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FREQUÊNCIA DOS ALELOS HLA EM PACIENTES COM LEUCEMIA E DOS
DOADORES VOLUNTÁRIOS DE MEDULA ÓSSEA, ATENDIDOS NA FUNDAÇÃO
HOSPITALAR DE HEMATOLOGIA E HEMOTERAPIA DO AMAZONAS
MIRIAN RODRIGUES RIBEIRO SANTIAGO
MANAUS
2015
UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE HEMATOLOGIA E HEMOTERAPIA DO AMAZONAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM HEMATOLOGIA MESTRADO EM CIÊNCIAS APLICADAS À HEMATOLOGIA
MIRIAN RODRIGUES RIBEIRO SANTIAGO
FREQUÊNCIA DOS ALELOS HLA EM PACIENTES COM LEUCEMIA E DOS
DOADORES VOLUNTÁRIOS DE MEDULA ÓSSEA, ATENDIDOS NA FUNDAÇÃO
HOSPITALAR DE HEMATOLOGIA E HEMOTERAPIA DO AMAZONAS
Orientador: Prof. Dr. Daniel Saito
Co-orientadora: Profa. Dra. Aya Sadahiro
MANAUS
2015
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Hematologia da Universidade do Estado do
Amazonas em Convênio com a Fundação
Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do
Amazonas, em cumprimento a requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em
Ciências Aplicadas à Hematologia.
APRESENTAÇÃO:
Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária da Fundação Hemoam: Ana Cristina
Chagas Sena CRB-11/348
S135f Santiago, Mirian Rodrigues Ribeiro.
Frequência dos alelos HLA Classe I e II em pacientes com leucemia e doadores voluntários de medula óssea atendidos na Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas. Mirian Rodrigues Ribeiro Santiago. Manaus: UEA/FHEMOAM 2015. 72p. Ilust. Dissertação (Mestrado em Ciências Aplicadas em Hematologia) – Universidade do Estado do Amazonas e Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas. Escola de Ciências da Saúde (ESA). Orientador: Prof. Dr. Daniel Saito Co-orientadora: Profa. Dra. Aya Sadahiro 1.Leucemias, 2. Alelos HLA, 3. Suscetibilidade, 4. Resistência. I. Título.
CDU: 616.155.392
FOLHA DE JULGAMENTO
FREQUÊNCIA DOS ALELOS HLA EM PACIENTES COM LEUCEMIA E
DOADORES VOLUNTÁRIOS DE MEDULA ÓSSEA ATENDIDOS NA FUNDAÇÃO
HOSPITALAR DE HEMATOLOGIA E HEMOTERAPIA DO AMAZONAS
MIRIAN RODRIGUES RIBEIRO SANTIAGO
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em
Ciências aplicadas a Hematologia, aprovada em sua forma final pelo Programa de
Pós-Graduação em Hematologia da Universidade do Estado do Amazonas em
convênio com a Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas”.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________ Prof. Daniel Saito, Dr.
Presidente
_____________________________________ Profa. Mariane Martins de Araújo Stefani, Dra.
Membro
______________________________________ Profa. Leny Nascimento da Motta Passos, Dra.
Membro
Dedicatória
Aos meus pais, Raimundo e Graça, meus
exemplos de vida e dedicação, graças a eles
pude chegar aonde cheguei e conquistar o que
conquistei.
A meu esposo Jacob e minha filha Thalyssa
pelo apoio, dedicação e amor dedicados a
mim.
A vocês, meu AMOR, CARINHO, RESPEITO e
GRATIDÃO.
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, agradeço a DEUS, criador de TUDO e de TODOS.
Graças a ELE, pude desenvolver meus conhecimentos e aprimorar minhas aptidões
profissionais. Obrigado Deus Pai! Pela vida, saúde, vitória e, acima de tudo, pela
força, para sempre me erguer nos momentos difíceis.
Ao meu esposo Jacob e minha filha Thalyssa que sempre estiveram ao meu
lado, obrigada pelo carinho, incentivo, amor e paciência.
Aos meus pais Raimundo e Graça Ribeiro que continuam nessa mesma
filosofia e me incentivam até hoje, a eles minha eterna gratidão não só pela
formação profissional, mas pelos ensinamentos para a vida.
A minha família Ribeiro que sempre estiveram presentes dando todo o apoio
necessário para que pudesse vencer os obstáculos do dia-a-dia;
Aos meus orientadores e mestres Dr. Daniel Saito e Dra. Aya Sadahiro, pelo
apoio, disponibilidade e carinho que sempre demonstram a mim.
A todos esses professores em especial, minha gratidão, nossa convivência
durante esses anos contribuiu muito para meu crescimento profissional.
Agradeço também aos pacientes, que foram essenciais para realização
deste trabalho.
A toda equipe do Laboratório de HLA (Adriana, Lorena, Nandara e William) e
a todos os funcionários do LAC por toda ajuda dada;
A equipe do setor de estatística da Fundação HEMOAM pela ajuda no
projeto.
Enfim, a todos que contribuíram para que essa dissertação de mestrado se
tornasse uma realidade, muito obrigada.
RESUMO
O desenvolvimento das leucemias está relacionado a diversos fatores, tais
como a predisposição genética, exposição a produtos químicos e irradiação. No
Brasil, embora muitas pesquisas sobre antígenos leucocitários humanos (HLA)
associados às doenças tenham sido conduzidas, ainda existe uma grande lacuna de
conhecimentos sobre a participação do HLA nas leucemias. Por este motivo, o
presente estudo teve como objetivo a investigação da frequência dos alelos HLA
Classe I (A e B) e II (DRB1) em 177 pacientes com diagnóstico de leucemia: linfóide
aguda (LLA, n=105), mieloide aguda (LMA, n=42) e mieloide crônica (LMC, n=30) e
em 1.200 indivíduos saudáveis, atendidos na Fundação Hospitalar de Hematologia e
Hemoterapia do Amazonas (FHHEMOAM). A tipificação de HLA foi realizada pela
técnica multiplex com sondas únicas de oligonucleotídeos de sequências específicas
para alelos e grupos alélicos (PCR-SSOP). Neste estudo, os alelos HLA mais
frequentes (≥10%), tanto nos pacientes quanto nos controles, foram: A*02, A*24,
A*31, B*15, B*35, DRB1*04 e DRB1*08. Além disso, os alelos HLA-B*39 (p=0,0246;
OR=1,725; IC 95%=1,10-2,72) e HLA-B*44 (p=0,0069; OR=0,347; IC 95%=0,16-
0,75) foram associados, respectivamente, à suscetibilidade e proteção para LLA,
enquanto que o alelo HLA-A*03 (p=0,0559; OR=2,071; IC 95%=1,05-4,09) foi
associado à suscetibilidade para LMA. Os resultados obtidos sugerem que alguns
alelos HLA classe I têm participação relevante no desenvolvimento de LLA e LMA na
população-alvo do estudo.
Palavras-chave: leucemia, HLA, suscetibilidade, resistência.
ABSTRACT
The development of leukemia is related to several factors such as genetic
predisposition, exposure to chemical products and radiation. In Brazil, although a lot
of research have been conducted on the impact of human leukocyte antigens (HLA)
in a variety of diseases, there is still a huge gap of knowledge about the participation
of HLA in leukemia. In this reality, this study aimed to investigate the frequency of
HLA Class I (A and B) and II (DRB1) in 177 patients with acute lymphoblastic (ALL,
n=105), acute myeloid (AML, n=42) and chronic myelogenous (CML, n=30) leukemia,
and 1,200 healthy control subjects, all attended at the Hematology and Hemotherapy
Hospital of Amazonas Foundation (FHHEMOAM). HLA typing was performed by
multiplex polymerase chain reaction, based on sequence-specific oligonucleotide
probes (PCR-SSOP). In all, the most frequently detected alleles (≥10%), both in
patients and in controls, were A*02, A*24, A*31, B*15, B*35, DRB1*04 and DRB1*08.
In addition, alleles HLA-B*39 (p=0.0246, OR=1.725, 95% CI=1.10 to 2.72) and HLA-
B*44 (p=0.0069, OR=0.347; 95% CI=0.16 to 0.75) were associated, respectively,
with susceptibility and protection for ALL, while HLA-A*03 (p=0.0559; OR=2.071;
95% CI=1.05 to 4.09) was associated with susceptibility to AML. The results suggest
that specific HLA class I alleles have a relevant participation in the development of
ALL and AML, within the target population of the study.
Key-words: leukemia, HLA, susceptibility, resistance.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Distribuição geográfica das taxas de incidência das leucemias segundo
unidades da Federação Brasileira, a cada 100 mil habitantes para o ano de 2014. . 13
Figura 2. Distribuição das regiões HLA classes I, II e III ao longo do cromossomo 6 e
respectivos lócus gênicos.......................................................................................... 15
Figura 3. Estrutura da molécula HLA de classe I e classe II..................................... 15
Figura 4. Procedimento técnico da etapa de hibridização. ........................................ 29
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Características dos pacientes com Leucemia (LLA, LMA e LMC) e do grupo controle. .......................................................................................................... 31 Tabela 2. Frequência dos alelos de HLA-A*, em pacientes com Leucemia e suas diferentes formas clínicas (LLA, LMA e LMC) e nos controles. ................................. 34 Tabela 3. Frequência dos alelos de HLA-B*, em pacientes com Leucemia e suas diferentes formas clínicas (LLA, LMA e LMC) e nos controles. ................................. 35 Tabela 4. Frequência dos alelos de HLA-DRB1*, em pacientes com Leucemia e suas diferentes formas clínicas (LLA, LMA e LMC) e nos controles. ........................ 36
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Classificação das LLCs ............................................................................. 6 Quadro 2. Classificação da Organização Mundial de Saúde (2008) das LMAs. ........ 9 Quadro 3. Classificação Franco-Americano-Britânica (FAB) das LMAs. .................. 10 Quadro 4. Estudos em HLA, em pacientes com Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) e em controles. .......................................................................................................... 18
Quadro 5. Estudos de HLA em pacientes com Leucemia Mieloide Aguda (LMA) e em controles. ............................................................................................................. 20 Quadro 6. Estudos de HLA em pacientes com Leucemia Mieloide Crônica (LMC) e em controles. ............................................................................................................. 21
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDAS
BCR-ABL Translocação dos cromossomos 9 e 22
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
CD Cluster of Differentiation
DNA Ácido Desoxirribonucleico
DVMO Doador Voluntário de Medula Óssea
dNTP Desoxirribonucleico Trifosfato
EDTA Ácido Etileno Diamino Tetracético
EUA Estados Unidos da América
FAB-LMAs Classificação Franco-Americano-Britânico das LMAs
FHHEMOAM Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas
HLA Antígeno Leucocitário Humano
IMGT International Immunogenetics Information System
INCA Instituto Nacional do Câncer
kDa Kilo Dalton
KIR Immunoglobulin-like receptor
LLA Leucemia Linfoblástica Aguda
LLC Leucemia Linfoblástica Crônica
LMA Leucemia Mielóide Aguda
LMC Leucemia Mielóide Crônica
MHC Complexo Maior de Histocompatibilidade
mg Miligrama
mL Mililitro
NK Células Natural Killer
OMS Organização Mundial de Saúde
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
PE Ficoeritrina
RPM Rotação por minuto
SAPE Estreptavidina Conjugada com R-ficoeritrina
SSOP Sequência Específica de Sondas de Oligonucleotídeos
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TCR Receptor de Célula T
TMO Transplante de Medula Óssea
UEA Universidade do Estado do Amazonas
UFAM Universidade Federal do Amazonas
SUMÁRIO 1. INTRODUCÃO ........................................................................................................ 1
1.1 Tipos de Leucemias ........................................................................................... 2
1.1.1 Leucemia Linfóides .................................................................................................................... 2
1.1.1.1 Leucemia Linfóide Aguda ................................................................................................ 3 Linfoma não Hodgkin em fase leucêmica ................................................................ 6
Linfoma de zona marginal esplênico/Linfoma da zona marginal nodal .................... 6 1.2 Neoplasias Mieloides ......................................................................................... 7
1.2.1 Leucemia Mieloide Aguda ....................................................................................................... 8
1.2.2 Leucemia Mieloide Crônica .................................................................................................. 11 1.3. Epidemiologia das Leucemias no Brasil ......................................................... 13 1.4 Complexo Principal de Histocompatibilidade ................................................... 14 1.5 Leucemias e HLA (Antígeno Leucocitário Humano) ........................................ 16
1.5.1 HLA e LLA: ................................................................................................................................... 17
1.5.2 HLA e LMA: ................................................................................................................................. 18
1.5.3 HLA e LMC: .................................................................................................................................. 20 2. JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 23 3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 24
4. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 25 4.1 Modelo de Estudo ............................................................................................ 25 4.2 Universo de Estudo ......................................................................................... 25
4.2.1 População de Referência ....................................................................................................... 25
4.2.2 População de Estudo ............................................................................................................... 25
4.2.3 Critérios de inclusão e exclusão .......................................................................................... 26 4.3 Procedimentos ................................................................................................. 26
4.3.1 Coleta da amostra clínica....................................................................................................... 26
4.3.2 Tipificação HLA ......................................................................................................................... 27
4.3.3 Extração de DNA ....................................................................................................................... 27
4.3.4 Amplificação de DNA ............................................................................................................... 28
4.3.5 Hibridização ............................................................................................................................... 28 4.4 Interpretação de dados e análises estatísticas ................................................ 29 4.6 Considerações Éticas ...................................................................................... 30
5. RESULTADOS ...................................................................................................... 30 5.1 Características gerais e clínicas da população estudada ................................ 30
5.2 Identificação dos alelos HLA classe I e II nos pacientes com leucemias e controles saudáveis ............................................................................................... 32
6. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 39 6.1. Resultados gerais ........................................................................................... 39
6.2. Frequência alélica e análise de associação nas leucemias ............................ 40
6.2.1. Leucemia Linfóide Aguda (LLA) ........................................................................................ 41
6.2.2. Leucemia Mieloide Aguda (LMA) ...................................................................................... 43
6.2.3. Leucemia Mieloide Crônica (LMC) .................................................................................... 44 7. CONCLUSÃO ........................................................................................................ 46 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 47
9. ANEXOS ............................................................................................................... 55
1
1. INTRODUCÃO
Historicamente, a leucemia foi originalmente evidenciada há mais de 200
anos por Peter Cullen, em um caso de esplenite aguda associada ao ―sangue
leitoso‖ (CULLEN, 1811). Alguns anos após, Alfred Velpeau (1827) observou pus
nos vasos sanguíneos de um paciente, cujos sintomas eram característicos do que
seria conhecida, futuramente, como a doença leucêmica. Contudo, o
reconhecimento da leucemia como doença humana distinta somente ocorreu no ano
de 1845, quando os pesquisadores Rudolf Virchow, na Alemanha, e John Bennett e
David Craigie, na Escócia, descreveram a ―doença do sangue branco‖ (VIRCHOW,
1845; BENNETT e CRAIGIE, 1845). Esta foi, posteriormente, denominada
―leucemia‖ por Rudolf Virchow (1856), sendo este termo amplamente aceito pela
comunidade científica e utilizado até a atualidade.
As leucemias constituem o tipo mais comum de câncer em crianças e
adolescentes, sendo representadas por um conjunto de doenças caracterizadas pela
proliferação neoplásica das células brancas da medula óssea. Esta proliferação
celular, por sua vez, interfere diretamente na hematopoiese, causando
anormalidades no sangue periférico e, por vezes, infiltrando em tecidos não
hematopoiéticos. Tais alterações acarretam, habitualmente, em sangramento,
infecções e anemia, dentre outras complicações sistêmicas importantes (LORENZI,
2006).
Nos Estados Unidos, estima-se que aproximadamente 13,9 indivíduos por
100 mil habitantes desenvolverão algum tipo de leucemia, com uma taxa de morte
de 6,8 pacientes em cada 100 mil habitantes. Em números absolutos, esta
estimativa equivale um total de 54.270 novos casos (3% do total de casos de
câncer) e 24.450 mortes (4,1% do total de mortes por câncer), no ano de 2015. No
Brasil, o levantamento epidemiológico mais recente indicou um total de 11.370
novos casos e 6.187 mortes, entre homens e mulheres (INCA, 2014).
As leucemias podem ser classificadas em agudas ou crônicas, conforme a
velocidade de evolução da doença, e em linfóide ou mieloide, dependendo da
linhagem celular envolvida. Dentre os principais tipos de leucemia encontram-se:
2
leucemia linfóide aguda (LLA), leucemia linfóide crônica (LLC), leucemia mieloide
aguda (LMA), leucemia mieloide crônica (LMC) (BARION et al., 2007). Porém,
salienta-se que as leucemias diferem não apenas quanto ao seu perfil
citomorfológico, como também quanto aos aspectos clínicos, incluindo o quadro
evolutivo e a resposta ao tratamento (ZAGO et al., 2013).
Atualmente, a classificação das leucemias (bem como o seu diagnóstico e a
avaliação das terapias) é realizada por uma abordagem multifacetada. De fato,
ensaios imunofenotípicos, citogenéticos e de genética molecular vêm sendo
gradativamente utilizados, contribuindo com informações adicionais aos métodos
tradicionais e resultando em um aumento na confiabilidade do processo de
classificação (HUTCHISON e DAVEY, 2008).
Muito embora os mecanismos de origem das leucemias permaneçam, na
maioria dos casos, desconhecidos, existem evidências de que alguns fatores
possam estar associados ao risco para o desenvolvimento de variantes específicas
desta doença. Dentre eles, podemos citar a predisposição genética, a exposição à
radiação ionizante, o uso de medicamentos quimioterápicos e a exposição
ocupacional a produtos químicos, como o benzeno (INCA, 2014).
Dentre os genes já implicados como fatores de risco às leucemias, aqueles
pertencentes ao grupo Antígeno Leucocitário Humano (HLA) - sistema altamente
polimórfico e crucial durante a resposta imunológica – tendo relevância em diversas
populações do mundo (BARION et al, 2007).
Nesse contexto, estudos de associação entre HLA e leucemias também têm
sido conduzidos no Brasil, muito dos quais com resultados conflitantes, havendo
necessidade de confirmá-los com pesquisas epidemiológicas complementares.
Diante disto, descrevem-se os tipos de leucemias, alvos do presente estudo,
incluindo suas características clínicas, critérios de classificação e diagnóstico.
1.1 Tipos de Leucemias
1.1.1 Leucemia Linfóides
3
Compreendem neoplasias linfoblásticas que apresentam características
clínicas e morfológicas bastante variáveis, originárias da proliferação de linfócitos
das linhagens T, B ou natural killer (NK), em diferentes estágios de maturação
(ZAGO et al., 2013).
Deve-se considerar que as doenças proliferativas da linhagem linfoblástica
também podem estar associadas a quadros clínicos agudos ou crônicos. As
linfoproliferações agudas são denominadas leucemias linfóides agudas (LLA) e são
caracterizadas pela elevada porcentagem de blastos linfóides ou linfoblastos (>20%)
no sangue periférico e na medula óssea (LORENZI, 2006).
1.1.1.1 Leucemia Linfóide Aguda
Definição da LLA
A leucemia linfóide aguda (LLA) é uma desordem maligna de células
progenitoras linfoblásticas na medula óssea e outros órgãos, principalmente baço e
fígado, afetando tanto crianças como os adultos acima de 60 anos. É mais comum
em homens, com pico de prevalência entre as idades de 2 e 5 anos (PUI et al.,
2004; PUI, ROBINSON e LOOK, 2008; SCHUMACHER et al., 2002). Atualmente, a
taxa de cura (ausência de evidência de doença em 10 anos) é de 80% para crianças
e 40% para adultos (PUI et al., 2004).
A LLA é considerada a leucemia mais comum na infância, perfazendo 80%
dos casos. Em contrapartida, é responsável por apenas 20% das leucemias agudas
no adulto. Uma avaliação diagnóstica ampla e precisa é necessária para uma
correta avaliação prognóstica, bem como para fundamentar as decisões
terapêuticas. Ela pode ser alcançada com base na morfologia celular, citoquímica,
imunofenotipagem e, cada vez mais, nas anormalidades citogenéticas e análise de
expressão de genes híbridos resultantes de translocações (ZAGO et al., 2004).
A etiologia da LLA encontra-se estreitamente relacionada a mutações
genéticas secundárias a infecções, a ação de agentes físicos ou químicos
4
(radiações ionizantes, agentes quimioterápicos e o benzeno), sendo que uma
pequena porcentagem dos casos (<5%) está associada a presença de alguma
síndrome genética (Síndromes como de Down, de Bloom, de Nijmegen (PUI,
ROBINSON e LOOK, 2008; CRANS e SAKAMOTO, 2001).
Classificação da LLA
A classificação da LLA baseia-se em critérios morfológicos, imunofenotípicos
e citogenéticos, e tem como objetivo facilitar o diagnóstico, aumentar a
reprodutibilidade entre os estudos, identificar fatores prognósticos favoráveis e
desfavoráveis e permitir a detecção precoce da recaída da doença. Com esses
critérios, é possível identificar diferentes subgrupos prognósticos e,
consequentemente, utilizar abordagem terapêutica específica para cada um dos
subgrupos (WHO, 2012).
Em 2008, a Organização Mundial de Saúde (OMS) classificou as leucemias
linfóides agudas (LLAs) foram subdivididas em duas categorias: Leucemia/linfoma
linfoblástica T (LLLA-T) e Leucemia/linfoma linfoblástica B (LLLA-B).
A Leucemia/linfoma linfoblástica B (LLLA-B) foi subdivida em duas
subcategorias, também descrita por Swerdlow et al., 2008:
1. Leucemia/linfoma linfoblástica B associada a anormalidades genéticas
recorrentes.
2. Leucemia/linfoma linfoblástica B não categorizada nos itens anteriores.
Manifestações clínicas e Diagnóstico da LLA
As manifestações clínicas na LLA decorrem do acúmulo das células anormais
(blastos) na medula óssea impedindo a produção das células normais (hemácias,
leucócitos e plaquetas), com a diminuição dos leucócitos (glóbulos brancos)
propiciando o aparecimento de infecções; a diminuição do número de hemácias
provoca anemia, e a redução da contagem de plaquetas ocasionam sangramentos.
5
Além de outras manifestações clínicas da LLA secundárias à proliferação excessiva
das células imaturas da medula óssea (blastos), que infiltram os tecidos do
organismo, tais como: amígdalas, linfonodos, pele, baço, rins, sistema nervoso
central (SNC) e outros. Mostrando também os sinais e sintomas mais freqüentes
como a febre, adenomegalias (aumento dos gânglios), manifestações hemorrágicas,
palidez, esplenomegalia (aumento do baço) e hepatomegalia (aumento do fígado),
fadiga, e dor óssea (BARBOSA; NAKAMURA; TERRERI, 2002; RODRIGUES;
CAMARGO, 2003).
O procedimento de diagnóstico da LLA é feito por meio de punção óssea
realizada com agulha própria. Em seguida, os procedimentos de diagnóstico, que
inclui o mielograma, com a análise morfológica complementada pelos exames de
imunofenotipagem, citogenética e biologia molecular. Estas técnicas mais
específicas e sensíveis para a classificação da leucemia, com fundamental
importância para a escolha do esquema terapêutico (BRAGA; TONE; LOGGETTO,
2007).
1.1.1.2 Leucemia Linfoide Crônica
Definição da LLC
A leucemia linfoide crônica (LLC) é constituído por um grupo heterogêneo de
neoplasias formados em média por 12 diferentes patologias, tendo em comum à
origem a partir de células linfoides maduras (periféricas), que apesar de infiltrarem
os órgãos linfoides (gânglios linfáticos e baço), também estão presentes na medula
óssea e no sangue periférico. Trata-se de uma neoplasia de célula B monomórfica
de pequeno tamanho que usualmente expressam antígenos CD5 e CD23 na sua
superfície (ZAGO et al., 2013).
A Organização Mundial de Saúde (OMS) classifica a LLC entre as doenças
linfoproliferativas crônicas de células B maduras, junto do linfoma de pequenos
linfócitos (LPL). É uma leucemia freqüente nos países do Ocidente, entre a
população de caucasóides, correspondendo entre 25 a 30% de todas as leucemias.
6
É mais comum no gênero masculino (2M:1F) e acomete indivíduos idosos (média de
68 anos no diagnóstico; sendo 90% dos casos >50 anos de idade (YAMAMOTO et
al., in FIGUEIREDO et al., 2011).
Existem questões a esclarecer em relação a etiologia da doença, como a
incidência de LLC com a exposição à radiação ou a substâncias químicas
(DIGHIERO; HAMBLIN, 2008).
Classificação da LLC
A classificação das LLCs segundo a linhagem celular de origem: células B,
células T ou NK. Os critérios diagnósticos consideram as características
morfológicas, imunofenotípicas, citogenéticas e as alterações moleculares, segundo
a linhagem celular de origem (Quadro 1) (ZAGO et al., 2013).
Quadro 1. Classificação das LLCs Células B Células T ou NK
Leucemia linfoide crônica Leucemia prolinfocítica Tricoleucemia
Clássica
Variante
Linfoma não Hodgkin em fase leucêmica
Linfoma de zona marginal esplênico/Linfoma da zona marginal nodal
Linfomas foliculares Linfoma linfoplasmocítico Linfoma de células do manto Outros
Leucemia prolinfocítica
Clássica
Variante de células pequenas
Doenças linfoproliferativas de linfócitos granulares
Células T
Células NK
Sindrome de Sézary
Leucemia-Linfoma de célula T do adulto Linfomas T-periféricas Outros
Fonte: Zago et al., 2013
Manifestações clínicas e Diagnóstico da LLC
No diagnóstico a maioria dos pacientes com LLC é assintomática e a doença
é detectada em exames de rotina, com os achados mais comuns: a linfoadenopatia
generalizada, perda de peso e cansaço. Geralmente apresentam gânglios
7
pequenos, mas podem ser muito volumosos, mas ambas com consistência normal,
sendo móveis e indolores. Na metade dos pacientes é detectada a presença de
esplenomegalia sendo em geral não volumosa. Pode ocorrer a infiltração leucêmica
em todas as partes do corpo incluindo as tonsilas, meninges e pele, com os
sintomas e sinais de anemia presentes, mas raramente são intensos. Petéquias e
equimoses são raras. Observam-se infecções bacterianas com frequente
desenvolvimento de pneumonias (ZAGO et al., 2013).
Geralmente o diagnóstico da LLC se dá pelas características morfológicas
das células neoplásicas no sangue periférico e nos esfregaços de medula óssea,
entretanto, a análise da morfologia da medula óssea, gânglios linfáticos e baço são
indispensáveis para o diagnóstico. Como exame complementar, os estudos
citogenéticos e de biologia molecular podem ser necessários para se estabelecer um
correto diagnóstico (ZAGO et al., 2013).
1.2 Neoplasias Mieloides
As neoplasias mieproliferativas clonais são resultantes da mutação de uma
célula progenitora pluripotencial com capacidade, embora de maneira imperfeita, de
diferenciação e maturação para cada uma das linhagens mieloides (ZAGO et al.,
2013).
As anomalias proliferativas podem manifestar-se desde o início da doença,
encontrando-se no sangue um número elevado de células indiferenciadas,
denominadas blastos mieloides, como acontece nas leucemias mieloides agudas
(LMA), já nas leucemias mieloides crônicas (LMC) a proliferação dos granulócitos
também é evidente, mas no sangue e na medula óssea são encontradas células
maduras e há raras formas blásticas em circulação (LORENZI, 2006).
8
1.2.1 Leucemia Mieloide Aguda
Definição da LMA
A leucemia mieloide aguda (LMA) é uma doença clonal do tecido
hematopoiético caracterizada pela proliferação anormal de células progenitoras da
linhagem mieloide, eritróide, células megacariocíticas e monocíticas, ocasionando
produção insuficiente de células sanguíneas maduras normais (RUBNITZ, GIBSON
e SMITH, 2008).
A LMA representa cerca de 15-20% das leucemias agudas da infância e 90%
das leucemias agudas que ocorrem entre os adultos. Na maioria dos casos, não há
evidencia da influência de fatores genéticos e raciais, ao contrário da LLA (ZAGO et
al., 2013).
Alguns fatores de risco para o desenvolvimento desse tipo de leucemia são:
uso frequente de tabaco, tratamento prévio com quimioterápicos ou radioterapia e
desordens sanguíneas como a síndrome mielodisplásica (McKENZIE, 2005).
Classificação da LMA
Em 2008, a Organização Mundial de Saúde (OMS) publicou a classificação
das LMAs, na qual é destacada a importância das alterações citogenéticas e
moleculares nos algorítimos para o diagnóstico, resposta ao tratamento e sobrevida.
Nessa classificação, são listadas 07 (sete) categorias principais que, por sua vez,
são divididas em subcategorias (Quadro 2) (VARDIMAN et al., 2009; ZAGO et al.,
2013).
9
Quadro 2. Classificação da Organização Mundial de Saúde (2008) das LMAs. Características
Leucemia mieloide aguda com anormalidades genéticas recorrentes:
LMA com t (8; 21) (q22, q22), RUNX1-RUNX1T1
LMA com inv (16) (p13.1q22) ou t (16, 16) (P13.1; p22); CBFB-MYH11
Leucemia promielocítica aguda, com t (15, 17) (q22, q12); PML-RARA
LMA com t (9; 11) (p22, q23) MLLT3-MLL
LMA com t (6:09) (p23, q34); DEK-NUP214
LMA com inv (3) (q21q26.2) ou t (3,3) (q21; q26.2); RPN1-EVl1
LMA (megacarioblástica) com t (1:22) (p13, q13); RBM15-MKL1
LMA com NPM1 mutado
LMA com CEBPA mutado
Leucemia mieloide aguda com alterações relacionadas à mielodisplasias
Neoplasias mieloides relacionadas à terapia
Leucemia mieloide aguda não especificada nos itens anteriores:
LMA com diferenciação mínima
LMA sem maturação
LMA com maturação
Leucemia mielomonocítica aguda
Leucemia monocítica e monoblástica aguda
Leucemia eritróide aguda
Leucemia megacarioblástica aguda
Leucemia a basófilos aguda
Panmielose aguda com mielofibrose
Sarcoma mieloide
Proliferações mieloides relacionadas à Sindrome de Down
Mielopoiese anormal transitória
Leucemia mieloide associada com a síndrome de Down
Neoplasia blástica de células dendríticas plasmocitóides
Fonte: Zago et al., 2013 (Adaptado de VARDIMAN et al., 2009).
10
A classificação Franco-Americano-Britânica (FAB) das LMAs (subtipos) tem
como base as características morfológicas e citoquímicas, para a determinação da
linhagem e do grau de maturação das células blásticas. A LMA apresenta-se com
uma variedade de tipos de células que podem ser observados no sangue periférico e
na medula óssea (Quadro 3) (HAMERSCHLAK, 2008; ZAGO et al., 2013).
Quadro 3. Classificação Franco-Americano-Britânica (FAB) das LMAs. Subtipos de LMA Características
M0 LMA sem diferenciação morfológica
M1 LMA com mínima diferenciação morfológica
M2 LMA com diferenciação (componente monocítico < 20%)
M3 LMA promielocítica hipergranular
LMA variante hipogranular
M4 LMA mielomonocítica (células monocíticas ≥ 20%)
M5 LMA monocítica (com células monocíticas ≥ 20% das células
leucémicas)
M5a LMA monoblástica (sem diferenciação, blastos ≥ 80%)
M5b LMA monocítica (com diferenciação, blastos < 80%)
M6 Eritroleucemia
M7 LMA megacarioblástica
Fonte: Zago et al., 2013 (Adaptado de VARDIMAN et al., 2009).
Manifestações clínicas e Diagnóstico da LMA
Na sua totalidade os casos, o diagnóstico de LMA inicia-se a partir de uma
suspeita clínica com características que incluem: palidez, hepatomegalia,
esplenomegalia, linfadenopatia, febre em consequência de infecções, faringite,
petéquias e outras manifestações hemorrágicas, dor óssea, hipertrofia gengival,
lesões cutâneas. No Geral, os exames de laboratório apresentam no hemograma a
contagem de plaquetas e hemoglobinas baixas, contagem de leucócitos com
variação de <1.000/μL a 200.000/μL, contagem diferencial de células brancas
anormais com neutropenia e presença de blastos, anemia normocrômica e
normocítica, trombocitopenia podendo ser severa, baseando-se na avaliação do
sangue periférico e da medula óssea (BAIN, 2003).
11
1.2.2 Leucemia Mieloide Crônica
Definição da LMC
A leucemia mieloide crônica (LMC) é uma doença maligna de expansão clonal
da célula progenitora hematopoiética que ocorre principalmente na quarta e quinta
décadas de vida. A existência da translocação em 90% dos pacientes pode ser
facilmente diagnosticada por cariotipagem. Esta alteração da translocação de t
(9;22) (q34;q11) resulta na formação do cromossomo Philadelphia (cromossomo Ph
ou Ph+). Dois genes fundidos (BCR e ABL) codificam a proteína de fusão P210 com
uma elevada atividade tirosino-quinase que tem um papel importante na patogenia
da LMC (AMIRZARGAR et al., 2007).
A LMC era fatal na década de 1980, apresentando sobrevida média de 48
meses. Porém, o surgimento das técnicas de transplante de medula óssea (TMO)
permitiu que alguns doentes atingissem a cura. Atualmente, o uso da terapia
molecular com a inibição da proteína tirosino-quinase tem promovido um
prolongamento importante da sobrevida dos pacientes (CHAUFFAILLE, 2010).
A incidência da LMC é de um a dois casos para cada 100 mil habitantes por
ano, representando cerca de 15% de todas as leucemias. Achados mostram que a
mediana de idade ao diagnóstico é de 55 a 60 anos, com menos de 10% dos casos
em pacientes com menos de 20 anos (TEFFERI et al., 2005). Ultimamente, houve a
diminuição do número de indivíduos acometidos com idade superior a 60 anos, o
que se sugere que muitos dos relatos da literatura sejam de estudos clínicos que
excluíram os pacientes mais idosos (BORTOLHEIRO e CHIATONE, 2008).
Classificação da LMC
A classificação da LMC é de acordo com os exames clínicos e de laboratório
definindo em fases: fases inicial crônica, acelerada duradoura e final aguda. Na
última fase, pode ocorrer a crise blástica, sendo esta considerada a mais grave
(DOBBIN e GADELHA, 2002; LOPES e ABREU, 2009).
12
Manifestações clínicas e Diagnóstico da LMC
A LMC é inicialmente de progressão lenta; sendo assim, a especificidade do
tratamento para estes pacientes é importante, uma vez que esta doença pode
evoluir para as fases acelerada e aguda, arriscando a vida do paciente (LOPES e
ABREU, 2009).
De acordo o protocolo de condutas do Instituto Nacional do Câncer (INCA,
2002), a evolução clínica da LMC apresenta as seguintes fases, podendo ser o
diagnóstico dado em qualquer uma delas:
Na fase crônica da LMC, com duração mediana entre 3 a 5 anos, as
manifestações clínicas incluem sintomas constitucionais como fadiga, perda de
peso, sudorese, febre e os achados ao exame clínico de palidez e esplenomegalia,
sendo que a intensidade das manifestações clínicas depende do volume da doença
existente. Os exames de laboratório apresentam leucocitose que é caracterizada por
marcada hiperplasia medular e capacidade de maturação das células mieloides.
A fase acelerada da LMC tem duração de alguns meses e caracteriza-se por
resistência terapêutica citorredutora, aumento da esplenomegalia, basofilia e número
de células blásticas, trombocitose ou trombocitopenia, mielofibrose, sendo que
nessa fase os pacientes podem ser assintomáticos ou pode apresentar febre,
sudorese noturna, perda de peso e dores ósseas, o paciente é resistente à terapia
medicamentosa, tendo por características a evolução clonal citogenética e, no
sangue periférico, ≥15% de blastos, ≥30% de blastos e pró-mielócitos, ≥20% de
basófilos e, não relacionado à quimioterapia, <100.000 plaquetas/mm3 .
Finalmente, na fase blástica da LMC é comum a presença de febre,
sudorese noturna, anorexia, perda de peso e dores ósseas. Trata-se de uma fase
agressiva, com quadro clínico da leucemia aguda e permitindo ao doente uma
sobrevida muito curta com expectativa de sobrevida sem tratamento é de 3 a 6
meses após o início da crise blástica, caracterizada por ≥ 30% de blastos no sangue
periférico ou na medula óssea, seja por infiltrado extramedular de células blásticas.
13
1.3. Epidemiologia das Leucemias no Brasil
Assim como ocorre em vários países desenvolvidos, não se conhece o
número real de casos novos de câncer diagnosticados a cada ano pelos serviços de
saúde no Brasil, devido à ausência de um sistema de registro que cubra todo o
território nacional (LEITE, 2012).
Em relação aos registros brasileiros, as estimativas anuais de incidência
continuam apresentando grande importância, pois, de acordo com dados do Instituto
Nacional do Câncer, para o ano de 2014, foram estimados 5.050 casos novos de
leucemia em homens e 4.320 em mulheres que corresponderiam a um risco de 5
casos novos/100 mil homens e 4/100 mil mulheres (Figura 1) (INCA, 2014).
Segundo os dados do mesmo Instituto, na região Norte, a leucemia em
homens é a quinta neoplasia mais freqüente (3 casos/100 mil habitantes) e o sétimo
mais frequente em mulheres (2 casos/100 habitantes), excluindo-se os casos de
tumores da pele não-melanoma. No Estado do Amazonas, foi estimada uma taxa
bruta de 3,65 casos em 100 mil homens e 2,31 casos em 100 mil mulheres (INCA,
2014).
Figura 1. Distribuição geográfica das taxas de incidência das leucemias segundo unidades da Federação Brasileira, a cada 100 mil habitantes para o ano de 2014.
Fonte: MS/INCA, 2014.
14
1.4 Complexo Principal de Histocompatibilidade
O Complexo Principal de Histocompatibilidade ou ―Major Histocompatibility
Complex‖ (MHC) representa o conjunto de genes responsável por codificar as
moléculas de histocompatibilidade em uma determinada espécie, sendo chamado no
ser humano de sistema Antígeno Leucocitário Humano ―Human Leukocyte Antigen‖
(HLA), o qual é controlado por genes do braço curto do cromossomo seis (6p.21.3) e
apresenta um número excepcionalmente grande de genes, os quais são agrupados
em três regiões (SHANKARKUMAR, 2004).
Os genes do sistema HLA são altamente polimórficos, isto é, possuem alta
variabilidade alélica. A maioria dos genes do HLA codificam proteínas envolvidas no
sistema Imune (http://hla.alleles.org/). O HLA pode ser dividido em três classes: I, II e
III, sendo que os de classes I e II estão diretamente envolvidos na apresentação de
peptídeos aos linfócitos T. Além disso, as moléculas de HLA apresentam diferenças
estruturais e funcionais importantes. A distribuição e organização dos genes de HLA,
no braço curto do cromossomo 6, podem ser observadas na Figura 2 (KLEIN e
SATO, 2000).
A molécula de HLA classe I é formada por duas cadeias polipeptídicas ligadas
não-covalentemente: a cadeia mais pesada, de 44 kDa a 47 kDa, e a cadeia 2-
microglobulina de 12 kDa (Figura 3). Somente a cadeia é transmembrana. O HLA
de classe I está presente na maioria das células somáticas, embora o nível de
expressão dessas moléculas possa ser diferente dependendo do tecido. A molécula
de HLA classe I participa do processo de apresentação de antígenos citosólicos aos
linfócitos T citotóxicos (CD8) (KLEIN e SATO, 2000).
A molécula de HLA classe II é composta por duas cadeias polipeptídicas
ligadas não covalentemente, a cadeia de 32 kDa a 34 kDa e a cadeia de 29 a 32
kDa, sendo que as duas apresentam domínios transmembrana (Figura 3). O HLA
classe II, normalmente está presente na superfície de células que incluem: células
dendríticas, macrófagos, linfócitos B, linfócitos T ativados e células do epitélio tímico,
15
sendo que as três primeiras células atuam como apresentadoras de antígenos
endocíticos aos linfócitos T helper (CD4) (KLEIN e SATO, 2000).
Figura 2. Distribuição das regiões HLA classes I, II e III ao longo do cromossomo 6 e respectivos
lócus gênicos.
Fonte: Klein e Sato, 2000.
Figura 3. Estrutura da molécula HLA de classe I e classe II.
Fonte: Klein e Sato, 2000.
16
Conforme a última estatística realizada pelo Banco de Dados do projeto
Internacional em Imunogenética (IMGT/HLA) em colaboração com o ―European
Bioinformatics Institute‖, mais de 12.672 variantes alélicas já foram identificadas até
o momento nestes múltiplos loci MHC humanos (HLAs), incluindo cerca de 9.437 de
classe I e 3.105 de classe II (IMGT/HLA Database).
A variabilidade observada nos genes HLA, que cresce continuamente pela
descoberta de novos alelos, têm como resultante a codificação de proteínas que
diferem umas das outras em um ou mais resíduos de aminoácidos, resultando em
funcionalidades distintas com implicações diretas na dinâmica do sistema
imunológico como, por exemplo, na compatibilidade doador-receptor nos
transplantes heterólogos de órgãos (VOLTARELLI, PASQUINI e ORTEGA, 2009).
1.5 Leucemias e HLA (Antígeno Leucocitário Humano)
As leucemias fazem parte de um grupo importante de doenças
hematopoiéticas que, apesar de constituírem alvo de diversos estudos científicos,
ainda exigem investigações complementares, para se elucidarem aos seus
verdadeiros mecanismos etiológicos. Dentre estes estudos, os imunogenéticos têm
obtido especial atenção, uma vez que a interação entre as moléculas do sistema
imune e as células neoplásicas pode ter um papel importante na gênese destas
enfermidades (BARION et al, 2007).
Pelo fato dos genes do sistema HLA serem altamente polimórficos, análises
das associações entre estes e as diferentes variantes de leucemia, em diferentes
raças ou grupos étnicos, são especialmente importantes, na medida em que
possibilitam uma definição mais clara quanto à distribuição da doença na população
humana, possibilitando, também, o estabelecimento abordagens terapêuticas mais
específicas no futuro a médio prazo (GHODKE et al., 2005).
A vigilância imunológica contra as células tumorais depende do
reconhecimento de antígenos, no contexto do HLA classe I, por linfócitos T
citotóxicos via receptor da célula T (TCR) e por células Natural Killer (NK), via
receptores KIR (immunoglobulin-like receptor). Ademais, sabe-se que, para
17
respostas envolvendo ação de células T helper, são necessárias as moléculas de
HLA classe II (GUILLAUME e MAROLLEAU, 2013). Assim, não se descarta a
possibilidade de os genes HLA classe I e II estarem diretamente envolvidos no
desenvolvimento das leucemias.
1.5.1 HLA e LLA:
Em estudos realizados sobre LLA, no período de 1996 a 2011 (Quadro 4),
três associaram HLA-DRB1*04 ao desenvolvimento das leucemias. Em
contrapartida, em dois outros estudos, HLA-DRB1*13 foi associado à proteção à
doença. Esses dois alelos pertencem ao HLA classe II e, certamente, respostas
imunológicas envolvendo apresentação de peptídeos (próprios ou não) aos linfócitos
T devem participar na regulação da doença, tanto para um maior risco à LLA, como
para proteção à mesma.
Barion et al. (2007) conduziram uma investigação em uma população
brasileira de etnia mista, a partir da qual foi possível observar os alelos HLA classe I
HLA-B*45 e HLA-B*56 em associação à LLA (Quadro 4). Similarmente, Fernandes
et al. (2010) desenvolveram estudo, em indivíduos brasileiros, constituído por
pacientes com leucemias agudas. Os autores sugeriram que o alelo HLA-DRB1*07
confere suscetibilidade à LMA e HLA-DRB1*03, à LLA, e o alelo HLA-DRB1*04
confere proteção à LLA. Os mesmos alelos HLA de classe I também foram
associados positivamente à LLA e LMA, no trabalho realizado por Mundhada et al.
(2004), numa população mista dos EUA.
Orgad et al. (1988), em estudo com crianças judias diagnosticadas com LLA,
sugeriu a existência de possível associação entre antígenos HLA e leucemia, a partir
da observação de frequências mais elevadas de HLA-A30 em pacientes doentes,
sugerindo suscetibilidade, e mais baixas de HLA-B14, sugerindo proteção à LLA.
NG et al. (2006), em um estudo em crianças chinesas, encontrou uma
correlação significativa entre os antígenos HLA e LLA, onde HLA-A33 (p=0,006) e
HLA-B17 (p<0,001) apresentaram correlação estreita com a presença de leucocitose
elevada. Similarmente, Gao et al. (2005) demonstraram que os alelos HLA-A*26,
18
B*56 e DRB1*09 parecem contribuir para a suscetibilidade genética à LLA. No
entanto, os alelos HLA-A*30, A*33 e B*58 parecem ter papel protetor.
Luo et al. (2008), em estudo na população de uma província chinesa, com
leucemias (LMC e LLA) na população chinesa de Han na província de Hunan,
observaram que os alelos HLA-B*58, DRB1*12, DRB1*14 parecem contribuir para a
suscetibilidade genética de pacientes com LMC, enquanto que HLA-B*58 pode estar
associado à suscetibilidade genética à LLA. Tais resultados corroboram os de Wang
et al. (2009), no qual se evidenciou o alelo HLA-DRB1*15 como um dos fatores de
risco à LLA em crianças chinesas.
Quadro 4. Estudos em HLA, em pacientes com Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) e em controles.
Autor (es) Ano Local Alelo HLA Caso (n) Controle (n) P
Valor
Dorak et al. 1999 País de
Gales DRB1*04 47/114 96/325 0,029
Dorak et al. 2002 Turquia DRB1*04 41/86a
13/57a
0,003
DRB1*13 11/86a
18/57a
0,010
Barion et al. 2007 Brasil B*45 c
3/35 72/2.472 0,020b
B*56c
1/35 20/2.472 0,030b
Fernandes et al. 2010 Brasil DRB1*03 6/15 13/100 0,008
Ozdilli et al. 2010 Turquia A*23 18/110 8/100 0,050
B*07 6/110 14/100 0,035
DRB1*04 38/110 20/100 0,019
Uçar et al. 2011 Turquia A*11 18/103 29/360 0,010
DRB1*01 20/103 27/360 0,001
DRB1*13 19/103 129/360 0,003
a Análise de pacientes portadores de LLA somente do sexo masculino.
b HLA associado à proteção à LLA.
c Análise estatística corrigida pelo número de antígenos testados.
1.5.2 HLA e LMA:
Nos estudos sobre LMA, os alelos HLA associados à doença foram distintos
em cada população (Quadro 5) e dois deles, HLA-B*07 e HLA-DRB1*11, que
haviam sido associados à suscetibilidade à LMA, apresentaram evidências de
19
proteção à LLA (Quadro 4) e observada em outros estudos com leucemia. A
identificação dos subtipos desses alelos seria fundamental para que fosse possível
conhecer o alelo específico associado às condições de risco e proteção, bem como
o papel dos mesmos na imunobiologia das leucemias.
Sarafnejad et al. (2006) estudaram as freqüências alélicas HLA classe II em
pacientes LMA iranianos, observando uma associação positiva significativa entre a
doença e o alelo HLA-DRB1*11 (p=0,033). Sugere-se, portanto, que este constitui
um fator de predisposição genética à doença. Por outro lado, o alelo HLA-DRB4
mostrouse significativamente diminuídos nos pacientes, sugerindo conferir proteção
à mesma.
O alelo HLA-B*07 foi previamente associado à suscetibilidade a LMA em uma
população do Brasil de etnia mista (BARION et al., 2007). Ainda neste contexto,
outros genes investigados, e que devem estar envolvidos diretamente ao HLA, são
os genes que codificam para o KIR (immunoglobulin-like receptor), presentes em
células NK, os quais também são altamente polimórficos (BABOR et al., 2013).
Estas células possuem fundamental papel no combate às células neoplásicas
(ABBAS, LICHTMAN e PILLAI, 2012).
No entanto, tem sido demonstrado que a ação das células NK no sangue
periférico de pacientes com leucemias é significativamente reduzida (COSTELLO et
al., 2002; FAURIAT et al., 2007; BABOR et al., 2013). Uma das explicações seria o
aumento expressivo das moléculas de MHC de classe I nas células blásticas
leucêmicas, ou a reduzida expressão dos receptores ativadores nas células NK
(NOWBAKHT et al., 2005).
20
Quadro 5. Estudos de HLA em pacientes com Leucemia Mieloide Aguda (LMA) e em controles.
Autor (es) Ano Local Alelo HLA Caso (n) Controle (n) P
Valor
Barion et al. 2007 Brasil B*07 12/50 286/2472 0,01a
Khosravi et al. 2007 Irã DRB1*11 42/120 88/360 0,033
Fernandes et al. 2010 Brasil DRB1*07 13/30 20/100 0,01
Ozdilli et al. 2010 Turquia A*11b
4/90 14/100 0,027
B*11b
2/90 10/100 0,036
B*49 12/90 5/100 0,044
DRB1*15 23/90 13/100 0,027
Uçar et al. 2011 Turquia A*03 42/268 74/720 0,019
B*51 52/268 82/720 0,001
a Os autores utilizaram probabilidade corrigida pelo número de antígenos testados.
b HLA associado a proteção.
c Valor P corrigido.
1.5.3 HLA e LMC:
Na LMC, o HLA-DRB1*04 foi associado à doença (Quadro 6), assim como
observado na LLA em três populações investigadas (Quadro 4). No entanto, o
subtipo HLA-DRB1*0405 foi mais frequente nos controles, sendo associado à
proteção a LMC (Quadro 5). Estes resultados podem ser atribuídos às diferenças
nas frequências desses alelos de HLA-DRB1*04 em populações distintas e pelo fato
deste HLA ter mais de 200 subtipos já descritos no mundo (IMGT/HLA Database).
Estudos de frequência dos alelos HLA têm demonstrado que o HLA-DRB1*04
está entre os mais frequentes na população brasileira (VISENTAINER et al., 1997;
MONTE et al., 2004; BARION et al., 2007). Da mesma forma, em levantamento
realizado por Sacramento et al. (2011) em 1.200 candidatos a doadores de medula
óssea, identificou-se que HLA-DRB1*04 está entre os alelos mais frequentes na
população residente no Estado do Amazonas. Outro alelo frequente em pacientes
LMC na população brasileira é HLA-B*45 (Quadro 5), que também apresentou
resultados significativos de associação à LLA, com os valores de probabilidade
corrigidos (Quadro 3).
21
O número avaliado de pacientes com a presença do HLA-B*45 foi muito
pequeno, sugerindo a necessidade de estudos adicionais com a inclusão de mais
casos para confirmar os resultados. Por outro lado, o alelo HLA-B*45 está entre
aqueles com frequência menor que 1% (SACRAMENTO et al., 2011).
Quadro 6. Estudos de HLA em pacientes com Leucemia Mieloide Crônica (LMC) e em controles.
Autores Ano Local Alelo HLA Caso (n) Controle (n) P
Valor
Yasukawa et al. 2000 Japão DRB1*0405b
6/50 40/127 0,005
Rosas-Cabral et al. 2003 México DRB1*14 2/63 2/746 0,03
DRB1*03 13/63 62/746 0,000
Oguz et al. 2003 Turquia B*35b
45/169 86/213 <0,01
B*37 12/169 3/213 <0,01
DRB1*11b
62/169 103/213 <0,05
Barion et al. 2007 Brasil B*45 7/78 72/2472 0,01a
DRB1*04 30/77 562/2472 0,002a
DRB1*08 16/77 247/2472 0,004a
a Os autores utilizaram probabilidade corrigida pelo número de antígenos testados.
b HLA associado à proteção.
Chhaya et al. (2006) investigou pacientes indianos diagnosticados
clinicamente com LMC com idade entre 17 a 54 anos e revelou que os indivíduos
que expressam HLA-A3, -B8, -DR4 tem risco diminuído para o desenvolvimento de
LMC, em populações caucasianas. Na distribuição dos antígenos HLA de classe I,
as diferenças para o HLA-A11 (p(C)=0,351) e DRB1*13 (p(C)=0,403) não
permaneceram significativas após a aplicação de um fator de correção para o valor
p. Estes resultados sugerem que o desenvolvimento de LMC está aparentemente
associada a fenótipos HLA específicos para cada população.
Num estudo incluindo a população canadense, os pesquisadores Naugler e
Liwski (2009), investigaram a associação dos alelos HLA em pacientes com LMC e
concluíram que HLA-B*13 (OR=4,92), HLA-B*55 (OR=4,50) e HLA-DRB1*16
(OR=4,07) eram marcadores de risco para a doença. Não se observou, contudo,
quaisquer alelos associados à proteção.
22
Um estudo realizado por Wang et al. (2014), na população chinesa, mostrou
relevante associação entre HLA e leucemias. Para tanto, avaliaram as categorias
clinicas de leucemias, incluindo LLA, LMA, LMC e observaram relação negativa
entre LLA e DRB1*09, o que pode desempenhar um papel importante por uma
resposta imunitária de células T restrita na gênese da leucemia, ao passo que a
relação positiva entre LMC e HLA-B*18 sugere não ativar antígenos específicos
presentes na leucemia resultando em escape imunológico.
Em outra investigação, sugerindo que determinados alelos HLA podem estar
associados com a patogênese da LMC na população chinesa, os pesquisadores
Zhang et al. (2011) demonstraram que os alelos HLA-A*11, A*74, B*40, B*47, B*55
e B*81 foram correlacionados com o risco crescente de LMC, porém o alelo
DRB1*13 confere proteção genética à doença.
1.6 Registros de doadores e receptores de Medula óssea no Brasil
A existência dos Bancos de registros de doadores e receptores no Brasil tem
sua grande importância para busca de doadores compatíveis com receptores para o
Transplante de Células-Tronco Hematopoéticas (TCTH), para isso criou-se em 1993,
o Registro Nacional de Doadores de Medula Óssea (REDOME/SP), e em 1999 no
INCA/RJ, ampliou-se a aplicação de recursos específicos na busca de doadores não
aparentados de medula óssea que não possuía doador compatível na família. De
acordo com o INCA, existem mais de 4.000 milhões de doadores cadastrados,
classificando o Redome como o terceiro maior banco público de doadores de
medula óssea do mundo, reunindo todos os dados dos voluntários à doação para
pacientes que não possuem um doador na família (INCA, 2014)..
No Redome incluem-se 300 mil novos doadores/ano, onde a probabilidade de
se identificar um doador aumenta se o doador e o paciente possuem a mesma
origem étnica ou racial, para isso o INCA criou o Registro Nacional de Receptores
de Medula Óssea (REREME), a fim de organizar o cadastro de pacientes, para os
quais a única alternativa de cura da doença imuno-hematológicas para o TCTH
(INCA, 2014).
23
2. JUSTIFICATIVA
No Estado do Amazonas há poucos registros de investigação científica sobre
as leucemias, principalmente, no que se refere aos aspectos imunológicos da
doença. Neste aspecto, a proposta de realizar um estudo sobre a frequência dos
Antígenos Leucocitários Humanos (HLA) nos pacientes com leucemias, foi
considerada relevante, nas quais foi estimulada pelas evidências científicas
nacionais e internacionais sobre os estudos com peptídeos ligantes as moléculas do
HLA e que podem estar diretamente ou indiretamente associadas ao
desenvolvimento das leucemias. Neste contexto, decidiu-se investigar a frequência
dos alelos HLA classe I (A e B) e classe II (DRB1) nas leucemias (LLA, LMA e LMC),
em pacientes atendidos na Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas.
O estudo visa, em última instância, contribuir para a identificação dos marcadores
imunogenéticos que possam estar associados às leucemias, além de investigar o
perfil dos alelos HLA em doadores de sangue/medula óssea saudáveis na
população amazonense, possibilitando um melhor entendimento dos fatores
envolvidos na imunobiologia das leucemias.
24
3. OBJETIVOS
Objetivo geral:
Avaliar a frequência dos alelos HLA Classe I e II em pacientes com
diagnóstico de leucemia e em doadores saudáveis, atendidos na FHHEMOAM.
Objetivos específicos:
- Determinar a frequência dos alelos HLA classe I (A e B) em pacientes portadores
de LMA, LMC e LLA e em doadores voluntários de medula óssea saudáveis
(DVMO);
- Determinar a frequência dos alelos HLA classe II (DRB1) em pacientes portadores
LMA, LMC e LLA e em DVMO;
- Comparar as frequências dos alelos HLA identificados nos pacientes leucêmicos
e nos DVMO;
- Identificar os possíveis alelos associados à suscetibilidade ou à resistência ao
desenvolvimento de LMA, LMC e LLA.
25
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Modelo de Estudo
Este é um estudo do tipo transversal descritivo, em perídodos retrospectivo e
prospectivo realizado em pacientes com diagnóstico de leucemia (LMA, LMC e LLA)
que procuraram a Fundação HEMOAM e que concordaram em participar do estudo,
após prévia explicação deste por um responsável.
4.2 Universo de Estudo
4.2.1 População de Referência
O presente estudo teve como alvo os pacientes com diagnóstico de leucemia
atendidos na Fundação HEMOAM, na cidade de Manaus/Amazonas.
4.2.2 População de Estudo
A população de estudo foi constituída de 180 pacientes portadores de
leucemias encaminhados ao Ambulatório da Fundação HEMOAM, instituição de
referência para elucidação diagnóstica de doenças benignas e malignas do sangue.
Para o estudo retrospectivo, foram incluídos pacientes atendidos no período de
janeiro de 2011 a agosto de 2013. Para o estudo prospectivo, foram incluídos
pacientes atendidos no período de setembro de 2013 a dezembro de 2014 por
outros serviços de saúde ou por outros especialistas em hematologia.
Características gerais e clínicas dos casos antigos e casos novos de leucemia
atendidos na Fundação HEMOAM foram obtidas dos prontuários médicos e
compiladas num banco de dados. A população do estudo prospectivo foi contatada
para assinar o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) para inclusão no
estudo.
26
O grupo controle foi constituído de 1200 voluntários saudáveis, doadores de
sangue e medula óssea, atendidos na Fundação HEMOAM (fevereiro de 2009 a
dezembro de 2010), os quais assinaram o TCLE. Características gerais (variáveis)
foram obtidas do software Redomeweb do Instituto Nacional do Câncer (INCA).
4.2.3 Critérios de inclusão e exclusão
Foram incluídos pacientes com diagnóstico de leucemia (LMA, LMC e LLA)
com indicação para o transplante de medula óssea, de ambos os sexos, com faixa
etária de 6 meses a 70 anos, atendidos na Fundação HEMOAM de 2011 a 2014.
Pacientes com diagnóstico de leucemia e outras comorbidades e indígenas foram
excluídos.
Para inclusão dos pacientes no estudo, estes foram submetidos a avaliação
no ambulatório médico e foram solicitados os exames complementares para
confirmação do diagnóstico leucemia: exames hematológicos (hemograma,
mielograma, imunofenotipagem de leucócitos e análise citogenética), além de
exames bioquímicos e sorológicos. Para imunofenotipagem de leucócitos, foi
utilizado um painel de anticorpos como marcadores celulares para a identificação do
tipo de leucemia, principalmente para as variantes agudas (LLA ou LMA). Nos
exames citogenéticos, a presença da mutação do cromossomo Filadélfia constituiu
sinal patognomônico para o diagnóstico de LMC.
4.3 Procedimentos
4.3.1 Coleta da amostra clínica
Os pacientes portadores de leucemia encaminhados ao Laboratório de HLA
para realização da tipagem de HLA receberam orientação sobre a rotina dos exames
para o transplante de medula óssea e seguiram o protocolo de atendimento do
Departamento de Análises Clínicas da Fundação HEMOAM. Já os doadores
voluntários de sangue receberam orientação sobre a doação de medula óssea. Em
27
ambos os casos, após a explicação do projeto por um profissional responsável e da
assinatura do TCLE pelo participante (pacientes ou DVMO), foi obtida uma amostra
de sangue de 5 mL por punção venosa colhida em tubo a vácuo contendo
anticoagulante EDTA (Vacutainer®) para realização da tipificação HLA, sendo esta
devidamente armazenada até a sua análise.
4.3.2 Tipificação HLA
Os pacientes e doadores do estudo foram tipificados no Laboratório de HLA
da Fundação HEMOAM. Para os alelos HLA Classe I (A, B), e para os alelos HLA
Classe II (DRB1). As tipificações HLA de Classe I e II dos pacientes e doadores
foram realizadas com o kit LabType SSO, utilizando-se sondas de oligonucleotídeos
de sequência específica (SSO) ligados à microesferas marcadas fluorescentemente.
Para tanto, utilizaram-se marcadores para os genes HLA de classe I e II dos loci A,
B e DRB1, conforme a nomenclatura de HLA mais recente: A*01, A*02, A*03, A*11,
A*15, A*18, A*23, A*24, A*25, A*26, A*29, A*30, A*31, A*32, A*33, A*34, A*36,
A*43, A*66, A*68, A*69, A*74, A*80, B*07, B*08, B*13, B*14, B*15, B*18, B*27,
B*35, B*37, B*38, B*39, B*40, B*41, B*42, B*44, B*45, B*46, B*47, B*48, B*49,
B*50, B*51, B*52, B*53, B*54, B*55, B*56, B*57, B*58, B*59, B*62, B*67, B*73,
B*78, B*81, B*82, B*83, DRB1*01, DRB1*03, DRB1*04, DRB1*07, DRB1*08,
DRB1*09, DRB1*10, DRB1*11, DRB1*12, DRB1*13, DRB1*14, DRB1*15, DRB1*16.
4.3.3 Extração de DNA
A extração foi realizada a partir do sangue total dos pacientes e voluntários. O
DNA genômico foi extraído pelo kit IllustraTM Blood GenomicPrep Mini Spin (GE
Health Care), com modificações. Para a extração, adicionaram-se 200µL de sangue
total a 20µL de Proteinase K em um microtubo de 1,5 mL. Em seguida, adicionaram-
se 400 µL de solução de lise, homogeneizando-se em vórtex por 15 s. Após um
período de incubação de 10 min em temperatura ambiente (sob ação de vórtex a
cada 3 minutos), o tubo foi centrifugado a 14000 rpm. Em seguida, o material foi
transferido a um frasco com coluna e novamente centrifugado, por 1 min, a 14000
28
rpm. Após esta centrifugação, o conteúdo do tubo foi descartado e 400 µL da
solução de lise foram adicionados, sendo a mistura submetida a nova centrifugação.
O conteúdo do tubo foi descartado e 500 µL de tampão de lavagem foram
adicionados. Esta solução foi então centrifugada por 3 minutos, a 14000 rpm, e o
conteúdo do tubo foi descartado. Em seguida, a coluna foi transferida para um novo
tubo, com a identificação do paciente/doador. Foram adicionados 130 µl de água
ultrapura a 70º C e a solução foi submetida à centrifugação, por 1 minuto, a 14000
rpm. Por fim, a coluna foi descartada e o frasco com o filtrado foi guardado a -20º C
para o diagnóstico molecular.
4.3.4 Amplificação de DNA
O DNA previamente extraído foi submetido à Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR), conforme as seguintes condições: 1,5 µL de DNA, 2,0 µL de
primers HLA A, B e DRB1, 6,9 µL de D-mix (Tris-HCl, KCl, MgCl2 e desoxinucleotídio
trifosfato - dATP, dCTP, dGTP, dTTP) e 0,1 µL de Taq polymerase (Invitrogen Life
Technologies). A reação foi conduzida em um termociclador Veriti 9200 (Applied
Systems) conforme o seguinte ciclo de temperatura: desnaturação inicial do DNA a
96ºC, seguida de 36 ciclos de: desnaturação a 96ºC, anelamento de primers a 60ºC,
elongação a 72ºC. Por fim, realizou-se uma extensão final e resfriamento a 4ºC.
4.3.5 Hibridização
A primeira etapa da hibridização correspondeu à desnaturação do DNA. Para
isso, adicionaram-se 2,5 µL do produto da PCR (DNA previamente amplificado) em
1,25 µL do tampão de desnaturação. Nesta etapa, o produto da reação permaneceu
em temperatura ambiente por 10 minutos. Após o período de incubação,
adicionaram-se 2,5 µL do tampão de neutralização. O produto da PCR desnaturado
foi submetido à hibridização com sondas complementares ao DNA-alvo, marcadas
fluorescentemente e aderidas à superfície de microesferas (beads). Para tanto,
alíquotas separadas do DNA foram misturadas a 2,0 µL de beads específicos para
cada um dos loci (A, B e DRB1) e 17 µL do tampão de hibridização. A mistura foi
29
submetida a um termociclador Applied Systems Verity 9200, a temperatura de 60ºC,
por 15 minutos.
Após sucessivas lavagens e centrifugações, o produto foi marcado com
biotina, permitindo a posterior análise com estreptavidina conjugada a R-ficoeritrina
(SAPE). Por fim, o produto desta última reação foi transferido para uma placa de
leitura e processado no Analisador Luminex, que identifica a intensidade de
fluorescência de ficoeritrina em cada microesfera (Figura 4).
Figura 4. Procedimento técnico da etapa de hibridização.
4.4 Interpretação de dados e análises estatísticas
A etapa de aquisição dos dados foi realizada após leitura da placa pelo
equipamento LABScan 100 (Luminex da One Lambda). A interpretação dos
30
resultados se deu pelo software HLA Fusion versão 3.0 (One Lambda). Os
resultados da tipagem HLA classe I e II, bem como os demais dados (identificação
do paciente/doador, data do nascimento, data da coleta, município, sexo, idade)
foram armazenados em um banco de dados do Laboratório de HLA da Fundação
HEMOAM.
As freqüências alélicas foram obtidas por contagem direta dos alelos
observados. A análise da associação entre as variantes HLA e a ocorrência dos
tipos de leucemia foi realizada pelo Teste do Qui-Quadrado, com correção de Yates
ou Teste Exato de Fisher dependendo da natureza dos dados, através do programa
QuickCalcs, GraphPad Software. Os valores de probabilidade (p) foram
considerados significativos quando inferiores a 0,05. Valores de p superiores a 0,05
foram considerados como tendência para a associação com a doença. Por fim, o
valor de OR (odds-ratio) e os intervalos de confiança (IC) ao nível de 95% foram
calculados para avaliar o risco de o indivíduo desenvolver a doença possuindo um
tipo de HLA.
4.6 Considerações Éticas
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da
Fundação HEMOAM, obedecendo às diretrizes e normas que regulamentam as
pesquisas envolvendo seres humanos, a Resolução 196 de 10 de outubro de 1996
(Anexo 1). Para os pacientes participantes do estudo retrospectivo, o
CEP/FHEMOAM autorizou a dispensa do Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (Anexo 2). Os pacientes e/ou responsáveis pelos pacientes referentes
ao período prospectivo foram informados de todos os critérios para a inclusão no
estudo e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 3).
5. RESULTADOS
5.1 Características gerais e clínicas da população estudada
Dos 177 pacientes portadores de leucemias, selecionados neste estudo, 105
(59,3%) eram portadores de LLA, 42 (23,7%) de LMA, e 30 (17,0%) de LMC. As
características gerais dos participantes demonstraram que, entre os pacientes com
31
leucemia, a maioria (60,5%; 107/177) era do sexo masculino. No grupo controle, o
resultado foi semelhante, observando-se o sexo masculino como sendo o mais
frequente (68,7%; 824/1200) (Tabela 1).
A idade dos pacientes com leucemia variou de 5 meses a 66 anos. Nos
pacientes com LMA, idades inferiores a 18 anos foram mais frequentes (31,0%;
13/42) (Tabela 1). Ainda nos pacientes com LMA, outra faixa frequente foi de 46 a
55 anos de idade (26,2%; 11/42). Em relação ao grupo dos pacientes com LMC, a
faixa etária mais frequente foi entre 36 a 45 anos (30,0%; 9/30). Nos controles
saudáveis a faixa etária variou de 16 a 59 anos, sendo que as faixas mais
frequentes foram de 18 a 25 anos (33,2%; 398/1200) e de 26 a 35 anos (32,0%;
384/1200).
A maioria dos pacientes com leucemias era proveniente do Estado do
Amazonas (91,0%; 161/177). No entanto, aproximadamente 20,0% (10/42) dos
pacientes com LMA eram oriundos de outros Estados. De maneira similar, a maioria
dos doadores saudáveis eram originários do Amazonas (95%; 1140/1200), conforme
dados descritos na Tabela 1.
Tabela 1. Características dos pacientes com Leucemia (LLA, LMA e LMC) e do grupo controle.
Características LLA
n=105 (%) LMA
n=42 (%) LMC
n=30 (%)
Total n=177
(%)
Controles DVMO
n=1200 (%)
Gênero
Masculino 64 (61,0) 25 (59,5) 18 (60,0) 107 (60,5) 824 (68,7)
Feminino 41 (39,0) 17 (40,5) 12 (40,0) 70 (39,5) 376 (31,3)
Faixa etária (anos)
<18 66 (62,9) 13 (31,0) 4 (13,3) 83 (46,9) 0
18 a 25 14 (13,3) 1 (2,4) 2 (6,7) 17 (9,6) 398 (33,2)
26 a 35 10 (9,5) 6 (14,3) 4 (13,3) 20 (11,3) 384 (32,0)
36 a 45 12 (11,4) 4 (9,5) 9 (30,0) 25 (14,1) 270 (22,5)
46 a 55 2 (1,9) 11 (26,2) 5 (16,7) 18 (10,2) 144 (12,0)
>56 1 (1,0) 7 (16,7) 6 (20,0) 14 (7,9) 4 (0,3)
Naturalidade
Amazonas 100 (95,2) 32 (76,2) 29 (96,7) 161 (91,0) 1140 (95,0)
Pará 3 (2,9) 8 (19,0) 1 (3,3) 12 (6,8) 40 (3,3)
Roraima 1 (1,0) 1 (2,4) 0 2 (1,1) 5 (0,4)
Outros 1 (1,0) 1 (2,4) 0 2 (1,1) 15 (1,3) LLA: Leucemia Linfoblástica Aguda; LMA: Leucemia Mieloide Aguda; LMC: Leucemia Mieloide Crônica; DVMO:Doador Voluntário de Medula Óssea.
32
5.2 Identificação dos alelos HLA classe I e II nos pacientes com leucemias e controles saudáveis
Na análise dos alelos de HLA, foram considerados o dobro do número de
alelos para cada indivíduo, pois os genes de HLA são codominantes, ou seja, o
fenótipo do indivíduo é sempre determinado pelos dois alelos presentes em cada
locus. Desta forma, o número avaliado foi de n=354 para os pacientes com
leucemias e n=2400 para os controles.
Quanto ao HLA-A*, três alelos foram os mais freqüentes, tanto entre
pacientes com leucemias, como entre DVMO: HLA-A*02 (25,6%; 92/354 nas
leucemias e 27,7%; 665/2400 nos DVMO; p=0,4293) seguidos do HLA-A*24 (15,3%;
55/354 nas leucemias e 14,9%; 357/2400 nos DVMO; p=0,9039) e HLA-A*31
(14,4%; 52/354 nas leucemias e 11,4%; 273/2400; p=0,1102) (Tabela 2). Entre
pacientes com leucemias, não foram identificados os alelos HLA-A*43, A*66 e A*69.
Já entre os DVMO, não houve a ocorrência do alelo HLA-A*43.
Na estratificação das formas clínicas das leucemias, a LMA, a LMC e a LLA,
os mesmos alelos HLA-A*, anteriormente citados, foram os mais freqüentes: LMA:
A*02 (27,4%; 23/84), A*24 (17,9%; 15/84) e A*31 (16,7%; 14/84); LMC: A*02
(31,7%; 19/60), A*24 (6,7%; 4/60), A*31 (11,7%; 7/60); LLA: A*02 (23,8%; 50/210),
A*24 (17,1%; 36/210), A*31 (14,8%; 31/210). Na comparação entre os grupos de
pacientes com LMA e controles saudáveis, foi identificado uma possível associação
entre a presença do alelo HLA-A*03 e o risco no desenvolvimento da LMA
(p=0,0559; OR=2,071; IC 95%=1,05-4,09). Na comparação entre LMC e doadores
saudáveis, observamos também possível associação do alelo HLA-A*74 (p=0,0557;
OR=3,775; IC 95%=1,13-12,67) com suscetibilidade para o desenvolvimento da
LMC.
Quanto aos alelos HLA-B*, três foram os mais frequentes tanto entre os
pacientes com leucemias como entre os controles: HLA-B*15 (10,6%; 38/354 nas
leucemias e 10,5%; 253/2400 nos DVMO; p=0,9330) seguidos do HLA-B*35 (15,6%;
56/354 nas leucemias e 14,7%; 352/2400 nos DVMO; p=0,7162) e HLA-B*44 (5,8%;
21/354 nas leucemias e 9,0%; 217/2400; p=0,0547) (Tabela 3). Entre os pacientes
33
com leucemias não foram identificados os alelos HLA-B*46, B*47, B*54, B*59, B*67,
B*73, B*81, B*82 e B*83. Já entre os DVMO não foi observada a presença dos
alelos HLA-B*46, B*54, B*59, B*62, B*73 e B*83.
Na LMA e na LMC, dois dos alelos HLA-B* anteriormente descritos foram os
mais freqüentes: LMA: B*15 (13,0%; 11/84) e B*35 (19,0%; 16/84); LMC: B*15
(16,7%; 10/60) e B*35 (13,3%; 8/60). Já na LLA os três alelos mais frequentes foram
os B*35 (15,2%; 32/210); B*39 (11,4%; 24/210) e B*51 (9,5%; 20/210). Na
comparação entre os grupos de pacientes LMA e controles saudáveis foi identificada
a presença do alelo HLA-B*62, possivelmente associado ao risco a doença
(p=0,0338; OR= 86,250 e IC 95%=3,49-2135). No entanto, a presença deste alelo foi
em apenas um paciente e nos controles não observado o HLA-B*62. Na
comparação entre LLA e doadores saudáveis foi observada associação entre o alelo
HLA-B*39 (p=0,0246; OR=1,725; IC 95%=1,10-2,72) para suscetibilidade a LLA.
Enquanto o alelo HLA-B*44 foi fortemente associado à proteção para LLA
(p=0,0069; OR=0,347; IC 95%=0,16-0,75).
Em relação ao HLA-DRB1*, três alelos foram os mais frequentes nos dois
grupos avaliados (pacientes e DVMO): HLA-DRB1*04 (18,3%; 66/354 nas leucemias
e 18,4%; 442/2400 nos DVMO; p=0,9722) seguidos do HLA-DRB1*08 (12,2%;
44/354 nas leucemias e 11,9%; 286/2400 nos DVMO; p=0,936) e HLA-DRB1*13
(9,7%; 35/360 nas leucemias e 11,6%; 278/2400 nos DVMO; p=0,3424) (Tabela 4).
Na LMA e na LMC os alelos HLA-DRB1* anteriormente descritos foram os
mais frequentes [LMA: DRB1*04 (17,9%; 15/84), DRB1*08 (16,7%; 14/84) e
DRB1*13 (10,7%; 9/84); LMC: DRB1*04 (18,3%; 11/60), DRB1*08 (8,3%; 5/60) e
DRB1*13 (16,7%; 10/60)]. Na LLA os alelos mais frequentes foram DRB1*01 (7,6%,
16/210), DRB1*04 (18,6%; 39/210), DRB1*08 (11,4%; 24/210) e DRB1*13 (7,6%;
16/210). Para HLA DRB1* não foi encontrado nenhum alelo associado às leucemias.
34
Tabela 2. Frequência dos alelos de HLA-A*, em pacientes com Leucemia e suas diferentes formas clínicas (LLA, LMA e LMC) e nos controles.
Alelos HLA-A*
Pacientes Leucemia n=360(%)
Controles DVMO
n=2400(%)
p valor
OR IC 95% Pacientes
LLA n=210(%)
p valor OR IC 95% Pacientes
LMA n=84(%)
p valor OR IC 95% Pacientes
LMC n=60(%)
p valor OR IC 95%
A01 20 (5,6) 159 (6,6) 0,5134 0,829 0,51-1,34 15 (7,1) 0,8853 1,084 0,63-1,88 3 (3,6) 0,6790 0,522 0,16-1,67 2(3,3) 0,4312 0,486 0,12-2,01
A02 92 (25,6) 665 (27,7) 0,4293 0,896 0,70-1,15 50 (23,8) 0,2567 0,815 0,59-1,13 23 (27,4) 0,9537 0,984 0,60-1,60 19 (31,7) 0,5961 1,209 0,70-2,10
A03 25 (6,9) 147 (6,1) 0,6292 1,144 0,73-1,78 11 (5,2) 0,7144 0,847 0,45-1,59 10 (11,9) 0,0559 2,071 1,05-4,09 2 (3,3) 0,5812 0,529 0,13-2,19
A11 10 (2,8) 103 (4,3) 0,2266 0,637 0,33-1,23 7 (3,3) 0,6286 0,769 0,35-1,68 1 (1,2) 0,2637 0,269 0,04-1,95 2 (3,3) 1,0000 0,769 0,19-3,19
A15 1 (0,3) 0 0,1304 20,030 0,81-493,1
1 (0,5) 0,0805 34,370 1,39-847,1 0 — — — 0 — — —
A18 1 (0,3) 0 0,1304 20,030 0,81-493,1
1 (0,5) 0,0805 34,370 1,39-847,1 0 — — — 0 — — —
A23 16 (4,4) 97 (4,0) 0,8282 1,104 064-1,90 9 (4,3) 0,9916 1,063 0,53-2,14 2 (2,4) 0,7729 0,579 0,14-2,39 4 (6,7) 0,3090 1,696 0,60-4,77
A24 55 (15,3) 357 (14,9) 0,9039 1,032 0,76-1,41 36 (17,1) 0,4350 1,184 0,81-1,73 15 (17,9) 0,5503 1,244 0,70-2,19 4 (6,7) 0,0941 0,409 0,15-1,13
A25 2 (0,6) 18 (0,8) 1,0000 0,739 0,17-3,20 2 (1,0) 0,4350 1,184 0,81-1,73 0 1,0000 0,762 0,05-12,76 0 1,0000 1,064 0,06-17,88
A26 9 (2,5) 47 (2,0) 0,6317 1,284 0,62-2,64 6 (2,9) 0,9282 1,272 0,29-5,52 0 1,0000 0,762 0,05-12,76 2 (3,3) 0,3371 1,726 0,41-728
A29 8 (2,2) 82 (3,4) 0,3027 0,643 0,31-1,34 2 (1,0) 0,0626 0,272 0,66-1,11 3 (3,6) 0,7634 1,047 0,32-3,39 2 (3,3) 1,0000 0,975 0,23-4,01
A30 17 (4,7) 94 (3,9) 0,5608 1,216 0,72-2,06 8 (3,8) 0,9388 0,972 0,47-2,03 4 (4,8) 0,5718 1,277 0,44-3,42 5 (8,3) 0,1655 2,230 0,87-5,70
A31 52 (14,4) 273 (11,4) 0,1102 1,315 0,96-1,81 31 (14,8) 0,1754 1,349 0,90-2,02 14 (16,7) 0,1876 1,588 0,87-2,08 7 (11,7) 0,9440 1,029 0,46-2,86
A32 8 (2,2) 51 (2,1) 0,9391 1,047 0,49-2,23 5 (2,4) 0,9977 1,123 0,44-2,85 1 (1,2) 1,0000 0,555 0,08-4,07 2 (3,3) 0,3729 1,588 0,38-0,70
A33 11 (3,1) 55 (2,3) 0,4841 1,344 0,70-2,60 6 (2,9) 0,7780 1,254 0,53-2,94 3 (3,6) 0,4452 1,579 0,48-5,16 2 (3,3) 0,6487 1,470 0,35-6,18
A34 1 (0,3) 9 (0,4) 1,0000 0,740 0,09-5,96 0 1,0000 0,598 0,03-10,32 0 1,0000 1,490 0,98-25,89 1 (1,7) 0,2192 4,503 0,56-36,14
A36 1 (0,3) 10 (0,4) 1,0000 0,666 0,08-5,22 1 (0,5) 0,6033 1,144 0,15-8,89 0 1,0000 1,347 0,07-23,20 0 1,0000 1,882 0,11-32,50
A43 0 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —
A66 0 23 (1,0) 0,0626 0,140 0,01-2,32 0 0,2519 0,240 0,01-3,97 0 1,0000 0,599 0,04-9,95 0 1,0000 0,836 0,05-13,94
A68 24 (6,7) 170 (7,1) 0,8589 0,937 0,60-1,46 15 (7,1) 0,9743 1,009 0,58-1,75 5 (6,0) 0,8562 0,830 0,33-2,08 3 (5,0) 0,7967 0,690 0,22-2,23
A69 0 3 (0,1) 1,0000 0,950 0,05-18,44
0 1,0000 1,627 0,08-31,63 0 1,0000 4,053 0,21-79,15 0 1,0000 5,661 0,29-110,9
A74 6 (1,7) 33 (1,4) 0,8432 1,216 0,51-2,92 3 (1,4) 0,7639 1,040 0,32-3,42 0 0,6266 0,418 0,03-6,88 3 (5,0) 0,0557 3,775 1,13-12,67
A80 1 (0,3) 4 (0,2) 0,5031 1,669 0,19-14,98
1 (0,5) 0,3428 2,866 0,32-25,77 0 1,0000 3,151 0,17-59,04 0 1,0000 4,401 0,23-82,72
TOTAL 360(100%) 2400(100%) — — — 210(100%) — — — 84(100%) — — — 60(100%) — — —
Teste Qui-quadrado ou Teste exato de Fisher, dependendo da natureza dos dados. n=número de alelos; OR=Odds Ratio; IC=Intervalo de Confiança; LLA:Leucemia Linfoblástica Aguda; LMA:Leucemia Mieloide Aguda; LMC:Leucemia Mieloide Crônica.
35
Tabela 3. Frequência dos alelos de HLA-B*, em pacientes com Leucemia e suas diferentes formas clínicas (LLA, LMA e LMC) e nos controles.
Teste Qui-quadrado ou Teste exato de Fisher, dependendo da natureza dos dados. n=número de alelos; OR=Odds Ratio; IC=Intervalo de Confiança; LLA:Leucemia Linfoblástica Aguda; LMA:Leucemia Mieloide Aguda; LMC:Leucemia Mieloide Crônica.
Alelos HLA-B*
Pacientes Leucemia n=360(%)
Controles DVMO
n=2400(%)
p valor
OR IC 95% Pacientes
LLA n=210(%)
p valor OR IC 95% Pacientes
LMA n=84(%)
p valor OR IC 95% Pacientes
LMC n=60(%)
p valor OR IC 95%
B07 16 (4,4) 108 (4,5) 0,9622 0,987 0,58-1,69 8 (3,8) 0,7711 0,841 0,40-1,75 5 (6,0) 0,7897 1,061 0,38-2,95 2 (3,3) 1,0000 0,732 0,18-3,04
B08 11 (3,1) 72 (3,0) 0,9541 1,019 0,53-1,94 9 (4,3) 0,4106 1,448 0,71-2,93 1 (1,2) 0,5159 0,390 0,05-2,84 1 (1,7) 1,0000 0,548 0,07-4,01
B13 5 (1,4) 24 (1,0) 0,9141 1,019 0,53-1,94 2 (1,0) 1,0000 0,952 0,22-4,05 2 (2,4) 0,2188 2,415 0,56-10,39 1 (1,7) 0,4623 1,678 0,22-12,62
B14 14 (3,9) 105 (4,4) 0,7762 0,884 0,50-1,56 10 (4,8) 0,9309 1,093 0,56-2,12 2 (2,4) 0,5824 0,533 0,13-2,19 2 (3,3) 1,0000 0,754 0,18-3,13
B15 38 (10,6) 253 (10,5) 0,9330 1,001 0,70-1,44 16 (7,6) 0,2234 0,699 0,41-1,19 11 (13,1) 0,5712 1,279 0,67-2,44 10 (16,7) 0,1919 1,697 0,85-3,39
B18 11 (3,1) 72 (3,0) 0,9141 1,019 0,53-1,94 8 (3,8) 0,6571 1,281 0,61-2,70 2 (2,4) 1,0000 0,789 0,19-3,27 1 (1,7) 1,0000 0,548 0,07-4,01
B27 7 (1,9) 32 (1,3) 0,4986 1,467 0,64-3,35 5 (2,4) 0,3539 1,805 0,70-4,70 0 0,6253 0,431 0,03-7,11 2 (3,3) 0,2005 2,552 0,60-10,91
B35 56 (15,6) 352 (14,7) 0,7162 1,072 0,79-1,46 32 (15,2) 0,9024 1,046 0,71-1,55 16 (19,0) 0,3397 1.369 0,78-2,39 8 (13,3) 0,9174 0,895 0,42-1,90
B37 2 (0,6) 19 (0,8) 0,8764 0,700 0,16-3,02 2 (1,0) 0,6839 1,205 0,28-5,21 0 1,0000 0,723 0,04-12,08 0 1,0000 1,009 0,06-16,92
B38 4 (1,1) 43 (1,8) 0,4763 0,616 0,22-1,73 3 (1,4) 1,0000 0,794 0,24-2,58 1 (1,2) 1,0000 0,660 0,09-4,86 0 0,6251 0,448 0,02-7,36
B39 36 (10,0) 167 (7,0) 0,0508 1,486 1,02-2,17 24 (11,4) 0,0246 1,725 1,10-2,72 5 (6,0) 0,8900 0,846 0,34-2,12 7 (11,7) 0,2501 1,766 0,79-3,94
B40 30 (8,3) 169 (7,0) 0,4388 1,200 0,80-1,80 20 (9,5) 0,232 1,390 0,85-2,30 7 (8,3) 0,8125 1,200 0,55-2,64 3 (5,0) 0,7964 0,695 0,22-2,24
B41 4 (1,1) 22 (0,9) 0,9493 1,215 0,42-3,55 2 (1,0) 1,0000 1,039 0,24-4,45 1 (1,2) 0,5483 1,302 0,17-9,78 1 (1,7) 0,4348 1,832 0,24-13,83
B42 2 (0,6) 30 (1,3) 0,3768 0,441 0,11-0,86 2 (1,0) 1,0000 0,760 0,18-3,20 0 0,6637 0,460 0,03-7,59 0 1,0000 0,642 0,04-10,63
B44 21 (5,8) 217 (9,0) 0,0547 0,623 0,39-0,99 7 (3,3) 0,0069 0,347 0,16-0,75 6 0,6860 0,774 0,33-1,79 5 (8,3) 0,9689 0,915 0,36-2,31
B45 4 (1,1) 33 (1,4) 0,8727 0,806 0,28-2,29 1 (0,5) 0,5181 0,343 0,05-2,52 2 (2,4) 0,3329 1,747 0,41-7,42 1 (1,7) 0,5706 1,216 0,16-9,04
B46 0 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —
B47 0 9 (0,4) 0,6157 0,349 0,02-6,02 0 1,0000 0,598 0,03-10,32 0 1,0000 1,490 0,09-25,82 0 1,0000 2,080 0,12-36,18
B48 7 (1,9) 46 (1,9) 0,8649 1,015 0,45-2,27 4 (1,9) 1,0000 0,994 0,35-2,79 2 (2,4) 0,6766 1,248 0,30-5,23 1 (1,7) 1,0000 0,867 0,12-6,40
B49 10 (2,8) 50 (2,1) 0,5165 1,343 0,67-2,67 5 (2,4) 0,9701 1,146 0,45-2,91 3 (3,6) 0,4239 1,741 0,53-5,70 2 (3,3) 0,3640 1,621 0,38-6,82
B50 8 (2,2) 59 (2,5) 0,9300 0,9018 0,43-1,90 5 (2,4) 0,8704 0,9678 0,38-2,44 3 (3,6) 0,4654 1,470 0,45-4,79 0 0,4014 0,325 0,02-5,33
B51 30 (8,3) 213 (8,9) 0,8115 0,933 0,63-1,39 20 (9,5) 0,8493 1,081 0,67-1,75 5 (6,0) 0,4627 0,650 0,26-1,62 4 (6,7) 0,8163 0,733 0,26-2,04
B52 13 (3,6) 103 (4,3) 0,6461 0,836 0,46-1,50 7 (3,3) 0,6286 0,769 0,35-1,68 3 (3,6) 1,0000 0,847 0,26-2,728 3 (5,0) 0,7426 1,174 0,36-3,81
B53 12 (3,3) 62 (2,6) 0,5179 1,300 0,69-2,44 7 (3,3) 0,6706 1,300 0,59-2,88 4 (4,8) 0,2822 1,885 0,67-5,31 1 (1,7) 1,0000 0,639 0,08-4,70
B54 0 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —
B55 2 (0,6) 23 (1,0) 0,6499 0,577 0,14-2,47 2 (1,0) 1,0000 0,994 0,23-4,25 0 1,0000 0,599 0,36-9,95 0 1,0000 0,836 0,05-13,94
B56 1 (0,3) 8 (0,3) 1,0000 0,833 0,10-6,68 0 1,0000 0,669 0,04-11,63 1 (1,2) 0,2666 3,602 0,45-29,15 0 1,0000 2,326 0,13-40,79
B57 8 (2,2) 43 (1,8) 0,7220 1,246 0,58-2,67 7 (3,3) 0,1935 1,890 0,84-4,30 0 0,4010 0,321 0,02-5,26 1 (1,7) 1,0000 0,929 0,13-6,86
B58 5 (1,4) 58 (2,4) 0,3038 0,569 0,23-1,43 1 (0,5) 0,0855 0,193 0,03-1,40 1 (1,2) 0,7213 0,487 0,07-3,56 3 (5,0) 0,1848 2,125 0,65-6,99
B59 0 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —
B62 1 (0,3) 0 0,1304 20,030 0,81-493,1
0 — — — 1 (1,2) 0,0338 86,250 3,49-2135 0 — — —
B67 0 1 (0,0) 1,0000 2,219 0,09-54,61
0 1,0000 3,800 0,15-93,64 0 1,0000 9,579 0,39-237,1 0 1,0000 13,220 0,53-328,10
B73 0 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —
B78 2 (0,6) 1 (0,0) 1,0000 2,219 0,09-54,61
0 1,0000 0,193 0,03-1,40 0 1,0000 9,579 0,39-237,1 0 1,0000 13,220 0,53-328,10
B81 0 3 (0,1) 0,1298 4,464 0,74-26,82
1 (0,5) 0,2852 3,823 0,40-36,94 0 1,0000 4,053 0,21-79,15 1 (1,7) 0,0941 13,54 1,39-132,2
B82 0 3 (0,1) 1,0000 0,950 0,05-18,44
0 1,0000 1,627 0,08-31,63 0 1,0000 4,053 0,21-79,15 0 1,0000 5,661 0,29-110,9
B83 0 0 — — — 0 — — — 0 — — — 0 — — —
TOTAL 360(100%) 2400(100%) — — — 210(100%) — — — 84(100%) — — — 60(100%) — — —
36
Tabela 4. Frequência dos alelos de HLA-DRB1*, em pacientes com Leucemia e suas diferentes formas clínicas (LLA, LMA e LMC) e nos
controles. Teste Qui-quadrado ou Teste exato de Fisher, dependendo da natureza dos dados. n=número de alelos; OR=Odds Ratio; IC=Intervalo de Confiança; LLA:Leucemia Linfoblástica Aguda; LMA:Leucemia Mieloide Aguda; LMC:Leucemia Mieloide Crônica.
Alelos HLA-
DRB1*
Pacientes Leucemia n=360(%)
Controles DVMO
n=2400(%)
p valor
OR IC 95% Pacientes
LLA n=210(%)
p valor OR IC 95% Pacientes
LMA n=84(%)
p valor OR IC 95% Pacientes
LMC n=60(%)
p valor OR IC 95%
DR01 20 (5,6) 176 (7,3) 0,265 0,743 0,46-1,20 16 (7,6) 0,9886 1,042 0,61-1,78 2 (2,4) 0,0867 0,308 0,08-1,26 1 (1,7) 0,1243 0,214 0,03-1,56
DR03 29 (8,1) 172 (7,2) 0,6196 1,135 0,75-1,71 20 (9,5) 0,2640 1,364 0,84-2,22 4 (4,8) 0,5186 0,648 0,23-1,79 4 (6,7) 1,0000 0,925 0,33-2,58
DR04 66 (18,3) 442 (18,4) 0,9722 0,995 0,75-1,32 39 (18,6) 0,9702 1,010 0,70-1,45 15 (17,9) 0,9895 0,963 0,55-1,70 11 (18,3) 0,8791 0,995 0,51-1,93
DR07 29 (8,1) 259 (10,8) 0,1359 0,724 0,49-1,08 16 (7,6) 0,1872 0,682 0,40-1,15 9 (10,7) 0,8757 0,992 0,49-2,01 4 (6,7) 0,3994 0,591 0,21-1,64
DR08 44 (12,2) 286 (11,9) 0,0936 1,029 0,73-1,44 24 (11,4) 0,9216 0,954 0,61-1,48 14 (16,7) 0,2531 1,478 0,82-2,66 5 (8,3) 0,5170 0,672 0,27-1,69
DR09 12 (3,3) 62 (2,6) 0,5179 1,300 0,69-2,44 8 (3,8) 0,4054 1,493 0,71-3,16 1 (1,2) 0,7228 0,454 0,06-3,32 2 (3,3) 0,6686 1,300 0,31-5,45
DR10 5 (1,4) 39 (1,6) 0,9141 0,853 0,33-2,18 4 (1,9) 0,7741 1,176 0,42-3,32 0 0,6412 0,354 0,02-5,81 1 (1,7) 1,0000 1,026 0,14-7,60
DR11 30 (8,3) 173 (7,2) 0,5129 1,170 0,78-1,75 16 (7,6) 0,9351 1,062 0,62-1,81 7 (8,3) 0,8596 1,170 0,53-2,60 7 (11,7) 0,2897 1,700 0,76-3,80
DR12 6 (1,7) 32 (1,3) 0,7921 1,254 0,52-3,02 3 (1,4) 0,7574 1,072 0,33-3,53 3 (3,6) 0,1126 2,741 0,82-1,14 0 1,0000 0,602 0,04-9,96
DR13 35 (9,7) 278 (11,6) 0,3424 0,822 0,57-1,19 16 (7,6) 0,1034 0,630 0,37-1,06 9 (10,7) 0,9432 0,916 0,45-1,85 10 (16,7) 0,3142 1,527 0,77-3,05
DR14 30 (8,3) 156 (6,5) 0,2375 1,308 0,87-1,97 20 (9,5) 0,1255 1,514 0,93-2,47 7 (8,3) 0,6579 1,308 0,59-2,89 3 (5,0) 1,0000 0,757 0,23-2,45
DR15 30 (8,3) 169 (7,0) 0,4388 1,200 0,80-1,80 14 (6,7) 0,9496 0,943 0,54-1,66 7 (8,3) 0,8125 1,200 0,54-2,64 8 (13,3) 0,1074 2,031 0,95-4,35
DR16 24 (6,7) 156 (6,5) 0,9860 1,027 0,66-1,60 14 (6,7) 0,9586 1,027 0,58-1,81 6 (7,1) 0,9922 1,107 0,47-2,58 4 (6,7) 0,7949 1,027 0,37-2,87
TOTAL 360(100%) 2400(100%) — — — 210(100%) — — — 84(100%) — — — 60(100%) — — —
39
6. DISCUSSÃO
6.1. Resultados gerais
Dos tres tipos de leucemias diagnosticadas no presente estudo, a maioria foi
representada por LLA (59,3%), seguida de LMA (23,7%) e LMC (17,0%). Segundo
Pollock et al. (2006), a distribuição mundial das leucemias nas formas mais comuns
são: 29% LLC, 14% LMC, 40% LMA e 17% LLA, sendo esta última mais comum
entre crianças, enquanto que as outras formas têm suas incidências aumentadas
nas outras faixas etárias. Estas frequências são diferentes das observadas em
nosso estudo, principalmente com respeito aos casos de LLA. De fato, existe uma
variedade de estudos populacionais sobre associações de alelos HLA e doenças
humanas (GHODKE et al., 2005). Os resultados destas pesquisas indicam que a
miscigenação racial, aliada ao elevado polimorfismo genético do sistema HLA, pode
gerar frequências alélicas bastante distintas nas diferentes populações de estudo
(MONTE et al., 2004; BANDEIRA et al, 2006; BORTOLOTTO et al, 2012).
Entre os pacientes com leucemia, a maioria (61,0%) mostrou-se como sendo
do sexo masculino. O grupo controle apresentou resultado semelhante, com 68,7%
dos indivíduos do sexo masculino. Estudos epidemiológicos sobre o câncer
pediátrico, em todo o Brasil, são escassos (RIBEIRO, BUFFLER e METAYER, 2008;
CURADO, VOTI, e SORTINORACHOU, 2009). Não obstante, dentre os dados
disponíveis, também observa-se predominância do sexo masculino (SANTANA,
ALMEIDA e PORTUGAL, 2007).
A idade dos pacientes com leucemia variou de 5 meses a 66 anos. No grupo
LLA, a predominância foi de idades inferiores a 18 anos (62,9%). Este resultado
corrobora os estudos realizados por Ecker et al. (2009), que encontraram 70% dos
casos de LLA em crianças menores de 15 anos. Além disso, dentre as leucemias em
crianças, verifica-se que 85 a 90% dos casos são do tipo LLA, sendo 10% não-
linfoblástica aguda e 5% do tipo LMC (SILVA, PIRES e NASSAR, 2002). Pui et al.
(2004) também relataram a LLA como sendo mais freqüente em crianças. Contudo,
cabe salientar que esta doença pode se manifestar em qualquer faixa etária,
especialmente em adultos acima de 60 anos, sendo um pouco mais comum em
40
homens que em mulheres. No adulto, a LLA apresenta pior prognóstico clínico, com
uma taxa de cura de apenas 25-40% (MELO, 2008).
Similarmente, em nosso estudo, 31,0% dos pacientes LMA tinham idade
inferior a 18 anos, contrariando os resultados de outras pesquisas, as quais
demonstram que LMA é mais comum em pacientes de aproximadamente 60 anos de
idade (BAIN, 2003). Apesar deste fato, a segunda faixa etária mais frequente foi de
46 a 55 anos (26,2%), de acordo com a citada na maioria dos estudos de LMA. Em
relação ao sexo na LMA, também foi mais frequente o masculino (59,5%),
confirmando os dados de outros trabalhos (SARAFNEJAD et al, 2006; KHOSRAVI et
al, 2007; OZDILLI et al, 2010; UÇAR et al, 2011).
Finalmente, com respeito ao grupo de pacientes com LMC, a faixa etária
mais frequente foi de 36 a 45 anos (30,0%). As casuísticas nacionais, dos anos de
2005 e 2006, mostram a mediana de idade ao diagnóstico dos pacientes com LMC
entre 40 e 46 anos (LORAND-METZE et al., 2005; FUNKE et al., 2005; CAMPOS et
al, 2006; BANDEIRA et al., 2006). Tais resultados confirmam os dados observados
em nosso estudo, apesar das limitações descritas em relação ao recrutamento dos
pacientes do Laboratório de HLA da Fundação HEMOAM apresentarem faixa etária
inferior a 18 anos. No caso dos controles saudáveis, a faixa etária variou de 18 a 59
anos, sendo que as mais frequentes foram de 18 a 25 anos (33,0%) e de 26 a 35
anos (32,0%).
6.2. Frequência alélica e análise de associação nas leucemias
No presente trabalho, foi possível identificar seis alelos apresentando
resultados estatisticamente significativos de associação para algum tipo de
leucemia: HLA-A*03, HLA-A*74, HLA-B*39, HLA-B*44, HLA-B*62 e HLA-B*81. Os
alelos HLA-B*39 e o HLA-B*44, em especial, foram considerados potencialmente
associados à LLA, para suscetibilidade e para a proteção à doença,
respectivamente. Contudo, embora os demais alelos tenham apresentado resultados
estatisticamente significativos, o número de casos da doença foi relativamente
pequeno, o que limitou a confiabilidade dos resultados. Cabe salientar que cinco
41
destes alelos já foram identificados em outras populações e envolvidos a algum tipo
de leucemia, não descartando o seu possível papel na etiologia das leucemias.
As frequências dos alelos entre pacientes e controles apresentam uma
distribuição muito semelhante, apenas dois alelos encontrados nos controles
(DRB1*07 e DRB1*13) não tiveram frequências superiores a 10% nos pacientes,
mas os valores foram próximos. Estes dados representam a frequência dos alelos
mais comuns na população investigada. No entanto, os alelos A*02, A*24, B*15,
B*35, DRB1*04, também são frequentes na população brasileira (PRADO, 1999;
PROBST et al., 2000, GRUMET et al., 2001; RUIZ et al. 2005; BORTOLOTTO et al.
2012; MONTE et al., 2004; OLIVEIRA, 2014), confirmando os dados observados no
nosso estudo.
Quanto à análise da possível associação de HLA com as leucemias, conforme
comentado anteriormente, dois alelos HLA, B*39 e B*44 foram significativos, o
primeiro para suscetibilidade e o segundo, para proteção. No entanto, após
estratificação das formas clínicas das leucemias, verificou-se que estes dois alelos
estavam associados especificamente à LLA. Revelou-se, também, que os alelos
HLA-A*3 e A*74 mostraram-se associados à suscetibilidade a LMA e LMC,
respectivamente.
Para uma abordagem mais aprofundada, as frequências alélicas serão
abordadas segundo as diferentes formas de leucemia avaliadas no estudo: LLA,
LMA e LMC.
6.2.1. Leucemia Linfóide Aguda (LLA)
Nesta investigação, os alelos de HLA mais frequentes (≥10) nos pacientes
com LLA foram: A*02 (23,8%), A*24 (17,1%), A*31 (14,8%), B*35 (15,2%), B*39
(11,4%), DRB1*04 (18,6%) e DRB1*08 (11,4%). Estes mesmos alelos também foram
frequentes no grupo controle, com exceção do HLA-B*39, que foi associado a
suscetibilidade para LLA, colaborando com os resultados descritos por Klitz et al.,
(2012) em uma população de crianças. No entanto, um estudo realizado no México
42
encontrou este mesmo alelo associado a doença, porém para proteção
(FERNANDEZ-TORRES et al., 2013). Estes resultados controversos podem ser
atribuídos ao sistema HLA ser altamente polimórfico e a distribuição dos alelos ser
diferente de uma população para outra, assim como a presença de subtipos que
podem ser investigados, dependendo do tipo de HLA.
Além disso, o alelo HLA-B*44 apresentou dados significativos para proteção à
LLA. Este alelo também foi detectado como protetor em estudo realizado por Klitz et
al., (2012). Estes fatos sugerem que as moléculas de HLA devem exercer funções
cruciais na resposta imunológica para LLA. Neste mesmo contexto, Greaves (2006)
relatou que as crianças que receberam baixos estímulos imunológicos, durante a
infância, desenvolveram riscos maiores para leucemia e postulou que o curso
natural das infecções por contato com outras crianças parecer ser protetora para
leucemias.
Neste aspecto, é de conhecimento que a participação do HLA é crucial para a
apresentação de antígenos às células T, sendo importante o grau de ligação entre a
molécula de HLA e o peptídeo, ambos reconhecidos pelos receptores de célula T
(TCR), para obtenção de uma resposta imune adequada. Os peptídeos ligadores de
HLA podem ser de agentes infecciosos, mas também de proteínas anormais, como
produtos de genes mutados, ou de proteínas fusionadas como Bcr/Abl, presentes
em células neoplásicas. Neste último caso, podem ser reconhecidos por linfócitos T
citotóxicos, gerando resposta contra tumores (ABBAS, LICHTMAN e PILLAI, 2015).
Em relação aos alelos de HLA classe II, HLA-DRB1*04 foi associado à
suscetibilidade para LLA, em três trabalhos científicos distintos (DORAK et al., 1999;
DORAK et al., 2002 e OZDILLI et al., 2010). Embora, em nosso estudo, não tenha
sido observada associação com DRB1*04, não podemos descartar essa
possibilidade, considerando que existem mais de 200 subtipos de HLA-DRB1*04
(IMGT/HLA Database) e que a sua frequência foi elevada nos grupos investigados.
Neste aspecto, a genotipagem, por técnicas de alta resolução, definiria os subtipos
de DRB1*04 e permitiria identificar subtipos que pudessem estar associados à LLA,
seja para proteção ou suscetibilidade.
43
No Brasil, estudos de HLA e leucemias têm sido conduzidos por Barion et al.
(2007) e Fernandes et al. (2010), mas os alelos associados à LLA, por esses
autores, não foram evidenciados no nosso estudo, provavelmente pelo mesmo fato
da população ser miscigenada. Neste caso, uma genotipagem mais detalhada e a
pesquisa de epítopos compartilhados nos diferentes HLA poderiam ser investigadas
para esclarecer estas associações.
6.2.2. Leucemia Mieloide Aguda (LMA)
Para o estudo dos alelos de HLA nos pacientes com LMA os mais frequentes
(≥10%) nos foram: o A*02 (27,4%), A*03 (11,9%); A*24 (17,9%), A*31 (16,7%), B*15
(13,0%), B*35 (19,0%), DRB1*04 (17,9%), DRB1*08 (16,7%) e DRB1*13 (10,7%).
No entanto, somente o HLA-A*3 (11,9%) foi associado à LMA. Conforme comentado
anteriormente, o ideal é que os alelos mais frequentes na LMA sejam genotipados
por técnicas de alta resolução, que certamente ajudarão a revelar outros possíveis
alelos envolvidos na doença.
O alelo HLA-A*03 foi associado à suscetibilidade à LMA, corroborando o
resultado observado por Uçar et al., (2011) que também encontrou este alelo e o
HLA-B*51 associados à LMA, em estudo realizado com pacientes da Turquia. Em
outra investigação, em crianças turcas com LMA, foram identificados HLA-B*49 e
DRB1*15, para suscetibilidade, e HLA-A*11 e B*38, para proteção (OZDILLI et al.,
2010).
Em 2013, Bai et al., identificaram 3 (três) peptídeos (UBA1, Isoforma 1 of
fibrinogen alpha chain precurson e PAF4) produzidos por células tumorais em
pacientes com LMA, que podem ser considerados biomarcadores para esta doença.
Neste sentido, podemos sugerir que os HLAs que foram associados à
suscetibilidade para LMA não devem ter uma boa ligação com os peptídeos citados
e, consequentemente, não conseguem induzir uma resposta imune de células T
contra as células tumorais. No entanto, os indivíduos que expressam os HLAs
protetores para LMA devem ter uma alta afinidade para esses peptídeos,
conduzindo uma resposta eficiente de linfócitos T citotóxicos (CD8+), favorecendo
uma eliminação mais eficiente das células tumorais.
44
Além disso, foi identificada presença do alelo HLA-B*62, possivelmente
associada ao risco à doença (p=0,0338; OR= 86,250 e IC 95%=3,49-2135). No
entanto, HLA-B*62 estava presente em apenas 1 (um) paciente com LMA e, no
grupo controle, este alelo não foi encontrado. A baixa freqüência deste alelo nos
grupos estudados limita a inferência estatística quanto à possibilidade de associação
à doença.
6.2.3. Leucemia Mieloide Crônica (LMC)
No presente estudo, foi observado que os alelos HLA mais frequentes nos
pacientes com LMC foram: A*02 (31,7%), A*31 (11,7%), B*15 (16,7%), B*35
(13,3%), DRB1*04 (18,3%) e DRB1*13 (16,7%). Destes, nenhum apresentou valores
estatisticamente significativos para uma associação à LMC. Porém dentre os alelos
genotipados, o HLA-A*74 foi associado à suscetibilidade para LMC. Embora este
alelo tenha apresentado baixa frequência nos pacientes (5,0%), esta foi ainda menor
no grupo controle (1,4%). No estudo de metanálise realizado por Zhang et al., (2011)
sobre polimorfismos genéticos de HLA em LMC, identificaram-se 6 (seis) alelos HLA
associados à suscetibilidade (A*11, A*74, HLA-B*40, B*47, B*55 e B*81). Dentre
estes, cita-se o A*74, sugerindo que este alelo possa, de fato, estar associado à
LMC. Ressalta-se, contudo, que estudos complementares baseados em um maior
número de casos serão necessários para confirmar tal hipótese.
Ainda na metanálise realizada por Zhang et al., (2011), os autores descrevem
que o HLA-DRB1*13 parece estar associado à proteção para LMC. Porém, em
nosso estudo, o DRB1*13 foi frequente tanto nos pacientes, quanto nos indivíduos
saudáveis. Ademais, a existência de uma possível associação não pôde ser
comprovada, devido ao fato deste alelo apresentar vários subtipos. Outro alelo
relacionado à proteção a LMC foi descrito por Oguz et al. (2003); porém, em nosso
estudo, nenhuma associação foi observada.
Barion et al., (2007), em trabalho realizado no Brasil, identificou dois alelos de
HLA classe II associados à suscetibilidade para LMC: HLA-DRB1*04 e DRB1*08.
EM contrapartida, em nosso estudo, não foi observada nenhuma forma de
associação. Vale salientar que, para o HLA-DRB1*04, conforme comentado para
45
LLA, é necessário realizar uma genotipagem de alta resolução, a fim de determinar
se os subtipos desse alelo estão associados à LMC.
Além disso, nos pacientes com leucemias selecionados no presente estudo,
não foram encontrados os seguintes alelos: A*43, A*66, A*69, B*46, B*47, B*54,
B*59, B*67, B*73, B*82 e B*83. Já entre os DVMO não foi observada a presença dos
alelos A*43, B*46, B*54, B*59, B*62, B*73 e B*83. Com base nas evidências
apresentadas na literatura, observa-se rara ausência de certos alelos HLA na
população humana (Rede Brasil de Imunogenética). Dessa maneira, é plausível se
considerar que exista uma baixa frequência dos referidos alelos na população-alvo
de nosso estudo.
Finalmente, é importante esclarecer que este estudo deve ser
complementado com pesquisas adicionais, utilizando-se um maior número de casos
e, preferencialmente, baseadas em técnicas de genotipagem de alta resolução, para
se investigar o impacto dos vários subtipos dos alelos nas leucemias. Prevê-se que
tal abordagem possa abrir portas para investigações mais específicas dos
biomarcadores associados às leucemias, como a predição in silico de estruturas
protéicas e a análise in silico de interação molecular (―molecular docking‖), com o
intuito de se avaliar o grau de afinidade das moléculas HLA aos peptídeos tumorais.
Em última instância, tais estudos permitirão a obtenção de uma compreensão mais
aprofundada dos mecanismos imunológicos envolvidos nas leucemias.
46
7. CONCLUSÃO
Com base nos resultados obtidos no estudo, é possível concluir que:
1. Os alelos HLA-B*39 e HLA-B*44 estão associados, respectivamente, à
suscetibilidade e proteção para LLA, indicando que podem ter envolvimento
importante na resposta imune contra as células tumorais.
2. O alelo HLA-A*03 está associado à suscetibilidade para LMA, sugerindo que a
molécula codificada por este gene não apresenta boa afinidade aos peptídeos
tumorais, não induzindo, portanto, uma boa resposta imunológica contra as
células tumorais.
Considerações Finais:
O presente trabaho permitiu uma visão geral da distribuição genérica dos
alelos HLA classe I (A e B) e II (DRB1) numa parcela restrita da população do
Amazonas, contribuindo para o conceito de que a freqüência dos alelos HLA pode
estar relacionada a fatores raciais ou sócio-demográficos. O estudo também, foi
possível determinar associações dos alelos HLA classe I com LLA e LMA,
contribuindo para ampliar o conhecimento a respeito dos fatores imunogenéticos
envolvidos nas leucemias.
47
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Cellular and molecular immunology. Philadelphia: Elsevier Saunders; 2012. Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Cellular and molecular immunology. Philadelphia: Elsevier Saunders; 2015. Amirzargar AA, Khosravi F, Dianat SS, Alimoghadam K, Ghava F, Ansaripour B, Moradi B, Nikibin D. Association of hla class II allele and haplotype frequencies with chronic myelogenous leukemia and age-at-onset of the disease. Pathol Oncol Res 2007;13(1):47-51. Babor F, Fisher JC, Uhrberg M. The role of KIR genes and ligands in leukemia surveillance. Front Immunol 2013;4:27. Bai J, He A, Zhang W, Huang C, Yang J, Yang Y, Wang J, Zhang Y. Potential biomarkers for adult acute myeloid leukemia minimal residual disease assessment searched by serum peptidome profiling. Proteome Science 2013;11:1-16. Bain JB. Diagnóstico em Leucemias. 2.ed. Rio de Janeiro:Revinter; 2003. Bandeira DMA, Melo MC, Freire CJ, Chee HC. Análise do perfil epidemiológico dos pacientes com leucemia mielóide crônica do hospital universitário Prof. Alberto Antunes no período de 1996 a 2005. Rev. Bras. Hematol. Hemoter 2006;28(2):442. Barbosa CMPL, Nakamura C, Terreri MT et al. Manifestações músculo-esqueléticas como apresentação inicial das leucemias agudas na infância. J Pediatr 2002;78 (6):481-484. Barion LA, Tsuneto LT, Testa GV, Lieber SR, Persoli LB, Marques SB, Vigorito AC, Aranha FJ, Eid KA, Oliveira GB, Mirianda EC, Souza CA, Visentainer JE. Association between HLA and leukemia in a mixed brazilian population. Rev Assoc Med Bras 2007; 53(3):252-256.
Bennett, JH. Case of hypertrophy of the spleen and liver in which death took place from suppuration of the blood. Edinburgh Med Surg J 1845;64:413-423.
Bevan S, Catovsky D, Matutes E, et al. Linkage analysis for major histocompatibility complex-related genetic susceptibility in familial chronic lymphocytic leukemia. Blood 2000;96(12):3982–3984. Bortin MM, D’Amaro J, Bach FH, Van Rood JJ, Rimm AA. Associations with leukemia. Blood 1987;70(1):227-232. Bortolheiro TC, Chiattone CS. Leucemia Mielóide Crônica:história natural e classificação. Rev. Bras. Hematol. Hemoter 2008;30(1):3-7.
48
Bortolotto AS, Petry MF, Krieger EAG, Bondar F, Fernades SR, Neumann J, Bonorino C. HLA-A, -B, and -DRB allelic and haplotypic diversity in a sample of bone marrow volunteer donors from Rio Grande do Sul State, Brazil. Elsevier 2012;73(2):180-185. Braga JAP, Tone LG, Loggetto SR. Hematologia para o pediatra. São Paulo. Ateneu, p.283-297, 2007. Campos MG, Arantes AM, Oliveira JSR, Chauffaille MLLF. Considerações sobre idade e perfil de apresentação em leucemia mieloide crônica. Rev. Bras. Hematol. Hemoter 2006; 28(2):452. Chauffaille MLLF. Neoplasias mieloproliferativas: revisão dos critérios diagnósticos e dos aspectos clínicos. Rev. Bras. Hematol. Hemoter 2010;32(4):308-316. Chhaya SU. Human leukocyte antigens in Indian patients with chronic myeloid leukemia. Leuk Lymphoma 2006;47(2):291-5. Costello, RT, Sivori, S, Marcenaro, E, Lafage-Pochitaloff M, Mozziconacci MJ, Reviron D, Gastaut JA, Pende D, Olive D, Moretta A. Defective expression and function of natural killer cell–triggering receptors in patients with acute myeloid leukemia. Blood 2002;99:3661-3667.
Craigie, D. Case of disease of the spleen in which death took place in consequence of the presence of purulent matter in the blood. Edinburgh Med Surg J 1845; 64:400-413.
Crans HN, Sakamoto KM. Transcription factors and translocation in lymphoid and myeloid leukemia. Leukemia 2001;15(3):313-331. Cullen P. Case of splenitis acutus in which the serum of the blood drawn from the arm had the appearance of milk. Edinburgh Medical Journal 1811;7:169-171. Curado MP, Voti L, Sortino-Rachou AM. Cancer registration data and quality indicators in low and middle income countries: Their interpretation and potential use for the improvement of cancer care. Cancer Causes & Control 2009;20(5):751-756. D’Amaro J, Bach FH, Van Rood JJ, Rimm AA, Bortin MM. HLA-C associations with acute leukemia. Lancet 1984;2:1176. Dearden SP, Taylor GM, Gokhalel DA, Robinson MD, Thompson W, Ollier W, Binchy A, Birch JM, Stevens RF, Carr T, Bardsleys WG. Molecular analysis of HLA-DQB1 alleles in childhood common acute lymphoblastic leukaemia. Britsh Journal of Cancer 1996;73:603-609. Dobbin JA, Gadelha MIP. Mesilato de imatinibe para tratamento da leucemia mieloide crônica. Rev Bras Cancerol 2002;48(3): 429-38.
49
Dorak MT, Lawson T, Machulla HK, Darke C, Mills KI, Burnett AK. Unravelling an HLA-DR association in childhood acute leukemia. Blood 1999;94:694–700. Dorak MT, Oguz FS, Yalman N, Diler AS, Kalayoglu S, Anakc S, Sargin D, Carin M. A male-specific increase in the HLA-DRB4 (DR53) frequency in high-risk and relapsed childhood ALL. Leukemia Research 2002;26:651–656. Ecker CS, Laghi FVI, Shinzato FI, Shinzato LMI, Costa Neto JBI. Leucemia linfoblástica aguda: a importância do laboratório de líquor para o sucesso do tratamento. Rev. Bras. Anal. Clin 2009;41(3):201-203. Fauriat C, Just-Landi S, Mallet F, Arnoulet C, Sainty D, Olive D, Costello RT. Deficient expression of NCR in NK cells from acute myeloid leukemia: evolution during leukemia treatment and impact of leukemia cells in NCRdull phenotype induction. Blood 2007;09:323-330. Fernandes TAR, Fukai R, Souza CA, Lorand-Metze I, Magna LA, Kraemer MHS. Molecular identification of the HLA-DRB1-DQB1 for diagnosis and follow-up of acute leukemias. Blood Cells, Molecules and Diseases 2010;44:69–73. Fernández-Torres J, Flores-Jiménez D, Arroyo-Pérez A, Granados J, López-Reyes
A. HLA-B∗40 Allele Plays a Role in the Development of Acute Leukemia in Mexican Population: A Case-Control Study. BioMed Research International 2013:1-6. Funke VAM, Medeiros CR, Lima DH, Setúbal DC, Bitencourt MA, Bonfim CM, et al. Therapy of chronic myeloid leukemia with imatinib mesylate in Brazil: study of 98 cases. Rev. Bras. Hematol. Hemoter 2005;27(3):159-65. Gao SQ, Deng ZH, Jin SZ, Zhang SY, Zhang X, Wu GG. Study on the correlation between acute lymphoblastic leukemia and HLA genes in southern China Han population. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 2005;13(2):210-214. Ghodke Y, Joshi K, Chopra A, Patwardhan B. HLA and disease. European Journal of Epidemiology 2005; 20:475-88. Gragert L, Fingerson S, Albrecht M, Maiers M, Kalaycio M, Hill BT. Fine-mapping of HLA associations with chronic lymphocytic leukemia in US populations. Blood 2014;124 (17):2657-2665. Greaves M. Infection, immune responses and the aetiology of childhood leukemia. Nature Reviews Cancer 2006;6:193-203. Grumet FC, Hiraki DD, Brown BWM et al. CD31 mismatching affects marrow transplantation outcome. Biol Blood Marrow Transplant 2001;7:503-512. Guillaume N, Marolleau JP. Is immune escape via human leukocyte antigen expression clinically relevant in chronic lymphocytic leukemia? Focus on the controversies. Leukemia Research 2013;37:473-477.
50
Hamerschlak N. Leukemia: genetics and prognostic factors. J Pediatr 2008;84(4):52-57. Hutchison RE, Davey FR. Distúrbios leucocitários. In: Henry JB. Diagnósticos clínicos e tratamento por métodos laboratoriais. 20.ed. São Paulo: Manole. p.681-723; 2008. Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes. Leucemia Mieloide Crônica. Condutas do INCA.Rio de Janeiro. Revista Brasileira de Cancerologia 2003;49(1):5-8. Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva. Coordenação Geral de Ações Estratégicas. Coordenação de Prevenção e Vigilância. Estimativa 2014:incidência de câncer no Brasil/Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva, Coordenação Geral de Ações Estratégicas, Coordenação de Prevenção e Vigilância. Rio de Janeiro:Inca, 2014. International ImMunoGeneTics Information System®. Acesso em 07/08/2015. Disponível em: URL: http://hla.alleles.org/nomenclature/stats.html.
Khosravi F, Amirzargar A, Sarafnejad A, Nicknam MH, Alimoghadam K, Dianat S, Solgi G, Nikbin B. HLA class II allele and haplotype frequencies in Iranian patients with leukemia. Iran J Allergy Asthma Immunol 2007;6(3):137-42. Klein J, Sato A. The HLA system. First of two parts. The New England Journal of Medicine 2000;343(10):p.702-709. Klitz W, Gragert L, Trachtenberg E. Spectrum of HLA associations: the case of medically refractory pediatric acute lymphoblastic leukemia. Immunogenetics 2012;64:409-419. Leite JB. Estudo da permeabilidade intestinal em pacientes leucêmicos antes da quimioterapia. Dissertação de Mestrado. Belo Horizonte:2012. Lopes NR, Abreu MTCL. Inibidores de tirosino quinase na leucemia mieloide crônica. Rev. Bras. Hematol. Hemoter 2009;31(6):449-453 Lorand-Metze I, Pagnano KBB, Vieira VA, Delamain MT, Rossini MS, Metze K. Fatores que influem na resposta citogenética com o uso do imatinibe em pacientes com leucemia mielóide crônica. Rev. Bras. Hematol. Hemoter 2005;27(2):365. Lorenzi TF. Manual de Hematologia: Propedêutica e Clínica. 4.ed. Rio de Janeiro:Guanabara Koogan;Cap. 4.Patologia dos leucócitos. p.295-498;2006. Luo Q, Li L, Xie Y, Yan M, Yu P. Association of HLA-A, B and DRB1 alleles with leucemia in Han population in Hunan Province. J South Med Univ 2008;28(6):1016-1018.
51
Machulla HKG, Mueller LP, Schaaf A, et al. Association of chronic lymphocytic leukemia with specific alleles of the HLA-DR4:DR53:DQ8 haplotype in german patients. Int J Cancer 2001;92:203–207. Mckenzie SB. Advances in understanding the biology and genetics of acute myelocytic leukemia. Clinical Laboratory Science 2005;18(1):28-37. Melo, M. Leucemias & Linfomas. Atlas do Sangue Periférico. São Paulo: LMP;2008. Monte SJH, Neto JMM, Rapim GF, Shulzhenko N, Morgun A, De Lima MG. Polimorfismo do sistema HLA em uma amostra de mestiços da população de Teresina, Piauí. Rev Assoc Med Bras 2004; 50(4):422-426. Mundhada S, Luthra R, Cano, P. Association of HLA Class I and Class II genes with BCR-ABL transcripts in leukemia patients with t(9;22) (q34;q11). BMC Cancer 2004;4:25-31. Naugler C, Liwski R. HLA risk markers for chronic myelogenous leukemia in Eastern Canada. Leukemia and Lymphoma 2009;50(2):254-9. Ng MH, Lau KM, Hawkins BR, Chik KW, Chan NP, Wong WS, Tsang KS, Shing MM, Li CK. HLA-B67 may be a male-specific HLA marker of susceptibility to relapsed childhood ALL in Hong Kong Chinese and HLA-A33 or HLA-B17 signifies a higher presentation leukocytosis: A retrospective analysis on 53 transplant candidates (1989-2003). Ann Hematol 2006;85(8):535-41. Nowbakht P, Ionescu MCS, Rohner A, Kalberer CP, Rossy E, Mori L, Cosman D, Libero G, Wodnar-Filipowicz A. Ligands for natural killer cell–activating receptors are expressed upon the maturation of normal myelomonocytic cells but at low levels in acute myeloid leukemias. Blood 2005;105:3615-3622. Oguz FS, Kalayoglu S, Sarper DA, Tozkir H, Sargin D, Carin M, et al. HLA system affects the age-at-onset in chronic myeloid leukemia. Am J Hematol 2003;73(4):256-262. Oliveira AJDR. Frequência de associação de haplótipos de HLA-B/HLA-C E HLA-DRB1/HLA-DQB1 de doadores voluntários de medula óssea da região de Ribeirão Preto. Monografia apresentada ao Programa de Aprimoramento Profissional/CRH/SES-SP e FUNDAP, Ribeirão Preto; 2014. Orgad S, Cohen IJ, Neumann Y, Vogel R, Kende G, Ramot B, Zaizov R, Gazit E. HLA-A11 is associated with poor prognosis in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL). Leukemia 1988;2(12):79S-87S. Ozdilli K, Oguz FS, Anak S, Kekik C, Carin M, Gedikoglu G. The frequency of HLA class I and II alleles in Turkish childhood acute leukaemia patients. J Int Med Res 2010;38(5):1835-1844.
52
Pollock RE, Doroshow JH, Khayat D, et al. Manual de oncologia clínica da UICC. 8ª ed. São Paulo, SP: John Wiley, Fundação Oncocentro de São Paulo; 2006. Prado KB. Diversidade Molecular dos Genes HLA de Classe I em Populações Paranaenses. Dissertação de Mestrado em Genética. Univ. Fed. do Paraná. 1999. Probst CM, Bompeixe EP, Pereira NF, Dalalio MMO, Visentainer JEL, Tsuneto LT, Petzl-Erler ML. HLA Polymorphism and Evaluation of European, African and Amerindian Contribution to the White and Mulatto Populations from Paraná, Brazil. Human Biology 2000;72:597-617. Pui CH, Robison LL, Look AT. Acute lymphoblastic leukemia. Lancet 2008;371(9617):1030–1043. Pui CHMD, Relling MV, Pharm D, Downing JRMD. Mechanisms of disease: Acute Lymphoblastic Leukemia. N Engl J Med 2004;350:1535-1548. Rede Brasil de Imunogenética®. Acesso em 07/08/2015. Disponível em: URL: http://imunogenetica.org/resultados/perfil-genomico-do-redome-rereme/alelos-raros. Ribeiro KB, Buffler PA, Metayer C. Socioeconomic status and childhood acute lymphocytic leukemia incidence in Sao Paulo, Brazil. International Journal of Cancer 2008;123(8):1907-1912. Rodrigues, KE, Camargo B. Early diagnosis of childhood cancer: a team responsibility. Rev Assoc Med Bras 2003;49(1):29-34. Rosas-Cabral A, Irigoyen L, Alvarado L, Vela-Ojeda J, Ayala SM, Tripp-Villanueva F, et al. HLA Cw3 and HLA Cw4 have a protective effect on acquisition of chronic myeloid leukemia on Mexican patients. Rev Invest Clin 2003;5(4):423-428. Rubnitz JE, Gibson B, Smith FO. Acute myeloid leukemia. Pediatr Clin North Am 2008;55:21–51. Ruiz TM, Costa SMCM, Ribas F, Luz PR, Lima SS, Bicalho MG. Human leucocyte antigen allelic groups and haplotypes in a brazilian sample of volunteer donors for bone marrow transplant in Curitiba, Paraná, Brazil. Transplant Proc 2005;37:2293-96. Sacramento WS, Santiago MRR, Vásquez LS, Cordeiro AMR, Silva KLT. Frequência HLA-A*, B* e DRB1* e perfil epidemiológico em candidatos a doadores voluntários do REDOME coletados na Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Estado do Amazonas. Rev Bras Hematol Hemoter 2011;33(1):13-25. Santana LR, Almeida MF, Portugal TS. Leukemia Epidemiology of Children and Teenagers in the Brazilian State of Bahia. Gazeta Médica da Bahia 2007;77(1):S51-S54. Sarafnejad A, Khosravi F, Alimoghadam K, Dianat S, Ansaripour B, Moradi B, Dorkhosh S, Amirzargar A. HLA Class II Allele and Haplotype Frequencies in Iranian
53
Patients with Acute Myelogenous Leukemia and Control Group. Iran J Allergy Asthma Immunol 2006;5(3):115-119. Schumacher HR, Alvares CJ, Blough RI, Mazella F. Acute leukemia. Clin Lab Méd 2002;22(1):153–192. Shankarkumar U. HLA associations in leprosy patients from Mumbai, India. Lepr Ver 2004;75(1):79-85. Silva DB, Pires MM, Nassar SM. Câncer pediátrico: análise de um registro hospitalar. Jornal de Pediatria 2002;78(5):409-414. Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al. editors. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Lyon: IARC; 2008. Tefferi A, Dewald GW, Litzow ML, Cortes J, Mauro MJ, Talpaz M, et al. Chronic myeloid leukemia: current application of cytogenetics and molecular testing for diagnosis and treatment. Mayo Clin Proc 2005;80(3):390-402. Theodorou I, Abel L, Mauro F, et al. High occurence of DRB1 11 in chronic lymphocytic leukaemia families. Br J Haematol 2002;119(3):713-715. Uçar F, Sonmez M, Erkut N, Balci M, Yucel B, Yilmaz M, Erduran E, Ovali E. Relation of HLA-A, -B, -DRB1 alleles and haplotypes in patients with acute leukemia: a case control study. Rch Med Res 2011;42(4):305-310. Vardiman JW, Thiele J, Arber DA, et al. The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes. Blood 2009;114:937-951.
Velpeau, A. Sur la resorption du pusaet Sur l’alteration du sang dans les maladies clinique de persection nenemant. Premier observation. Rev Med 1827;2:216.
Virchow, R. Weisses blut. Notiz Geb Natur Heilk 1845;36:152-156. Visentainer JE, Tsuneto LT, Serra MF, Peixoto PR, Petzl-Erler ML. Association of leprosy with HLA-DR2 in a Southern Brazilian population. Braz J Med Biol Res 1997;30(1):51-59. Voltarelli JC, Pasquini R, Ortega ETT. Transplante de Células-tronco Hematopoéticas. 1a ed. São Paulo:Editora Atheneu:93-113;2009. Wang XJ, Zhang YZ, Sun HY, Li QH, Ru K. Associations of HLA gene with leukemia in 1186 cases. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 2014;22(2):263-268. Wang XJ, Ai XF, Sun HY, Wang F, Xu SC, Gui FM, Shen H, Wang ZQ, Li QH, Liang XL, Zhu XF. Relation of HLA-DRB1*15 with pathogenesis in 162 childhood cases of acute lymphoblastic leukemia. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 2009;17(6):1507-1510.
54
World Health Organization. BMI classification. Geneva, Switzerland;2012. Yasukawa M, Ohminami H, Kojima K, Inokuchi K, Nishimura Y, Fujita S. Analysis of HLA-DRB1 alleles in Japanese patients with chronic myelogenous leukemia. Am J Hematol 2000;63(2):99-101. Zago MA, Falcão RP, Pasquini R. Hematologia: fundamentos e prática. São Paulo: Atheneu;2004. Zago MA, Falcão RP, Pasquini R. Hematologia: fundamentos e prática. São Paulo: Atheneu;2013. Zhang MY, Chen FY, Zhon, H. Meta-analysis of human leucocyte antigen genetic polymorphisms and susceptibility to chronic myelogenous leukemia in Chineses population. Leuk Res 2011;35:1564-1570.
55
9. ANEXOS