FRET

BRET

FLIM

BiFC

1

Stéphane GUILLOU - Timothée BITSCH - Thibaud LAGACHE

Limite : 200 nm

Microscopes à fluorescence conventionnels

2

F R E T

Transfer

Förster /Fluorescence

Resonance

Energy

3

FRET

1946 par Theodore Förster

« Energie d’excitation transférée d’une molécule à

une autre à travers une interaction entre dipôles

oscillant de molécules proches dans l’espace »

Théorie du FRET

4

FRET

Théorie du FRET

1 à 10 nm

Définition : Processus non radiatif par lequel de l’énergie

d’un fluorophore donneur à l’état excité est transmis à un

fluorophore accepteur à proximité immédiate (1-10nm)

5

FRET

Les conditions

I. Excitation du donneur

6

FRET

Les conditions

FRET

II. Chevauchement du spectre d’émission du donneur et du

spectre d’absorption de l’accepteur

Spectre

d’excitation

Spectre

d’émission Spectre

d’excitation

Spectre

d’émission

Inte

nsi

té

Longueur d’onde en nm

Donneur Accepteur

Chevauchement

Intégrale de recouvrement J(λ) :• fD : intensité de la fluorescence émise par le

donneur à une longueur d’onde donnée

• εA : coefficient d’extinction molaire de l’accepteur7

FRET

Les conditions

III. Distance donneur/accepteur 1-10 nm

= distance donneur - accepteur pour laquelle l’efficacité

du transfert d’énergie est de 50%.

• R : distance effective qui sépare les deux molécules

• R0 : rayon de Förster

Efficacité de transfert E = nb de molécules qui se désactivent par transfert

nb total de molécules excitées

8

Les conditions

Calcul de la distance :

• J : intégrale de recouvrement

• n : indice de réfraction du milieu

• QD : rendement quantique du donneur en absence d’accepteur

• κ2 : facteur d’orientation qui est fonction de l’orientation relative

des dipôles du donneur et de l’accepteur

III. Distance donneur/accepteur 1-10 nm

= distance donneur - accepteur pour laquelle l’efficacité

du transfert d’énergie est de 50%.

• R : distance effective qui sépare les deux molécules

• R0 : rayon de Förster

Efficacité de transfert E = nb de molécules qui se désactivent par transfert

nb total de molécules excitées

9

FRET

IV. Orientation donneur – accepteur favorable

Les conditions

Angle différent de 90°

FRET

Angle égal à 90°

Pas de FRET

Remarque : En Biologie ceci n’est généralement pas un

problème car les donneurs et les accepteurs peuvent

avoir une certaine liberté de rotation

10

FRET

Les conséquences

Inte

nsi

té d’é

mis

sion

Temps

Donneur seul

Donneur en présence d’accepteur

et lorsqu’il y a FRET

• Diminution de l’intensité de fluorescence du donneur et

augmentation de l’ intensité de fluorescence de l’accepteur

• Diminution de la durée de vie de florescence du donneur

11

FRET

Visualisation et Mesure du FRET

Fluorimètre Microscope

Fluorimètre pour microplaques

Appareil qui va permettre de

mesurer le spectre de fluorescence

d’une molécule en fonction de la

longueur d’onde d’excitation et

inversement on pourra mesurer la

variation de la fluorescence pour

diverses longueurs d’ondes

d’excitation.

Après excitation du donneur

celui-ci va à sont tour (s’il y a

interaction) exciter le

receveur, permettant ainsi la

mesure de la fluorescence. En

plus de l’information sur

l’existence de l’interaction,

nous aurons une information

de localisation subcellulaire. 12

FRET

Visualisation et Mesure du FRET

Mesure du FRET par intensité

Mesure du ratios donneur/accepteur

Mesure de l’augmentation de l’intensité de l’accepteur

Mesure de l’intensité du donneur

!

!

!

Corrections à apporter concernant la fluorescence détecter

dans le canal de l’accepteur due au donneur

La stœchiométrie donneur /accepteur doit être constante au

cours de l’expérience

Débris

Mesure du FRET par photoblanchiment (pbFRET)

Mesure du FRET par pbFRET de l’accepteur (DFRAP)

Mesure du FRET à l’aide de la durée de vie de

fluorescence (FLIM)13

FRET

Applications du FRET

Etude d’interactions intermoléculaires

Protéine - Protéine

Exemple :

- Montrer la dimérisation de récepteurs couplés aux protéines G,

- Analyser la fixation d'un ligand sur un récepteur

- Mettre en évidence l'interaction de canaux ioniques de type L

avec la calmoduline . 14

FRET

Applications du FRET

Etude d’interactions intramoléculaires

Changements conformationnels de protéines

Caractérisation de complexes macromoléculaires

Dimérisation de protéines

15

FRET

Applications du FRET

FRET

Etude d’interactions intramoléculaires

Changements conformationnels de protéines

Caractérisation de complexes macromoléculaires

Dimérisation de protéines

Biosenseurs : applications à l’étude d’activités enzymatiques, à la

détermination déconcentration d’ions (Ca 2+ ) ou de métabolites

(AMPc).

535 nm

480 nm

+ 4 Ca 2+

- Ca 2+

RATIO : 535/480 (YFP/CFP) 16

17

Les principaux avantages et

inconvénients

FRET

Avantages :

- Simplicité de mise en œuvre

- Possibilité d’étude dynamique

- Rapidité

Inconvénients :

- Risque d’artefacts : auto-fluorescence

18

FRET

Perspectives du FRET

Développements

- de nouveaux fluorophores

- de détecteurs plus performants

- de logiciels d’acquisition et d’analyse

19

F L I M

Fluorescence

Lifetime

Imaging

FLIM

20

Problème : SBT = spectral bleed-through

Solution : mesure de la durée de vie d’excitation

FLIM

21

FLIM

BRET

B R E T

Bioluminescence

Resonance

Energy

Transfer

22

Découverte du BRET

Phénomène de

bioluminescence chez

Aequorea victoria

Dr Shimomura en 1960

observe un phénomène de

Bioluminescence

23

BRET

Théorie de BRET

Site d’affinité pour

le Ca2+ (Cofacteur)

Site d’affinité pour

l’oxygène moléculaire

Coelenterazine

Ca2+

O2/

O3

L’Aequorine:

24

BRET

Théorie de BRET

Site d’affinité pour

l’oxygène moléculaire

Coelenterazine

O2/

O3

La Renilla Luciférase :

25

BRET

La Technique du BRET

Prot A Prot BProt A Prot B

26

BRET

La Technique du BRET

BRET

27

La Technique du BRET

28

BRET

Avantages du BRET

- L’utilisation d’une enzyme pour exciter le

donneur luminescent permet de s’affranchir

d’une source excitatrice extérieure

-Plus sensible que le FRET et meilleur

quantification

-Adaptable au format microplaque

-outil de choix pour l’étude des

protéines en cellules vivantes

29

-Travail avec cellules auto-fluorescente

BRET

Désavantages du BRET

-Variations de signal dues à des fluctuations

de la lumière émise (interférences optiques

des milieux, variations du nombre de

cellules, volume de l’essai…).

-Le signal sur bruit d’un essai en BRET est

affecté par le recouvrement des spectres

d’émission du substrat de la Luciférase et

de la YFP.

30

BRET

Désavantages du BRET

-Orientation du donneur et de l’accepteur

-Sensibilité de la GFP au pH

-Amplification du BRET difficile

31

BRET

Utilisations du BRET

-Utilisée pour analyser l’oligomérisation

(association de protéines)

-utilisée pour l’activation des récepteurs

couplés aux protéines G

-Outils de choix pour l’études de protéine en

cellules vivantes

- De nouveaux outils

32

BRET

BiFC

Bimolecular

Fluorescence

Complementation

33

Bi F C

On veut :

- Observer une interaction entre macromolécules

- In vivo

- Avec une bonne sensibilité

34

BiFC

T. K

. Kerp

pola

, Nat.

Met

hod

s, 2

006, 3

, 969

Association de fragments de protéines

I. Origines

35

BiFC

I. Origines

Ghosh, I., Hamilton, A. D. & Regan, L.

Antiparallel Leucine Zipper-Directed Protein Reassembly: Application to the

Green Fluorescent Protein

Journal of the American Chemical Society 122, 5658 (2000) 36

BiFC

Hu, C. D., Chinenov, Y. & Kerppola, T. K

.

Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living

cells using bimolecular fluorescence complementation

Mol. Cell 9, 789-798 (2002).

Kerppola, T. K.Hu, C. D.

I. Origines

37

BiFC

C-YFP

P1P2

N-YFP

II. Principe

38

BiFC

II. Principe

Préparation...

Schun a

nd C

ourt

lai,

2010 (

Wik

imedia

Com

mo

ns)

39

BiFC

II. Principe

… et observation

Microscope à fluorescence inversé

Nuno N

ogu

eir

a, 2

007 (

Wik

imedia

com

mo

ns)

Schun a

nd C

ourt

lai,

2010 (

Wik

imedia

Com

mo

ns)

40

BiFC

III. Variantes

→ Multicolor BiFC

C. D

. H

u a

nd T

. K

. K

erp

pola

, N

at. B

iote

chnol.,

2003, 21, 539

→ UbFC

41

BiFC

V. Avantages

- Observation in vivo

- Visualisation directe

- Sensibilité

- Pouvoir de résolution très élevé

- Équipement classique

IV. Applications

- Observation simultanée de plusieurs complexes

- Observation des modifications de voies de signalisation

- Observation d'interactions entre protéines et ARN

- Étudier la formation de complexes dans divers compartiments

cellulaires

42

BiFC

VI. Limites

43

- Attente de plusieurs heures

- Reformation irréversible du fluorochrome

- Reformation indépendante d'une interaction

- Altération de la structure ou fonction de la protéine

- Seulement chez des organismes aérobies

Peuvent être évitées !

BiFC

44

Bibliographie

Author(s): Trugnan, G; Fontanges, P; Delautier, D; Ait-Slimane, T

Title: FRAP, FLIP, FRET, BRET, FLIM, PRIM... new techniques for a colourful life

Source: M S-MEDECINE SCIENCES, 20 (11): 1027-1034 NOV 2004

Author(s): Wallrabe, H; Periasamy, A

Title: Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy

Source: CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY, 16 (1): 19-27 FEB 2005

Author(s): Ghosh, I; Hamilton, AD; Regan, L

Title: Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein

Source: JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, 122 (23): 5658-5659 JUN 14 2000

Author(s): Hu, CD; Chinenov, Y; Kerppola, TK

Title: Visualization of interactions among bZip and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation

Source: MOLECULAR CELL, 9 (4): 789-798 APR 2002

Author(s): Yao Xu, Akihito Kanauchi,et al

Title: Bioluminescence resonance energy transfer (BRET): a new technique for monitoring protein-protein interactions in living cells; 18p, 2001

Author(s): K.D.G.Pfleger and K.A.Eidne;

Title: Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer (BRET); vol3, n°3, Mars 2006

Cours de Didier Pascal (Université de Strasbourg) ; Title : La fluorescence

Autor(s): Rocheville M, La,ge DC, Kumar U, Patel SC, Patel RC, and Patel YC (2000)

Title : Recpetors for dopamine and somatostatin: formation of hétéro-oligomers with enhanced functional activity.

Source: Science 288: 154-157

Author(s): Riyaz A Bhat, Thomas Lahaye and Ralph Panstruga

Title: The visible touch: in planta visualization of protein-protein interactions by fluorophore-based methods

Source: Plant Methods 2006, 2:12

Author(s): Wu P, Brand L.

Title: Resonance energy transfer: methods and applications.

Source: ANALYTICAL BIOCHEMISTRY Volume: 218 Issue: 1 Pages: 1-13 Published: APR 1994

Author(s): Jares-Erijman EA, Jovin TM

Title: FRET imaging

Source: NATURE BIOTECHNOLOGY Volume: 21 Issue: 11 Pages: 1387-1395 Published: NOV 2003