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Trabalho prático: Técnica da membrana filtrante...

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Curso Cientfico-Humanstico de Cincias e Tecnologias

ESCOLA SECUNDRIA AUGUSTO GOMES, MATOSINHOS

FORMAO DE ADULTOS | CURSO EFA DUPLA CERTIFICAO | 2013-14Curso Tcnico de Controlo de Qualidade Alimentar

Formao tecnolgica

Mdulo 25h Anlise bacteriolgica das guas

Formadora Sofia PimentaFormando Alexandre Filipe Carvalho Lourador

Ficha de trabalho n.3Introduo microbiologia das guasTcnica das membranas filtrantesEsta atividade trata alguns aspetos microbiolgicos da qualidade da gua destinada ao consumo humano. A avaliao da qualidade bacteriolgica da gua realizada em rotina baseia-se na pesquisa de bactrias indicadoras de contaminao fecal na gua por recurso tcnica das membranas filtrantes.

Este procedimento experimental visa exemplificar a metodologia envolvida na pesquisa e enumerao de bactrias coliformes (totais e fecais) numa amostra de gua, com base na tcnica das membranas filtrantes. Palavras-chave: Qualidade da gua; Anlise bacteriolgica; Contaminao fecal; Tcnica das membranas filtrantes; Bactrias coliformes.Objetivos de aprendizagem

1. Identificar aspetos microbiolgicos da qualidade da gua destinada ao consumo humano;

2. Compreender os fundamentos e a importncia do recurso pesquisa de bactrias indicadoras de contaminao fecal na anlise por rotina da qualidade de uma gua;3. Compreender a metodologia envolvida na pesquisa e enumerao de bactrias coliformes (totais e fecais) numa amostra de gua, com base na tcnica das membranas filtrantes;4. Interpretar e discutir a qualidade de uma gua em termos bacteriolgicos, com base em resultados experimentais concretos resultantes de uma anlise de pesquisa de coliformes numa amostra da gua.

Procedimento experimental1 Passo: Recolha da amostra de gua

As amostras de gua para anlise so colhidas em frascos de vidro ou plstico com 500 ml de capacidade, rolhados ou tapados com rolha de algodo, e que foram previamente esterilizados na autoclave.

Ao abrir e fechar o frasco, durante a colheita, deve-se ter o maior cuidado para evitar a ocorrncia de contaminaes que lhe sejam exteriores.Procedimento a seguir no caso de guas canalizadas:

1.Limpar a torneira ou local de passagem da gua com algodo embebido em lcool etlico; deixar secar ao ar.

2.Deixar correr um pouco de gua, antes da recolha.

3.Recolher a gua num recipiente previamente esterilizado.

Nota: quando a gua a analisar for gua tratada com cloro, os frascos onde a amostra recolhida devem conter um cristal de tiossulfato de sdio para neutralizar vestgios residuais daquele gs, o qual poderia causar a morte das bactrias porventura presentes na gua.

No caso de guas de um poo ou de guas balneares (por exemplo: rios, ribeiros, lagos, mar):

1.Evitar o contacto do bocal do frasco com as mos ou com terra/areia eventualmente existente no local da colheita;

2.Fazer a colheita, mergulhando o frasco na gua do poo ou no curso de gua, com a maior rapidez possvel;

3.Evitar colher gua da superfcie, a qual contm, por vezes, quantidade aprecivel de produtos de origem vegetal em decomposio.

A amostra a analisar deve ser colhida, no mximo, 6 horas antes da realizao da anlise, e deve ser mantida em gelo ou no frigorfico.Diluio da amostra de gua

Se for previsvel que a gua a analisar esteja muito contaminada (p. ex. guas de poos ou rios contaminadas com efluentes domsticos ou fezes de animais), esta deve ser diluda entre 10-1 e 10-3, com gua destilada estril. Tanto a amostra de gua como as suas diluies sero sujeitas a anlise de pesquisa de bactrias indicadoras.

Procedimento:

2 Passo: Aplicao da tcnica das membranas filtrantesFig. 1 - Material necessrio e esterilizao do sistema de filtrao.

A anlise bacteriolgica de rotina de guas frequentemente realizada com base na tcnica das membranas filtrantes.

O procedimento envolve:

Fig. 2 - Filtrao da gua a analisar.

1. Filtrao, sob vcuo, de um volume adequado da gua a analisar atravs de uma membrana filtrante (com porosidade controlada de 0,45 m), onde ficaro retidas clulas de possveis bactrias contaminantes (figura 2);

Fig. 3 - Colocao da membrana filtrante sobre meio slido.

2. Colocao da membrana sobre um meio de cultura seletivo para a deteo do grupo especfico de microrganismos indicadores, contido em placa de Petri (figura 3);

Fig. 4 - Membrana filtrante com colnias de bactrias.

3. Incubao da placa de Petri (s) temperatura(s) adequada(s) multiplicao celular do(s) microrganismo(s) em causa;

4. Observao e contagem das colnias formadas sobre a membrana (figura 4).

Nota: O material utilizado deve ser previamente esterilizado. O sistema de filtrao de inox esterilizado diretamente chama do bico de Bunsen. O restante material de plstico ou vidro previamente esterilizado na autoclave (*). As membranas filtrantes vm esterilizadas de origem.(*) Esterilizao pelo calor: autoclavagemA utilizao de calor em ambiente hmido um dos mtodos mais eficazes de destruio de microrganismos. A morte das clulas microbianas por ao do calor hmido resulta da desnaturao das protenas e da destabilizao da membrana citoplasmtica. Ocorre quando as clulas so sujeitas a temperaturas superiores temperatura mxima de crescimento dos microrganismos em causa.

A esterilizao por calor hmido efetuada em autoclave, que consiste numa cmara com vapor de gua saturado presso de 1 atm acima da presso atmosfrica, a que corresponde, em locais ao nvel do mar, uma temperatura de ebulio da gua de 121C. No laboratrio de Microbiologia, usual sujeitar o material a esterilizar a 121C (1 atm; presso relativa) durante 15 minutos, de modo a assegurar a morte de todas as formas de vida microbianas, incluindo a dos endsporos bacterianos, mais resistentes ao calor que as clulas vegetativas. Contudo, o tempo necessrio para se esterilizar convenientemente os materiais, a esta temperatura, depende da natureza do material a esterilizar e/ou do seu volume.

O calor hmido sob presso utilizado na esterilizao de meios de cultura que no contenham componentes termolbeis e na esterilizao de material de plstico e de vidro a utilizar nos trabalhos experimentais de Microbiologia.

3 Passo: Registo de resultados.Registo de resultados:

Legenda: 1- Recolha da amostra de gua; 2 e 3- Preparao do meio cultura; 4- Placagem das placas de Petri;

5, 6 e 7- Tcnica da membrana filtrante; 8- Incubao a 37C, 24horas.

Anlise dos resultados:

Resultado observado lupa a 21x: Membrana filtrante com colnias de coliformes.Anlise de resultados

As colnias amarelas formadas na superfcie da membrana filtrante aps incubao a 37C durante 24h, tm origem em clulas viveis de bactrias lactose - positivas (note-se que de esperar que o meio de cultura por baixo destas colnias tambm fique amarelo em resultado da sua acidificao). A contagem destas colnias fornece-nos informao sobre o nmero presuntivo de coliformes totais possivelmente presentes no volume de gua analisada. Para confirmar a contagem de coliformes totais necessrio verificar a ausncia de actividades oxidase nas bactrias presentes nestas colnias lactose - positivas, com base em teste bioqumico especfico.

Por outro lado, a presena de colnias amarelas, lactose - positivas, na membrana filtrante que foi incubada a 44.5C durante 24h, considerada indicao presuntiva da presena na gua de coliformes fecais (termotolerantes). Normalmente requer a confirmao da presena da espcie fecal Escheridria coli (E. coli).

Uma das formas de confirmar que algumas, ou todas, as colnias amarelas isoladas a 44.5C pertencem espcie E. coli, consiste em:

-Subcultivar estas colnias em meio de cultura selectivo que contm, entre outros componentes, o aminocido triptofano e o substrato fluorognico MUG ("4- methylumbelly - feryl - - D - glucuronide"). -Em seguida incuba-se as suspenses de clulas obtidas temperatura 44.5C durante 24h. -Sero contadas como colnias de E. coli, as colnias amarelas que, aps este perodo, tenham conduzido a culturas que:

1.hidrolizam o substrato MUG (em resultado da actividade da enzima -glucuronidase) com formao de um produto fluorescente, que observvel por irradiao da cultura com luz ultra-violeta; e,

2.produzem ndole a partir do triptofano (a presena de ndole na cultura revelada com reagente de KOVAC).

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