenó en un cuarto frío a 4C hasta que se

inocularon las raíces, máximo 24 horas des-

pués.

Patógeno

Se empleó como inóculo, el aislamiento 44

identificado mediante secuenciación de la

región ITS del ADN ribosomal, como P.

tropicalis (similar a P. capsici). Este aisla-

miento se obtuvo de yuca afectada por Pudri-

ción de Raíces en Barcelona (Quindío). El

inóculo se cultivó en agar avena (2% avena

Quaker®, 2% agar) preparado con Penicilina

900 mg/ml, Rifampicina 0,2 gr/ml y Ampici-

lina 750mg/ml. La incubación fue entre 20 y

26 C durante 4 días para la familia K y entre

6 y 7 días para CM 9582.

Inoculación

Dentro de una cámara de aislamiento, frente a

un mechero, se hizo una perforación en la

raíz mediante la extracción de un fragmento

de aproximadamente 15 mm de longitud con

un sacabocado de 8 mm de diámetro. Al

fondo de la perforación se depositó un disco

de crecimiento micelial con un sacabocado de

5 mm de diámetro, se cubrió luego el orificio

con el fragmento de raíz de yuca extraído y se

aseguró con cinta de enmascarar.

Cada genotipo fue inoculado con un con-

trol negativo, el cual consistió en inocular las

raíces con discos de medio de cultivo sin

crecimiento de P. tropicalis. Una vez inocu-

lada la raíz de la yuca se procedió a incubar-

las en una bolsa plástica, con una toalla de

papel estéril húmeda; las bolsas cerradas se

colocaron en bandejas plásticas, dejándose a

22C en oscuridad durante 7 días (familia K)

o 5 días (CM 9582).

Evaluación

Se realizó un corte transversal a cada raíz de

yuca donde se depositó el inóculo, se midió

largo y ancho de la lesión y largo y ancho del

corte de la raíz. También se midió la longitud

de la raíz y profundidad del inóculo en la

raíz; estos datos se registraron y se procesa-

ron mediante el programa Excel.

Análisis de datos

Para el análisis de la información se conside-

ró como unidad experimental una raíz y se

tuvieron en cuenta algunas consideraciones

así: para la familia K se excluyeron los geno-

tipos con menos de cinco (año 2000) o seis

(año 2001) raíces; se eliminaron las raíces de

genotipos con un diámetro promedio menor

de 3 cm; para las raíces con un daño mayor a

7 cm (2001) u 8 cm (2000) se consideró co-

mo área afectada 100% y los valores del

diámetro de raíces mayor a 7 cm (2001) u

8cm (2000) se consideraron de 7 u 8 cm,

respectivamente. En cuanto a CM 9582 se

excluyeron los genotipos con menos de cua-

tro repeticiones; se eliminaron las raíces de

genotipos con un diámetro promedio menor

de 3 cm; las raíces con un daño mayor a 6

cm se consideró el área afectada 100% y los

valores del diámetro de raíces mayor a 6 cm

se consideraron de 6 cm.

Análisis de QTLs

Para el análisis de QTL o de Loci controla-

dores de caracteres cuantitativos, las raíces de

92 genotipos de la familia de K fueron cose-

chadas en CIAT en 2000. Para el análisis de

QTL, se utilizó un mapa basado en la segre-

gación de marcadores moleculares en la po-

blación K. El mapa se basó en la segregación

de alelos de la madre (M Nga 2), correspon-

diendo a 192 marcadores de diferentes clases:

RFLP, ADN polimórfico amplificado al azar

(RAPD), isoenzimas, microsatélites, sitios

etiquetados por la expresión (ESTs) y genes

conocidos (Martin Fregene, comunicación

personal).

El análisis y mapeo se hizo utilizando el

programa programa Q-Gene 3.06V, en un

equipo McIntosh, por medio de una regresión

simple o análisis de un solo marcador (SPA),

donde la variable dependiente es la reacción

al patógeno y la variable independiente es el

número de alelos en el locus marcador, de-

pendiendo de la segregación del individuo.

Se definió asociación significativa entre

un marcador de ADN y resistencia de Phy-

tophthora, si la probabilidad de no presencia

de un QTL, era menor a 0,005 para reducir al

mínimo, la detección de positivos falsos. El

grado de la variación fenotípica explicada por

cada marcador fue obtenido del coeficiente de

la regresión (r2). Los valores totales r2 de

cada QTL eran computados como: (suma de

los cuadrados para cada suma de marcado-

res)/(total de cuadrados).

RESULTADOS

Con base en evaluaciones previas y observa-

ciones en campo, se definieron cuatro catego-

rías de resistencia: Resistente, con menos de

10% de área de raíz afectada; moderadamente

resistente, entre 10 %y 30%; susceptible,

entre 30 y 60% y altamente susceptible, para

más de 60% de raíz afectada.

Los genotipos de yuca de la familia K,

evaluados durante los años 2000 y 2001 mos-

traron un porcentaje de área de raíz afectada

continuo entre el 22% y 95% (Figura 1). Tres

genotipos (4,3%) de yuca con resistencia

moderada a P. tropicalis en el año 2000,

mostraron la tendencia a alta susceptibilidad

en el año 2001 y viceversa. Un genotipo

(K19) de yuca de resistencia moderada en el

año 2000, mostró el mismo grado de resisten-

cia en el año 2001, con un rango de 27,1 a

29,7% de área afectada (Tabla 2).

De los 10 genotipos de yuca de la familia

K que presentaron menor grado de susceptibi-

lidad a P. tropicalis, seis de estos (K19, K88,

K98, K69, K66 y K30) presentaban muy baja

resistencia moderada en el año 2000 y hacia

el año 2001 presentaron una resistencia mo-

derada más alta.

De los 10 genotipos de yuca de la familia

K que presentaron resistencia moderada a P.

tropicalis, cuatro (K81, K79, K110 y K114)

mostraron resistencia moderada en un por-

centaje más alto en el año 2000 que en el

2001. De los 10 genotipos de yuca de la fami-

lia K que presentaron alta susceptibilidad a P.

tropicalis en el año 2001, siete (K9, K57,

K148, K39, K35, K122 y K64) mostraron

menor susceptibilidad a P. tropicalis en el

año 2000 que en el 2001. De los 10 genotipos

de yuca de la familia K que presentaron alta

susceptibilidad al patógeno en el año 2001,

tres (K92, K145 y K6) mostraron mayor

susceptibilidad en el año 2000 que en el

2001.

Al realizar el análisis de los genotipos de

yuca de la familia K entre los años 2000 y

2001, se encontró que los 10 genotipos de

yuca con menor susceptibilidad presentada a

P. tropicalis fueron: K 19, K 110, K 88, K

98, K 69, K 114, K 79, K 66, K 30 y K 81,

mientras que los 10 genotipos de yuca de

mayor susceptibilidad a la enfermedad, fue-

ron: K9, K57, K92, K148, K39, K35, K6,

K122, K145 y K64. La correlación entre el

área afectada por el patógeno durante el año

de evaluación 1 y año 2, fue de –0.15 para la

familia K.

Los genotipos de yuca de la familia CM

9582 evaluados en el año 2001, mostraron un

área afectada entre 35,2 – 91,4%. Se encon-

traron pocos genotipos con resistencia mode-

Tabla 1. Parentales de las Familias K y CM

9582 de Manihot esculenta, utilizados en el

estudio para determinar la genética de la resiten-

cia a Phytophthora tropicalis

Parentales Origen Reacción a

P. tropicalis

Familia K

M Nga 2 (1) Nigeria,

Africa

Susceptible

CM2177-2 (1) Híbrido,

CIAT

Susceptible

CM 9582

M CR 81 (2) Costa

Rica

Resistente

M Bra 1045 (2) Brasil Resistente (1) Parentales de Familia K (2) Parentales de

Familia CM 9582


63

rada y ninguno con resistencia alta (Figura 2).

En el análisis realizado a la familia CM

9582 en el año 2001 se encontró que los 10

genotipos de yuca con mayor grado de resis-

tencia intermedia presentada al patógeno

fueron: 136, 148, 150, 133, 151, 121, 71, 115,

140 y 47. Los 10 genotipos de yuca con ma-

yor % de susceptibilidad presentada a P.

tropicalis fueron: 45, 42, 172, 153, 68, 62,

52, 163, 78 y 91.

En cada experimento se evaluaron dos va-

riedades testigos. M Col 2066, considerada

susceptible en el campo a Pudrición causada

por Phytophthora, consistentemente fue sus-

ceptible a P. tropicalis (86,2%, 78,3% y

70,9% área afectada respectivamente). La

variedad M Bra 1045, tolerante a la enferme-

dad en el campo, mostró 11,6% y 51,5% de

área afectada en los años 2000 y 2001 respec-

tivamente.

Las Figuras 3 y 4 muestran la distribución

de los individuos por grupo de acuerdo con el

grado de resistencia al patógeno. La distribu-

ción de la frecuencia de los genotipos de

yuca de la familia K de acuerdo al área de

raíz afectada por P. tropicalis, es una distri-

bución normal, con un genotipo que presenta

resistencia moderada en los dos años de eva-

luación, 50 genotipos susceptibles y 17 geno-

tipos altamente susceptibles (Figura 3).

En la distribución de la frecuencia de los

genotipos de yuca de la familia CM 9582 por

área afectada por PRP, se presenta una curva

ascendente con la mayoría de genotipos sus-

ceptibles; M Bra 1045 muestra un 56,3% de

área afectada (Figura 4).

La correlación entre longitud de raíz y

área afectada fue de –0.30 para la familia

CM 9582, indicando esto que entre más larga

sea la raíz de la yuca, menor es la cantidad de

enfermedad (Tabla 2).

La Tabla 3 muestra los resultados del

análisis de la regresión del marcador simple

del porcentaje del área infectada en las raíces

inoculadas en el laboratorio. Los marcadores

definieron ocho QTLs situados en los grupos

de ligamiento C, H, J, N, Q, y V. Los QTLs

explicaron entre 1,3 y el 9% de la varianza

fenotípica. Siendo el No. 7, el QTL más sig-

nificativo, situado en grupo de ligamiento V

del mapa.

DISCUSIÓN

Con el fin de avanzar en la investigación de

la base genética de resistencia de yuca a

pudrición de raíz causada por Phytophthora

tropicalis, se evaluó la reacción a éste pató-

geno, de las progenies de dos poblaciones: la

familia K y CM 9582.

Famila K

Una parte de los genotipos evaluados de la

familia K expresaron resistencia moderada a

P. tropicalis. Algunos genotipos de esta fami-

lia presentaron resistencia moderada en el año

2000 pero fueron susceptibles en el año 2001.

También ocurrió lo contrario: algunos geno-

tipos susceptibles en 2000 presentaron resis-

tencia moderada en 2001.

Este cambio probablemente pudo ocurrir

por la acción de factores tales como cambios

en las condiciones ambientales o en suelo por

la presencia de productos químicos utilizados

en la fertilización. Situación que sería similar

a lo los resultados de Lübberstedt et al (1998)

en un estudio con maíz, en donde factores

como los mencionados afectaron la resisten-

cia parcial a Puccinia sorghi y la expresión

de QTLs.

Tabla 2. Evaluación fenotípica de dos poblaciones segregantes para resistencia a Pudrición de Raíces

causada por Phytophthora tropicalis.

Población/Genotipo

Familia K

Área afectada (%) Población/

Genotipo

Area afectada (%)

Años

Promedio 2000 2001 Año 2001 CV (%)

CM 9582

Moderadamente resistente (10-

30%)

K 19 29,7 27,1 28,4 - - 21,3

Susceptible (30-60%):

K 110 34,2 42,1 38,2 136 35,2 57,3

K 88 54,4 26,0 40,2 148 49,6 25,6

K 98 54,8 28,8 41,8 150 54,9 20,5

K 69 44,2 41,8 43,0 - - 21,0

K 114 32,8 56,6 44,7 - - 16,5

K 79 36,3 53,6 44,9 - - 6,9

K 66 53,2 37,8 45,5 - - 6,2

K 30 55,9 35,8 45,9 - - 13,3

K 81 22,8 70,5 46,7 - - 14,7

Promedio 41,8 42,0 41,9

46,6

20,3

Correlación entre años -0,67

Altamente susceptible (>60%)

K 9 60,2 67,3 63,8 42 84,4 5,4

K 57 61,6 65,9 63,8 68 84,7 8,4

K 92 72,7 57,3 65,0 172 85,2 7,5

K 148 62,7 69,4 66,0 153 85,4 13,5

K 39 37,1 95,2 66,1 62 85,9 8,9

K 35 64,9 69,0 66,9 45 86,2 4,4

K 6 69,2 65,9 67,5 52 86,2 9,7

K 122 65,9 71,0 68,5 78 87,9 6,5

K 145 81,6 69,4 75,5 91 88,0 13,2

K 64 67,3 87,2 77,3 163 91,4 5,3

Promedio 64,3 71,7 68,0 86,5 8,3

Correlación entre años -0,66

General

Promedio 53,6 56,0 54,8 76,0

Correlación -0,15

Parentales

M Nga 2 66,3 56,7 61,5 M CR 81 -

CM 2177-2 69,6 83,9 76,7 M Bra 1045 46,1 19,6

Testigos

M Bra 1045 (resistente) 11,6 51,5 31,5

M Col 2066

(susceptible) 70,9 11,6

M Col 2066 (susceptible) 70,5 86,2 78,3

M Nga 2


CM 2177-2


El promedio de resistencia intermedia a P. tropicalis de los 10 genotipos de yuca de la familia K, fue mayor

que el promedio de resistencia de los 10 genotipos de la familia CM 9582. El promedio de susceptibilidad a

P. tropicalis de los 10 genotipos de yuca de la familia CM 9582, fue mayor que el promedio de susceptibi-

lidad de los 10 genotipos de la familia K


Otros factores pueden ser el monocultivo,

el ciclo vegetativo largo y la propagación

vegetativa sin un control de calidad de esta-

cas previa a la siembra, por cuanto puede

haber efecto de ellos en el desarrollo de raí-

ces.

Los cambios en las poblaciones de mi-

croorganismos benéficos o detrimentales, en

la rizosfera y raíces pueden afectar la resis-

tencia. Las condiciones del suelo permiten

que se multipliquen las bacterias, las cuales

crean un ambiente favorable para que algunos

microorganismos colonicen la raíz de yuca.

El uso de agua de riego rica en bacterias,

infectan la planta o el suelo y a su vez facilita

la entrada de microorganismos específicos.

La variabilidad en la expresión de resis-

tencia entre años puede indicar que dicha

familia presenta poligenes, de acuerdo con

Llano (2003). Generalmente el ambiente

influye en la expresión fenotípica generando

variación. Es importante anotar que ciertos

genotipos de la familia K con resistencia

intermedia en el año 2000, la siguen expre-

sando en el año 2001.

Ambos parentales de la familia K son

susceptibles a P. tropicalis, sin embargo un

grupo de genotipos de la famila K presenta

resistencia intermedia. Esto indica que los

parentales son heterocigotos y que ambos

tienen genes de resistencia. Fregene et al.

(1997) demostraron que la familia K es hete-

rocigota.

CM 9582

La familia CM 9582 se obtuvo por cruza-

miento de M Bra 1045 y M CR 81. En estu-

dios anteriores (Llano, 2003) M Bra 1045

mostró resistencia a P. tropicalis, pero en las

pruebas presentadas mostró variación de

resistente a susceptible entre los dos años de

evaluación. Una explicación puede ser que

por cambios de factores ambientales la expre-

sión cambió, como se explicó anteriormente.

Se puede deducir que la base genética de M

Bra 1045 es poligénica, también puede haber

efectos epistáticos en este cruce.

Las dos poblaciones

Al comparar la resistencia intermedia presen-

tada por las familias K y CM 9582, se en-

cuentra que esta familia presenta pocos geno-

tipos de yuca con resistencia intermedia a P.

tropicalis. La explicación a este comporta-

miento se puede encontrar en los cruces gené-

ticos de los parentales de las dos familias, los

cuales son diferentes. Se observó que los 10

genotipos más resistentes de la famila K

tienen mayor grado de resistencia que los 10

genotipos más resistentes de CM 9582.

Análisis de QTLs

Los resultados muestran que la resistencia a

la pudrición de la raíz causada por Phytop-

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Genotipos

Are

a a

fecta

da

(%

)Año 2000 Año 2001 Promedio

Figura 1. Tendencia del porcentaje de área afectada por Phytophthora tropicalis en 69 individuos de la

familia K de yuca, durante evaluaciones en 2000 y 2001.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90 90-100

Area afectada (%)

Frecu

encia

(%

)

% Familia K

Figura 3. Distribución de la frecuencia de los genotipos de la familia K según el porcentaje de área de

raíz afectada por P. tropicalis, evaluación de 2000 y 2001

Figura 2. Tendencia del porcentaje de área afectada por Phytophthora tropicalis en 43 individuos de la

familia de yuca CM 9582, en evaluación realizada en 2001.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Genotipos

Area

afe

cta

da

(%

)

CM 9582


65

hthora tropicalis es poligénica en la familia

de K.

La presencia de individuos más resisten-

tes que los dos padres y la detección de QTLs

asociados a los marcadores moleculares del

mapa derivado de la madre de la familia K,

muestra que alelos de resistencia que provie-

nen de ambos padres, contribuyen a la resis-

tencia en las progenies (segregación transgre-

siva). Tales características son bien conocidas

en especies heterocigotas y son útiles para

combinar factores genéticos de la resistencia

en el mismo cultivar (Jorge et el al. 2001).

CONCLUSIONES Y RECOMENDA-

CIONES

Las poblaciones mostraron diferencias en la

base genética de la resistencia a Phytophtho-

ra. Los niveles de resistencia observados no

son suficientemente altos para usar en pro-

gramas de mejoramiento, por esta razón será

conveniente identificar parentales y desarro-

llar nuevas poblaciones.

Se sugieren las siguientes recomendaciones:

Hacer el ligamiento de la expresión

fenotípica con marcadores moleculares.

Inocular cada raíz con un testigo nega-

tivo y el patógeno. En esta forma se re-

duce la probabilidad de evaluación de

positivos falsos.

Estudiar los factores que influyen en la

expresión de resistencia.

Evaluar raíces procedentes de distintas

localidades, por ejemplo de Quindío y

Cauca.

Estudiar la patogénesis de Phytophtho-

ra en raíces de yuca y los mecanismos

de resistencia.

AGRADECIMIENTOS

A Herney Rengifo, Juan Fernando Mejía y

Lina María Tabares, por su colaboración

durante las cosechas de yuca e inoculaciones.

A Martin Fregene y Jaime Marín para su

ayuda en el análisis de QTLs.


Barragán, M I., Álvarez, E., Loke, J. B. y

Llano, G. A. 1998. Identificación de fuen-

tes de resistencia a la pudrición radical de

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Crantz ) by Trichoderma spp. Annual

Report CIAT, 1994.

Llano, G. A. 2003. Identificación de genes

análogos de resistencia a enfermedades

en yuca (Manihot esculenta Crantz), y su

relación con la resistencia a tres especies

de Phytophthora. Tesis de Maestría en

Tabla 3. QTLs que explican los valores más altos de la varianza fenotípica para la resistencia en yuca,

según lo descrito por el porcentaje del área de la raíz infectada. Los valores en negrilla son significativos a

P = 0,05

Grupo de ligamiento

(Mapa Femenino)

Marcadores

(Posición en cM)a

Fb

Vc (%)

Pd

No. de

QTL

C (3) RGY172 0,029 5,4 <0,0500 1

H (8) SSRY178 0,315 1,3 <0,0500 2

J (10) CDY76 0,163 4,0 <0,0500 3

K2a 0,040 8,6 <0,0500 4

N (14) SSRY13 0,078 4,2 <0,0500 5

Q (17) SSRY911 0,047 5,7 <0,0500 6

V (22) NS911 0,007 9,0 0,0070 7

GY153 0,049 4,5 <0,0500 8 aDistancia del primer marcador observado. bEstadístico F del análisis de la variación. cPorcentaje de la

varianza fenotípica explicada (del coeficiente r2 de la regresión). d Probabilidad del estadístico F.

0

10

20

30

40

50

60

0-10 10-20 20-30 30-40 40-50 50-60 60-70 70-80 80-90 90-100

Área afectada (%)

Frecu

encia

(%

)

CM 9582

Figura 4. Distribución de la frecuencia de los genotipos de la familia CM 9582 según el porcentaje de área

de raíz afectada por P. tropicalis, evaluación de 2001


Ciencias Agrarias, énfasis en Fitomejo-

ramiento. Universidad Nacional de Co-

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PURIFICACIÓN DEL VIRUS DEL SÍNDROME DE LA HOJA AMARILLA DE LA CAÑA DE

AZÚCAR (Sugarcane Yellow Leaf luteovirus ScYLV) Y PRODUCCIÓN DE ANTISUERO*

Juan Carlos Angel Sánchez1, Mavir Carolina Avellaneda Barbosa1, Jorge Ignacio Victoria Kafure1, Mónica Betancourt Vásquez2, Cristina Díaz-

Granados3, José Alejandro Arroyave Posada4 y Mauricio Castaño Jaramillo4

1Centro de Investigación de la caña de Azúcar de Colombia CENICAÑA, [email protected] , 2Universidad de Caldas. Manizales

[email protected] , 3Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá, [email protected] , 4Centro Internacional de Agricultura Tropical

CIAT Apartado Aéreo 6713 Cali

*Trabajo realizado con recursos del proyecto cofinanciado por COLCIENCIAS-CENICAÑA “Diagnóstico de enfermedades virales, endémicas y

exóticas de la caña de azúcar en Colombia. Código 2214-07.023-97. Galardonado con el Premio Nacional de Fitopatología Rafael Obregón

Auspiciado por BAYER S.A. y Otorgado por ASCOLFI en el XXIII Congreso de la Asociación, Bogotá, Julio 3-6 de 2002

RESUMEN

Plantas de la variedad SP 71–6163 afectadas por el virus del síndrome

de la hoja amarilla de la caña de azúcar (ScYLV), se sembraron en

condiciones de invernadero para purificar el agente causal y producir

anticuerpos específicos. La metodología de purificación utilizada fue

la de Lockhart (1999) modificada, agregando la enzima Celluclast 1,5

L al 2% a la solución de extracción. Las preparaciones parcialmente

purificadas fueron evaluados por microscopía electrónica en el labora-

torio de la unidad de virología del CIAT para verificar la concentra-

ción de partículas virales. Una vez obtenida una alta concentración el

semipurificado se ultracentrifugó en un gradiente de densidad de

sucrosa de 10-40% para incrementar la pureza del virus. El purificado

obtenido se empleó como antígeno en la producción de inmunoglobu-

linas específicas inyectando conejos de la raza Nueva Zelandia durante

cuatro semanas en una concentración de 1mg ScYLV/ml, para luego

evaluar el antisuero mediante técnicas de microscopía electrónica y

TBIA. Se encontró una alta concentración de partículas virales en

semipurificados empleando Celluclast 1,5 L al 2%. La relación de

absorbancia A260/A280 fue de 1,49 y la concentración viral aproximada

de 1,87 mg/ml. El anticuerpo producido se utilizará en pruebas seroló-

gicas de ISEM y tissue-blot para el diagnóstico del ScYLV en la zona

azucarera del Valle del Cauca.

Palabras claves: caña de azúcar, síndrome de la hoja amarilla, anti-

suero.

SUMMARY

Plants of SP 71-6163 variety positive for the virus of the sugarcane

yellow leaf syndrome (ScYLV) were sowed under greenhouse condi-

tions to purify the causal agent and to produce specific antibodies. The

methodology used for purification was that of Lockhart (1999) modi-

fied by CENICAÑA, adding the Celluclast 1,5 L to 2% enzyme to the

extraction buffer. The purified of the obtained virus were evaluated by

electronic microscopy in the laboratory of the Virology Unit at CIAT

inn order to verify viral particles concentration. Once obtained a high

concentration of virus particles, the purified were put on a sucrose

gradient with density of 10-40 % to increase the purity of the virus

which was determined later in the spectrophotometer. The purified

obtained was used as antigen in the production of inmunoglobulin by

injecting New Zealand rabbits during four weeks by a concentration of

1mg ScYLV/ml. The antiserum was evaluated by ISEM and TBIA.

High concentration of virus particles was found by adding 2 % Cellu-

clast 1,5 L. The absorbance A260/A280 was of 1.49 and the approximate

viral concentration of 1.87 mg/ml. The antibody produced will be used

for serological tests of ISEM and TBIA in the diagnosis of the ScYLV

in the sugarcane area of the Cauca Valley.

Key words: Sugarcane, Yellow leaf syndrome, antibody

INTRODUCCIÓN

En la actualidad la región azucarera del Valle

del Cauca se enfrenta a una enfermedad de

origen viral potencialmente importante, el

síndrome de la hoja amarilla (ScYLV), el

cual está infectando vertiginosamente los

cultivos de caña de azúcar debido a la rápida

diseminación por vectores, su difícil detec-

ción en el campo por la variabilidad de su

infección y a la gran cantidad de variedades

susceptibles (Victoria et al,1998).

Entre 1990 y 1991 se observaron los pri-

meros síntomas de amarillamiento en las

plantas, en la parte sur del Brasil, específi-

camente en la zona productora de caña de

azúcar del estado de Sao Paulo (Lima et al,

1995, Vega et al, 1997). Para 1992 el sín-

drome de la hoja amarilla estaba presente en

la mayoría de cultivos de la variedad SP 71-

6163, de la zona de Sao Paulo la cual repre-

sentaba el 25% de la caña cultivada en esta

zona. En esta variedad se registraron síntomas

severos, indicando la alta sensibilidad de la

variedad al virus. Los síntomas en la variedad

SP 71-6163, no son visibles en hojas nuevas,

solamente hay evidencia de éste en las hojas

maduras. Los primeros síntomas se presentan

como un amarillamiento intenso de la nerva-

dura en las hojas viejas, se observa además,

una coloración rojiza en la superficie axial de

la nervadura. La decoloración subsiguiente se

esparce, desde de la punta hacia la base de la

hoja y se desarrolla eventualmente síntomas

de necrosis. Las raíces y los tallos se debilitan

en su crecimiento y la producción se reduce

significativamente (Vega et al, 1997).

La etiología del ScYLV, fue puesta en

duda por mucho tiempo. Factores abióticos

incluyendo compactación del suelo, desba-

lance nutricional, falta de agua y condiciones

climáticas adversas fueron sugeridos como

posibles causantes de la enfermedad. Sin

embargo, el patrón de los síntomas y su dis-

tribución en el campo sugerían que podría ser

debido a un agente biótico, opinión que fue

sustentada cuando se asociaron los síntomas

con presencia de partículas vírales en los

tejidos. En 1994 los síntomas fueron asocia-

dos con la presencia de un closterovirus por

medio de la prueba de de detección de dobles

cadenas de ARN (Borth et al, 1994). En 1997

Vega et al, encontraron partículas de luteovi-

rus en los tejidos del floema por medio de

pruebas citológicas y se acercaron a los pri-

meros estudios de purificación, basados en

las metodologías para el virus del enanismo

amarillo de la cebada (Barley Yellow Dwarf

luteovirus BYDV). Dos patógenos Sugarcane

Yellow Leaf Virus ScYLV ( Lockhart et al,

1995, Irey et al, 1996; Vega et al, 1997) y

Sugarcane Yellow Leaf Phytoplasma

(ScYLP) (Cronje et al, 1997) han sido regis-

trados y asociados a síntomas del síndrome

de la hoja amarilla de la caña de azúcar.

En el 2000 Scagliusi y Lockhart, ratifica-

ron los resultados de Vega et al., 1997, indi-

cando que la enfermedad era causada por un

luteovirus con partículas de 25 a 29 nm de


diámetro el cual denominaron como “Sugar-

cane Yellow Leaf Virus”. Sin embargo, utili-

zando los últimos sistemas de taxonomía se

clasificó nuevamente el agente causal como

un virus del género polerovirus, familia

luteoviridae. (Moonan y Mirkov, 1999).

El síndrome de la hoja amarilla se regis-

tró por primera vez en Colombia en mayo de

1998, en la variedad SP 71-6163 introducida

del Brasil en 1987 (Victoria et al, 1998;

Victoria et al, 1999). Esta enfermedad se

transmite al usar semilla vegetativa infectada

y por la acción vectora de los áfidos Mela-

naphis sacchari y Rhopalosiphum maidis

presentes en las zonas azucareras del país.

Entre octubre de 1998 y marzo de 1999, la

enfermedad se observó ampliamente distri-

buida en la región azucarera aunque con

mayor incidencia en la zona sur (Victoria et

al., 1998; Victoria et al., 1999). La incidencia

fue mayor en la variedad CC 85-96, seguida

por las variedades ICC 93-02, MZC 82-11,

CC 84-75 y PR 61-632, entre otras, produ-

ciendo efectos de disminución en la produc-

ción, especialmente en las variedades suscep-

tibles CC 84-75 y CC 85-96.

La enfermedad puede diagnosticarse por

diferentes técnicas serológicas entre ellas

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent

Assay), TBIA (Tissue-Blot ImmunoAssay),

DBIA (Dot-Blot ImmunoAssay) y por la

observación al microscopio electrónico de las

partículas vírales purificadas a partir de

tejido enfermo (Schenck y Lockhart, 1997;

Victoria et al, 1998; Scagliusi y Lockhart,

2000; Guzmán y Victoria, 2001). El proceso

de purificación para la producción del anti-

suero específico se ha dificultado debido a la

ubicación restringida del virus a los tejidos

del floema de la planta y a la baja concentra-

ción de partículas vírales en los tejidos, lo

que hace más difícil su extracción; además a

la ausencia de síntomas en plantas infectadas

debido a las diferencias de comportamiento

de las variedades de caña cultivadas y a la

carencia de hospedantes alternos de rápido

crecimiento (Lockhart et al, 1995; Vega et al,

1997; Scagliusi et al, 2000).

Actualmente en CENICAÑA la enferme-

dad del síndrome de la hoja amarilla de la

caña de azúcar se diagnostica con las pruebas

serológicas TBIA y DBIA utilizando antisue-

ros importados con la limitaciones que impli-

ca su adquisición. Para obviar estas dificul-

tades se planeo en esta investigación producir

localmente un antisuero especifico para el

diagnóstico del ScYLV, previa la purificación

del agente causal del síndrome de la hoja

amarilla (ScYLV).


Este estudio se realizó bajo condiciones de

invernadero en la estación experimental de

San Antonio de los Caballeros del Centro de

Investigación de la Caña de Azúcar de Co-

lombia CENICAÑA, localizada en el munici-

pio de Florida departamento del Valle del

Cauca, a una altura de 980 metros sobre el

nivel del mar, precipitación de 1140 mm/año,

temperatura promedia de 23,5 °C y humedad

relativa del 76%, y en los laboratorios de

fitopatología y virología de CENICAÑA y

CIAT respectivamente.

Para el proceso de purificación se utiliza-

ron plantas de la variedad SP 71-6163 afecta-

das por ScYLV previamente diagnosticadas

como positivas por TBIA para síndrome de la

hoja amarilla, las cuales se sembraron en

macetas plásticas (11x14x11 cm); se empleó

como substrato una mezcla de tierra y arena

zarandeada estériles en proporción 2:1 res-

pectivamente. El tratamiento que se dio al

material sembrado consistió en un riego

suministrado diariamente y fertilización

semanal.

Purificación del virus del síndrome de la

hoja amarilla (ScYLV)

Debido a que el proceso de purificación del

ScYLV ha presentado dificultades por su

restricción a los tejidos del floema y a la

variabilidad de la infección de acuerdo con la

variedad afectada, se probaron tres metodolo-

gías de purificación (Tabla 1):

Protocolo propuesto para purificación de

virus en general (Lockhart, 1999)

Protocolo para ScYLV (Scagliusi y Lo-

ckhart, 2000)

Protocolo modificado en CENICAÑA para

el ScYLV

En cada una de las metodologías se esta-

bleció un control estricto sobre los tiempos de

centrifugación, concentraciones y pH de los

tampones de extracción, esterilización de los

materiales, cantidad y forma de picado del

tejido. Todas las purificaciones realizadas en

las diversas pruebas fueron observadas al

microscopio electrónico en el laboratorio de

virología del CIAT para determinar la con-

centración de partículas vírales en ellas.

Una vez determinada la mejor metodolo-

gía en la que se obtuvieron semipurificados

limpios, sin daños de las partículas y una

aceptable concentración de ellas, se desarro-

llaron cambios para estandarizar el proceso y

mejorar los resultados del protocolo seleccio-

nado.

Edad fisiológica y tipo de tejido para la

purificación del virus

Con la metodología estandarizada, se rehicie-

ron varios ensayos para determinar la edad de

las plantas más adecuada para realizar el

proceso de purificación. Se seleccionaron

plantas en el campo, se marcaron varios

tallos por cepa y se colectó de cada tallo

seleccionado la hoja TVD (primera hoja con

cuello visible); a éstas se les realizó la prueba

de TBIA (Guzmán y Victoria, 2001). Los

tallos que resultaron positivos para la enfer-

medad fueron utilizados como semilla para

sembrar sus yemas en condiciones de inver-

nadero, se sembraron 50-100 plantas. Una

vez desarrolladas las plantas se tomaron 100

gramos de tejido para purificar el virus a

diferentes edad de las plantas: 15, 20, 30 y 60

días después de la siembra, las pruebas de 6 y

12 meses se desarrollaron con plantas enfer-

mas de campo. El material fue recolectado

tomando sólo la parte más joven de la planta,

(hojas del cogollo hasta la hoja TVD) pre-

sumiendo allí una alta concentración de virus.

También se realizaron pruebas para determi-

nar el tipo de tejido y el más adecuado para

realizar la purificación, tomando 100 g de

cada tipo de tejido de plantas que previamen-

te habían resultado positivas para ScYLV.

Los tipos de tejidos utilizados fueron: hojas

de cogollo, hoja TVD sin nervadura y hoja

TVD con nervadura, nervaduras de hoja TVD

y entrenudos de tallo.

Cuantificación de la concentración viral

Las preparaciones obtenidas en cada metodo-

logía probada se analizaron en la Unidad de

Virología del CIAT por medio de microsco-

pía electrónica evaluando concentración viral

(número de partículas por campo). A partir de

los semipurificados con presencia de una alta

concentración de partículas virales se selec-

cionaron las muestras aptas para ser someti-

das a un gradiente de densidad de sucrosa de

10-40 %, para de esta forma obtener un virus

más purificado. Posteriormente se analizó la

suspensión final del virus de la mejor meto-

dología diluida (1/100) en un espectrofotóme-

tro, dentro de un rango de longitud de onda

comprendida entre 220 y 320 nm (Rango luz

ultravioleta). La pureza y la concentración

(mg ScYLV por mL) se determinaron mi-

diendo la relación de absorbancia A260/A280 y

utilizando la fórmula: A260 x dilución / coefi-

ciente de extinción del virus.

Método de inmunización para obtener

antisuero

El método de inmunización utilizado consis-

tió en inyectar el purificado del virus de la

mejor metodología en los cojinetes de las

patas traseras de un conejo de la raza Nueva

Zelandia de 3 meses de edad. La inmuniza-

ción se basó en la aplicación de cuatro inyec-

ciones de 0,3 mL de la suspensión viral

(1mg/mL), los cuales previamente habían

sido mezclados con un volumen igual de

coadyuvante de Freund completo para la

primera inyección e incompleto para las

siguientes.

Las inyecciones se administraron con una

semana de intervalo. La sangre se comenzó a

colectar un mes después de la primera inyec-

ción y se continuó semanalmente hasta doce

semanas después, teniendo cuidado de privar-

lo de comida por lo menos 18 horas antes de

cada sangría. La sangre (5-10 mL) se colectó

de la oreja de los conejos inmunizados en

tubos de centrifuga y se llevó luego a un baño


maría a 37 °C durante 60 minutos, se centri-

fugó luego a 2750 r.p.m. durante 15 minutos,

se recolectó el sobrenadante y se sometió

nuevamente a centrifugación éste por cinco

minutos a 3500 r.p.m. para eliminar comple-

tamente los glóbulos rojos. Los antisueros

obtenidos de cada una de las sangrías se

marcaron y se transfirieron a tubos pequeños

(1mL) congelándose a –20 °C.

Preparación de Inmunoglobulina (IgG)

para el ScYLV

Con el fin de aumentar la especificidad del

antisuero obtenido en cada sangría, éste se

purificó precipitando las proteínas que aún

pudiera contener, utilizando la metodología

de Ball et al (1990). Esta consistió en adicio-

nar por cada ml de antisuero, 1 mL de agua

destilada estéril y 1,3 mL de sulfato de amo-

nio saturado pH 7,0-7,2, se agitó por 30

minutos y se refrigeró toda la noche, luego se

centrifugó a 8000 r.p.m. durante 10 minutos y

colectó el precipitado, éste se resuspendió en

1 ml con tampón fosfato salino PBS 0,01 M

conteniendo NaCl 0,15 M. Se repitió la pre-

cipitación de proteínas adicionando 1 mL de

agua destilada estéril y 1.02 ml de sulfato de

amonio saturado por ml de precipitado resus-

pendido, se agitó por 30 minutos y se centri-

fugó nuevamente a 8000 r.p.m. por 10 minu-

tos. El precipitado que contiene las Ig G

purificadas sé resuspendió en PBS con la

mitad del volumen original del antisuero y se

congeló a –20 ºC para emplearse posterior-

mente en las pruebas serológicas.

Pruebas serológicas con el antisuero de

ScYLV

El antisuero específico se usó en las pruebas

serológicas de TBIA (Guzmán y Victoria,

2001) e ISEM (Derrick, 1973). Para el caso

de TBIA se ensayaron diluciones de 1:5000,

1:6000, 1:7000, 1:8000 y 1:9000 de los anti-

sueros de cada una de las sangrías obtenidas,

como muestras positivas se utilizaron impre-

siones del tejido de la nervadura central de la

hoja TVD proveniente de la variedad SP 71-

6163 con ScYLV, las cuales se imprimieron

en membranas de nitrocelulosa. Se tomó

como testigo negativo, plantas sanas de la

variedad MZC 74-275. El proceso de diag-

nóstico que se siguió fue el de Shenck et al

(1997) y Guzmán y Victoria (2001).

Para la técnica de ISEM se tomó tejido

enfermo de hojas del cogollo de la variedad

SP 71-6163 con el cual se procedió a probar

diferentes variantes a saber: 1. Macerado de

tejido más Celluclast 15 L (1 hora) más anti-

suero puro. 2. Macerado de tejido sin Ce-

lluclast 1,5 L más antisuero puro. 3. Macera-

do de tejido sin Celluclast 1.5 L y sin antisue-

ro. 4. Macerado de tejido con Celluclast 1.5

L (1 hora) sin antisuero. 5. Semipurificado

más antisuero puro. 6. Semipurificado sin

antisuero.

El procedimiento para ISEM usado fue el

de Derrick (1973) teniendo en cuenta cada

una de las variaciones. Con esto se seleccionó

la mejor variante de captura de las partículas

vírales mediante la técnica de microscopía

electrónica, evaluando concentración viral (#

partículas por campo).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Metodologías para la purificación del virus

En la purificación del virus del síndrome de

la hoja amarilla de la caña de azúcar, utili-

zando la metodología general de virus pro-

puesta por Lockhart, 1999 (Tabla 1), la cual

se caracteriza por el empleo de bajos volúme-

nes de cloroformo y soluciones y sin el uso

del Celluclast 1.5 L (Novo Nordisk Bioche-

mich North America, Inc., Franklinton); la

concentración víral se vio reducida debido a

que el virus se encuentra restringido al tejido

Tabla 1. Comparación de los protocolos usados para la purificación del virus del síndrome de la hoja amarilla (ScYLV).

Protocolo general para purificación de virus

(Lockhart, 1999) Protocolo para ScYLV

(Scagliusi y Lockhart, 2000)

Protocolo para ScYLV

modificado CENICAÑA

1. Colectar 100 g de tejido enfermo y picar en

pequeños pedazos.

2. Adicionar 250 ml tampón fosfato 250 mM pH

6,0 más 0.5% de 2-mercaptoethanol

3. Homogenizar y filtrar a través de gasa.

4. Agregar 2,5 mL de tritón X-100 al 33% y

agitar por una hora.

5. Centrifugar de 10.000 a 12.500 r.p.m. por 10

minutos

6. Colectar el sobrenadante y colocarlo sobre 5

ml de un colchón de Sucrosa 30% en tampón

fosfato 100 mM, pH 7.0 y centrifugar a 42.000

r.p.m. por una hora.

7. Resuspender el precipitado en tampón fosfato

100 mM pH 7,0 y agregar un volumen igual de

cloroformo.

8. Centrifugar a 12.500 r.p.m. por 10 minutos.

9. Colectar el sobrenadante, que contendrá el

semipurificado parcial

10. Evaluar por microscopía electrónica

11. Colocar en gradiente de Cloruro de Cesio (10 –

30%) y centrifugar a 42.000 r.p.m. por 3 horas

12. Colectar la banda del virus purificado.

13. Evaluar al microscopio electrónico.

1. Colectar 100 grs. De tejido infectado, picar en

pequeños pedazos y congelar a – 90°C.

2. Moler o pulverizar con un moledor de café con

ayuda de hielo seco.

3. Mezclar con 3 volúmenes (v/V) (100g / 300 ml)

de tampón fosfato pH 6.0, 250 mM, contenien-

do 0.2% (v/V) de 2–mercaptoethanol, 2% (v/V)

de Celluclast 1.5 L (Novo Nordisk Biochemich

North America, Inc., Franklinton).

4. Agitar por 4 horas a temperatura ambiente.

5. Filtrar a través de gasa.

6. La fibra se re-extrae con 1 volumen de tampón

de extracción sin celluclast, 1,5 L.

7. Mezclar los filtrados y adicionar tritón X-100

con una concentración de 0,8% (v/V).

8. Agitar por toda la noche a 4°C.

9. Clarificar por extracción con un volumen igual

de cloroformo–n-butanol, (1:1 v/v), y centri-

fugar 10.000 r.p.m. por 15 minutos

10. Colectar la fase acuosa y concentrar el virus

adicionando 10% de PEG (PM 10.000) y 2%

(P/V) de NaCl.

11. Centrifugar a 10000 r.p.m. por 20 minutos.


100 mM pH 7,0, conteniendo 0,65% (v/V) de

Tritón X–100.

13. Clarificar por centrifugación a 13000 r.p.m.por

15 minutos

14. Ultracentrifugar a 42000 r.p.m./90 minutos,

sobre un colchón de sucrosa al 30 % en tampón

fosfato pH 7,0.


100 mM PH 7,0. y evalúa por Microscopía

electrónica.

1. Colectar 100 gramos de hojas enfermas, cortar-

las en pequeños pedazos, congelarlas con Ni-

trógeno líquido y pulverizarlas con hielo seco

en un moledor de café. Adicionar, Celluclast

1,5 L al 2 % (Novo Nordisk Biochemich North

America, Inc., Franklinton), solución fosfato

250 mM, pH 6,0 (2,5 volúmenes p/v) y 0,2%

de 2–Mercaptoethanol y dejar mezclando a

temperatura ambiente tres a cuatro horas

2. Homogenizar en licuadora.

3. Filtrar con una malla de 200 mesh de nylon.

4. Adicionar 2.5 ml de tritón X–100, al 33% y

agitar a 4°C por una hora.

5. Centrifugar a baja velocidad 10000 r.p.m. por

10 minutos.

6. Filtrar el sobrenadante a través de gasa.

7. Centrifugar a 42000 r.p.m. por una hora a 4°C

sobre un colchón de Sucrosa al 30% en tampón

fosfato 100 mM pH 7,0.

8. Resuspender el precipitado toda la noche en

100 mM pH 7,0

9. Clarificar con un volumen igual de cloroformo

(1:1) y agitar en vortex.

10. Centrifugar a baja velocidad (10000 r.p.m. por

10 minutos).

11. Recolectar el sobrenadante.

12. Centrifugar a 42000 por una hora con o sin

colchón de sucrosa al 30% .

13. Resuspender el precipitado en 100 mM de

tampón Fosfato pH 7,0 por toda la noche.

14. Centrifugar a 5.000 r.p.m. por 5 minutos y

recoger el sobrenadante.

15. Observar al microscopio electrónico.

16. Pasar por un gradiente de sucrosa del 10-40 %

si es necesario


del floema y se necesita de algún agente que

lo pueda liberar.

La otra metodología que se ensayó fue la

propuesta por Scagliusi y Lockhart (2000)

para purificación de ScYLV. El proceso

utiliza la enzima del Celluclast 1.5 L (2 %)

(Novo Nordisk Biochemich North America,

Inc., Franklinton) adicionado a la solución de

extracción, se observó una mayor concentra-

ción viral con relación al protocolo general

(Tabla 1) para purificación de virus (Lo-

ckhart, 1999), debido a que la enzima rompe

las paredes celulares dejando libre las partícu-

las vírales (Figura 1 A-D). Esta técnica utiliza

cantidades altas de cloroformo y butanol que

pueden resultar poco favorables para el virus

ya que lo puede degradar. A pesar de todo, la

concentración viral aun se mostró muy baja

para inmunizar los conejos y la adición de

productos como PEG al 10% y NaCl al 2%,

no produjeron incremento en la concentración

viral.

La metodología modificada por

CENICAÑA (Tabla 1) resultó ser la más

efectiva para la purificación del virus; en esta

técnica a la solución de extracción le fue

adicionado Celluclast 1.5 L al 2% (Novo

Nordisk Biochemich North America, Inc.,

Franklinton). La adición de esta enzima

celulolítica permitió el rompimiento de los

enlaces -glucosídicos de la celulosa de las

paredes de las células y de esta manera el

virus se liberó fácilmente de las células del

floema (Figura 1 A-C) y la concentración

viral aumentó en comparación con la metodo-

logía general propuesta por Lockhart (1999) y

la de Scagliusi y Lockhart, (2000) para

ScYLV. Además, la agitación a temperatura

ambiente durante 4 horas del tejido picado

con la solución de extracción y el Celluclast

1.5 L, promovió la disgregación del virus

antes de los procesos de limpieza (Figura 1-

D).

En la técnica modificada se encontró que

es necesario mantener el tejido en condicio-

nes controladas de frío utilizando nitrógeno

líquido, evitando así que el tejido se hume-

dezca para posteriormente triturar finamente

el tejido en un moledor de café con la ayuda

de hielo seco. Las centrifugaciones a baja

velocidad fueron uniformizadas a 10.000

r.p.m. por 10 minutos. La primera centrifuga-

ción a alta velocidad debe realizarse siempre

sobre un colchón de sucrosa al 30% para

disminuir el efecto de pérdida del virus (Ta-

bla 2). Es también necesario dejar el precipitado

en resuspensión por un tiempo mínimo de 12

horas para favorecer la disgregación del virus,

este tiempo no debe excederse porque pueden

presentarse contaminaciones por bacterias. El

uso de bajas concentraciones de cloroformo

incidió en que el virus no se degradara. Es

importante una última concentración del virus

a alta velocidad de centrifugación (42000

r.p.m. x 1 hora) con o sin colchón de sucrosa,

para obtener menores volúmenes de resus-

pensión y de esta forma tener una alta con-

centración del virus (Figura 1-D).

Edad fisiológica y tipo de tejido para

purificar el virus

Se encontró que las mejores muestras para

usar en la purificación del virus corresponden

a tejido joven (hojas de cogollo y hoja TVD)

de plantas entre 30 y 60 días que no hayan

recibido procesos de congelamiento, pues en

estas muestras se observó un promedio mayor

de partículas virales mediante microscopía

electrónica. Los materiales jóvenes presentan

también mayores ventajas para su manejo,

especialmente en el proceso de trituración.

Materiales de mayor edad, entre 6 y 12 meses

y tejido de nervaduras de hojas y entrenudos-

de tallo mostraron promedios bajos en con-

centración de partículas y además son difíci-

les de triturar.

CCuuaannttiiffiiccaacciióónn ddee llaa ccoonncceennttrraacciióónn viral

Las preparaciones del virus purificado de la

metodología modificada en Cenicaña tuvie-

ron una relación de absorbancia A260/A280 de

1,49 y su concentración fue de 1.87 mg

ScYLV/ml. La concentración del virus per-

mitió preparar las diferentes dosis que fueron

utilizadas en el proceso de inmunización y

producción del antisuero específico.

Método de inmunización para obtener

antisuero

Al finalizar la aplicación de las dosis y al

cumplirse la quinta semana se iniciaron las

sangrías del conejo realizándose doce en

total. Con cada sangría se obtuvo un antisuero

más específico, precipitando las proteínas que

aún pudiera contener, utilizando la metodolo-

gía de Ball et al (1990). El precipitado sé

resuspendió en PBS con la mitad del volumen

original del antisuero y se congeló para em-

Tabla 2. Evaluación de los antisueros de las diferentes sangrías para la detección del virus

del síndrome de la hoja amarilla ScYLV, mediante la técnica serológica TBIA.

Sangría

Dilución del antisuero

1:5000 1:6000 1:7000 1:8000 1:9000

1 y 2 - + + + -

3 + + + + -

4, 5 y 6 - + - - -

7, 8 y 9 - - - - -

10, 11 y 12 - - - - -

+: Detección positiva a la enfermedad -: Detección negativa a la enfermedad

C

B A

D

Figura 1. Corte de tejidos del floema. A-C. Partículas virales dentro de la célula D. Observación por mi-

croscopía electrónica del virus purificado siguiendo el protocolo general de purificación propuesta por

Lockhart 1999 con adición de Celluclast 1.5 L en el proceso de purificación.


plearse en la realización de las pruebas sero-

lógicas.

Pruebas serológicas con el antisuero de

ScYLV

El antisuero de cada una de las sangrías se

evaluó por la técnica serológica de TBIA y se

observó una reacción positiva específica del

antisuero sobre el patógeno presente en las

nervaduras de las plantas enfermas, a partir

de la primera hasta la sexta sangría, siendo la

tercera sangría la demás alto titulo al poder

emplearse en un rango de dilución que va de

1:5000 a 1:8000 (Tabla 2).

La primera y segunda sangría también

mostraron resultados óptimos ya que respon-

dieron específicamente en las diluciones

realizadas entre 1:6000 a 1:8000. De igual

manera, de la cuarta a la sexta sangría res-

pondieron de manera específica solo en la

dilución 1:6000 (Tabla 2).

Las sangrías posteriores no mostraron

ninguna reacción positiva a las diferentes

diluciones de anticuerpos, lo cual puede ser

debido a que la concentración de anticuerpos

producidos por el conejo se disminuyó con el

paso del tiempo. En las impresiones de ner-

vaduras de plantas sanas no se observó nin-

guna reacción positiva en ninguna de las

diluciones de los antisueros utilizados.

Para la técnica de ISEM se utilizó el me-

jor antisuero que fue el de la tercera sangría.

Se observó que cuando se usa el Celluclast

1.5 L adicionado a la solución de macerado

de tejido y dejándolo por una hora y adicio-

nándole luego el antisuero específico se

detecta una captura de las partículas virales

con mayor especificidad que cuando se utiliza

solo el antisuero sin usar el celluclast en el

proceso de maceración (Tabla3).

Se observó además que el antisuero pre-

parado en este estudio actuó específicamente

mostrando una mayor captura de partículas

virales en los mismos semipurificados utili-

zados para la inmunización de los conejos de

este trabajo que cuando se observó el semipu-

rificado sin adicionarle el antisuero (Tabla 3,

Figura 2). En las variantes de macerado del

tejido con Celluclast 1.5 L y tejido macerado

sin Celluclast 1.5 L y sin utilizar el antisuero,

no hubo detección de partículas vírales (Tabla

3).

CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS

Se purificó el virus causante de la enfer-

medad del síndrome de la hoja amarilla

empleando la metodología modificada en

CENICAÑA, y al adicionar la enzima ce-

lulolítica Celluclast 1.5 L al 2 % (Novo

Nordisk Biochemich North America, Inc.,

Franklinton) a la solución de extracción

se aumentó considerablemente la concen-

tración de partículas virales.

El material óptimo para purificar el agen-

te causal del virus del síndrome de la hoja

amarilla debe ser tejido joven proveniente

de hojas de cogollo hasta la TVD sin congelar

y con edad de las plantas de 30 a 60 días,

donde se encontró una alta concentración de

partículas virales.

Se obtuvo un purificado con una relación

de absorbancia A260/A280 igual a 1.49 y

una concentración viral de 1.87 mg

ScYLV/mL.

Se obtuvo antisuero específico contra el

ScYLV para ser empleado en la técnica

serológica de TBIA en un titulo de

1:5000 a 1:8000.

El empleo del celluclast 1.5 L al 2 %

(Novo Nordisk Biochemich North Ame-

rica, Inc., Franklinton) en la técnica sero-

lógica ISEM, mostró beneficio en la cap-

tura de las partículas virales del ScYLV.

Por medio de ésta metodología se puede

seguir produciendo un antisuero específi-

co con un alto titulo para ser utilizado en

pruebas de diagnóstico de la enfermedad

en campos de caña de azúcar.


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Tabla 3. Comparación del uso del Celluclast 1.5 L y el antisuero específico en la captura de partículas

mediante la prueba serológica de ISEM.

Muestra Sin antisuero

Con antisuero

Tejido sin Celluclast - +

Tejido con Celluclast - ++

Semipurificado + +++

- = No partículas vírales (0), + = bajo númerpo de partículas vírales (1-2), ++ = Número moderado de

partículas vírales (5-10),+++ = Alto número de partículas vírales (>10)

A B

Figura 2. Captura específica de partículas virales extraídas de plantas de caña de azúcar afectadas por

ScYLV. A. Semipurificado sin antisuero. B. Semipurificado con antisuero.


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CARACTERIZACIÓN PARCIAL DE UN POTEXVIRUS AISLADO DE PITAHAYA AMARILLA

(Selenicereus megalanthus) AFECTADA POR MOSAICO EN COLOMBIA

Helena Reichel 1, Rosalía Pérez2 y Ana Karine Martínez3, Raúl Sedano3, Maritza Cuervo3, José Alejandro Arroyave3 y Francisco José Morales3

1Laboratorio de Virología Vegetal, Programa Nacional de Recursos Genéticos Vegetales y Biotecnología Agrícola, Corporación Colombiana de

Investigación Agropecuaria (CORPOICA), A. A. 240142 Las Palmas, Bogotá, Colombia; 2Pontificia Universidad Javeriana, Departamento de

Bioquímica y Nutrición, Cr. 7 No. 40-62, Bogotá, Colombia; 3Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Unidad de Virología, A. A.

6713, Cali, Colombia.

RESUMEN

Observaciones al microscopio electrónico de extractos de plantas de

pitahaya amarilla (Selenicereus megalanthus) afectada por un mosaico

tenue, procedentes del municipio de Arbeláez, Cundinamarca, revela-

ron la presencia de partículas flexuosas de aspecto viral de aproxima-

damente 476 x 10 nm. Mediante IC-RT-PCR, se amplificó un frag-

mento de cerca de 370 pares de bases con una homología del 94% con

el gen de la cubierta proteica del Virus X del cactus (CVX). Este es el

primer reporte del CVX en pitahaya en Colombia.

Palabras claves: Virus X del cactus (CVX)

SUMMARY

Yellow pitahaya (Selenicereus megalanthus) plants showing mosaic

symptoms, from the locality of Arbeláez, Cundinamarca, Colombia,

were shown by electron microscopy to contain viral-like filamentous

particles of ca. 476 x 10 nm. IC-RT-PCR amplified a fragment of ca.

370 base pairs, showing a 94% amino acid homology to the coat pro-

tein of Cactus virus X (CVX). This is the first report of CVX infecting

yellow pitahaya in Colombia.

Keywords: Cactus virus X (CVX)

INTRODUCCIÓN

La pitahaya amarilla (Selenicereus megalant-

hus) es una especie de la familia Cactaceae,

aparentemente originaria del norte de Sur

América (Rodríguez et al. 1993; Becerra,

1994). Colombia es el mayor productor de

esta fruta en América Latina, principalmente

los Departamentos de Valle, Cauca, Cundi-

namarca, Tolima, y Boyacá (Holmes et al,

1995), Becerra, 1994). En 1990 existían

aproximadamente 400 hectáreas de pitahaya

amarilla para consumo interno y exportación,

principalmente hacia el Japón (Zenner de

Polanía, 1990). Desafortunadamente este

mercado fue cerrado en 1989 debido a la

presencia de la mosca de la fruta (Vidal y

Abello, 1998). Actualmente existen en Co-

lombia 180 hectáreas cultivadas de pitahaya

amarilla, y se han reiniciado las exportaciones

colombianas de pitahaya hacia el Japón,

Europa y Estados Unidos (Agricultura y

Ganadería, 2001).

Recientemente se observaron plantas de

pitahaya amarilla con síntomas de mosaico

tenue, cerca de plantaciones de Musa sp.

donde se realizaba una prospección por la

presencia de enfermedades virales. Teniendo

en cuenta la importancia de la pitahaya amari-

lla en Colombia, se procedió entonces a

determinar el agente causal del mosaico de la

pitahaya amarilla y su posible relación con

los virus aislados de Musa spp. en Colombia.


Aislamiento y mantenimiento. Durante 1997

se observó un cultivo de pitahaya amarilla

afectado por un mosaico tenue (Figura 1A) en

la localidad de Arbeláez, Cundinamarca.

Materiales propagativos de estas plantas se

mantuvieron en condiciones de invernadero

en CORPOICA-Tibaitatá y posteriormente en

el Centro Internacional de Agricultura Tropi-

cal (CIAT), ubicado en Palmira, Valle.

Microscopía electrónica.

Se utilizó la técnica de maceración de tejido

foliar y teñido negativo con acetato de urani-

lo, pH 4,0 al 2%, para su observación poste-

rior en un microscopio electrónico (Hitachi

12 HU). Para estudios citológicos se produje-

ron secciones de tejido del tallo de una planta

de pitahaya con síntomas de la enfermedad,

utilizando un ultramicrótomo (Sorvall MT

6000). Las secciones se observaron con un

microscopio electrónico (JEOL JEM-1010).

Síntesis y clonaje de ADN complementario

(ADNc).

Se utilizó una sección del tallo de pitahaya

con síntomas de mosaico como fuente de

material para el presente estudio. Para ampli-

ficar parte del gene de la cubierta proteica

(CP) y la región viral 3’ no codificante, cono-

cida en inglés como ‘untranslated region’

(UTR), se utilizó el método de immuno-

captura y transcripción reversa mediante la

reacción en cadena de la polymerasa (IC-RT-

PCR) según Sharman et al. (2000). La sínte-

sis del ADNc a partir del ARN viral se realizó

mediante el uso de 200 Unidades de trans-

criptasa reversa Super Script II (GIBCO,

BRL) en presencia de 10 pmoles del iniciador

degenerado Poty 1 (5´-GGATCCCGGGTTT

TTTTTTTTTTTTTTV-3´) para el extremo

poliadenilado de ARN, 30 pmoles del inicia-

dor degenerado DCCP (5’-TATGCNGCNTT

YGAYTTCTTRGAYG-3’),2mM de MgCl2,

0,2 mM de dNTPs (Invitrogen, CA,USA), y 1

Unidad de polimerasa Taq (Ampli Taq DNA

polymerase, Perkin Elmer). La PCR se reali-

zó en un termociclador PTC-100 TM Pro-

grammable Thermal Controller (MJ Re-

search, Inc.,USA), con el siguiente programa:

94 C/1 min; 94 C/20 s.; 56 C/1 min.;

72C/1 min; por 35 ciclos y un ciclo final de

72C/3 min.

El producto de la PCR se purificó usando

el Kit ‘Magic PCR System’ siguiendo las

instrucciones del productor (Promega, WI,

USA) y posteriormente fue clonado en la

cepa de DH5 de E. coli utilizando como

vector el plásmido pCR® 2.1 del Kit TA

Cloning (Invitrogen), según las instrucciones

del fabricante. Las colonias de E. coli fueron

establecidas en el medio selectivo LB-agar

con ampicilina, X-GAL, y el inductor IPTG

para seleccionar los clones recombinantes. El

ADN plasmídico se purificó usando el Kit


“WizardTM Plus Miniprep DNA Purification

Systems” (Promega) y se observo en un gel

de agarosa usando bromuro de etidio.

Análisis de secuencia. Se utilizó un se-

cuenciador automático ABI Prism 377 (Per-

kin-Elmer). Las reacciones de secuenciación

se hicieron con el juego de reacción de se-

cuencias con terminadores “Big-Dye” de ABI

prism y el iniciador M13. Las secuencias

obtenidas se analizaron utilizando el progra-

ma BLAST de la base de datos del GenBank.


Microscopía electrónica.

Los tallos sintomáticos de pitahaya contenían

partículas filamentosas con un diámetro de

aproximadamente 10 nm y una longitud de

476 nm (Figura 1 B). En las células infecta-

das se observaron haces de partículas fila-

mentosas en el citoplasma. La morfología y

citopatología (Figura 1C) de estas partículas

observadas son similares a las descritas para

especies del género Potexvirus (Francki et al.,

1985; Brunt et al, 1990).

Análisis moleculares.

Se amplificó un fragmento de ca. 370 pares

de bases, pb (Fig. 2). Tres clones obtenidos

de este fragmento se secuenciaron mediante

el iniciador M13. El fragmento secuenciado

tiene una homología del 94% con la proteína

de la cubierta del Virus X del cactus (CVX),

perteneciente al género de los Potexvirus

(GenBank AF308158).

Estos resultados demuestran que el CVX

se encuentra en Colombia infectando plantas

de pitahaya amarilla. Este virus se puede

diseminar mediante la propagación vegetati-

va, al sembrar estacas de pitahaya provenien-

tes de plantas infectadas, así como por con-

taminación mecánica. Como medida de con-

trol se recomienda utilizar material de siem-

bra certificado, libre del CVX.

AGRADECIMIENTOS

Esta investigación fue financiada en parte por

la Corporación Colombiana de Investigación

Agropecuaria (CORPOICA), el Centro Inter-

nacional de Agricultura Tropical (CIAT), por

el Fondo Nacional de Fomento Hortifrutícola

(ASHOFRUCOL) y por la Dra. Margarita

Perea (Universidad Nacional de Colombia).

Agradecemos al Sr R. Zerda (Fundación

Santa Fé de Bogotá) por su colaboración en

EM; Sra Clemencia de La Rotta (MIP,

CORPOICA) por las muestras de pitahaya

utilizadas en este estudio; y Sr. Antonio Rios

(Produmedios) por su colaboración en foto-

grafía.


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Figura 1. A. Síntomas de mosaico sistémico en tallo de pitahaya amarilla procedente de la localidad de

Arbeláez,Cundinamarca. B. Partículas del Virus X del cactus (CVX) observadas en extractos de tallos de

pitahaya amarilla de Arbeláez, Cundinamarca. C. Citopatología de células infectadas por CVX. Inclusiones

fibrilares (V)

B C

V

V

V

A

1 2

Figura 2. Carril 1= Producto amplificado por IC-

RT-PCR, de una muestra de pitahaya infectada por

el Cactus virus X; carril 2= Marcador de peso

molecular 1 Kb DNA Ladder (GIBCO, BRL).

506

396

pb

1636

1018

2036


NUEVOS BROTES DE BEGOMOVIRUS EN COLOMBIA

Francisco J. Morales, Ana K. Martínez, y Ana C. Velasco

Unidad de Virología, Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), A.A. 6713, Cali, Colombia;

Correo electrónico [email protected]

RESUMEN

Se han presentado brotes de enfermedades virales antes desconocidas

en habichuela y en tomate en varios municipios del Valle del Cauca.

Las habichuelas presentan un arrugamiento foliar severo y amarilla-

miento moderado, mientras que el tomate muestra síntomas moderados

de mosaico y deformación foliar. También se observó una nueva

enfermedad viral en tomate en el municipio de Fusagasugá, Cundina-

marca. Las plantas afectadas muestran un mosaico amarillo y defor-

mación foliar. Pruebas serológicas y de amplificación de ácidos nu-

cléicos revelaron la presencia de geminivirus transmitidos por la mos-

ca blanca Bemisia tabaci (begomovirus). Secuencias parciales de

clones seleccionados de los fragmentos amplificados por PCR, mostra-

ron la presencia de dos especies nuevas de begomovirus en habichuela

(Virus del arrugamiento foliar del frijol), y en tomate (Virus del mo-

saico suave del tomate) en el Valle del Cauca. Las secuencias obteni-

das de la muestra de tomate de Fusagasugá, demuestra que el begomo-

virus detectado es el Virus del mosaico amarillo del tomate, original-

mente descrito en Venezuela. En algunas de las muestras de tomate,

también se encontraron potyvirus y un cucumovirus. Se discute la

naturaleza de estos brotes de begomovirus y se hacen recomendacio-

nes para su control a corto y largo plazo.

Palabras claves: Geminivirus, leguminosas, habichuela, tomate,

hortalizas

SUMMARY

Previously unknown viral diseases have been observed in past months

in different regions of the Cauca Valley, Colombia, affecting snap

bean and tomato plantings, The affected snap bean plants show severe

leaf malformation (crumpling) and mild variegation. The diseased

tomato plants show moderate degrees of mosaic and leaf malfor-

mation. Some tomato samples were obtained in Fusagasuga, Cundi-

namarca, central Colombia. These samples showed foliar yellowing

and moderate leaf malformation. Serological tests and PCR amplifica-

tion of viral nucleic acids using begomovirus-specific primers, re-

vealed the presence of two new begomovirus species in snap bean

(Bean leaf crumple virus) and tomato (Tomato mild mosaic virus). The

tomato samples from central Colombia contained a known be-

gomovirus species (Tomato yellow mosaic virus) originally described

from Venezuela; and some samples also contained aphid-borne po-

tyviruses. The unexpected outbreak of these whitefly-borne be-

gomoviruses is discussed here with a view to adopting effective virus

control measures.

Keywords: Geminivirus, legumes, greenbeans, tomato, vegetables

INTRODUCCIÓN Es posible que los geminivirus transmitidos

por la mosca blanca Bemisia tabaci Genn.

(begomovirus) hayan existido en Colombia

por más de un siglo, pero es a partir de la

década de los 1970s cuando aparece un in-

forme (Galvez et al, 1975) sobre enfermeda-

des causadas por estos virus en una especie

cultivada (frijol común). Este informe coinci-

de con epidémias causadas por diversos

begomovirus en cultivos como algodón,

tomate y frijol en Brasil, Venezuela, México,

El Salvador, Cuba y Puerto Rico (Morales y

Anderson, 2001) para citar solo algunos de

los países más afectados por estas nuevas

plagas.

En las últimas décadas, los begomovirus

se han convertido en el principal problema de

producción de cultivos como el frijol, tomate,

pimentón, chile, tabaco y varias cucurbitá-

ceas, en agro-ecosistemas localizados entre el

nivel del mar y los 1.000 metros de altura

sobre el nivel del mar (msnm), especialmente

donde el clima es cálido y con períodos

secos definidos, lo cual favorece la reproduc-

ción de B. tabaci.

En Colombia, a pesar de que se han regis-

trado en años recientes brotes en cultivos

como melón y badea, en el norte del país

(Atlántico y Córdoba, respectivamente);

tabaco en Huila; y frijol y soya en el Valle del

Cauca (Morales et al, 2000), los begomovirus

no se han convertido en problemas endémicos

Esta situación podría explicarse por la locali-

zación geográfica ecuatorial y andina del

país, las cuales condicionan una adecuada

distribución de lluvias durante el año, y pisos

térmicos con temperaturas promedio inferio-

res a las requeridas por la mosca blanca B.

tabaci. Sin embargo, existen varias regiones,

como la Costa Atlántica, donde existen culti-

vos susceptibles (e.g., melón y tomate), tem-

peraturas cálidas, y períodos prolongados de

sequía, donde B. tabaci existe como plaga

pero no como vector de begomovirus.

En esta investigación informamos sobre

nuevos brotes de begomovirus en zonas

agrícolas andinas, y discutimos los factores

ambientales que podrían estar condicionando

el resurgimiento de estos virus en mayor

escala.


Las muestras procesadas en esta investigación

consistieron en plantas de diversas varieda-

des e híbridos de tomate (Lycopersicon escu-

lentum Mill.) afectadas por un mosaico y

deformación foliar moderados (Figura 1a)

procedentes de Buga, Guacarí, Robledo,

Roldanillo, Rozo, Toro, Tuluá y Vijes. Algu-

nas plantas con síntomas avanzados de la

enfermedad, presentaban amarillamiento

foliar. En el caso de la habichuela (Phaseolus

vulgaris L.), las muestras recolectadas en

diferentes lotes de los municipios de Bugala-

grande, Pradera, Rozo y Roldanillo, Valle del

Cauca, consistían en hojas con un arruga-

miento severo (Figura 1b) y variegación

moderada (Figura 1d).

Posteriormente llegó una muestra de to-

mate procedente de Fusagasugá, Cundina-

marca, con síntomas de mosaico amarillo y

deformación foliar (Figura 1c).

Las muestras de tomate y habichuela del

Valle del Cauca fueron recolectadas por el

Ing. Agrónomo José Miguel Pacheco, el

autor principal, y personal del laboratorio de

entomología de frijol del CIAT, coordinado

por el Dr. Cesar Cardona. Las muestras de

tomate de Fusagasugá fueron enviadas por el

Ing. Orlando Arguello. La incidencia de estas

enfermedades en el campo era superior al


80%.

Serología

Las muestras foliares se procesaron mediante

maceración en una solución salina de tampón

fosfato (PBS) según el método de ELISA por

captura de anticuerpo. Para este ensayo, se

seleccionó el anticuerpo monoclonal 3F7 de

amplio espectro, el cual detecta todos los

begomovirus originarios del Nuevo Mundo

(Cancino et al, 1995). También se usaron

anticuerpos monoclonales contra potyvirus

(AGDIA, Inc.USA) y cucumovirus (produci-

do en el CIAT) utilizando la técnica de

ELISA-indirecta (Voller et al, 1979). En el

caso de una muestra de tomate de Fusagasu-

gá, se realizó una prueba serológica a los

frutos. El lector de ELISA se calibró a una

densidad óptica (DO) de 405 nm.

Amplificación, clonación y secuenciación

parcial del AND viral

Para todas las muestras se hizo extracción del

ADN total según el método de Gilbertson et

al (1991). Para la amplificación por PCR de

secuencias seleccionadas del genoma de los

begomovirus, se utilizó el par de primers

PAR1C 715 y PAL1V 1978 (Rojas y Gilber-

tson, 1993), los cuales amplifican un frag-

mento de aproximadamente 1500 pb. La

mezcla de reacción para la amplificación se

hizo a un volumen final de 25 µL con las

Figura 1. Síntomas de begomovirus en tomate y habichuela , además de

otros disturbios en tomate:

a Síntomas de mosaico y deformación foliar moderados observados en una

planta de tomate procedente de Guacarí, Valle del Cauca.

b. Arrugamiento foliar severo en una planta de habichuela observada en el

municipio de Rozo, Valle del Cauca.

c. Amarillamiento y deformación foliar observados en una planta de tomate

procedente de Fusagasugá, Cundinamarca

d.Variegación moderada (derecha) observada en una planta de habichuela

observada en el municipio de Rozo, Valle del Cauca. Arrugamiento foliar

severo ( Izquierda)

e. Maduración irregular del tomate (‘arco iris’) causada por la alimentación

de la mosca blanca Bemisia tabaci, biotipo B.


siguientes concentraciones finales de los

reactivos: Tampón 1X, MgCl2 1,5 mM,

dNTPs (total) 0,2 mM, cebadores 0,2 µM, 0,2

µL de taq polimerasa y 5µL de ADN concen-

trado. Para todas las pruebas de amplificación

se incluyó un control positivo de begomovi-

rus y un control negativo donde el ADN era

reemplazado por agua estéril.

El programa de amplificación consiste de

un ciclo inicial de denaturación a 94 C por 1

min, 29 ciclos de “annealing” a 52 C por

1:30 min, extensión a 72 C por 1 min, dena-

turación a 94 C por 30 s, “annealing” a 52

C por 1 min y extensión a 72 C por 1min.; y

finalmente una extensión de 5 min a 72 C.

Los fragmentos amplificados del ADN

viral se clonaron utilizando el Kit de “T.A.

Cloning de Invitrogen”. Se utilizó para cada

reacción 1µL de una solución tampón, el

Vector 2µL, T4 DNA ligasa y se variaron las

cantidades de ADN y agua estéril según la

concentración del fragmento amplificado.

Previo montaje de la ligación, el producto de

amplificación se purificó con el Kit Wizard

PCR preps (Promega). La ligación se hizo a

14 C durante toda la noche y se almacenó a -

20 C hasta el momento de la transformación.

La transformación se hizo por choque térmico

con células competentes DH5, elaboradas

en el laboratorio. En este proceso, las células

se incubaron inicialmente en hielo por 30 min

y luego 45 s en un baño María a 42 C. Pasa-

do este proceso, las células transformadas son

recuperadas adicionándoles medio SOC y

agitando a 37 C por una hora.

Posteriormente las células son plateadas

en cajas con medio selectivo de LB agar más

ampicilina, X-gal e IPTG. Las cajas selladas

se incubaron durante toda la noche a 37 C.

Las colonias blancas resultantes fueron

evaluadas por PCR para determinar si estas

contenían el inserto del tamaño esperado. La

amplificación se hizo según las siguientes

condiciones para un volumen final de 50 µL:

tampón 1X, MgCl2 1,5mM, dNTPs (total)

0,05 µM, primers M13 y T7 0,1µM, taq

polimerasa 0,2µM y agua bidestilada estéril.

El programa de amplificación consta de los

siguientes ciclos: denaturación inicial a 94 C

por 3 min; denaturación a 94 C 30 s, “annea-

ling” a 55 C 30 s, extensión a 72 C 2 min,

29 veces; extensión final a 72 C por 5 min.

Las colonias que tenían el inserto del tamaño

esperado, se pusieron a crecer a 37 C toda la

noche en medio LB líquido con ampicilina

para posteriormente poder purificar el ADN

plasmídico con la ayuda del Kit Wizard plus

Minipreps (Promega). Los plásmidos obteni-

dos fueron secuenciados automáticamente

primero con uno de los dos primers M13 o T7

para comprobar si los clones obtenidos eran

reales. La autenticidad del clon se verifica,

una vez editada la secuencia con el programa

SEQUENCHER 4.0, comparado, por medio

del algoritmo de BLAST, la secuencia obte-

nida con las secuencias ya introducidas en el

banco de genes. Los clones que resultaron

reales se secuenciaron con el primer comple-

mentario correspondiente.

RESULTADOS

Las muestras de tomate procedentes de los

municipios de Buga, Guacarí, Roldanillo,

Rozo y Vijes en el Valle del Cauca, reaccio-

naron positivamente (DO405nm 0,11-0,56)

en pruebas de ELISA con el monoclonal de

amplio espectro para detectar begomovirus.

Los valores para el control negativo (tomate

libre de virus) variaron entre DO405nm de

0,004 a 0,01.

Las muestras de tomate procedentes de

Fusagasugá, Cundinamarca, también reac-

cionaron positivamente al mismo antisuero

(DO405nm 0,12-0,56). Algunas de las mues-

tras de tomate de Roldanillo y Rozo, reaccio-

naron positivamente (DO405nm 0,16-2,68)

con el monoclonal para potyvirus. El control

negativo tuvo una lectura DO405nm de 0,02.

Las muestras de tomate de Fusagasugá reac-

cionaron fuertemente al monoclonal de

potyvirus (DO405nm >2,0). El control nega-

tivo mostró una lectura DO405nm de 0,01.

En la muestra de esta localidad donde se

examinaron frutos de tomate, las lecturas

DO405 nm para potyvirus fueron positivas (>

3,0), pero negativas para begomovirus a pesar

de que los frutos pertenecían a una planta

sero-positiva por los dos tipos de virus. Solo

una muestra de tomate procedente de Vijes

(Valle), resultó positiva (DO405nm 0,3) para

cucumovirus (el control negativo presentó

una DO405nm de 0,02).

En el caso de habichuela, las muestras de

Pradera, Roldanillo y Rozo (Valle) reacciona-

ron positivamente (DO405nm 0,28-0,74) con

el antisuero monoclonal para begomovirus.

Ninguna de las muestras de habichuela reac-

cionó en estos ensayos contra los antisueros

para potyvirus o cucumovirus.

Las pruebas de PCR para begomovirus

resultaron en la amplificación de un fragmen-

to esperado de aproximadamente 1500 pb

(Figura 2), tanto para las muestras sero-

positivas de tomate como de habichuela. La

secuenciación de un clon de 550 bases obte-

nido del fragmento amplificado de una mues-

tra de tomate enfermo procedente de Guacarí,

Valle, demostró una identidad a nivel de

nucleótidos del 85% con el gen de la proteína

putativa de la replicasa (AL1) del Virus del

mosaico enano del frijol (BDMV). El porcen-

taje de identidad a nivel de aminoácidos

subió a 87% para la misma región del virus

de tomate y del BDMV. En el caso de la

muestra de tomate procedente de Fusagasugá,

se secuenció un clon de 500 bases, el cual

mostró una identidad en la secuencia de

nucleótidos del 91% con parte del gen de la

cápside del Virus del mosaico amarillo del

tomate (ToYMV). La identidad a nivel de

aminoácidos aumentó a 95% para este clon en

relación al ToYMV.

La secuenciación de un clon de 627 bases

obtenido del fragmento amplificado para el

begomovirus detectado en una muestra de

habichuela procedente de Rozo, Valle, mostró

una identidad a nivel de nucleótidos del 85%

con la cápside del Virus del mosaico dorado

amarillo del frijol (BGYMV). Este porcentaje

de identidad descendió al 71% cuando la

comparación con el BGYMV se hizo a nivel

de aminoácidos.

DISCUSIÓN

Esta investigación demuestra que los bego-

movirus pueden cobrar una mayor importan-

cia socioeconómica en Colombia. Los brotes

descritos aquí ocurren a menos de tres años

de aparecer un informe preliminar sobre la

diseminación de estos patógenos en diferen-

tes departamentos del país (Morales et al,

2000). La alta incidencia de estos virus en las

plantaciones de tomate y habichuela visitadas

en el Valle del Cauca, pone de manifiesto el

gran potencial epidemiológico que estos virus

han demostrado poseer en otras regiones

tropicales y subtropicales del mundo. La

ocurrencia de epidemias de begomovirus en

el Valle del Cauca está estrechamente rela-

cionada con la aparición del biotipo B de B.

tabaci en esta región a finales de la década de

los 1990s (Quintero et al, 1998). Este biotipo

es más agresivo que el biotipo original, en

términos del número de especies vegetales

atacadas y su mayor capacidad reproductiva y

de daño directo (Perring, 1995).

Adicionalmente, se viene presentando en

los últimos años en el Valle del Cauca y otras

regiones agrícolas del país, incluyendo Fusa-

gasugá, una tendencia al incremento de los

períodos de sequía, acompañados por mayo-

res temperaturas diurnas. Estos factores cli-

2036

Figura 2. Gel de agarosa 1,2 % mostrando ampli-

ficación para Geminivirus con primers específicos

PAR1C715 y PAL1V1978. a. Marcador de peso

1Kb1Kb ADN Ladder ( GIBCO, BRL). b. Tomate

empire. c. Habichuela d. Control positivo (Alysi-

carpus rugosus) y e. Control de reacción. Los

fragmentos amplificados por PCR tienen un

tamaño aproximado de 1500 pb en tomate y

habichuela

a b c d e

pb

1018

506

1636

3054


máticos son importantes debido a que favore-

cen la reproducción de la mosca blanca B.

tabaci.

En condiciones climáticas normales, en el

Valle del Cauca y Fusagasugá (>1000

msnm), predomina la especie de mosca blan-

ca Trialeurodes vaporariorum (Quintero et

al, 2001), la cual no transmite begomovirus.

Evidencia directa de la presencia del biotipo

B de B. tabaci en el Valle del Cauca, es el

daño fisiológico conocido vulgarmente como

‘arco iris’ (maduración irregular) del tomate,

el cual va en incremento desde hace un año

en este valle (Figura 1e). Este daño al fruto

del tomate es causado por la alimentación del

biotipo B de B. tabaci en tomate (Maynard y

Cantliffe, 1989) y no por efecto de virus

transmitidos por mosca blanca.

Los ataques del biotipo B en el Valle del

Cauca, también se han manifestado en el

cultivo de la habichuela en años recientes.

Estos nuevos problemas han obligado a los

agricultores a usar más pesticidas para prote-

ger los cultivos susceptibles. Desafortunada-

mente, el uso intensivo de insecticidas es otro

de los factores que más agrava el problema de

mosca blanca, ya que elimina el control bio-

lógico natural y crea rápidamente resistencia

a los agroquímicos en la mosca blanca

(Prabhaker et al, 1985).

El frijol común, ya sea para consumo

como grano seco o habichuela, es muy sus-

ceptible a virus transmitidos por mosca blan-

ca (Morales y Anderson, 2001). En Colombia

y específicamente en el Valle del Cauca, se

conocía ya la presencia de los begomovirus

del mosaico enano (BDMV) y del mosaico

dorado amarillo (BGYMV) del frijol (Mora-

les et al, 1990; Morales et al, 2000). Sin

embargo, se encontró aquí un begomovirus

relacionado al BDMV infectando tomate, lo

cual no es del todo sorprendente, ya que el

BDMV proviene de malezas (malváceas)

hospederas de varios begomovirus pertene-

cientes al grupo del Virus del mosaico del

abutilón (AbMV), capaces de infectar diver-

sas especies vegetales. De hecho, el BDMV

es estrechamente relacionado a un begomovi-

rus que ataca el tomate en la Florida, Estados

Unidos: el Virus del moteado del tomate

(Gilbertson et al, 1993). Otros begomovirus

del tomate relacionados al BDMV, son el

Virus del tomate de la Habana, descrito en

Cuba (Martínez et al, 1998) y el Virus del

achinamiento del tomate (TLCrV) de México

(Brown et al, 2000). Sin embargo, la secuen-

cia parcial obtenida en esta investigación

sugiere que el begomovirus encontrado en el

Valle del Cauca es una nueva especie, a la

que tentativamente damos el nombre de Virus

del mosaico suave del tomate (Tomato mild

mosaic virus). Este es el primer begomovirus

descrito en tomate en Colombia.

Por el contrario, el begomovirus encon-

trado en Fusagasugá, Cundinamarca, es una

especie conocida, originalmente descrita en

Venezuela (Debrot et al, 1963). Este virus ha

sido ampliamente diseminado en la región del

Caribe, posiblemente, mediante el tráfico de

material vegetativo infectado. La presencia de

este virus en Fusagasugá sugiere también que

ha ocurrido tráfico de plántulas de tomate

infectadas entre Venezuela y Colombia. Lo

que es más sorprendente, es que este virus se

haya diseminado en el municipio de Fusa-

gasugá, dado que las condiciones climáticas

allí, son más propicias para Trialeurodes

vaporariorum que para B. tabaci. Según

informes del IDEAM (www.ideam.gov.co),

el municipio de Fusagasugá ha sufrido condi-

ciones de sequía desde finales del año pasado,

lo que explicaría la mayor presencia de B.

tabaci en esa región del país. Los potyvirus

encontrados en las muestras de tomate proce-

dentes de Fusagasugá, sugieren que las con-

diciones secas han favorecido también el

desarrollo de poblaciones de áfidos vectores

de estos virus.

El begomovirus aislado de habichuela en

el Valle del Cauca está relacionado estrecha-

mente con el Virus del mosaico dorado ama-

rillo del frijol (BGYMV), pero parece ser una

nueva especie. Estos dos virus también se

diferencian por los síntomas que causan en

frijol. Como su nombre lo indica, el BGYMV

induce generalmente un amarillamiento nota-

ble en las hojas de las plantas de frijol, mien-

tras que el nuevo begomovirus descrito aqui

induce un arrugamiento foliar severo, con

poco amarillamiento. Mientras se caracteriza

este virus más a fondo, lo llamaremos tentati-

vamente el Virus del arrugamiento foliar del

frijol (Bean leaf crumple virus).

La emergencia de begomovirus capaces de

infectar tomate en Colombia es de gran im-

portancia económica, dado el gran potencial

patogénico de estos virus y la falta de varie-

dades o híbridos resistentes en la América

Latina. La única esperanza para su manejo a

mediano plazo, es que las condiciones climá-

ticas se normalicen y las poblaciones de B.

tabaci en el Valle y Cundinamarca vuelvan a

los niveles bajos que tenían. De persistir esta

plaga, se deben proteger los semilleros de

tomate con malla contra la mosca blanca, así

como el cultivo hasta la etapa de formación

de frutos mediante el uso de insecticidas

sistémicos aprobados para este cultivo. El uso

de insecticidas de contacto cuando se observa

la mosca blanca en el tomate, no contribuye

al control de virus transmitidos por mosca

blanca.

A pesar de que existen fuentes de resis-

tencia a begomovirus en frijol común, estas

no han sido suficientemente usadas para

mejorar variedades de habichuela como la

que los productores del Valle están cultivan-

do actualmente. Se requiere entonces iniciar

un programa de mejoramiento genético rápi-

damente. A corto plazo, el uso de insecticidas

sistémicos al momento de la siembra, y evitar

sembrar en meses secos, ayudaría a reducir la

incidencia y daño causado por estos virus en

habichuela.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen el apoyo financiero del

Departamento para el Desarrollo Internacio-

nal del Reino Unido (DFID) en esta investi-

gación que hace parte del Proyecto Tropical

de Mosca Blanca.


Brown, J.K., Ostrow, K.M., Idris, A.M., y

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ENFERMEDADES VIRALES DE LA PALMA DE ACEITE EN EL SUROCCIDENTE

COLOMBIANO Y SUS AGENTES CAUSALES

Francisco J. Morales, Iván Lozano, José A. Arroyave, Mauricio Castaño, Raúl Sedano y Ana C. Velasco

Unidad de Virología, Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), A.A. 6713, Cali, Colombia;

Correo electrónico: [email protected]

RESUMEN

En 1998 se inició una investigación para determinar la etiología de

dos enfermedades de aparente naturaleza viral, que afectan el cultivo

de la palma africana de aceite en el suroccidente colombiano. La pre-

sencia de la ‘mancha anular’ se registró por primera vez en 1985, en el

municipio de Tumaco, Nariño. Esta enfermedad afecta palmas jóve-

nes en los primeros 1-3 años de vida. Las plantas afectadas mueren

rápidamente debido a una necrosis sistémica. Esta enfermedad se

asoció consistentemente a la presencia de un virus filamentoso de

aproximadamente 800 nm de longitud y 15 nm de diámetro, con un

genoma sencillo compuesto por una molécula de ARN de aproxima-

damente 8.000 nucleótidos. La caracterización molecular parcial del

virus mostró identidades del 51-67% en la secuencia de aminoácidos

con respecto al ORF 1 de dos especies tentativas del género Foveavi-

rus: el Cherry green ringspot mottle virus y el Cherry necrotic rusty

mottle virus. También se observaron identidades de secuencia de

aminoácidos del 40-62% para la misma región, entre el virus de la

palma africana de aceite y los foveavirus Apple stem pitting virus y

Rupestris stem pitting-associated virus. La segunda enfermedad viral,

el ‘anillo clorótico’, no es letal, pero las plantas sintomáticas son

destruidas por los agricultores. Esta enfermedad se observó en 1996 en

el municipio de Tumaco, afectando también palmas jóvenes. El ‘anillo

clorótico’ es causado por un virus filamentoso de aproximadamente

750 nm de longitud y 15 nm de diámetro, el cual induce inclusiones

cilíndricas en el citoplasma de las células infectadas. El virus se

transmitió mecánicamente a especies de gramíneas (maíz, caña de

azúcar, sorgo y braquiaria). Secuencias parciales del genoma viral

demostraron homologías del 90.8-95% con cepas del Sugarcane mo-

saic virus. Se discuten aquí algunas estrategias de control.

Palabras claves: Elaeis guineensis, Virus del mosaico de la

caña de azúcar, foveavirus

ABSTRACT

An investigation was initiated in 1998, to elucidate the etiology of two

diseases of apparent viral nature in the southwestern African oil palm

production region of Colombia. The ‘ring spot’ disease was first ob-

served in 1985, in the municipality of Tumaco, Nariño, causing a

lethal disease of young (1-3 year-old) palms. Electron microscopy of

diseased foliar tissue extracts revealed the presence of filamentous

virus-like particles, ca. 800 nm in length. Double-stranded RNA ex-

tractions made from diseased palms, led to the cloning and partial

sequencing of viral genome fragments showing amino acid sequence

identities of 51-67% with the corresponding genes of the tentative

foveavirus species Cherry green ringspot mottle virus and Cherry

necrotic rusty mottle virus. Lower but consistent amino acid sequence

identities (40-62%) were observed in comparisons with two recog-

nized foveaviruses: Apple stem pitting virus and Rupestris stem pit-

ting-associated virus. The second disease, ‘chlorotic ring’, was first

observed in 1996, also affecting young African oil palms in Tumaco.

This disease is not lethal, but growers eliminate affected palms any-

way. The disease is caused by a different filamentous virus ca. 750 nm

in length. The virus was characterized as a species of the genus Po-

tyvirus, namely a strain of Sugarcane mosaic virus. Possible virus

transmission mechanisms and disease management practices are dis-

cussed here.

Key words: Elaeis guineensis, Sugarcane mosaic virus, foveavirus

INTRODUCCIÓN

Colombia es el principal productor de palma

de aceite africana (Elaeis guineensis Jacq.) en

las Américas, con un área estimada en 1999

de 150.399 hectáreas distribuidas en diferen-

tes zonas del país (Fedepalma, 2000). En la

zona occidental se cultivan unas 20,970

hectáreas de palma dentro del municipio de

Tumaco, Nariño. Este municipio es importan-

te no solo por contribuir un 14,0% de la

producción total nacional de aceite de palma

crudo, sino también desde el punto de vista

socio-económico, ya que en el se encuentra la

mayor concentración (85%) de pequeños

productores de palma de aceite en el país.

Uno de los principales retos de los palmi-

cultores colombianos han sido el de aumentar

la productividad del cultivo y reducir los

costos de producción, con el fin de competir

favorablemente en el mercado interno y

externo. Entre los factores que más han inci-

dido negativamente en la productividad del

cultivo, están la incidencia de plagas y en-

fermedades. En el caso específico de la zona

suroccidental, existen enfermedades descono-

cidas en otras zonas productoras de palma de

aceite del país. En 1985, se registró la enfer-

medad conocida como ‘mancha anular’ en el

municipio de Tumaco (Jiménez y Peña,

1988). Esta enfermedad se observó por pri-

mera vez en 1969 (Arévalo, 1988; Renard y

Quillet, 1984), en la región amazónica (Toca-

che) del Perú. En 1974, la enfermedad se

detectó en la región noroccidental del Ecua-

dor, donde se le llamó ‘amarillamiento letal’

y ‘moteado del cogollo’ (Dzido et al, 1978;

Chávez, 1988). Las pérdidas de palmas jóve-

nes en el Ecuador alcanzaron niveles de

incidencia superiores a los 90% en algunas

plantaciones. En Tumaco, la ‘mancha anular

apareció hacia 1988 (Jiménez, 1988). La

incidencia de la ‘mancha anular’ ha fluctuado

entre el 2 y 45%, pero en los últimos años

han ocurrido brotes de mayor gravedad en

algunas plantaciones (Morales, 1998). Por lo

general, la ‘mancha anular’ es una enferme-

dad letal que afecta palmas jóvenes en etapa

de vivero y en los dos primeros años después

de la siembra definitiva en plantaciones co-

merciales.

Los síntomas iniciales de la enfermedad

se manifiestan como una clorosis y amarilla-

miento de las hojas más jóvenes de la planta

(Figura 1a), algunas de las cuales presentan

un moteado en los folíolos y en la base del

raquis (Figura 1b). La hoja flecha puede o no


presentar necrosis sistémica (Figura 1c). La

muerte de las palmas afectadas ocurre por la

necrosis del meristemo o punto de crecimien-

to. Al cortar el estípite longitudinalmente, se

observa la necrosis violácea del sistema

vascular (Figura 1d).

En 1995, se observó una enfermedad

diferente a la ‘mancha anular’ en viveros de

palma de aceite en el occidente del Ecuador, a

la cual se denominó ‘anillo clorótico’ (Chin-

chilla et al., 1995; Rivera et al., 1996). En

1996, se observó una enfermedad similar en

el municipio de Tumaco (Morales, 1999). El

síntoma más característico del “anillo cloróti-

co”, es la presencia de anillos en las hojas de

palmas jóvenes (Figura 1e), así como diver-

sos tipos de variegación en las hojas de las

palmas afectadas (Figura 1 f, g) y en la parte

inferior del raquis (menos frecuente que en el

caso de la ‘mancha anular’). A diferencia de

la ‘mancha anular’, el ‘anillo clorótico’ no

mata las palmas de aceite afectadas, pero los

agricultores eliminan las palmas enfermas

como una medida sanitaria.

El objetivo de estas investigaciones fue el

de identificar los agentes causales de estas

enfermedades de la palma de aceite en el

municipio de Tumaco, con el fin de diseñar

medidas de control y así evitar mayores

pérdidas de producción y su diseminación a

otras zonas productoras de aceite de palma en

el país.


Las muestras fueron recolectadas en el muni-

cipio de Tumaco por el autor principal o por

personal del Centro Colombiano de Investi-

gación de Palma de Aceite (CENIPALMA) y

de algunas plantaciones comerciales. La

mayor parte del tejido afectado y sano utili-

zado provino de hojas flecha de palmas de

aceite africanas de uno a dos años de edad.

Los tallos de todas las palmas afectadas por

‘mancha anular’, seleccionadas para esta

investigación, se cortaron en secciones para

confirmar la presencia de la necrosis violácea

asociada con esta enfermedad. El tejido

seleccionado se procesó fresco o fue conser-

vado a – 80°C hasta el momento de utilizarse.

Se analizó también una muestra foliar obteni-

da de una palma silvestre del género Bactris

(tentativamente identificada como B. setulo-

sa) que presentaba síntomas de amarillamien-

to foliar similares a los descritos para la

‘mancha anular’ de la palma de aceite africa-

na. Asimismo se incluyeron en todas las

pruebas muestras de palmas de aceite africa-

nas libres de síntomas.

Pruebas de patogenicidad

Las inoculaciones mecánicas se hicieron

utilizando extractos obtenidos de tejido de

hoja flecha afectada por mancha anular,

diluido 1:4 ó 1:10 (peso/volumen) en agua

destilada estéril o tampón preparado a una

concentración de 0,5 ó 0,1 M de fosfato de

potasio, pH 7,5, con 0,5 g de sulfito de sodio

y 1 mM dietil-ditiocarbamato de sodio

(DIECA).

Las siguientes especies y variedades: Che-

nopodium album, C. amaranticolor, C. qui-

noa, C. murale, Elaeis guineensis, Nicotiana

benthamiana, N. tabacum cv ‘Samsum,

Sorghum bicolor cv’. Rio, y Zea mays, se

inocularon en el caso de la ‘mancha anular’.

El rango de hospederos del agente causal del

‘anillo clorótico’ se estableció usando las

siguientes especies y variedades: Avena

sativa cv. Clintland, Brachiaria brizantha

CIAT 26646, Chenopodium amaranticolor,

C. murale, C. quinoa, Cucumis sativus, Datu-

ra stramonium, Elaeis guineensis, Glycine

max cv. Mandarin y Clark, Nicotiana bent-

hamiana, N. tabacum cv. Samsun, Panicum

maximum CIAT 673, 6172 y 6299, Sorghum

bicolor cvs Atlas, Rio, Texas 2786 y Trudex,

Phaseolus vulgaris cv. Bountiful, Sacharum

officinarum CP-57-603, S. halepense, Vigna

unguiculata cv. Blackeye, y Zea mays cv.

Sikuanis. En todas las pruebas se inoculó un

promedio de cinco plantas por especie o

variedad.

Microscopía electrónica

Para la observación directa de muestras en un

microscopio de transmisión JEOL JEM-1010,

extractos de tejido de palmas de aceite enfer-

mas y sanas se tiñeron negativamente en

acetato de uranilo al 2%, pH 3,7. Para los

estudios de citopatología, se seleccionó tejido

foliar de palmas de aceite enfermas y sanas y

se procedió según la técnica descrita ante-

riormente (Morales et al., 1990). Los cortes

ultra-finos se obtuvieron con una cuchilla de

diamante empleando un ultra-microtomo MT

6000 Sorval.

Electroforesis

Se extrajeron ARNs de doble cadena (dc) de

plantas de palma de aceite sanas y afectadas

por la ‘mancha anular’ y el ‘anillo clorótico’,

de acuerdo al procedimiento de Dodds y Bar-

Joseph (1993). Se estimaron los pesos apro-

ximados del ARNdc usando un patrón de

ADN (1 Kb) (Gibco BRL). La muestra de

Bactris sp. se procesó siguiendo el mismo

procedimiento.

Extracción de ácidos nucléicos, síntesis de

ADNc, clonación y secuenciación

Las técnicas de extracción, síntesis de ADN

complementario y clonación utilizadas en

estas investigaciones, han sido publicadas en

detalle (Morales et al., 2002 a, b). La secuen-

ciación se llevó a cabo con un secuenciador

automático de ADN ABI PRISM 377 (Perkin

Elmer). Las secuencias obtenidas se analiza-

ron empleando el programa BLAST del

Centro Nacional de Información, Instituto

Nacional de Salud, Bethesda, MD, USA).

RESULTADOS

La observación directa al microscopio elec-

trónico de extractos foliares de palmas afec-

tadas por ‘mancha anular’, reveló consisten-

temente (aunque en baja concentración) la

presencia de partículas filamentosas de apro-

ximadamente 800 nm de longitud y 15 nm de

diámetro (Figure 2a). Partículas similares de

aproximadamente 750 nm de longitud y 15

nm de diámetro, se observaron en todas las

muestras foliares tomadas de palmas jóvenes

afectadas por ‘anillo clorótico’ (Figure 2b).

También se observaron partículas filamento-

sas (v) dispersas en el citoplasma de células

de hoja de palmas de aceite afectadas por

‘mancha anular’ (Figura 2c). La citopatología

practicada a las plantas afectadas por ‘anillo

clorótico’, reveló la presencia de ‘agregados

laminares’ (al), a menudo asociados a partícu-

las (v) virales (Figure 2d), característicos de

especies de potyvirus, sub-división II (pre-

sencia de inclusiones cilíndricas y agregados

laminares). No se observaron partículas fila-

mentosas en extractos de tejido o secciones

de tejido de varias palmas de aceite africanas

asintomáticas, utilizadas como controles

libres de virus.

Ninguna de las especies vegetales inocu-

ladas mecánicamente con extractos de palmas

afectadas por ‘mancha anular’, desarrolló

síntomas o mostró al microscopio electrónico

la presencia de partículas similares a virus.

Las plantas de palma de aceite inoculadas se

mantuvieron bajo observación durante un

año, pero ninguna de las 10 plántulas inocu-

ladas por métodos estándar o inyección,

expresó síntomas.

De los 24 genotipos inoculados con extrac-

tos de palmas afectadas por ‘anillo clorótico’,

solo cuatro especies de gramíneas: B. bri-

zantha (braquiaria), S. officinarum (caña de

azúcar), S. bicolor (sorgo) cvs. Rio y Trudex,

y Z. mays (maíz), desarrollaron síntomas de

mosaico y mostraron partículas virales en

exámenes de microscopía electrónica. Even-

tualmente se logró transmitir el virus de sorgo

a palma de aceite africana, por medios mecá-

nicos.

La extracción y electroforesis del RNAcd

de palmas de aceite africanas afectadas por la

‘mancha anular’ reveló la presencia de una

banda predominante (Figura 3) de aproxima-

damente 8.034 pares de bases (pb), y ocasio-

nalmente dos bandas menores de aproxima-

damente 7.171 y 5.854 pb, probablemente

sub-productos de la molécula predominante.

La muestra de hoja de la palma sintomática

de Bactris sp. produjo un patrón de banda

similar, con una especie de ARN predomi-

nante de aproximadamente 8.135 pb.

En el caso del anillo clorótico, solo se ob-

servó una banda de aproximadamente 10.000

pb (Figura 3). Extractos de tejido de palma

afectada por ‘anillo clorótico’ reaccionaron

en pruebas serológicas (ELISA) con el mono-

clonal comercial específico para detectar

potyvirus.


Figura 1. Síntomas de enfermedades virales en palma de aceite africana:

“Mancha anular”

a. Clorosis y amarillamiento en hoja joven.

b. Variegación en los folíolos y base del raquis de hojas jóvenes

c. Pudrición de la hoja flecha .

d. Necrosis violácea en el interior del estípite de palmas jóvenes con síntomas

avanzados

““Anillo clorótico”

e. Síntomas foliares característicos, nótese la presencia de anillos cloróticos

f. Rayado

g. Manchas aceitosas asociadas

a b

c d

e f

g


En el caso de la ‘mancha anular’, se se-

cuenciaron veinticinco clones, lo cual produjo

dos conjuntos de secuencias solapadas de un

solo clon. El primer conjunto de 15 clones

produjo una secuencia continua de 3.491 pb.

Este fragmento tenía una identidad de se-

cuencia de aminoácidos (aa) del 51% con la

correspondiente al ORF 1 próximo del extre-

mo 5’ del Cherry green ringspot mottle virus

(CGRMV) y Cherry necrotic rusty mottle

virus (CNRMV). El CGRMV es una especie

tentativa del género Foveavirus (Regenmortel

et al., 2000) y el CNRMV está estrechamente

relacionado con el CGRMV (Rott y Jelk-

mann, 2001). La similitud de secuencia de aa

para esta región ORF 1 del virus de la palma

de aceite africana fue del 70 y 69% compara-

da con el CGRMV y el CNRMV, respecti-

vamente. Similitudes del 62 y 61% se obtu-

vieron en comparaciones con las secuencias-

de aa correspondientes a la ORF 1 próxima

del Apple stem pitting virus (ASPV) y el

Rupestris stem pitting associated virus

(RSPaV), las dos especies reconocidas del

actual género Foveavirus (Regenmortel et al,

2000). El segundo conjunto de nueve clones

solapados con una secuencia continua de

1.667 pb mostró identidades de secuencia de

aa de 67% con la región ORF 1 3’ terminal

del CGRMV y CNRMV. La similitud de

secuencia de aa para esta región fue del 78%

con estos dos foveavirus tentativos.

Dos de los sub-clones obtenidos de palmas

afectadas por ‘anillo clorótico’, correspondían

a fragmentos de la proteína de la inclusión

nuclear (NIb) del genoma de los potyvirus.

Un análisis comparativo de la secuencia de aa

de estos fragmentos revelaron homologías del

77% y 70% con regiones correspondientes

del Virus del mosaico de la caña de azúcar

(SCMV) cepas A (GenBank Acc.U84579) y

Bulgaria (GenBank Acc. AJ001691), respec-

tivamente. La alineación óptima de 232 nu-

cleótidos pertenecientes a la región no tradu-

cida del extremo 3’ (UTR), mostró una ho-

mología del 90% a nivel de nucleótidos, con

la cepa MDB del SCMV (GenBank Acc.

D00949). La secuencia parcial de un pequeño

fragmento de 44 nucleótidos perteneciente a

la cápside del virus, mostró homologías

mayores del 95% con el SCMV-MDB y

otras cepas del SCMV.

Figura 2 Partículas virales y cortes ultrafinos de tejidos de palma de aceite africana: a. Partículas filamentosas características de los virus de la ‘mancha anu-

lar’(barra c.a. 100 nm). b. Partículas filamentosas características de los virus del ‘anillo clorótico’(barra c.a. 100 nm). c. Partículas filamentosas (v) observadas en el

citoplasma de células de hoja de palma de aceite africana afectada por ‘mancha anular’(barra c.a. 150 nm). d. Agregados laminares (al) y partículas virales (v) en el

citoplasma de células foliares de palma de aceite africana infectada por el potyvirus causal del ‘anillo clorótico (barra c.a. 500 nm’).

a b

c d

al

v

v

v

Figura 3. Patrones electroforéticos de ARN de

doble cadena de extractos de palma de aceite

africana y marcadores 1Kb ADN Ladder ( GIBCO,

BRL). a,b,f marcadores. c. Hoja flecha de planta

sana. d. Extracto de hoja flecha afectada por ‘anillo

clorótico’(banda de 10.000pb, triángulo) e. Extrac-

to de hoja flecha afectada por ‘mancha anular’.

a e f d c b


DISCUSIÓN

Se demostró en esta investigación que la

‘mancha anular’ de la palma de aceite africa-

na en Colombia está asociada con un virus

filamentoso relacionado con especies recono-

cidas y tentativas del género Foveavirus

(Zhang et al., 1998; Regenmortel y colabora-

dores, 2000; Rott y Jelkmann, 2001). Sin

embargo, es posible que este género de virus

pueda ser reorganizado taxonómicamente en

un futuro próximo, debido a las evidentes

diferencias genéticas que existen entre las

diversas especies de virus que lo integran

están asociadas a este género actualmente.

Una característica importante del virus de la

palma de aceite africana, denominado en lo

sucesivo Virus de la mancha anular de la

palma de aceite africana (AOPRV), es su

rápida diseminación durante ciertos años y

épocas del año. Este patrón epidemiológico

es interesante, considerando que los foveavi-

rus no tienen vectores biológicos conocidos

(Regenmortel et al, 2000) y la palma de aceite

africana no requiere tratamientos culturales

de ninguna clase, tales como injertos o podas,

durante los primeros tres años de edad. Ba-

sados en la observación que la enfermedad de

la mancha anular de la palma de aceite afri-

cana se difunde más rápidamente durante

épocas de precipitación relativamente baja,

no puede descartarse en este momento la

posible existencia de un vector artrópodo.

También se debe tener en cuenta la posibili-

dad de que otros géneros de palmas nativos

actúen como reservorios del virus. En todo

caso, se recomienda no efectuar ningún tipo

de poda en palmas jóvenes menores de tres

años, y no hacer aplicaciones de insecticidas

en las plantaciones establecidas. Como medi-

da preventiva, se puede proteger las plántulas

durante el primer año con un insecticida

sistémico.

En relación a la segunda enfermedad viral

de la palma de aceite africana en Colombia,

esta investigación ha demostrado que el

‘anillo clorótico’ en el suroccidente de Co-

lombia, es causado por una cepa del Virus del

mosaico de la caña de azúcar (SCMV). Vale

la pena destacar la existencia de potyvirus

también pertenecientes a la subdivisión II en

otras especies de palmas, tales como la palma

real cubana (Thomas et al, 1993) y la palma

de abanico mejicana en Australia y los Esta-

dos Unidos (Mayhew y Tidweel, 1978),

respectivamente. El potyvirus de palma de

aceite descrito en la India (Solomon y Babu,

1998), induce inclusiones citoplasmáticas

diferentes (ringletes y rollos) característicos

de la subdivisión I de los potyvirus (Edward-

son y Christie, 1991). Las inclusiones cito-

plasmáticas observadas en palma de aceite

africana en el Ecuador (Chinchilla et al,

1995) son similares a las descritas en este

trabajo. La identificación de una cepa del

SCMV como el agente causal del ‘anillo

clorótico’ de la palma de aceite africana, está

de acuerdo al rango de patogenicidad obser-

vado en esta investigación. Este hecho, sin

embargo, dificulta el control del virus debido

al gran número de gramíneas hospederas que

posee el SCMV, y a las diversas especies de

áfidos que transmiten estos virus de manera

no-persistente (Persley, 1996). En el caso del

‘anillo clorótico’, parece no existir un proce-

so de transmisión biológica eficiente entre las

gramíneas huéspedes del virus y la palma de

aceite africana, ya que la incidencia de esta

enfermedad en el municipio de Tumaco se

mantiene baja. De todas formas se recomien-

da mantener los alrededores de los cultivos de

palma libres de gramíneas silvestres o culti-

vadas. La recomendación actual de reempla-

zar gramíneas por leguminosas en las planta-

ciones de palma de aceite africana como

cobertura vegetal, ayudaría al control del

‘anillo clorótico’. El control químico de

potyvirus no es aconsejable, ya que los insec-

ticidas no pueden prevenir la transmisión de

estos virus.

Estas investigaciones demuestran que

existen dos enfermedades virales de la palma

de aceite africana en el suroccidente de Co-

lombia. A pesar de que la ‘mancha anular’ es

una enfermedad letal y el ‘anillo clorótico’ no

lo es, la incidencia de cualquiera de estas dos

enfermedades obliga a la eliminación de las

palmas jóvenes infectadas. Esperamos que

estas investigaciones faciliten el diagnóstico

de estas dos enfermedades de la palma de

aceite, para que se puedan adoptar las medi-

das adecuadas de control.

AGRADECIMIENTOS

Esta investigación fue posible gracias al

apoyo logístico y financiero del Centro Co-

lombiano de Investigación de la Palma de

Aceite (CENIPALMA) y del CIAT. Se

reconoce especialmente el apoyo administra-

tivo de su Director, Dr. Pedro León Gomez, y

la ayuda logística del Dr. Hugo Calvache y de

los ingenieros agrónomos de CENIPALMA,

CORPOICA y empresas palmeras del muni-

cipio de Tumaco, cuya ayuda facilitó el desa-

rrollo de estas investigaciones.


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NEMATODOS ASOCIADOS A LA GRANADILLA Passiflora ligularis Juss

EN EL VALLE DEL CAUCA*

Zulaima E. Vargas Z1, Francia Varón de A2 y Eider D. Gómez1

1Universidad Nacional, Sede Palmira, PBX 2717000.N. 2ICA, Palmira, Fax 2733949.

*Proyecto cofinanciado por FONTAGRO

RESUMEN

La granadilla (Passiflora ligularis Juss) es una de las especies de

pasifloras cultivadas en Colombia con mayor potencial de exportación

y de gran aceptación en el mercado nacional, lo que ha motivado el

incremento en el área sembrada en diferentes regiones del Valle del

Cauca, en donde se siembra para rotar o intercalar con cultivos como

café, lulo, tomate de árbol entre otros. Teniendo en cuenta la suscepti-

bilidad de estos cultivos a nematodos, especialmente a Meloidogyne, y

los pocos estudios que existen sobre estos microorganismos en este

cultivo, se planteó un reconocimiento de nematodos fitoparásitos

asociados al cultivo de la granadilla en el Valle del Cauca. Para tal fin

se visitaron fincas ubicadas en las principales zonas productoras de

granadilla en el Valle del Cauca. Se realizó un muestreo recorriendo el

lote en zig –zag, y colectando suelo y raíces en 20 a 30 plantas por

hectárea. Durante el reconocimiento se identificaron asociados a la

granadilla los géneros Meloidogyne, Helicotylenchus, Pratylenchus,

Trichodorus, Tylenchorhynchus, Paratylenchus, Criconemella, Ho-

plotylus y Rotylenchulus, siendo los de mayor frecuencia y distribu-

ción Meloidogyne con 64 y 61 por ciento en suelo y raíces, Helicoty-

lenchus y Pratylenchus con 45 y 46 y de 21 y 26 por ciento, respecti-

vamente. Además, identificaron nematodos no fitoparásitos de las

familias Rhabditidae Aphelenchidae, Dorylaimidae y Mononchidae.

Meloidogyne fue el nematodo de mayor importancia en granadilla por

su frecuencia y amplia distribución, encontrándose la mayor infesta-

ción en los municipios de Versalles, Roldanillo, Trujillo y Ginebra.

Mediante las pruebas de parasitismo se demostró que Meloidogyne

induce pobre desarrollo aéreo y radical reduciendo de 28 a 64 por

ciento el peso seco aéreo y de 31 a 81 por ciento el peso seco de

raíces, el índice de nudosidad alcanzó un grado de severidad de cinco

confirmando de esta forma la susceptibilidad de la granadilla a este

nematodo. Cuando estaban presentes Meloidogyne, Helicotylenchus y

Pratylenchus el daño fue mayor. Las especies Meloidogyne incógnita,

M. javanica y M. hapla se encontraron asociadas con cultivos de

granadilla.

Palabras claves: Reconocimiento, granadilla, Meloidogyne spp, ne-

matodos.

SUMMARY

The passionflower (Passiflora ligularis Juss) is one of the cultivated

species in Colombia with great implicit potential of exportation, and

great acceptance in the national market, the one which has motivated

the increments in the area sowed in several regions of the Cauca Val-

ley, in where is used as a rotation crop with coffee, tomato or other

kind of crops. Keeping in mind the susceptibility of these crops to

nematodes, especially to Meloidogyne, and the few studies about this

wireworms affecting passionflower crop, a survey of phytoparasitic

nematodes was planned. In order to obtain the information were visit-

ed the principal passionflower producing zones at the Cauca Valley. It

was carried out a sampling in some farms. Samples of roots and soil

were collected in 20 to 30 plants for hectare. Results of the survey

showed that Meloidogyne, Helicotylenchus, Pratylenchus, Trichodo-

rus, Tylenchorhynchus, Paratylenchus, Criconemella, Hoplotylus and

Rotylenchulus, were the genera of nematodes frequently registered.

Meloidogyne was present in 64% of soil samples, and in 61% root

ones; Helicotylenchus in 45% of soil samples and in 46% root ones,

and finally Pratylenchus in of 21 of soil samples and in 26 % of root

samples. Also, it was recorded non-phytoparastic nematodes of the

families Rhabditidae Aphelenchidae, Dorylaimidae and Mononchidae.

Meloidogyne was the nematode of great importance in passionflower

crops at Cauca Valley for it frequency and wide distribution, recording

high infestations in the municipalities of Versalles, Roldanillo, Trujillo

and Ginebra. Using parasitism tests it was demonstrated that

Meloidogyne induces poor development in the aerial part of the plant

and also reduces the root system. It was detected reduction in the

foliage dry weight ranged between 28 - 64 % and reduction in the root

dry weight ranged between 31 - 81 percent. The knot index reached a

grade of severity of five confirming the susceptibility of the P. ligu-

laris to this nematode in this way. When Meloidogyne was present

with Helicotylenchus and Pratylenchus the damage was high. The

species Meloidogyne incognita, M. javanica and M. hapla were asso-

ciated with P. ligularis crops at Cauca Valley.

Key words: tropical fruits, plant diseases, survey

INTRODUCCIÓN

La granadilla es una de las especies de pasi-

floras con mayor potencial de exportación; es

originaria de la América Tropical, especial-

mente del centro y sur de América en parti-

cular de Colombia. Se cultiva en Caldas,

Tolima, Huila, Cundinamarca, Boyacá, Cau-

ca, Nariño, Risaralda, Quindío,Valle y Antio-

quia principalmente (Saldarriaga,1998).

Hasta hace poco el municipio de Urrao,

Antioquia, era considerado como el mayor

productor de granadilla, pero debido al ata-

que de la secadera Nectria haematococca y

el nematodo del nudo radical Meloidogyne

spp., el área sembrada se disminuyó conside-

rablemente (Tamayo y Varón, 1992).

Los nematodos fitoparásitos representan

uno de los problemas sanitarios de mayor

importancia debido a que reducen el sistema

de raíces, inhiben la toma normal de nutrien-

tes, y reducen la capacidad productiva de las

plantas, además, de relacionarse con otros

complejos patológicos como hongos y bacte-

rias, de difícil manejo (Sánchez y otros,

1992).

El nematodo del nudo radical Me-

loidogyne sp, es el de mayor importancia en

el mundo por su distribución, su rango de

hospederos y por su capacidad de multiplica-

ción y adaptación a diferentes pisos térmicos,

suelos y ambientes (Varón de A, 1995).

En cultivos de granadilla, se han encon-

trado con mayor frecuencia Pratylenchus,

Helicotylenchus, y Meloidogyne, prevale-

ciendo por su amplia diseminación M. in-

cognita y M. javanica (Tamayo y Varón,

1992). Adicionalmente se ha encontrado

interacción Meloidogyne - Fusarium que

reduce el desarrollo y crecimiento de las

plantas de granadilla (Múnera, 2000).

Garcés y Saldarriaga, (1993), registran a

Meloidogyne spp. y Helicotylenchus asocia-

dos al cultivo de la granadilla en la zona de


Urrao (Antioquia), causando el primero aga-

llas o nudosidades en su sistema radical.


88

Múnera y Navarro, (2001) y Tamayo

(2001), registran a Meloidogyne incognita

como el causante de la reducción de los pa-

rámetros de crecimiento y desarrollo de la

granadilla entre 29 y 73%, presentando esta

especie distribución muy amplia en todas las

zonas productoras del país.

Debido a la importancia del cultivo de la

granadilla como renglón de exportación, el

incremento repentino en el área de siembra en

el Valle del Cauca, la susceptibilidad a nema-

todos de los cultivos con los que se intercala

o se rota como café, banano, tomate de árbol

entre otros y los altos costos de producción

se decidió realizar el presente trabajo, para

conocer los nematodos asociados al cultivo y

determinar el efecto de Meloidogyne sobre el

desarrollo de plantas jóvenes


Fase de Campo

Se seleccionaron las fincas más representati-

vas de las zonas productoras de granadilla en

el Valle del Cauca, y algunas de Quindío y

Risaralda, teniendo en cuenta el área sembra-

da, la edad del cultivo y el impacto social.

El muestreo se realizó con un barreno sa-

cabocado o con machete, buscando llegar al

área de mayor concentración de raíces, reali-

zando un recorrido al azar en zig-zag, y eva-

luando de 20 a 30 plantas por hectárea. (Va-

rón y Castillo, 2001).

Se diligenció un formulario con informa-

ción concerniente a localización, ubicación,

edad del cultivo, altura, prácticas y productos

aplicados, mediante entrevista con el agricul-

tor o administrador de la finca.

Las muestras se trasladaron al laboratorio

de Diagnóstico Vegetal del ICA Palmira, para

su inmediato proceso, en su defecto se con-

servaron refrigeradas a 100 C.

Fase de Laboratorio

Para la extracción de nematodos de suelo se

tomaron 100 cc y se empleó el método de

suspensión-filtración y decantación (Varón de

A. y Castillo, 2001).

Para el caso de las raíces, se tomó todo el

material vegetal colectado en la muestra, se

lavó, se registró su peso. Se colocó en la

licuadora, y se licuó en forma fraccionada por

espacio de 15 a 20 segundos. Una vez desin-

tegrado el tejido vegetal se depositó en los

tamices y platos de decantación durante 72

horas. (Varón y Castillo, 2001).

Se procedió a identificar y cuantificar las

poblaciones con base en la clave taxonómica

de Mai et al (1975). La población se expresó

con con base en 100 cc de suelo y un gramo

de raíces frescas.

Los resultados obtenidos durante el reco-

nocimiento se analizaron con base en los

porcentajes de frecuencia, las poblaciones

máximas y promedias de cada género y los

valores de prominencia. El valor de promi-

nencia se obtuvo multiplicando la densidad

absoluta o población promedia por la raíz

cuadrada de la frecuencia absoluta (Volcy,

1998).

Fase de invernadero

Se seleccionaron tres poblaciones correspon-

dientes a la mezcla de suelo procedente de las

veredas de Bolívar, Trujillo y Versalles.

Para la multiplicación de cada población

se tomó el suelo de cada municipio, y se

colocó en materos adicionando suelo autocla-

vado para completar volumen. En cada mate-

ro se sembraron dos semillas de granadilla y

dos de tomate variedad “Rutgers” el cual es

altamente susceptible a todas las poblaciones

de género Meloidogyne, a los sesenta días se

realizó la extracción de huevos con hipoclori-

to de sodio para proceder a la inoculación

(Varón y Riedel, 1982).

Pruebas de parasitismo

Se sembraron semillas de granadilla en mate-

ros con suelo autoclavado y suelo natural-

mente infestado de cada municipio y se man-

tuvieron las plantas bajo condiciones de

invernadero hasta el momento de la inocula-

ción. La inoculación se realizó cuando las

plantas alcanzaron de dos a tres hojas verda-

deras, abriendo tres orificios equidistantes en

la zona de mayor concentración de raíces

donde se depositó la suspensión que contenía

los huevos. De cada población se utilizaron

dos densidades (5.000 y 10.000 huevos por

planta), se usaron seis plantas por tratamiento

y seis como testigo absoluto. Como testigo

relativo se utilizó suelo colectado en el cam-

po de los diferentes municipios previamente

cuantificada la población presente antes de la

siembra.

Con el fin de evaluar el efecto parasítico

del nematodo sobre las plantas, noventa días

después de la inoculación, se levantaron las

plántulas, cuantificando el número total de

agallas, número de nematodos por 100 cc de

suelo, número de huevos y número de nema-

todos por gramo de raíces secas. También se

determinó peso fresco y seco del follaje y de

raíces, altura y número de hojas.

El índice de nudosidad se determinó se-

gún el número de agallas y / o masa de hue-

vos por planta con base en la escala propuesta

por Taylor y Sasser (1978). El porcentaje de

reducción de cada parámetro de crecimiento

permitió medir el efecto de Meloidogyne

sobre las plántulas evaluadas, este se obtuvo

utilizando la relación entre la diferencia de las

plántulas testigo y las inoculadas versus el

testigo expresado en porcentaje (Villota y

Varón, 1995).

La unidad experimental se representó por

un matero y su respectiva planta, se usó un

diseño completamente al azar con seis repeti-

ciones y seis testigos, los cuales se distribuye-

ron sobre una mesa del invernadero del C.I.

en Palmira. Se realizó un análisis de varianza

a las variables con las siguientes fuentes de

variación tratamiento, error y total y grados 9,

50 y 59 grados de libertad respectivamente.

Con el fin de comparar los promedios ob-

tenidos se hizo la prueba de diferencia míni-

ma significativa (DMS).

Al presentarse muerte prematura de plan-

tas los datos obtenidos se transformaron con

base en la ecuación:

Parámetro = 0,5Parámetro

Identificación de las Especies

La identificación de las especies se hizo con

base en el patrón perineal que provee las

características de cada especie de Me-

loidogyne (Villota y Varón de A, 1995).


Se tomaron muestras en 10 municipios de los

cuales siete pertenecían al Valle del Cauca,

una a Risaralda y dos al Quindío, alcanzando

una cobertura de 170 hectáreas e igual núme-

ro de muestras para suelo y raíces (Tabla 1).

Se visitaron 44 fincas productoras de gra-

nadilla en diferentes estados de desarrollo

como plántula, poda, producción y cosecha.

Se observaron síntomas del ataque de nema-

todos caracterizados por achaparramiento,

zonas cloróticas, pobre desarrollo tanto aéreo

como radical, además de la presencia de

agallas o nudosidades en raíces, coincidiendo

estos síntomas con los registrados por Nava-

rro (1989) en cultivos de granadilla en Urrao,

Antioquia. La presencia de agallas confirmó

el ataque de Meloidogyne; en infección avan-

zada se observó pudrición radical posible-

mente causada por organismos fungosos.

Se identificaron nueve géneros de nema-

todos fitoparásitos asociados a la granadilla

en las 31 veredas visitadas (Tabla, 2).

Los géneros de mayor importancia de

acuerdo con el porcentaje de frecuencia du-

rante el muestreo en suelo y raíces fueron:

Meloidogyne con 64 y 61 por ciento, Heli-

cotylenchus con 45 y 46 por ciento, Pratylen-

chus con 21 y 26 por ciento respectivamente

(Tabla, 2).

Garcés y Saldarriaga (1993), registran a

Meloidogyne spp. y Helicotylenchus sp.

como los géneros más importantes asociados

al cultivo de la granadilla en la zona de Urrao

(Antioquia), además Bernal (1991) cita a

Meloidogyne sp. como el responsable de

producir nudosidades en el sistema radical de

la granadilla, así mismo a Helicotylenchus y

Pratylenchus como los géneros de importan-

cia en este cultivo.

Con menor frecuencia se identificaron

Trichodorus, Tylenchorhynchus, Paratylen-

chus, Criconemella, Hoplotylus y Rotylenchu-

lus los cuales se registraron en porcentajes

muy bajos (Tabla 2).

Tanto en suelo como en raíces Me-

loidogyne sp. presentó las mayores poblacio-

nes alcanzando 750 individuos por 100 cc de


suelo y 255 por un gramo de raíces frescas.

Le sigue en importancia Helicotylenchus y

Pratylenchus con 650 y 224 individuos por

100 cc de suelo y 58 y 62 individuos por

gramo de raíces frescas (Tabla 3).

Vale la pena destacar la presencia de Tri-

chodorus el cual se encontró en poblaciones

potencialmente altas. Los demás géneros

presentaron poblaciones máximas y prome-

dias más bajas como es el caso de Tylenchor-

hynchus, Paratylenchus, Criconemella y

Hoplotylus (Tabla 3).

Los demás géneros encontrados pueden

estar asociados con la granadilla en el área

del Valle del Cauca o con cultivos como

plátano, banano, lulo, mora y hortalizas entre

otros, con los cuales la granadilla se siembra

intercalada.

Volcy (1998) registra géneros como Tri-

chodorus, Tylenchorhynchus, Paratylenchus

y Rotylenchulus asociados a plátano y café,

cultivos que en la mayoría de las fincas esta-

ban presentes o habían sido reemplazados por

granadilla.

Acompañando a esta nematofauna se

identificaron nematodos de los grupos Rhab-

ditidae, Aphelenchidae, Dorylaimidae y

Mononchidae con porcentajes de frecuencia

que van de 26 a 81 por ciento para suelo y 15

a 87 por ciento para raíces (Tabla 4 ).

Los nematodos no fitoparásitos, de vida

libre, depredadores o nematófagos como se

les ha calificado según sus hábitos alimenti-

cios se cuantificaron e identificaron por la

importancia agrícola que estos representan,

puesto que además de jugar un papel impor-

tante en el manejo de nematodos actuando

como biocontroladores de poblaciones fito-

parásitas, algunas especies del grupo Rhabdi-

tidae se asocian con la degradación de la

materia orgánica del suelo, contribuyendo de

esta manera al equilibrio biológico del medio

ambiente (Cepeda, 1996).

Tylenchus sp. se encontró en este estudio

asociado con suelo y raíces en porcentajes de

14 y 11 por ciento respectivamente. Este es

un nematodo de actividad parasítica descono-

cida (Tabla 4).

Meloidogyne presentó en todos los muni-

cipios el más alto valor de prominencia tanto

en suelo como en raíces con valores que van

desde 280 hasta 2118 en suelo y desde 34

hasta 280 en raíces (Tabla 5).

Según Volcy (1998) si un nematodo pre-

senta un valor de prominencia alto es consi-

derado una plaga común e importante en el

cultivo. Refleja en cierto modo la susceptibi-

lidad del cultivo al nematodo en cuestión, por

tanto Meloidogyne se considera el nematodo

de mayor importancia económica en el culti-

vo de la granadilla.

Con base en los valores (Tabla 5) cuanti-

ficados se podría afirmar que en el Valle del

Cauca los municipios de Versalles, Roldani-

llo, Trujillo y Ginebra presentan las zonas de

mayor infestación de Meloidogyne, represen

tando de esta manera un limitante más, tanto

para el cultivo de la granadilla como para

otros cultivos susceptibles.

Helicotylenchus alcanzó un valor de

prominencia de 1403 en Apia, 850 en El

Águila, 750 en Bolívar, lo que indica nueva-

mente que este nematodo representa un pro-

blema potencial al cultivo en algunas locali-

dades.

En suelo y raíces Pratylenchus registró

los valores de prominencia más altos (564 –

190), en Versalles y en Roldanillo (Tabla 5).

Las poblaciones de Helicotylenchus y

Pratylenchus representan al igual que Me-

loidogyne una amenaza desde el punto de

vista sanitario para los cultivos de la región.

Merece destacar los valores de prominen-

cia altos encontrados para estos tres géneros

en Apia y Génova lo cual se puede explicar

si se tiene en cuenta que éstas regiones son

productoras de granadilla desde hace más de

10 años además de que son monocultivos.

Las poblaciones de nematodos se ven in-

fluenciadas por diferentes factores relaciona-

dos con la actividad del cultivo, especialmen-

te en la actividad radical y los métodos de

control.

Con base en las encuestas realizadas se

encontró que en el 43 por ciento de las fincas

se realizaban prácticas culturales y/o biológi-

cas como rotación de cultivos, control de

arvenses, abonos orgánicos o biopreparados

de extractos vegetales para el manejo de los

nematodos, y en el 57 por ciento restante el

control de nematodos se llevaba a cabo con

productos químicos, los cuales son cataloga-

dos de moderada a altamente tóxicos y en la

mayoría de los casos de uso indiscriminado.

Al analizar las poblaciones de nematodos

con base en la edad de los cultivos se observa

que tanto en suelo como en raíces existen

picos máximos y picos mínimos y que en

situaciones normales se esperaría que estos

picos aumenten a medida que la planta se

desarrolla hasta un nivel tal que causa un

daño al sistema radical, iniciando el deterioro

del mismo o deteniendo la actividad radical,

en esta etapa los picos poblacionales comien-

zan a descender (Figura 1 y 2).

Tabla 1. Municipios visitados durante el reconocimiento de nematodos en granadilla (2000 – 2001)

Dpto. Municipio No. Veredas No. Fincas No. Muestras No. Has

Valle Bolívar 7 11 44 44

Valle El Dovio 2 4 14 14

Valle Ginebra 1 1 1 1

Valle Roldanillo 5 6 20 20

Valle Trujillo 3 5 26 27

Valle Versalles 6 7 33 33

Valle El Aguila 2 4 15 15

Risaralda Apia 3 4 8 8

Quindío Circasia 1 1 6 6

Quindío Génova 1 1 3 3

Total 31 44 170 170

Tabla 2. Porcentaje de frecuencia de nematodos

fitoparásitos asociados al cultivo de la granadilla

Género Suelo* Raíces*

Meloidogyne 64 61

Helicotylenchus 45 46

Pratylenchus 21 26

Trichodorus 10 5

Tylenchorhynchus 6 6

Paratylenchus 2 2

Criconemella 2 -

Hoplotylus 0,6 -

Rotylenchulus - 0,6

*170 muestras de suelo y raíces. – sin nemato-

dos.

Tabla 3. Población máxima y promedia de nematodos fitoparásitos en el cultivo de la granadilla

Género

No. Nematodos

Suelo* Raíces**

Máxima Promedio Máxima Promedio

Meloidogyne 750 77 255 23

Helicotylenchus 650 99 58 13

Pratylenchus 224 58 62 14

Trichodorus 280 65 28 13

Tylenchorhynchus 100 50 19 7

Paratylenchus 108 64 29 13

Criconemella 52 47 - -

Hoplotylus 31 31 - -

Rotylenchulus - - 8 8

*100 cc de suelo ** Un gramo de raíces frescas - Sin nematodos.

Tabla 4. Porcentaje de frecuencia de nematodos

no fitoparásitos asociados con el cultivo de la

granadilla

Género Suelo* Raíces**

Rhabditidae 81 87

Aphelenchidae 55 67

Dorylaimidae 32 26

Mononchidae 22 15

Tylenchus sp. 14 11

* 100 cc de suelo ** Un gramo de raíces secas


90

Los nematodos estuvieron presentes des-

de las primeras etapas del cultivo (0-6 meses)

encontrándose desde 350 a 650 indivi-

duos/100 cc de suelo, posiblemente porque

existía una fuente de inóculo previa en los

cultivos anteriores o asociados o porque el

material de propagación estaba infectado

desde el vivero. Como es sabido la mayor

fuente de diseminación de los nematodos

ocurre en el material de propagación y se

debe principalmente a la utilización de suelo

contaminado el cual no es seleccionado ni

tratado al momento de establecer el vivero

(Varón, 1994).

Las poblaciones mas altas en suelo se

presentaron en los cultivos con edades com-

prendidas entre 18 y 24 meses (750 indivi-

duos/100 cc de suelo). En esta etapa existe la

mayor actividad radical, hay producción

abundante de raicillas que son las preferidas

por los nematodos (Figura 2).

En los cultivos con más de 24 meses de

edad las poblaciones comienzan a descender

(450 individuos/ 100 cc de suelo) debido a

que en esta etapa las raíces se lignifican,

comienza la senescencia de la planta por lo

cual hay pocas raicillas aptas para la alimen-

tación y multiplicación de los nematodos.

Además de la edad del cultivo las pobla-

ciones de nematodos pueden estar influencia-

das por factores bióticos representados en la

microflora y microfauna que interactúan

permanentemente con ellos.

Las poblaciones no fitoparásitas entre las

que se encuentran los nematodos depredado-

res se mantuvieron relativamente estables en

todas las etapas de desarrollo del cultivo con

208-210 individuos/100cc de suelo, incre-

mentándose entre los 18 a 24 meses (322

individuos/100cc de suelo), edad donde el

cultivo generalmente comienza a perder

raíces y está provisto de cobertura, la cual

incorporada al suelo, aumenta la actividad

microbiana, como los hongos y los depreda-

dores de nematodos (Cepeda, 1996).

En cuanto a la población presente en

raíces varió de 44 a 88 individuos/g de raíces

frescas, incrementándose paulatinamente a

medida que la planta se desarrolla y alcanzó

su máxima población entre los 12 a 18 meses

de edad (255 individuos/ g de raíces frescas).

La población descendió en la etapa final 50-

58 individuos/g de raíces frescas. Esta situa-

ción es común observarla en cultivos peren-

nes cuando son atacados por nematodos

endoparásitos como es el caso de Meloidogy-

ne y Pratylenchus presentes durante el reco-

nocimiento (Figura 2).

Las poblaciones de nematodos no fitopa-

rásitos fueron relativamente bajas, compara-

das con las poblaciones de nematodos fitopa-

rásitos (62 individuos/1g raíces frescas)

mostrando una mayor población en las edades

de 6 a 12 meses.

La población de Meloidogyne en raíces

estuvo influenciada por la edad del cultivo,

observándose una población promedia de 88

individuos/1g de raíces frescas durante los

primeros meses de establecimiento, incre-

mentándose entre los 6 a 12 meses de edad,

periodos donde se ha logrado establecer. Una

vez establecida la población se aumenta

teniendo en cuenta su rápida reproducción y

la alta susceptibilidad del cultivo a este nema-

todo (Cepeda, 1996). Durante las etapas mas

avanzadas se observó disminución de las

poblaciones, esto puede deberse a lignifi-

cación de los tejidos, pocas raicillas, dete-

rioro radical, motivo por el cual los nema-

todos migran para buscar alimento en otras

plantas e iniciar su colonización y poste-

rior desarrollo (Taylor y Sasser, 1978).

Tabla 5. Valor de prominencia en suelo y raíces de los nematodos asociados con granadilla en los muni-

cipios muestreados durante 2000 – 2001.

Muestreo Municipio Géneros

Meloidogyne Helicotylenchus Pratylenchus

Suelo Apia 2118 1403 580

Bolivar 946 765 165

Circasia 230 0 0

El Aguila 1670 850 79

El Dovio 1230 624 308

Génova 860 600 300

Ginebra 1680 0 0

Roldanilo 1825 90 139

Trujillo 1734 821 192

Versalles 1168 513 564

Raíces Apia 99 78 43

Bolivar 141 123 62

Circasia 34 35 16

El Águila 116 31 0

El Dovio 176 118 66

Génova 100 40 17

Ginebra 200 0 0

Roldanillo 137 105 190

Trujillo 230 87 65

Versalles 280 60 39

P.V = P.P F%

Figura 2. Población de Nematodos de raíces y la edad del cultivo

0

50

100

150

200

250

300

No

de n

emat

odos

1g

de r

aíce

s

fres

cas

Máximo Promedio Máximo Promedio Fitoparásitos No Fitoparásitos

0-6 6,1-12 12,1-18 18,1-24 >24

Figura 1. Población de Nematodos en suelo y la dad del Cultivo

0

100

200

300

400

500

600

700

800

No

de

nem

ato

do

s en

10

0cc

de

suel

o

Máximo Promedio Máximo Promedio Fitoparásitos No Fitoparásitos

0-6 6,1-12 12,1-18 18,1-24 >24


En suelo las poblaciones de Meloidogyne

durante las edades de 0 a 18 meses fueron de

300–375 individuos/100cc de suelo y se

mantuvieron estables durante todas las etapas,

debido a que los huevos eclosionan dando

origen a estados juveniles infectivos los

cuales buscan raíces para alimentarse y desa-

rrollarse (Taylor y Sasser, 1978). Se observó

aumento de la población en cultivos con

edades comprendidas entre 18 y 24 meses

alcanzando población de 750 individuos/100

cc de suelo (Figura 3).

En cultivos con más de 24 meses se ob-

servó disminución de la población (450 indi-

viduos/100cc de suelo),sin embargo la pobla-

ción cuantificada es suficiente para infectar

nuevas plantas, originando nuevas generacio-

nes de juveniles infectivos (Taylor y Sasser,

1978).

Pruebas de parasitismo

Las plantas inoculadas presentaron en el

sistema radical los síntomas característicos

del ataque de Meloidogyne, como son agallas

o nudosidades, clorosis foliar y pobre desa-

rrollo radical y foliar, además, en algunas

plántulas se observó un avanzado deterioro de

raíces, que contribuyó a la muerte de algunas

plantas.

En las raíces de todas las plántulas inocu-

ladas se cuantificaron más de 100 agallas lo

que corresponde a un índice de 5 en la escala

de Taylor y Sasser (1978) y un índice de

reproducción superior a uno confirmando la

susceptibilidad de la granadilla a las pobla-

ciones inoculadas. Según Volcy (1998), en

las raíces afectadas por Meloidogyne, se

desarrolla hipertrofia e hiperplasia, siendo

esto un sobrecrecimiento de los tejidos pa-

renquimáticos, acompañado del engrosamien-

to de la raíz para finalmente formar las aga-

llas o nudosidades.

El efecto de Meloidogyne estuvo directa-

mente relacionado con la densidad de huevos

inoculada. La población de 5.000 huevos

indujo reducción del sistema radical en valo-

res 31 y 57 por ciento y la de 10.000 entre 75

y 80 por ciento (Tabla 6).

El peso seco del la parte aérea se redujo

en 55 y 64 por ciento con respecto al testigo

en las plantas inoculadas con 10000 indivi-

duos.

Además de la presencia de agallas las

plantas mostraron enanismo, clorosis y amari-

llamiento de hojas con defoliación prematura

Taylor y Sasser, 1978) indican que las plantas

atacadas por Meloidogyne son más pequeñas

y su sistema radical se deforma.

De las plantas inoculadas se recuperaron

más de 5.000 individuos por gramo de raíces

secas, y hasta 718 individuos por 100cc de

suelo capaces de invadir nuevas raicillas.

Cuando se usó el suelo naturalmente in-

festado las plantas murieron prematuramen-

te, posiblemente debido a la población alta, a

la presencia de los otros géneros, Helicoty-

lenchus y Pratylenchus o a microorganismos

patógenos acompañantes. En el suelo naturalmente infestado se en-

contró Meloidogyne, Helicotylenchus y

Pratylechus, con poblaciones iniciales relati-

vamente bajas (Tabla 7).

Las plantas que lograron sobrevivir mos-

traron síntomas severos del ataque de Me-

loidogyne sp. La mezcla de Meloidogyne,

Helicotylenchus y Pratylenchus redujo el

sistema radical en porcentajes hasta del 88

por ciento y el peso aéreo del 62 por ciento

superior a la reducción inducida por Me-

loidogyne cuando fue inoculado solo esta

situación fue observada con alguna frecuencia

en las fincas visitadas donde se encontró

población alta de los tres nematodos predo-

minantes.

Las poblaciones recuperadas en suelo al

levantar las plantas fue más alta que la pobla-

ción inicial indicando nuevamente la suscep-

tibilidad de granadilla a estos nematodos

(Tabla 7). Además en raíces se alcanzó una

población de juveniles y huevos capaz de

causar infección severa en las plantas.

Identificación de especies

Se encontró en Bolívar como única especie a

Meloidogyne incognita, considerada como la

especie de mayor ocurrencia en granadilla. En

Trujillo se encontró además de M. incognita ,

a M. hapla, y en Versalles M. incognita y M.

javanica; Einsenback (1992) indica que es

común encontrar estas especies juntas, siendo

considerada M. javanica como la segunda

especies más común en el mundo.

Tamayo (2001) registró a M. incognita

como la especie más común causando infec-

ción en raíces de granadilla en los departa-

Tabla 6. Porcentaje de reducción en los parámetros de crecimiento en plantas jóvenes de granadilla inocu-

ladas con diferentes poblaciones de Meloidogyne

Origen y Densidad de Población

Peso

seco

Parte

aérea

Peso

seco

raíces

Número

nematodos

suelo*

Número

nematodos

raíces*

Número

huevos

raíces*

Bolivar 5000

Bolivar 10000

Trujillo 5000

Trujillo 10000

Versalles 5000

Versalles 10000

Suelo Infestado naturalmente

Bolivar

Trujillo

Versalles

33,5

59,6

26,1

55,2

28,1

63,5

62,6

51.7

13,3

48,6

75,7

31,4

81,4

57,1

77,1

41,4

88,6

10,0

452

650

461

672

485

718

315

118

230

3375

4230

3312

4310

3000

4663

555

305

330

1170139

1906250

722916

2147500

562500

1921875

743750

1540625

812500

* 100 cc de suelo y un gramo de raíces secas.

Tabla 7. Población inicial y población final de nematodos en suelo infestado naturalmente

Género Bolivar* Trujillo* Versalles*

Pi Pf Pi Pf Pi Pf

Meloidogyne 244 315 121 118 193 230

Helicotylenchus 113 130 105 95 98 120

Pratylenchus 20 25 22 26 84 75

*100cc de suelo

Figura 3. Población de Meloidogyne sp., y la edad del cultivo en suelo y raíces

0

100

200

300

400

500

600

700

800

No

de

Nem

atod

os

10

0cc

de

suel

o/1

g d

e ra

íces

0-6 6,1-12 12,1-18 18,1-24 >24

Edad

(meses)

Máximo suelo Máximo raíces


92

mentos de Antioquia, Quindío y Valle del

Cauca, lo cual concuerda con estos resulta-

dos.

CONCLUSIONES

Durante el reconocimiento se identifica-

ron cinco géneros, asociados con el culti-

vo de la granadilla, siendo los de mayor

frecuencia el nematodo del nudo radical

Meloidogyne sp., el nematodo espiral

Helicotylenchus sp. y el nematodo de la

lesión Pratylenchus sp.

Meloidogyne sp por su distribución y

valor de prominencia se considera como

el nematodo de mayor importancia en el

Valle del Cauca, con mayor infestación

en Versalles, Roldanillo, Trujillo y Gine-

bra.

Como acompañantes se identificaron

nematodos no fitoparásitos pertenecientes

a las familias Rhabditidae, Aphelenchi-

dae, Dorylaimidae y Mononchidae.

Las poblaciones más altas de Meloidogy-

ne coinciden con la edad de 12 a 18 me-

ses, época en la cual se presenta la mayor

actividad radical de la planta.

Las especies del género Meloidogyne

asociadas a granadilla fueron M incogni-

ta, M. hapla y M. javanica.

Meloidogyne sp. afectó el normal desarro-

llo de la granadilla causando reducción

foliar y radical, lo que demuestra la gran

susceptibilidad del cultivo a este nemato-

do.

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan su agradecimiento al

ICA, FONTAGRO, IICA – PROCIANDINO,

UMATA del Valle del Cauca, Risaralda y

Quindío y demás personas e Instituciones que

colaboraron en el desarrollo del trabajo.


Bernal, J A. 1991. El cultivo de la granadilla .

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lombia Tomo II. Medellín. 182p


NEMATODOS ASOCIADOS AL TOMATE DE ARBOL Solanum betaceum

EN EL VALLE DEL CAUCA*

Sandra L. Lozada S1, Francia Varón de A.2 y Eider D. Gómez1

1Universidad Nacional, Sede Palmira. PBX 2717000, 2 ICA Palmira, Fax 2733949.

*Proyecto cofinanciado por FONTAGRO.

RESUMEN

El cultivo del tomate de árbol ha adquirido gran importancia en el país

por su potencial para la exportación como fruta fresca, así como su uso

en procesos agroindustriales para la preparación de jaleas, dulces,

mermeladas, y otros productos, y a la vez como generador de recur-

sos económicos para el agricultor. Teniendo en cuenta que los cultivos

de rotación y los que se intercalan con el tomate de árbol son suscepti-

bles a nematodos, se planteó este trabajo para conocer los nematodos

asociados y medir el efecto de Meloidogyne sp., en el desarrollo de las

plantas. El reconocimiento se hizo en fincas productoras de tomate de

árbol. Las muestras se procesaron en el Laboratorio de Diagnóstico

Vegetal, ICA-Palmira. Para medir el efecto de Meloidogyne se realiza-

ron pruebas de parasitismo, inoculando plantas de tomate de árbol,

con 6000 huevos. Se tomaron 125 muestras de suelo y raíces, en 46

fincas ubicadas en 10 municipios del Valle del Cauca y uno en Risa-

ralda, abarcando 125 hectáreas. Se observaron agallas o nudosidades,

inducidas por Meloidogyne y pobre desarrollo foliar y radical. Se

identificaron cinco géneros de nematodos fitoparásitos, siendo los de

mayor frecuencia y distribución Meloidogyne sp., Helicotylenchus sp.,

y Pratylenchus sp., los cuales se encontraron en el 86, 18 y 17 % de

las muestras analizadas. Se encontraron además nematodos no fitopa-

rásitos de las familias Rhabditidae, Aphelenchidae, Dorylaimidae y

Mononchidae. Se estableció que el nematodo más importante y más

ampliamente distribuido fue Meloidogyne, cuyas poblaciones máximas

para suelo se presentaron en los municipios de El Dovio, Roldanillo,

Trujillo, Ginebra y Versalles, con 1958, 1216, 1088, 700 y 609 indivi-

duos/100 cc de suelo. En raíces se presentó alta población en los mu-

nicipios de Ginebra, Trujillo y Versalles, con máximas de 453, 384 y

145 nematodos/g de raíces frescas, respectivamente. Meloidogyne

presentó mayor población en los 12 primeros meses del establecimien-

to del cultivo. El efecto parasítico de Meloidogyne se expresó en un

menor desarrollo aéreo y radical de las plantas inoculadas, con reduc-

ción en altura superior al 45%, en el peso seco del follaje mayor al

47% y en raíces hasta del 59% para peso seco, indicando la suscepti-

bilidad de esta especie a Meloidogyne. Se encontraron las especies M.

incógnita y M. arenaria asociadas al tomate de árbol.

Palabras claves: Reconocimiento, frutales, nematodos, Colombia.

SUMMARY The cultivation of Solanum betaceum has acquired great importance

in the country for their fresh fruit export potential , as well as their use

in processed foods as jellies, candies, marmalades, and other products ,

and it at the same time as a source of farmer incomes for their suste-

nance. Keeping in mind that the rotation crops using in intercropping

with S. betaceum are susceptible to nematodes, this work was planned

in order to know the nematode associated with this crops and measure

the effect of Meloidogyne sp., on the plant growth. The survey was

realized in farms planted with S. betaceum. The samples were pro-

cessed in the Diagnosis Laboratory of “ Sanidad Vegetal”, ICA-

Palmira. In order to measure the effect of Meloidogyne parasitism tests

was realized inoculating plants of S. betaceum, with 6000 eggs. 125

samples of soil and roots were taken in 46 farms located in 10 munici-

palities of the Cauca Valley and one in Risaralda. Root-knot, poor

development of roots and foliage induced by Meloidogyne were ob-

served. Five genera of phytoparasitic nematodes were identified, being

Meloidogyne sp., Helicotylenchus sp., and Pratylenchus sp. the genera

of major frequency, presents in 86%, 18%, 17% of the analyzed sam-

ples, respectively. Nematodes non-phytoparasitic of the Rhabditidae

families, Aphelenchidae, Dorylaimidae and Mononchidae also were

detected. It settled down that the most important nematode and more

thoroughly distributed it was Meloidogyne, whose maximal popula-

tions in soil were detected in the municipalities of The Dovio, Rol-

danillo, Trujillo, Ginebra and Versalles, with 1958, 1216, 1088, 700

609 nematodes / 100 cc of soil. In root samples high population was

detected in the municipalities of Ginebra, Trujillo and Versalles, with

maxims of 453, 384, 145 nematodes/g of fresh roots, respectively.

Meloidogyne showed high population in the 12 first months of the crop

development. The parasitic effect of Meloidogyne was expressed as

poor growth of the foliage and root systems of the inoculated plants,

with reduction in height over 45%, in foliage dry weight over 47%

and in roots until of the 59% for dry weight, indicating the susceptibil-

ity of this species to Meloidogyne. M. incógnita y M. arenaria were

the species associated with S. betaceum crops.

Keywords: survey, fruits, Colombia

INTRODUCCIÓN

El tomate de árbol en la actualidad se explota

comercialmente en las zonas andinas de clima

frío moderado en Antioquia, Boyacá, Caldas,

Cauca, Cundinamarca, Nariño y Valle del

Cauca (Saldarriaga et al , 1997).

Participa con el 5,3% del total de la pro-

ducción frutícola nacional ocupando el sépti-

mo lugar después de los cítricos, la piña, el

aguacate, la papaya, la guayaba y el mango;

ocupa el cuarto lugar en la canasta de frutas

de los hogares colombianos (CCI, 2000).

En el Valle del Cauca, se producen 443

hectáreas, distribuidas en Pradera, Versalles,

Roldanillo, Bolivar, Tulúa, El Dovio, Gine-

bra, Buga (URPA-Valle, 2001). Debido al

aumento de área sembrada y a la explotación

intensiva del cultivo, se presentan plagas,

enfermedades y nematodos que limitan la

producción y causan pérdidas, siendo moti-

vo de preocupación para muchos agricultores

(Varón de A, 1995)

Se han encontrado varios géneros de ne-

matodos asociados con tomate de árbol,

siendo el nematodo de la nudosidad radical,

Meloidogyne spp. el más importante. Las

especies de Meloidogyne que mayor daño

producen a los cultivos de tomate de árbol en

todas las zonas productoras son M. incognita,

M. javanica y M. hapla. (Saldarriaga et al,

1997).

Otros géneros encontrados en el cultivo

son: Helicotylenchus sp., Pratylenchus sp.,

Tylenchorhynchus spp. y Trichodorus sp.

(Toro-L,1991).

Teniendo en cuenta que los cultivos de

rotación y los que se intercalan con el tomate

de árbol son susceptibles a nematodos espe-


cialmente a Meloidogyne sp., y que hasta el

momento en el Valle del Cauca no existe un

trabajo dirigido a identificar la nematofauna

asociada al tomate de árbol y su importancia

en la producción, se planteo esta investiga-

ción para conocer los nematodos asociados al

cultivo y determinar el efecto de Meloidogy-

ne spp. en el desarrollo vegetativo de plantas

jóvenes.


Fase de campo

Se seleccionaron las fincas más representati-

vas de las diferentes zonas productoras de

tomate de árbol en el departamento del Valle

del Cauca, teniendo en cuenta el área sem-

brada y la edad del cultivo.

Las muestras se colectaron utilizando un

machete o barreno sacabocado, el cual se

introdujo en tres sitios equidistantes alrededor

de la planta en la zona de mayor concentra-

ción de raíces. Por cada hectárea de tomaron

10 submuestras tanto de suelo como de raí-

ces, recorriendo el lote en zig-zag. Se diligen-

ció con ayuda del agricultor o administrador

de la finca, un formulario que contenía los

datos relativos a localización, a la edad del

cultivo, al terreno, síntomas, prácticas y

productos aplicados, o al clima.

Fase de laboratorio.

Las muestras se llevaron al laboratorio de

Nematología del ICA - Palmira donde se

procesaron inmediatamente y en caso contra-

rio, se conservaron en la nevera a 10°C, hasta

su procesamiento y posterior análisis.

En el proceso de extracción de los nema-

todos del suelo y raíces se utilizó el método

de Cobb modificado, bajo principios de

filtración-decantación y el de trituración-

decantación, para luego hacer la identifica-

ción y cuantificación correspondiente en cada

una de las muestras colectadas. La cantidad

total de nematodos se expresó con base en

100 c.c. de suelo y un gramo de raíces frescas

(Varón y Castillo, 2001).

Los huevos de Meloidogyne sp. se obtu-

vieron de raíces infectadas de tomate de mesa

variedad Rutgers, siguiendo las recomenda-

ciones de Taylor y Sasser (1983).

Análisis de datos

Los resultados obtenidos durante el recono-

cimiento se analizaron con base en las tablas

de frecuencia, de poblaciones máximas y

promedias de cada género y los valores de

densidad absoluta de los géneros de nemato-

dos asociados al cultivo.

El Porcentaje de frecuencia se calculó

dividiendo el número de muestras con nema-

todos por el número de muestras totales,

multiplicando el resultado por cien.

La Densidad Absoluta es el promedio

aritmético de nematodos por muestra de 100

cc de suelo. indica el grado de infestación de

un suelo y se obtiene dividiendo la suma de

los registros de población de cada muestra

por el número total de muestras analizadas

(Volcy, 1998).

Fase de Invernadero

Como fuente de inóculo se utilizó suelo con

alto grado de infestación de nematodos,

proveniente de las diferentes fincas de tres

veredas visitadas durante el reconocimiento:

Betania (Bolivar), Guayabal (Versalles) y San

Isidro (Trujillo), más suelo autoclavado, para

completar el volumen del matero (1 Kg) en el

cual se sembraron semillas de tomate de mesa

variedad Rutgers, altamente susceptible al

ataque de especies de Meloidogyne.

Para las pruebas de parasitismo se toma-

ron semillas de tomate de árbol, se sembraron

en materos que contenían aproximadamente

un kilogramo de suelo autoclavado. Las

plantas se mantuvieron bajo condiciones de

invernadero hasta el momento de la inocula-

ción. A los dos meses se inocularon 6000

huevos por planta, abriendo tres orificios

equidistantes en el área de mayor concentra-

ción de raíces. Como testigo se usaron plantas

inoculadas con agua destilada estéril.

Parámetros de evaluación

Con el fin de evaluar el efecto parasítico del

nematodo, se midió durante tres meses la

altura de las plantas, iniciando al momento

de la inoculación. Al levantar las plantas se

determinó peso seco y fresco del follaje y de

raíces, población total de nematodos tanto en

suelo como en raíces y se estableció el índice

de nudosidad, determinado con base en la

escala de Taylor y Sasser (1983 y el índice

de reproducción determinado por la relación

entre la población final de huevos y la canti-

dad inicial (6000 huevos/planta) inoculada, el

cual se utilizó para conocer el grado de resis-

tencia. Para medir igualmente el grado de

daño se utilizó la escala de Canto Sáenz que

involucra el índice de nudosidad y el índice

de reproducción (Villota y Varón de Agude-

lo, 1995).

El porcentaje de reducción de cada pará-

metro de crecimiento permitió medir el efecto

de Meloidogyne sobre las plántulas evalua-

das; éste se obtuvo utilizando la relación entre

la diferencia del valor registrado en las plán-

tulas testigo y el valor de las inoculadas

versus el valor del testigo, expresado en

porcentaje.

Se usó un diseño completamente al azar

con cuatro tratamientos y ocho repeticiones

por tratamiento. La unidad experimental fue

una planta y los tratamientos el origen de los

nematodos (tres veredas: Betania (Bolivar),

Guayabal (Versalles) y San Isidro (Trujillo) y

un testigo absoluto.

Se realizó un análisis de varianza con las

variables: altura, peso aéreo y de raíces (fres-

co y seco) con los correspondientes fuentes

de variación y grados de libertad.

Con el fin de comparar los promedios ob-

tenidos se utilizó la prueba de Duncan.

Identificación de especies de Meloidogyne

spp.

La identificación de las especies se realizó

con el patrón perineal mediante comparación

con claves (Taylor y Sasser, 1983; Eisenback,

1981 et al).


El reconocimiento se realizó en 47 fincas

ubicadas en 11 municipios productores de

tomate de árbol: 10 pertenecientes al Valle

del Cauca y uno a Risaralda, abarcando 125

hectáreas y colectando igual número de

muestras para suelo y raíces (Tabla 1).

Se identificaron cinco géneros asociados

al cultivo del tomate de árbol, presentando

mayor frecuencia y distribución el nematodo

del nudo radical Meloidogyne spp. , el cual se

encontró en el 81 y 86 por ciento de las mues-

tras de suelo y raíces analizadas (Tabla 2).

El nematodo del nudo radical Me-

loidogyne spp., es quizá el factor más limitan-

te en la producción del tomate de árbol, debi-

do principalmente a que se siembra en suelos

que han sido cultivados previamente con

hortalizas, café, plátano, lulo y otras solaná-

ceas que son susceptibles a este género (Tis-

nés et al, 1981)

Los nematodos formadores de agallas del

género Meloidogyne spp. son los que mayor

Tabla 1. Municipios visitados durante el reconocimiento de nematodos en tomate de árbol (2000 – 2001)

Municipio No. Veredas No. fincas Area

(Has)

Muestras

Suelo Raices

Versalles

Apia

Trujillo

Bolivar

Buga

El Dovio

Ginebra

Guacari

Roldanillo

Pradera

El Cerrito

2

1

3

3

2

2

4

1

1

1

1

2

1

4

6

12

3

8

2

3

5

1

17

1

17

22

20

12

14

4

7

10

1

17

1

17

22

20

12

14

4

7

10

1

17

1

17

22

20

12

14

4

7

10

1

Total 21 47 125 125 125


daño causan al tomate de árbol en todas las

zonas productoras, ya que al causar agallas

impiden la absorción eficiente de los nutrien-

tes, e inducen muerte de las plántulas por la

invasión de otros microorganismos secunda-

rios o patógenos.

Su presencia pasa muchas veces inadver-

tida en la planta que establece su parasitismo,

porque los síntomas aéreos pueden ser con-

fundidos con deficiencias nutricionales.

Meloidogyne aumenta la susceptibilidad del

tomate de árbol a algunos problemas patoló-

gicos como es el caso de la bacteria Pseudo-

monas solanacearum agente causal de la

dormidera o marchitez (Saldarriaga et al,

1997; Suárez y Rosales, 2001).

Le sigue en importancia Helicotylenchus

sp., el cual se encontró en el 18 y 5 por ciento

de las muestras de suelo y raíces, respectiva-

mente (Tabla 2).

Con menor frecuencia se encontró el ne-

matodo de las lesiones Pratylenchus sp. (10

por ciento para suelo y 17 por ciento para

raíces). Con baja frecuencia se encontró

Trichodorus sp. y Tylenchorhynchus sp.

Se encontraron nematodos no fitoparási-

tos de los grupos Rhabditidae, Dorylaimidae,

Aphelenchidae, y Mononchidae con porcenta-

je de frecuencia de 99, 58, 49 y 29 por ciento

para suelo, respectivamente y 98, 34, 85 y 7

por ciento para raíces (Tabla 3).

Estos nematodos se encuentran princi-

palmente en ambientes que son ricos en

materia orgánica en descomposición, partici-

pando del proceso de desintegración de restos

como saprófitos, lo cual estimula la multipli-

cación de nematodos depredadores, hongos

capturadores de nematodos y otros enemigos

naturales que ayudan a mantener un equili-

brio biológico en el medio (Volcy, 1998). En

la familia Mononchidae se encuentra la ma-

yoría de los nematodos depredadores de

nematodos, ácaros, colémbolos, entre otros.

También se encontraron individuos del

género Tylenchus con porcentaje de fre-

cuencia de 47 y 32 por ciento para suelo y

raíces, respectivamente (Tabla 3). Estos son

nematodos sin actividad parasítica definida

y con frecuencia se encuentran en suelo y

tejidos de plantas sanas y enfermas.

Al analizar la población de nematodos pre-

sente en suelo y raíces se observó que Me-

loidogyne alcanzó las poblaciones más altas

con máximas en suelo de 1958 y promedio de

183 individuos por 100 cc de suelo. En raíces

la población máxima alcanzó 453 individuos

por gramo de raíces frescas y promedia de 35

(Tabla 4).

Estas poblaciones indican la alta suscep-

tibilidad del tomate de árbol al nematodo del

nudo radical, el cual es considerado agresivo,

capaz de causar daño en cultivos susceptibles

como tomate, lechuga, apio, fresa y otros, en

umbrales de 10 juveniles/100 cc de suelo

(Volcy, 1998).

Las poblaciones encontradas para Heli-

cotylenchus y Pratylenchus en raíz, alcanzan

máximas de 16 y 26 individuos por gramo de

raíces frescas, respectivamente (Tabla 4).

Aunque la literatura registra estos géne-

ros asociados al tomate de árbol, su impor-

tancia no ha sido evaluada, hasta el momento

no se registran estudios que permitan compa-

rar las poblaciones para saber si son bajas o

altas o si pueden estar en un umbral económi-

co.

Al analizar el número de nematodos por

municipio, se encontró la máxima población

de Meloidogyne en El Dovio, con 1958 indi-

viduos/100 cc de suelo. Se ha demostrado que

al final del ciclo de algunos cultivos, se au-

menta la proporción de nematodos en el

suelo, especialmente machos y juveniles del

segundo estado (J2 ). Esto indica que los

nematodos abandonan la raíz y migran al

suelo antes del agotamiento de los recursos y

aunque se desconocen las razones de este

comportamiento, investigaciones previas han

demostrado que el bajo nivel de nitrógeno, las

altas temperaturas y los cortos fotoperíodos

son factores que pueden incidir sobre esta

migración, además de otros factores ambien-

tales (Volcy, 1981; Volcy, 1998). De la

misma manera

Otros municipios que presentaron altas

poblaciones de Meloidogyne en suelo fueron

Roldanillo, Trujillo, Ginebra y Versalles con

1216, 1088, 700 y 609 individuos/100 cc de

suelo, respectivamente. En los municipios

como El Dovio, Roldanillo, Trujillo y Gine-

bra, donde se registran las máximas pobla-

ciones, los cultivos anteriores a éste eran

granadilla; plátano y café, y pasto; mora y

lulo, respectivamente. En ninguno de los lotes

sembrados con tomate de árbol de estos

municipios se había sembrado previamente

este cultivo, lo que indica la presencia de un

inóculo previo capaz de infectar a estas plan-

taciones o plantas de vivero infestadas.

Densidad absoluta

La densidad de población de un nematodo

dañino antes de plantar es, por lo menos, un

buen indicio del daño que se puede esperar

del cultivo

Se encontró que Meloidogyne es el nema-

todo que registra los valores más altos de

densidad absoluta en los municipios mues-

treados, siendo el municipio de El Dovio el

que presenta el mayor grado de infestación

con 375 nematodos/100 cc de suelo; le siguen

los municipios de Roldanillo, Apia, Trujillo,

Ginebra, Bolivar y Versalles con valores de

densidad absoluta de 278, 269, 233, 175, 110

y 108 (Tabla 5).

Cabe anotar que los suelos de la mayoría

de las fincas muestreadas son de textura

liviana y que Meloidogyne tiene preferencia

por estos suelos, donde tiende a ser más

agresivo y provoca mayores daños aún con

densidades de población relativamente bajas

(Volcy, 1998).

Los nematodos del género Helicotylen-

chus y Pratylenchus se presentaron con den-

sidades de población bajas con relación a

Meloidogyne.

Tabla 2. Frecuencia de géneros de nematodos

fitoparásitos asociados a cultivos de tomate de

árbol expresada en porcentaje, según las muestras

analizadas.

Genero Frecuencia (%)*

Suelo1 Raiz2

Meloidogyne

Helicotylenchus

Pratylenchus

Trichodorus

Tylenchorhynchus

81

18

10

4

1

86

5

17

0

0

* 125 muestras de suelo y raíces 1 100 c c de

suelo 21 gramo de raíces frescas

Tabla 3. Frecuencia de géneros de nematodos

no fitoparásitos asociados a cultivos de tomate de

árbol, expresada en porcentaje, según lasw

muestras analizadas .

Genero % Frecuencia ( %)*

Suelo1 Raiz1

Rhabditidae

Dorylaimidae

Aphelenchidae

Mononchidae

Tylenchus

99

58

49

29

47

98

34

85

7

32

* 125 muestras de suelo y raíces 1 100 c c de

suelo 21 gramo de raíces frescas

Tabla 4. Niveles de Población de géneros de nematodos fitoparásitos asociados al cultivo de tomate de

árbol

Género Suelo* Raiz*

Máximo Promedio Máximo Promedio

Meloidogyne

Helicotylenchus

Pratylenchus

Trichodorus

Tylenchorhynchus

1958

117

58

34

26

183

29

5

25

26

453

16

26

0

0

35

19

9

0

0

* No. de nematodos en 100 cc de suelo y un gramo de raíces frescas

Tabla 5. Densidad absoluta de nematodos en los

municipios muestreados

Mu

nic

ipio

Melo

idogyn

e

Heli

coty

len

ch

us

Pra

tyle

nch

us

Versalles

Bolivar

El Dovio

Trujillo

Roldanillo

Ginebra

Pradera

Buga

El Cerrito

Guacarí

Apia

108

110

375

233 278

175

83

12

27

3

269

9

5

2

0 4

5

0

11

14

15

0

5

4

0

2 4

0

1

1

27

0

0


0

500

1000

1500

2000

2500

Máx

imo

Pro

medio

Máx

imo

Pro

medio

Máx

imo

Pro

medio

Máx

imo

Pro

medio

Máx

imo

Pro

medio

0 - 6 6,1 - 12 12,1 - 18 18,1 - 24 >24

Edad en mesesN

úm

ero

de

nem

ato

dos Fitoparásitos No Fitoparásitos

Figura 1. Nivel de población de nematodos maximo y promedio en suelo y su relación con la

edad del cultivo

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900M

áxim

o

Pro

med

io

Máx

imo

Pro

med

io

Máx

imo

Pro

med

io

Máx

imo

Pro

med

io

Máx

imo

Pro

med

io

0 - 6 6,1 - 12 12,1 - 18 18,1 - 24 >24

Edad en meses

Núm

ero

de n

emat

odo

s

Fito parás ito s No Fito parás ito s

Figura 2. Población máxima y promedia de nematodos en raíces y su relación con la edad del

cultivo

0

500

1000

1500

2000

2500

Núm

ero

de

nem

ato

do

s

Suelo 1079 209 1958 193 484 128 700 123 77 26

Raíz 64 15 384 31 117 24 453 42 32 6

Máxima PromedioMáxima PromedioMáxima PromedioMáxima PromedioMáxima Promedio

0 - 6 6,1 - 12 12,1 - 18 18,1 - 24 >24

Figura 3. Población máxima y promedia de Meloidogyne y su relación con la edad del cultivo

En cultivos perennes la edad y fenología

del cultivo así como la actividad radical de

las plantas juegan un papel muy importante

en los cambios poblacionales de los nemato-

dos a través del tiempo.

La dinámica poblacional de nematodos

tiene un período en que la población aumenta

debido a la mayor disponibilidad de alimento

(raicillas) y periodos de disminución. En

condiciones normales se espera que los má-

ximos y mínimos sean cada vez más altos en

las primeras etapas de desarrollo del cultivo y

comiencen a bajar a medida que comienza la

senescencia.

Relacionando la población de nematodos

y la edad del cultivo, se encontró que cultivos

entre los 6 y los 12 meses presentaron las

poblaciones máximas de nematodos fitopará-

sitos en suelo con 1958 nematodos/100 cc de

suelo (Figura 1).

Desde los primeros meses del cultivo se

observó una población alta con 1079 nemato-

dos fitoparásitos, esto puede deberse a que ya

existía una fuente de inóculo previa debido a

los cultivos anteriores o en asocio y/o interca-

lados como café, lulo, plátano, entre otros,

que en la mayoría de los casos son suscepti-

bles a los mismos géneros, o a que el material

de propagación estaba infectado desde la

etapa de vivero (Figura 1). A partir del año, la

población de nematodos fitoparásitos se

disminuye.

Esto se debe a que las poblaciones de

nematodos no permanecen estacionarias;

disminuyen cuando las condiciones existentes

no favorecen la reproducción, y aumentan

cuando existen raíces de plantas susceptibles

que brindan alimento y cuando la temperatu-

ra y la humedad del suelo favorecen su acti-

vidad (Taylor y Sasser, 1983).

En raíces se presentó un máximo de ne-

matodos fitoparásitos entre los 18 y 24 meses

y de 6 a 12 meses con máximas de 453 y 384

nematodos/ 1 g de raíces frescas, respectiva-

mente (Figura 2).

En general, las especies endoparásitas

aumentan con gran rapidez pocas semanas

después de haberse plantado el cultivo y la

población alcanza su máximo cuando el

crecimiento de la raíz es más activo (Taylor y

Sasser, 1983).

Una población máxima es afectada por

factores bióticos y abióticos y se reduce para

volver a iniciar el crecimiento formando una

curva con ascensos y descensos acorde con la

actividad radical que le brinda el alimento

necesario para la multiplicación y alimenta-

ción de las progenies subsiguientes.

Las poblaciones de nematodos no fitopa-

rásitas se mantuvieron relativamente altas

durante las etapas de desarrollo del cultivo,

alcanzando una población máxima entre los 6

y 12 meses para suelo (1890 nematodos/100

cc de suelo) (Figura 1), y entre los 12 y 18

meses para raíces (853 nematodos/g raíces

frescas) (Figura 2). La presencia de nemato-

dos no fitoparásitos sugiere que existe una

gran actividad microbiológica en los ecosis-


temas sembrados con tomate de árbol, posi-

blemente debido al alto contenido de materia

orgánica, o posible deterioro de raíces por la

alimentación de los nematodos fitoparásitos,

especialmente por Meloidogyne sp.

En suelo, las poblaciones más altas de

Meloidogyne se encontraron durante los

primeros doce meses del cultivo con 1079 –

1958 individuos/100 cc de suelo (Figura 3),

debido a que en esta etapa el crecimiento de

las raíces es más activo proporcionando el

alimento necesario para su multiplicación.

Este incremento también puede depender de

la densidad del nematodo en el suelo al mo-

mento de efectuarse la siembra.

A partir de los 12 meses la población

comienza a descender paulatinamente tanto

en suelo como en raíces. Esto supone la

existencia de un índice constante de repro-

ducción hasta que la densidad es tan alta que

la población se autorregula ya sea por falta de

alimento o por la presencia de enemigos

naturales o bien la capacidad nutricional de la

planta se convierte en un factor limitante, por

presentar tejidos lignificados, pocas raicillas

y/o deterioro radical.

Prueba de Parasitismo con Meloidogyne sp.

Las plantas inoculadas con Meloidogyne,

mostraron pobre desarrollo foliar y marcado

enanismo. En el sistema radical de las plan-

tas inoculadas se observaron agallas y nudo-

sidades, similares a los observados en plantas

adultas de las fincas donde se realizó el reco-

nocimiento.

El efecto parasítico del nematodo se mar-

có principalmente en el desarrollo foliar

notándose que la población inoculada ejerció

efecto depresivo en las plantas, en altura de

la planta y tamaño de hojas, las cuales fue-

ron más pequeñas y cloróticas además de un

pobre sistema radical, comparadas con el

testigo.

Las plantas presentaron reducción en su

crecimiento superior al 44% (Tabla 6). En

cuanto el desarrollo foliar se observó tallos

más delgados y hojas más pequeñas. Para el

peso fresco se registró reducción entre el 53

y 65% y entre el 47 y 66% para peso seco.

En raíz se presentó reducción entre 37 y 60

% para peso fresco y entre 29 y 59% para

peso seco (Tablas 6 y 7).

Todas las plantas inoculadas con Me-

loidogyne presentaron más de 100 agallas, lo

que indica un índice de nudosidad de 5 (Ta-

blas 6 y 7).

Tanto en suelo como raíces se pudo recu-

perar altas poblaciones de estados juveniles

de Meloidogyne lo que permite comprobar

que el nematodo fue capaz de infectar, esta-

blecerse y multiplicarse en este cultivo.

Además en raíces alcanzó una población

de juveniles y huevos, capaz de causar infec-

ción severa en las plantas. La población,

encontrada en suelo fue de 504, 610, 1432

individuos por 100 cc de suelo y en raíz 6342,

6375 y 9791 individuos por gramo de raíces

secas (Tablas 6 y 7)

El índice de reproducción fue superior a

uno en todas las poblaciones estudiadas.

Según Canto Sáenz una planta con un índice

de reproducción superior a uno y un índice de

nudosidad superior a dos indica que la espe-

cie es susceptible al ataque de Meloidogyne

(Villota y Varón, 1995)

Identificación de especies de Meloidogyne

Al establecer la comparación con patrones

perineales (Taylor y Sasser, 1983) se deter-

minó en la vereda Betania (Bolivar) una

población mixta conformada por M. incogni-

ta y M. arenaria; en las veredas de Guayabal

(Versalles) y San Isidro (Trujillo) se encontró

M. incógnita .

En tomate de árbol se han registrado las

especies de M. incognita, M. arenaria, M.

javanica y M. hapla como las que mayor

daño producen a estos cultivos en todas las

zonas productoras (Saldarriaga y otros1997).

De acuerdo con el reconocimiento se es-

tableció que el nematodo más importante y

ampliamente distribuido es Meloidogyne y

afecta significativamente el desarrollo de las

plántulas de tomate de árbol.

CONCLUSIONES

Durante el reconocimiento se identificaron

cinco géneros fitoparásitos, asociados con el

cultivo del tomate de árbol, siendo Me-

loidogyne el de mayor frecuencia y distribu-

ción en los municipios muestreados . El

Dovio, Trujillo, Roldanillo y Versalles,

registraron las máximas infestaciones en

suelo. Se identificaron nematodos no fitopa-

rásitos pertenecientes a las familias Rhabdi-

tidae, Aphelenchidae, Dorylaimidae y Mo-

nonchidae.

Meloidogyne presentó mayor población

en los 12 primeros meses del establecimiento

del cultivo, época en que la planta produce

mayor cantidad de raíces, de hormonas, la

primera floración y producción de frutos,

Tabla 7. Efecto de Meloidogyne sp sobre algunos parámetros de crecimiento en plantas jóvenes de tomate

de árbol.

Parámetros

T1 T2

Sin Nematodos Población San Isidro

(Trujillo)

% de reducción

respecto al testigo

Incremento en altura

(cm)

17,141

8,28

51,70

Peso aéreo fresco (gr) 41,17 19,11 53,56

Peso aéreo seco (gr) 7,23 3,77 47,86

Peso raíz fresco (gr) 26,07 16,38 37,14

Peso raíz seco (gr) 2,96 2,08 29,78

No. De huevos 0 876.986

Población de nematodos

Suelo2 0 1432

Raíces2 0 9.791

Indice de nudosidad 0 5

Indice de reproducción 0 146,2

1Promedio de 7 repeticiones 2 No. de nematodos por 100 cc de suelo y un gramo de raíces secas

Tabla 6. Efecto de Meloidogyne sp sobre algunos parámetros de crecimiento en plantas jóvenes de tomate

de árbol.

Parámetros

T1 TT

Sin

Nematodos

Población

Betania

(Bolivar)

% de

reducción

respecto

al testigo

Población

Guayabal

(Versalles)

% de reducción

respecto al

testigo

2 T3

Incremento en altura (cm) 25,251 14,0 44,55 11,93 52,72

Peso aéreo fresco parte

aérea (g) 107,60 39,84 63,00 37,70 64,96

Peso aéreo seco (g) 13,59 5,54 59,24 4,57 66,36

Peso raíz fresco (g) 35,51 20,47 42,33 13,92 60,78

Peso raíz seco (g) 5,77 3,13 45,73 2,35 59,27

No. De huevos 0 255.649 338.777

Población de nematodos

Suelo2 0 504 610

Raíces2 0 6.342 6.375

Índice de nudosidad 0 5 5

Índice de reproducción 0 42,6 56,5 1Promedio de 7 repeticiones 2No. de nematodos por 100 cc de suelo y un gramo de raíces secas


factores que pueden incidir en las poblaciones

de los nematodos de la rizosfera, pues son

estimulados al tener una fuente constante de

alimento.

El efecto parasítico de Meloidogyne se

marcó principalmente en altura y un menor

desarrollo aéreo y radical de las plantas ino-

culadas comparadas con el testigo, lo que

indica que este nematodo puede incidir eco-

nómicamente en la producción de este culti-

vo, disminuyendo la productividad y por ende

el ingreso al agricultor.

Se encontraron M. incógnita y M. arena-

ria, en la vereda Betania (Bolívar); en Gua-

yabal (Versalles) y San Isidro (Trujillo) M.

incógnita.

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan su agradecimiento a

FONTAGRO, IICA – Prociandino, UMATA

del Valle del Cauca, Risaralda y Quindío y

demás personas e Instituciones que colabora-

ron en el desarrollo del trabajo.


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