ESCOLA SECUNDÁRIA AUGUSTO GOMES, MATOSINHOS

FORMAÇÃO DE ADULTOS | CURSO EFA DUPLA CERTIFICAÇÃO | 2013-14

Curso Técnico de Controlo de Qualidade AlimentarFormação tecnológica Módulo 25h – Análise bacteriológica das águasFormadora – Sofia PimentaFormando – Alexandre Filipe Carvalho Lourador

Ficha de trabalho n.º3Introdução à microbiologia das águas

Técnica das membranas filtrantes

Esta atividade trata alguns aspetos microbiológicos da qualidade da água destinada ao consumo humano. A

avaliação da qualidade bacteriológica da água realizada em rotina baseia-se na pesquisa de bactérias indicadoras

de contaminação fecal na água por recurso à técnica das membranas filtrantes.

Este procedimento experimental visa exemplificar a metodologia envolvida na pesquisa e enumeração de bactérias

coliformes (totais e fecais) numa amostra de água, com base na técnica das membranas filtrantes.

Palavras-chave: Qualidade da água; Análise bacteriológica; Contaminação fecal; Técnica das membranas filtrantes; Bactérias

coliformes.

Objetivos de aprendizagem

1. Identificar aspetos microbiológicos da qualidade da água destinada ao consumo humano;

2. Compreender os fundamentos e a importância do recurso à pesquisa de bactérias indicadoras de

contaminação fecal na análise por rotina da qualidade de uma água;

3. Compreender a metodologia envolvida na pesquisa e enumeração de bactérias coliformes (totais e fecais)

numa amostra de água, com base na técnica das membranas filtrantes;

4. Interpretar e discutir a qualidade de uma água em termos bacteriológicos, com base em resultados

experimentais concretos resultantes de uma análise de pesquisa de coliformes numa amostra da água.

Procedimento experimental

1º Passo: Recolha da amostra de água

As amostras de água para análise são colhidas em frascos de vidro ou plástico com 500 ml de capacidade,

rolhados ou tapados com rolha de algodão, e que foram previamente esterilizados na autoclave.

Ao abrir e fechar o frasco, durante a colheita, deve-se ter o maior cuidado para evitar a ocorrência de

contaminações que lhe sejam exteriores.

Procedimento a seguir no caso de águas canalizadas:

1.Limpar a torneira ou local de passagem da água com algodão embebido em álcool etílico; deixar secar ao ar.

2.Deixar correr um pouco de água, antes da recolha.

3.Recolher a água num recipiente previamente esterilizado.

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Nota: quando a água a analisar for água tratada com cloro, os frascos onde a amostra é recolhida devem conter

um cristal de tiossulfato de sódio para neutralizar vestígios residuais daquele gás, o qual poderia causar a morte

das bactérias porventura presentes na água.

No caso de águas de um poço ou de águas balneares (por exemplo: rios, ribeiros, lagos, mar):

1.Evitar o contacto do bocal do frasco com as mãos ou com terra/areia eventualmente existente no local da

colheita;

2.Fazer a colheita, mergulhando o frasco na água do poço ou no curso de água, com a maior rapidez possível;

3.Evitar colher água da superfície, a qual contém, por vezes, quantidade apreciável de produtos de origem vegetal

em decomposição.

A amostra a analisar deve ser colhida, no máximo, 6 horas antes da realização da análise, e deve ser mantida em

gelo ou no frigorífico.

Diluição da amostra de água

Se for previsível que a água a analisar esteja muito contaminada (p. ex. águas de poços ou rios contaminadas

com efluentes domésticos ou fezes de animais), esta deve ser diluída entre 10 -1 e 10-3, com água destilada estéril.

Tanto a amostra de água como as suas diluições serão sujeitas a análise de pesquisa de bactérias indicadoras.

Procedimento:

2º Passo: Aplicação da técnica das membranas filtrantes

Fig. 1 - Material necessário e esterilização do sistema de filtração.

A análise bacteriológica de rotina de águas é frequentemente realizada com base na técnica das membranas

filtrantes.

O procedimento envolve:

Fig. 2 - Filtração da água a analisar.

1. Filtração, sob vácuo, de um volume adequado da água a analisar através de uma membrana filtrante (com

porosidade controlada de 0,45 μm), onde ficarão retidas células de possíveis bactérias contaminantes

(figura 2);

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Fig. 3 - Colocação da membrana filtrante sobre meio sólido.

2. Colocação da membrana sobre um meio de cultura seletivo para a deteção do grupo específico de

microrganismos indicadores, contido em placa de Petri (figura 3);

Fig. 4 - Membrana filtrante com colónias de bactérias.

3. Incubação da placa de Petri à(s) temperatura(s) adequada(s) à multiplicação celular do(s)

microrganismo(s) em causa;

4. Observação e contagem das colónias formadas sobre a membrana (figura 4).

Nota: O material utilizado deve ser previamente esterilizado. O sistema de filtração de inox é esterilizado

diretamente à chama do bico de Bunsen. O restante material de plástico ou vidro é previamente esterilizado na

autoclave (*). As membranas filtrantes vêm esterilizadas de origem.

(*) Esterilização pelo calor: autoclavagem

A utilização de calor em ambiente húmido é um dos métodos mais eficazes de destruição de microrganismos. A

morte das células microbianas por ação do calor húmido resulta da desnaturação das proteínas e da destabilização

da membrana citoplasmática. Ocorre quando as células são sujeitas a temperaturas superiores à temperatura

máxima de crescimento dos microrganismos em causa.

A esterilização por calor húmido é efetuada em autoclave, que consiste numa câmara com vapor de água saturado

à pressão de 1 atm acima da pressão atmosférica, a que corresponde, em locais ao nível do mar, uma

temperatura de ebulição da água de 121ºC. No laboratório de Microbiologia, é usual sujeitar o material a

esterilizar a 121ºC (1 atm; pressão relativa) durante 15 minutos, de modo a assegurar a morte de todas as

formas de vida microbianas, incluindo a dos endósporos bacterianos, mais resistentes ao calor que as células

vegetativas. Contudo, o tempo necessário para se esterilizar convenientemente os materiais, a esta temperatura,

depende da natureza do material a esterilizar e/ou do seu volume.

O calor húmido sob pressão é utilizado na esterilização de meios de cultura que não contenham componentes

termolábeis e na esterilização de material de plástico e de vidro a utilizar nos trabalhos experimentais de

Microbiologia.

3º Passo: Registo de resultados.

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Registo de resultados:

Legenda: 1- Recolha da amostra de água; 2 e 3- Preparação do meio cultura; 4- Placagem das placas de Petri;

5, 6 e 7- Técnica da membrana filtrante; 8- Incubação a 37ºC, 24horas.

Análise dos resultados:

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Resultado observado à lupa a 21x: Membrana filtrante com colónias de

coliformes.

Análise de resultados

As colónias amarelas formadas na superfície da membrana filtrante após incubação a 37ºC durante 24h, têm

origem em células viáveis de bactérias lactose - positivas (note-se que é de esperar que o meio de cultura por

baixo destas colónias também fique amarelo em resultado da sua acidificação).

A contagem destas colónias fornece-nos informação sobre o número presuntivo de coliformes totais possivelmente

presentes no volume de água analisada. Para confirmar a contagem de coliformes totais é necessário verificar a

ausência de actividades oxidase nas bactérias presentes nestas colónias lactose - positivas, com base em teste

bioquímico específico.

Por outro lado, a presença de colónias amarelas, lactose - positivas, na membrana filtrante que foi incubada a

44.5ºC durante 24h, é considerada indicação presuntiva da presença na água de coliformes fecais

(termotolerantes). Normalmente requer a confirmação da presença da espécie fecal Escheridria coli (E. coli).

Uma das formas de confirmar que algumas, ou todas, as colónias amarelas isoladas a 44.5ºC pertencem à espécie

E. coli, consiste em:

-Subcultivar estas colónias em meio de cultura selectivo que contém, entre outros componentes, o aminoácido

triptofano e o substrato fluorogénico MUG ("4- methylumbelly - feryl - β - D - glucuronide").

-Em seguida incuba-se as suspensões de células obtidas à temperatura 44.5ºC durante 24h.

-Serão contadas como colónias de E. coli, as colónias amarelas que, após este período, tenham conduzido a

culturas que:

1.hidrolizam o substrato MUG (em resultado da actividade da enzima β-glucuronidase) com formação de um

produto fluorescente, que é observável por irradiação da cultura com luz ultra-violeta; e,

2.produzem índole a partir do triptofano (a presença de índole na cultura é revelada com reagente de KOVAC).

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Resultado observado à lupa a 21x: Membrana filtrante com colónias de

coliformes.

Análise de resultados

As colónias amarelas formadas na superfície da membrana filtrante após incubação a 37ºC durante 24h, têm

origem em células viáveis de bactérias lactose - positivas (note-se que é de esperar que o meio de cultura por

baixo destas colónias também fique amarelo em resultado da sua acidificação).

A contagem destas colónias fornece-nos informação sobre o número presuntivo de coliformes totais possivelmente

presentes no volume de água analisada. Para confirmar a contagem de coliformes totais é necessário verificar a

ausência de actividades oxidase nas bactérias presentes nestas colónias lactose - positivas, com base em teste

bioquímico específico.

Por outro lado, a presença de colónias amarelas, lactose - positivas, na membrana filtrante que foi incubada a

44.5ºC durante 24h, é considerada indicação presuntiva da presença na água de coliformes fecais

(termotolerantes). Normalmente requer a confirmação da presença da espécie fecal Escheridria coli (E. coli).

Uma das formas de confirmar que algumas, ou todas, as colónias amarelas isoladas a 44.5ºC pertencem à espécie

E. coli, consiste em:

-Subcultivar estas colónias em meio de cultura selectivo que contém, entre outros componentes, o aminoácido

triptofano e o substrato fluorogénico MUG ("4- methylumbelly - feryl - β - D - glucuronide").

-Em seguida incuba-se as suspensões de células obtidas à temperatura 44.5ºC durante 24h.

-Serão contadas como colónias de E. coli, as colónias amarelas que, após este período, tenham conduzido a

culturas que:

1.hidrolizam o substrato MUG (em resultado da actividade da enzima β-glucuronidase) com formação de um

produto fluorescente, que é observável por irradiação da cultura com luz ultra-violeta; e,

2.produzem índole a partir do triptofano (a presença de índole na cultura é revelada com reagente de KOVAC).

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